用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠及其制备方法与流程

技术特征：
1.一种用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠，其特征在于：在聚丙烯酰胺凝胶微珠的表面修饰有通用引物、细胞标签，其中通用引物的序列为/5`acryd//ithiomc6-d/ctacacgacgctctt；细胞标签包括bc1、bc2和bc3，以及对应的辅助夹板序列bc1-rc、bc2-rc、bc3-rc；所述bc1的序列为(x1)；bc2的序列为gt(x2)；bc3的序列为tg(x3)(n)
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ttttttttttttttttttttttttttttttvn；bc1-rc的序列为ac(x1`)agatcggaagagcg；bc2-rc的序列为ca(x2`)；bc3-rc的序列为(x3`)；其中x1与x1`、x2与x2`、x3与x3`互为反向互补序列，代表4-8bp预先设计好的序列，设计方法为每条序列之间至少有2个碱基的差异，每条序列内部没有超过连续4个重复碱基的序列，每条序列中至少有一个嘌呤和一个嘧啶。2.根据权利要求1所述的用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠，其特征在于：所述通用引物序列、细胞标签序列修饰到聚丙烯酰胺凝胶微珠表面后进行单链化处理。3.根据权利要求1或2所述的用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶微珠为可降解聚丙烯酰胺凝胶微珠。4.根据权利要求3所述的用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠，其特征在于：所述可降解聚丙烯酰胺凝胶微珠在光照刺激、还原剂刺激或热刺激条件下降解。5.根据权利要求3所述的用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶微珠粒径在40-70μm之间。6.一种用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠的制备方法，其特征在于步骤包括：(1)分别合成bc1、bc2、bc3、bc1-rc、bc2-rc、bc3-rc，以及通用引物；(2)合成聚丙烯酰胺凝胶微珠，合成的同时加入通用引物，使通用引物偶联到聚丙烯酰胺凝胶微珠上；(3)将bc1、bc1-rc退火，形成双链dna，退火后的bc1/bc1-rc双链dna通过dna连接酶连接到步骤(2)获得的聚丙烯酰胺凝胶微珠上；(4)重复步骤(3)，依次将bc2/bc2-rc双链dna以及bc3/bc3-rc双链dna连接到聚丙烯酰胺凝胶微珠上；(5)将步骤(4)获得的双链dna连结产物进行单链化处理，获得用于单细胞测序的功能化凝胶微珠。7.根据权利要求6所述的用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠的制备方法，其特征为：步骤(2)中将丙烯酰胺、n,n'双(丙烯酰)胱胺、引发剂、通用引物和功能捕获核酸加入水中作为水相，包裹油、temed混合后作为油相，两者分别装入注射器中，与微流控芯片对应的入口端通道相连，通过控制水相和油相的流速来控制液滴生成的速率和尺寸，在微流控芯片的出口端收集生成的液滴乳浊液，在液滴乳浊液液面上覆盖矿物油，加热条件下放置8小时以上，加入pfo破坏液滴，释放聚合好的聚丙烯酰胺凝胶微珠。8.根据权利要求7所述的用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠的制备方
法，其特征为：步骤(5)中用变性缓冲液处理双链dna连结产物，以使双链dna连结产物中的双链变性为单链。9.根据权利要求8所述的用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠的制备方法，其特征为：所述变性缓冲液包括150mm naoh、0.5％brij-35。

技术总结
本发明提供了一种用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠，凝胶微珠的表面修饰有通用引物、细胞标签，其中通用引物的序列为/5`Acryd//iThioMC6-D/CTACACGACGCTCTT；细胞标签包括BC1、BC2和BC3，以及对应的辅助夹板序列BC1-RC、BC2-RC、BC3-RC；细胞标签中X1与X1`、X2与X2`、X3与X3`互为反向互补序列，代表4-8bp预先设计好的序列。还公开了其制备方法。本发明通过独特的生化合成手段在每个凝胶微珠上均偶联了数百万到数千万个寡核苷酸用于捕获细胞内的转录本，并且合成的每个凝胶微珠上均携带有独特的细胞标签序列用于区分单个细胞的转录本。本发明的凝胶珠制备工艺操作简单，成本低廉，寡核苷酸偶联效率高，批间差异小，适合大规模量产。合大规模量产。合大规模量产。


技术研发人员：曹振 常明星 刘娜 刘倩 温昱晨
受保护的技术使用者：翌圣生物科技（上海）股份有限公司
技术研发日：2022.10.19
技术公布日：2023/1/13