对PD-1亲和力增强的PD-L1变体的制作方法

对pd-1亲和力增强的pd-l1变体
1.本发明涉及一种pd-l1多肽，其包含至少一个与seq id no:8具有至少70％相同的第一氨基酸序列，以及至少一个与seq id no:10具有至少70％相同的第二序列，其中所述多肽至少在氨基酸位置y56和p76处携带氨基酸取代，其中所述氨基酸位置是基于小鼠pd-l1的氨基酸序列(seq id no:6)。本技术还涉及编码上述pd-l1多肽的多核苷酸，以及与之相关的宿主细胞、方法和用途。
2.脓毒症是一种威胁生命的疾病，当全身对感染做出反应时就会发生。尽管进行了深入研究，脓毒症仍然是重症监护病房的第三大主要死亡原因。病理生理学上，在脓毒症进展过程中，有一个初始的过度炎症阶段，它会引发低炎症阶段的开始，部分并行发生(vincent,et al.(2013)lancet 381:774-775)。
3.最近的治疗方法主要集中在治疗过度炎症反应，以限制促炎性介质的释放、阻断其功能、或将其从循环中清除。tnfα是一种最有希望的候选药物，对其的抑制可以显著提高啮齿动物模型中脓毒症的存活率。使用中和抗体，这种方法被应用到人类情况，但未能提高脓毒症的存活率(reinhart et al.(2001)crit care med 29:765-769)。通过阻断免疫刺激限制过度炎症，大多数患者都能在这一阶段存活下来；然而，由于阻断促炎性免疫反应会降低宿主抵抗和控制原发性和继发性感染的能力，这种治疗方法最终未能显著提高脓毒症的存活率，而是导致或增强了低炎症阶段。这种免疫抑制通常会引发多器官功能障碍综合征(mods)和患者死亡(otto et al.(2011)crit care15:r183)。在不同的方法中，提供了人pd-l1多肽细胞外部分的fc融合蛋白，用于治疗和预防脓毒症期间的器官衰竭(wo 2017/029389 a1)。
4.在免疫性麻痹期间，还应用了抢救患者的治疗方法。考虑到单核细胞失活，gm-csf治疗恢复了脓毒症期间的单核细胞的功能(meisel et al.(2009)am j respir crit care med 180:640-648)。尽管如此，由于脓毒症的多种病因、各种预先存在的合并症、或患者的遗传先决条件，仍然难以实现合适的患者特异性治疗(hotchkiss and opal(2010)n engl j med 363:87-89)。
5.一般来说，当患者被诊断为脓毒症时，疾病的严重程度已经大大提高，并且肝损伤(脓毒症进展过程中相对较晚的事件)已经发生。脓毒症期间，器官衰竭，通常随后是多器官功能障碍综合征(mods)，经常导致患者死亡。因此，了解导致器官损伤的机制对于改进现有的护理方案或建立新的治疗方法是必须的。
6.脓毒症中导致器官损伤的过程是细胞毒性t细胞(ctl)对宿主细胞的攻击的不必要的自身免疫激活。细胞毒性t细胞的激活是一个严格调节的过程，需要多种信号事件同时发生。在健康情况下，免疫突触上的结合事件，例如t细胞受体(tcr)与主要组织相容性复合体1(mhc-1)结合或程序性细胞死亡-1(pd-1)与上皮细胞上的pd-1配体1(pd-l1)结合，调节ctl的激活。然而，在ctl引起炎症反应的感染过程中，上皮细胞经历几种变化。例如，感染细胞mhc-i蛋白上的非自身肽的呈递会激活ctls，从而导致感染组织的快速破坏。ctl激活的另一个实例是宿主细胞表面缺乏pd-l1，这是由环境中存在的细菌毒素等因素引起的。通过识别toll样受体，这些细菌毒素诱导吞噬细胞nadph氧化酶(nox2)的表达，导致胞浆中活性
氧(ros)水平的增加和细胞表面pd-l1的去除(von knethen et al.(2019),theranostics 9(7):2003)。虽然这两个过程对于在正常感染期间去除病变细胞至关重要，但是在大器官大规模感染或身体组织大面积细菌感染期间，pd-l1的丢失尤其会成为问题。然后器官会受到患者自身免疫反应的攻击而不会被感染，造成永久性损伤，或者在最坏的情况下，器官衰竭并死亡。
7.因此，迫切需要用于调制pd-1信号传导的改进手段和方法，尤其是在ctls表面，例如，尤其是用于治疗和/或预防脓毒症期间的器官衰竭。
8.本发明的技术问题可被视为提供满足上述需求的手段和方法。技术问题通过本文下述的权利要求和实施方案中表征的实施方案来解决。
9.因此，本发明涉及一种pd-l1多肽，其包含至少一个与seq id no:8具有至少70％同一性的第一氨基酸序列和至少一个与seq id no:10具有至少70％同一性的第二序列，其中
10.(i)多肽至少在下述位置之一处携带氨基酸取代：v54、y56、q63、q66、v68、a69、p76、i115、a121、d122、y123、k124和r125，其中，如果多肽在位置y56、c113或i115处包含氨基酸取代，则多肽还携带至少一个进一步的上述取代；其中，氨基酸位置是基于小鼠pd-l1的氨基酸序列(seq id no 6)；
11.(ii)多肽至少在氨基酸位置y56和p76处携带氨基酸取代，其中所述氨基酸位置是基于小鼠pd-l1的氨基酸序列(seq id no:6)；和/或
12.(iii)其中，多肽在第一氨基酸序列的下述氨基酸位置中的至少一个位置处携带至少一个氨基酸取代：v54、y56、q63、q66、v68、a69、p76；以及在第二氨基酸序列的下述氨基酸位置中的至少一个位置处携带至少一个氨基酸取代：i115、a121、d122、y123、k124和r125，其中所述氨基酸位置是基于小鼠pd-l1的氨基酸序列(序列id no:6)。
13.一般而言，除非另有说明，本文中使用的术语对于本领域普通技术人员来说具有普通和习惯的含义，不限于特殊或定制的含义。如下文所用，术语“有(have)”、“包含(comprise)”或“包括(include)”或其任意语法变体以非排他性方式使用。因此，这些术语既可以指除这些术语引入的特征外，在此上下文中描述的实体中不存在其他特征的情况，也可以指存在一个或多个其他特征的情况。作为实例，表述“a有b”、“a包含b”和“a包括b”既可以指除b之外，a中不存在其他元素的情况(即，a单独且排他地由b组成的情况)，也可以指除b之外，实体a中还存在一个或多个其他元素的情况，例如元素c、元素c和元素d，或者甚至其他元素。同样，如技术人员所理解的，“包含一个(a)”和“包含一个(an)”优选指“包含一个或多个”，即等同于“包含至少一个”。
14.此外，如下文所用，术语“优选地”、“更优选地”和“最优选地”，“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似术语与可选特征结合使用，不限制进一步的可能性。因此，这些术语引入的特征是可选特征，并不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如技术人员所意识到的，本发明可以通过使用替代特征来进行。类似地，“在一个实施方案中”或类似表述所引入的特征旨在成为可选特征，对本发明其他实施方案没有任何限制，对于本发明的范围没有任何限制，对于以这种方式引入的特征与本发明的其他可选或非可选特征相结合的可能性也没有任何限制。
15.如本文所用，如果没有另外说明，术语“标准条件”涉及iupac标准环境温度和压力
(satp)条件，即，优选温度为25℃且绝对压力为100kpa；同样优选地，标准条件包括ph为7。此外，如果没有另外指出，术语“约”涉及相关领域中具有公认技术精度的指定值，优选涉及指定值
±
20％、更优选
±
10％、最优选
±
5％。此外，术语“基本上”表示不存在对指定结果或用途有影响的偏差，即潜在偏差不会导致指定结果的偏差超过
±
20％，更优选
±
10％，最优选
±
5％。因此，“基本上由
……
组成”是指包括指定的成分，但不包括其他成分，但作为杂质存在的材料、作为用于提供该成分的过程的结果而存在的不可避免的材料、以及为实现本发明技术效果以外的目的而添加的成分除外。例如，使用短语“基本上由
……
组成”定义的组合物包括任何已知的可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载体等。优选地，基本上由一组组分组成的组合物将包含小于5重量％、更优选小于重量3％、甚至更优选小于重量1％、最优选小于0.1重量％的非指定组分。
16.两个生物序列，优选dna、rna或氨基酸序列之间的同一性程度(例如表示为“％同一性”)可以通过本领域公知的算法来确定。优选地，同一性的程度是通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定的，其中与用于最佳比对的序列相比，比较窗口中的序列片段可能包含添加或缺失(例如，缺口或突出端)。百分比通过下述计算：确定(优选在多核苷酸或多肽的整个长度上)两个序列中出现的相同残基的位置的数量以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数，然后将结果乘以100，得出序列同一性的百分比。通过smith和waterman(1981)的局部同源性算法、needleman和wunsch(1970)的同源性比对算法、pearson和lipman(1988)的搜索相似性方法、通过这些算法的计算化实施(威斯康星州麦迪逊科学街道575号遗传学计算机组(gcg)，威斯康星遗传学软件包中的gap、bestfit、blast、pasta和tfasta，遗传学计算机组(gcg),575science dr.,madison,wi)、或通过目视检查进行用于比较的最佳序列比对。鉴于已确定两个用于比较的序列，优选使用gap和bestfit来确定其最佳比对，从而确定同一性的程度。优选地，使用缺口权重长度的默认值5.00和缺口权重长度的默认值0.30。在本文提及的生物序列的上下文中，术语“基本上相同”表示至少80％、优选至少90％、更优选至少98％、最优选至少99％的％同一性值。可以理解，术语“基本上相同”包括100％的同一性。上述内容适用于术语“基本上互补”的必要的修正。
17.术语生物大分子(优选多核苷酸或多肽)的“片段”在本文中以广义使用，涉及包含指定序列、结构和/或功能的各个生物大分子的任何子部分，优选子结构域。因此，术语包括由生物大分子的实际片段化产生的子部分，也包括以抽象方式(例如由电脑模拟的)从各生物大分子中衍生出来的子部分。因此，如本文所用，fc或fab片段，以及例如单链抗体、双特异性抗体和纳米体可被称为免疫球蛋白的片段。
18.除非本文另有明确指示，否则指定的化合物尤其是pd-l1多肽，可以包含在较大的结构中，例如可以共价或非共价连接到载体分子、阻滞剂和其他赋形剂上。具体而言，指定的多肽可被包含在包含其他多肽的融合多肽中，这些多肽可用作例如用于纯化和/或检测的标签、接头或延长化合物的体内半衰期。术语“可检测标签”是指添加到融合多肽或引入融合多肽的一段氨基酸；优选地，将标签添加到本发明所述融合多肽的c-末端或n-末端。该一段氨基酸优选允许通过特异识别标签的抗体检测融合多肽；或者优选允许形成功能性构象，例如螯合剂；或者优选允许可视化，例如在荧光标签的情况下。优选的可检测标签为myc标签、flag标签、6-his-标签、ha标签、gst标签或荧光蛋白标签，例如gfp标签。这些标签在
本领域都是众所周知的。优选包含在融合多肽中的其他进一步的肽包含进一步的氨基酸或其他修饰物，其可作为分泌介质、血脑屏障通道介质、细胞穿透肽和/或免疫刺激物。多肽可融合的进一步的多肽或肽是信号序列和/或转运序列，例如il-2信号序列、接头序列，例如gsrs(seq id no:25)肽接头。
19.如本文所用，术语“多肽”是指由多个，通常至少20个氨基酸组成的分子，这些氨基酸通过肽键彼此共价连接。由少于20个氨基酸以肽键共价连接组成的分子通常被认为是“肽”。优选地，多肽包含50到1000个、更优选75到1000个，还更优选100到500个、最优选110到400个氨基酸。优选地，多肽包含在融合多肽和/或多肽复合物中。
20.根据本说明书的“融合多肽”是指由至少两个多肽或肽组成的多肽，包含在连续的肽键链中。因此，融合多肽优选可在体内由单个表达构建体表达，更优选由单个开放阅读框表达。优选地，融合蛋白包含至少一个pd-l1多肽和至少一个进一步的肽或多肽，优选延长包含其的融合多肽的体内半衰期的多肽；本文其他地方描述了合适的多肽。然而，融合多肽可包含两个、三个、四个、五个或甚至更多额外多肽或肽部分，例如信号序列、接头、铰链区域和/或延长体内半衰期的多肽。融合多肽可在体内由编码融合多肽的多核苷酸表达，多核苷酸可通过例如化学方法或重组dna技术合成，并在合适的表达系统中表达。然后，可以从表达系统中纯化表达的融合多肽。
21.如本文所用，术语“多肽复合物”涉及包含至少两个未通过肽键连接的多肽和/或肽的任何化合物。因此，融合多肽中的多肽和/或肽可通过共价键，特别是二硫键连接，或非共价连接，特别是通过离子键、氢键和/或范德华力连接，例如在亲和结合中。包含配体和受体部分的各种亲和结合系统是本领域技术人员已知的，能够构建包含彼此可逆结合不同肽或多肽部分的亲和对，而无需进一步处理。此类亲和结合系统的典型实例是基于抗体/抗原、链霉亲和素/生物素、亲和素/生物素和本领域已知的其他亲和结合系统。优选地，多肽复合物包含至少一个pd-l1多肽和至少一个进一步的肽或多肽，优选延长包含其的融合多肽的体内半衰期的多肽；本文其他地方描述了合适的多肽。
22.如本文所用，术语“pd-l1多肽”涉及一种多肽，其包含至少一个与seq id no:8具有至少70％同一性的第一氨基酸序列、和至少一个与seq id no:10具有至少70％同一性的第二序列；此外，与上述seq id no:6所示序列相比，pd-l1多肽包含至少一个氨基酸取代或氨基酸取代组合。如技术人员理解，氨基酸序列上下文中的术语“取代”涉及用不相同的氨基酸替换氨基酸。如技术人员将理解，本文提到的pd-l1多肽的基本结构优选衍生自pd-l1蛋白的已知结构，优选人类pd-l1蛋白(genbank acc no:np_054862.1，seq id no:26)和/或小鼠pd-l1蛋白(genbank acc no:adk70950.1，seq id-no:6，优选由seq id no:3的序列编码)。相应地，如上所述，pd-l1多肽内的所有氨基酸位置指示均是相应于如上所述的小鼠pd-l1的氨基酸序列(序列编号：6)提供的。如技术人员还将理解，优选地，通过将pd-l1多肽与seq id no:6比对来确定具有更多或更少氨基酸的pd-l1肽中的相应位置，优选如上所述。pd-l1多肽具有结合pd-1的生物活性，优选人类pd-1(genbank账号：np_005009.2)和/或小鼠pd-1(genbank帐号：np_032824.1)。优选地，pd-l1多肽具有结合包含完整蛋白质的31-150个氨基酸的小鼠pd-1重组片段的生物活性。优选地，pd-l1多肽与pd-1(优选上述小鼠pd-l1的重组片段)之间结合的kd最多为50nm、更优选最多为20nm、还更优选最多为10nm、甚至更优选最多为7.5nm、甚至更优选最多为5nm、最优选最多为2.5nm。如本文在实施例中更
详细地公开的，进一步多肽的存在，例如在融合多肽中，可能影响pd-l1多肽的亲和力；因此，上述kd值优选地针对对应于野生型pd-l1的18-132个氨基酸的肽，优选地对应于seq id no:4来确定。优选地，pd-l1多肽进一步具有抑制脓毒症诱导的细胞毒性t细胞的活性；同样优选的，所述pd-l1多肽进一步具有在受试者中诱导细胞毒性t细胞对脓毒症引起的激活的持久耐受的活性。在一个优选实施方案中，所述pd-l1多肽具有减少，更优选预防白细胞、优选t细胞分泌ifn-γ和/或tnf-α的活性。在一个优选实施方案中，pd-l1多肽具有减少，更优选预防t细胞、优选cd4 和/或cd8 t细胞分泌ifn-γ和/或巨噬细胞分泌tnf-α的活性。在进一步优选实施方案中，pd-l1多肽是pd-1激动剂，优选与野生型pd-l1相比对pd-1亲和力增加的pd-1激动剂。
23.pd-l1多肽至少包含如上上述的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列。优选地，第一氨基酸序列与seq id no:8具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％的同一性，和/或第二氨基酸序列与seq id no:10具有至少80％、优选至少90％、更优选地至少95％的同一性。最优选地，pd-l1多肽包含至少一个选自seq id no:7和seq id no:8的第一氨基酸序列，以及至少一个选自seq id:9和seq id:10的第二序列，包括如上所述的至少一个氨基酸取代。可以理解，上述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列可衍生自人类和/或小鼠pd-l1蛋白。因此，pd-l1多肽优选包含可衍生自该pd-l1蛋白质的进一步的序列，特别是与连接人类和/或小鼠pd-l1蛋白中上述第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的序列具有至少70％同一性的序列，即与人类pd-l1蛋白的77-112个氨基酸具有至少70％同一性的氨基酸序列。然而，还设想第一氨基酸序列和第二氨基酸序列通过不衍生自pd-l1蛋白的序列，例如合适的接头肽连接。尽管如此，优选地，所述pd-l1多肽包含，优选包含，与人类pd-l1的18-132个氨基酸具有至少70％同一性的氨基酸序列，即seq id no:5的氨基酸序列，优选地由与人类pd-l1的18-132个氨基酸具有至少70％同一性的氨基酸序列，即seq id no:5的氨基酸序列组成。优选地，pd-l1多肽包含与seq id no:5的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％同一性的氨基酸序列，优选地由与seq id no:5的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％同一性的氨基酸序列组成。更优选地，pd-l1多肽包含seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列，优选地由seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列组成，包括本文其他地方指定的取代。可以理解，表述“pd-l1多肽包含氨基酸序列x，包括本文其他地方指定的取代”涉及pd-l1多肽基本上包含氨基酸序列x，但包括指定的取代的事实；即优选地，pd-l1多肽包含氨基酸序列x，除了指示位置处的氨基酸被取代的氨基酸替换。
24.本文所述的pd-l1多肽在下述位置中的至少一个位置处携带氨基酸取代：v54、y56、q63、q66、v68、a69、p76、i115、a121、d122、y123、k124和r125，其中，如果多肽包含在位置y56、c113或i115处的氨基酸取代，则多肽携带至少一个进一步的前述取代，即选自v54、y56、q63、q66、v68、a69、p76、i115、a121、d122、y123、k124和r125的取代。更优选地，如果多肽在位置y56、q63、a69，p76、c113或i115处包含氨基酸取代，则多肽携带至少一个进一步的前述取代。更优选地，pd-l1多肽在位置y56和/或p76处更优选地在位置y56和p76处包含至少一个氨基酸取代。同样优选地，pd-l1多肽在氨基酸位置v54、q66、v68、a69和/或i115中的至少一个位置处携带至少一个进一步取代。更优选的，pd-l1多肽在第一氨基酸序列内的下述氨基酸位置中的至少一个位置处携带至少一种氨基酸取代：v54、y56、q63、q66、v68、a69、
p76；以及在第二氨基酸序列内的下述氨基酸位置中的至少一个位置处携带至少一种氨基酸取代：i115、a121、d122、y123、k124和r125。优选地，q63取代不是q63n取代，a69取代不是a69h取代，p76取代不是p76v取代，和/或i115取代不是i115m取代。更优选地，v54取代是v54l取代，y56取代是y56g、y56a、y56d或y56s取代，q63取代是q63h取代，q66取代是q66r取代，v68取代是v68e取代，a69取代是a69t或a69s取代，p76取代是p76f或p76h取代，和/或i115取代是i115l取代。优选地，所述pd-l1多肽在氨基酸位置c113处携带至少一个进一步的取代。同样优选地，所述pd-l1多肽在氨基酸位置v54、q66、v68、a69和/或i115中的至少一个位置的携带至少一个进一步取代。
25.优选地，pd-l1多肽包括取代：(i)y56s、p76f和i115l；(ii)v54l、y56d、q66r、v68e、a69s和p76h；(iii)y56g、q63h、p76f和i15l；(iv)y56a、q63h、a69t和p76f；或(v)y56a、q63h和p76h。最优选地，pd-l1多肽包括取代y56s、p76f和i115l；或v54l、y56d、q66r、v68e、a69s和p76h。因此，优选地，pd-l1多肽包含如seq id no:16至seq id no:20中所示的任何氨基酸序列，优选地由如seq id no:16至seq id no:20中所示的任何氨基酸序列组成；优选地，其中pd-l1多肽包含如seq id no:16或seq id no:17所示的氨基酸序列，优选地由如seq id no:16或seq id no:17所示的氨基酸序列组成。
26.优选地，所述pd-l1多肽包含在融合多肽和/或多肽复合物中，也如上文所述。优选地，pd-l1多肽包含在融合多肽中，该融合多肽进一步包含用于纯化和/或检测的标签、接头和/或延长化合物体内半衰期的多肽。延长化合物体内半衰期的多肽是本领域已知的，其具体包括抗体片段，例如免疫球蛋白的fc片段和卵清蛋白或其片段。同样优选地，pd-l1多肽包含在多肽复合物中；例如前述用于纯化和/或检测的标签、接头和/或延长化合物体内半衰期的多肽可通过二硫键或本文其他地方说明的亲和结合与pd-l1多肽连接。此外，融合多肽可形成多聚体，例如二聚体，在这种情况下，pd-l1多肽可包含在融合多肽和多肽复合物中，例如二聚体fc融合多肽中。因此，优选地，pd-l1多肽包含如seq id no:21或22所示的氨基酸序列，优选地由如seq id no:21或22所示的氨基酸序列组成，优选由包含seq id no：23或24所示的核苷酸序列的多核苷酸编码。
27.术语“免疫球蛋白的片段可结晶(fc)部分”是指包含抗体的ch2和ch3结构域的抗体片段，其可通过使用例如木瓜蛋白酶的抗体蛋白水解裂解获得。来自各种不同物种的各种免疫球蛋白是本领域已知的。这些免疫球蛋白包括iga、igd、ige、igg、igm、igw或igy。然而，根据本发明，在免疫球蛋白中优选的是那些出现在哺乳动物中特别是在人类中的免疫球蛋白，即iga、igd、ige、igg、igm。抗体的fc部分决定类别效应。由于只有重链的恒定结构域形成抗体的fc部分，因此重链的类别决定了类别效应。抗体中可能的重链类别包括α、γ、δ、ε和μ。这些重链类别定义了同种型。不同抗体同种型因其各自的fc部分而具有不同的类别效应。此类fc介导的类别效应包括影响效应细胞或效应分子的效应，例如调理作用、凝集反应、溶血、补体激活和肥大细胞脱颗粒。对于不同的抗体同种型，形成fc部分的ch2和ch3结构域的氨基酸序列在本领域中是众所周知的，并且可以由技术人员提供，无需进一步处理。根据本发明提到的fc部分可以优选是翻译后修饰的，更优选是糖基化的。优选地，根据本发明的该免疫球蛋白是igg，更优选是人类igg。编码人类igg的氨基酸序列以及编码它们的核酸序列在本领域是众所周知的。此外，众所周知，哪些氨基酸对应于该氨基酸序列中的fc部分。
28.优选地，该融合多肽或多肽复合物包括用于靶向的第三部分，特别地，第三部分是能够特异性结合细胞毒性t细胞的多肽。更优选地，能够特异性结合细胞毒性t细胞的该多肽选自下组：包括能够结合cd8的mhc-i复合物的部分的多肽、能够结合cd28的cd80的部分、多肽是能够特异结合cd8的抗体或其片段、多肽是能够特异结合cd28的抗体或其片段、以及淋巴细胞功能相关抗原-3(lfa-3)的cd2结合部分。对于本领域技术人员来说，这些部分如何衍生自各自的蛋白质是众所周知的。
29.有利的是，在作为本发明基础的研究中已经发现，所述pd-l1衍生物对配体pd-1有增加的亲和力。此外，还发现可以使用明显更小的分子。因此，治疗效果，特别是在治疗脓毒症相关的器官衰竭方面，可以在较低浓度下实现，从而减少所需剂量。因此，pd-l1变体优选替换宿主细胞的缺失信号，从而预防ctl的自身免疫激活。pd-l1变体优选含有增强对pd-1亲和力的突变，但保持与pd-l1野生型相同的结合模式。因此，工程化的pd-l1变体优选具有作为药物的潜力，该药物可以被施用以预防由脓毒症引起的患者器官/组织损伤。
30.上述定义经必要修改后适用于以下各项。下文进一步给出的附加定义和解释也适用于本说明书中描述的所有实施方案(经必要修改)。
31.本发明还涉及编码根据本发明的pd-l1多肽的多核苷酸。
32.如本文所用，术语“多核苷酸”是指单链或双链dna或rna分子。该术语包含基因组dna、cdna、hnrna、mrna以及此类分子物种的所有天然或人工衍生物，包括其片段。多核苷酸优选可以为线性分子或环状分子。此外，除了编码上述pd-l1多肽的核酸序列外，根据本发明的多核苷酸可包含正确转录和/或翻译所需的额外序列，例如5
′‑
或3
′‑
utr序列或剪接或rna稳定性所需的序列。本文其他地方也描述了编码根据本发明的pd-l1多肽的优选多核苷酸。优选地，多核苷酸包含与如seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少60％同一性的序列，优选地由与如seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少60％同一性的序列组成；优选地，多核苷酸包含如seq id no:11至15中的任一个所示的序列，优选由如seq id no:11至15中的任一个所示的序列组成，更优选由seq id no:11或12组成。
33.优选地，多核苷酸包含在允许在该受试者中表达该多核苷酸的表达构建体中。如本文所用，术语“表达构建体”是指包含前述编码pd-l1多肽的多核苷酸以及编码融合多肽的多核苷酸表达所需的核酸的异源多核苷酸。通常，优选与编码pd-l1多肽的多核苷酸异源的此类额外核酸可以是启动子序列、增强子序列和/或转录终止序列例如终止子。此外，表达构建体还可包含将表达构建体引入宿主所需的进一步的核酸。例如，如果需要在宿主细胞中表达，则表达构建体可包含转化或转染以及在宿主细胞中增殖引入的表达构建体所需的进一步的核酸。
34.本发明还涉及包含本发明多核苷酸的载体。
35.本文所指的载体优选地包括噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体以及人工染色体，例如细菌人工染色体或酵母人工染色体。包括编码pd-l1多肽的多核苷酸的载体优选进一步包含用于在宿主中繁殖和/或选择的选择性标记。载体可通过本领域众所周知的各种技术整合到宿主细胞中。例如，可以质粒载体引入沉淀物例如磷酸钙沉淀物或氯化铷沉淀物中，或者引入带有带电脂质复合物中，或者引入碳基簇例如富勒烯中。或者，可以通过热休克或电穿孔技术引入质粒载体。如果载体是病毒，则在应用于宿主细胞之前，可以使用合适的包装细胞系在体外对其进行包装。逆转录病毒载体可能具有复制能力或复制缺陷。在
后一种情况下，病毒增殖通常只发生在互补的宿主/细胞中。此外，多核苷酸通常可操作地与表达控制序列连接，以允许在原核或真核宿主细胞中表达，或者该载体表达其分离的部分。多核苷酸的表达包含将多核苷酸转录成可翻译的mrna。确保在宿主细胞中表达的调节元件是本领域众所周知的，并在上文的示例性基础上进行了描述。允许在原核宿主细胞中表达的可能调节元件包括，例如，大肠杆菌中的lac-、trp-或tac-启动子，允许在真核宿主细胞内表达的调节元件的实例为酵母中的aox1-或gal1-启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的cmv、sv40-、rsv启动子(劳斯氏肉瘤病毒)、cmv增强子、sv40增强子或珠蛋白内含子。本发明设想的其他表达系统应允许在昆虫细胞中表达，例如基于多角体蛋白(polyhedrin)启动子的系统。此外，诱导型表达控制序列可用于本发明所包含的载体中。此类诱导型载体可包含tet或lac操作子序列或可由热休克或其他环境因素诱导的序列。合适的表达控制序列是本领域众所周知的。除了负责转录起始的元件外，这些调节元件还可以包括转录终止信号，例如多核苷酸下游的sv40-poly-a位点或tk-poly-a位点。在这种情况下，本领域已知合适的表达载体是本领域已知的，例如冈山伯格(okayama-berg)cdna表达载体pcdv1(pharmacia)、pbluescript(stratagene)、pcdm8、prc/cmv、pcdna1、pcdna3(invitrogen)或psport1(invirogen)或杆状病毒衍生的载体。优选地，载体是表达载体和基因转移或靶向载体。衍生自病毒(诸如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒)的表达载体可用于将根据本发明的表达构建体传递到靶细胞群体，例如也可用于基因治疗方法中。本领域技术人员众所周知的方法可用于构建重组病毒载体；例如，参见sambrook,molecular cloning a laboratory manual,cold spring harbor laboratory(1989)n.y.和ausubel,current protocols in molecular biology,green publishing associates and wiley interscience,n.y.(1994)中描述的技术。
36.此外，设想将表达构建体引入宿主基因组。在这种情况下，表达构建体还可以包含允许该表达构建体异源或同源整合的核酸。因此，本文提到的表达构建体也可以是允许靶向构建体随机或定点整合到基因组dna中的靶向构建体。此类靶向构建体优选包含足够长度的dna，用于在具有编码pd-l1多肽的多核苷酸的表达盒侧翼进行同源或异源重组。此外，还可以使用整合系统如cre/loxp或crispr/cas引入表达构建体。在这种情况下，表达构建体可包含允许使用这些整合系统的进一步的核酸。合适的修饰/添加取决于所设想的整合系统，并且对于本领域技术人员来说是众所周知的。
37.本发明还涉及根据本发明的pd-l1多肽或多核苷酸，其作为药物使用。本发明还涉及根据本发明的pd-l1多肽或多核苷酸，用于治疗和/或预防患有脓毒症患者的器官衰竭，用于治疗免疫紊乱优选狼疮，和/或用于免疫肿瘤学治疗。
38.如本文所用，术语“治疗”是指改善或治愈疾病或至少一种与之相关的症状。因此，如果疾病或至少与之相关的症状得到改善或治愈，则治疗应被视为有效。可以理解，治疗可能并非对所有受试者都有效。然而，根据本发明，设想治疗将优选地至少在待治疗的受试者的统计显著部分中有效。如何确定可有效治疗的受试者的统计显著部分是技术人员众所周知的。本领域技术人员可以使用各种众所周知的统计评估工具，例如，确定置信区间、p值确定、student’s t检验、mann-whitney检验等，来确定部分是否具有统计显著性，而无需进一步处理。详细信息见dowdy and wearden,statistics for research,john wiley&sons,纽约1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选
为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，本发明设想的概率允许有效治疗的发现对给定群组或人群中至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的受试者是正确的。
39.如本文所用，术语“预防”是指避免疾病或至少一种与之相关的症状的发生，或预防疾病或该至少一种症状的恶化。本文提到的预防通常可以在药物施用期间实现。然而，如果停止施用药物，预防可能不会持续无限的时间，但在应用药物后的某个预防时间窗内可能持续存在。通常，根据本发明的预防时间窗可以是至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天。然而，预防时间窗也可能取决于药物剂量以及施用方式或制剂种类。例如，如果应用高剂量，通常可以实现更长的预防时间窗。如果施用药物缓释制剂或通过不会导致药物在受试者体内的立即代谢的途径施用药物，也同样如此。在这种情况下，预防时间窗口可能会增加到几周、几个月甚至几年。可以理解，预防可能并非对所有受试者都有效。然而，根据本发明，设想预防优选至少在受试者的统计显著部分中有效。如何确定可有效预防的受试者的统计显著部分是技术人员众所周知的。如上文所讨论的，所属领域的技术人员可以使用各种众所周知的统计评估工具来确定部分是否具有统计显著性，而无需进一步处理。
40.由于根据本发明的pd-l1多肽将用于医学治疗，因此优选将其配制为药物。本发明意义上的药物优选指药物组合物，其包含根据本发明的生物活性pd-l1多肽或编码生物活性pd-l1多肽的表达构建体作为药物活性化合物、以及一种或多种其他成分如一种或几种药物上可接受的载体。药物活性化合物可以以液体或冻干形式存在。例如，药物活性化合物可与甘油和/或蛋白质稳定剂(例如，人血清白蛋白)一起存在。药物通常是全身施用，优选是静脉内或肌肉内施用。然而，根据制剂的性质和所需的治疗应用，药物也可以通过其他途径施用。药物活性化合物是药物的活性成分或药物，并且优选以通过按照常规程序将药物与标准药物载体结合而制备的常规剂型施用。这些程序可能涉及混合、制粒和压缩，或溶解所需制剂的所需成分。应了解，药物上可接受载体或稀释剂的形式和特征由与其结合的活性成分的量、施用途径和其他众所周知的变量决定。在与制剂的其他成分相容且对受体无害的意义上，载体必须是可接受的。所使用的药物载体可以包括固体、凝胶或液体。示例性的固体载体的为乳糖、白土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸类。示例性的液体载体是磷酸盐缓冲盐水溶液、糖浆、油、水、乳液、各种类型的润湿剂等。类似地，载体或稀释剂可包括本领域熟知的延时材料，例如单独的甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯或者与蜡一起。该合适的载体包含上述载体和本领域熟知的其他载体，参见例如remington
′
s pharmaceutical sciences,mack publishing company,easton,pennsylvania。选择稀释剂以不影响组合的生物活性。这种稀释剂的实例有蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和汉克氏溶液。此外，药物组合物或制剂还可以包括其他载体、佐剂或无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。本文提到的药物优选地至少施用一次，例如作为药丸施用。然而，该药物可施用一次以上且优选至少两次，例如在规定时间窗口后永久或定期施用。
41.治疗有效剂量是指pd-l1多肽或编码pd-l1多肽的表达构建体在药物中使用的量，所述药物预防、改善或治愈伴随本说明书提到的疾病或病症的症状。药物的治疗功效和毒性可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定，例如ed50(对50％的群体治疗有效的剂量)和ld50(对50％的群体致死的剂量)。治疗效果和毒性效果之间的剂量比
是治疗指标，它可以表示为比率，ld50/ed50。剂量方案将由主治医生和临床因素决定。如医学领域众所周知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型大小、年龄、施用药物的特定配方、性别、施用时间和施用途径、总体健康状况以及同时施用的其他药物。可以通过定期评估来监测进展。处方医师或用户说明书中应注明剂量建议，以便根据所考虑的接受者来预测剂量调整。
42.根据本发明的药物在本发明的另一方面进一步可以包含除上述化合物之外的药物，这些药物在其配制期间添加。优选地，根据本发明的药物活性化合物将与至少一种进一步的药物一起应用，因此，可以与这些其他药物一起配制为药物。更优选地，该至少一种进一步的药物选自下组：抗生素、血管升压剂、类固醇、抗凝血剂、抗血栓形成剂、促炎细胞因子和damp抑制剂。此外，应当理解，药物组合物的配制优选在gmp标准化条件等下进行，以确保药物的质量、药物安全性和有效性。
43.如本文所用，术语“器官衰竭”是指器官的任何功能障碍，其影响器官的生理预期功能的程度，使得正常的体内稳态即无法维持，也无法内源性补偿。器官衰竭可能是急性或慢性的。与器官衰竭相关的症状(取决于受影响的器官)，通常通过受试者的病理生理学变得明显，可以通过例如临床或生化参数来确定。器官衰竭的症状在本领域也是众所周知的，在医学教科书中也有描述。优选地，本文提到的器官衰竭是多器官衰竭。多器官衰竭的特征是在短时间内两个或多个器官同时或相继衰竭。它通常是严重感染或炎症反应如全身炎症反应综合征(sirs)或脓毒症的结果。sirs或脓毒症期间衰竭的典型器官有肺、肾、心脏和/或整个循环系统、胃肠系统，特别是肝脏，以及神经系统。优选地，本文提到的多器官衰竭是由自身反应性细胞毒性细胞引起的，更优选是cd8细胞毒性t细胞依赖性多器官衰竭。同样优选地，本文提到的器官衰竭是肝衰竭，尤其是脓毒症患者的肝衰竭。
44.如本文所用，术语“受试者”是指任何种类的动物，包括哺乳动物、鸟类、鱼类或爬行动物。然而，通常情况下，动物是哺乳动物，例如用作宠物的哺乳动物包括狗、猫、马或啮齿动物，实验室动物例如大鼠、小鼠或猿，或农场动物例如猪、牛、山羊或绵羊。更优选地，哺乳动物是灵长类动物，最优选是人类。根据本发明的受试者优选已知或怀疑患有脓毒症或预期会发展为脓毒症；因此，受试者优选地显示出至少一种或多种病理变化，例如临床上明显的症状或通常与脓毒症相关的生理或分子参数的变化。优选地，已知或怀疑受试者患有免疫疾病，优选狼疮。同样优选地，已知或怀疑受试者需要免疫肿瘤学治疗。
45.如本文所用，术语“脓毒症”是指影响整个生物体的炎症反应。与脓毒症相关的典型症状是本领域众所周知的，并描述在标准医学教科书中。这些症状包括体温显著改变(低温或发热)、呼吸急促、心动过速、由于外周血管阻力降低导致的低血压、精神错乱和水肿形成。生化参数如凝血功能障碍或代谢性酸中毒也是脓毒症的典型症状。脓毒症优选由细菌、病毒、寄生虫或真菌的严重感染引起。此外，有一些共同的因素影响脓毒症的发病或结果，如糖尿病或癌症。优选地，本文提到的脓毒症的特征在于存在两种或更多种响应于感染的下述症状：异常温度(优选低于36℃或高于38℃)、异常心率(优选高于90次/分钟)、异常呼吸频率(优选超过20次呼吸/分钟)或异常血液气体成分(优选co2小于4.3kpa)、和异常白血球数(优选小于4x109/l或大于12x109/l.或组织学上存在带状嗜中性粒细胞)。
46.术语“免疫紊乱”被本领域技术人员理解为涉及攻击发生免疫反应的受试者的细胞类型、组织和/或器官的免疫反应相关的任何紊乱。免疫紊乱优选由同种免疫反应引起或
加重；因此，免疫紊乱优选涉及宿主免疫系统针对外来组织或器官的免疫反应，特别是器官移植排斥，和/或涉及外来免疫系统针对宿主组织或器官的免疫反应，特别是移植物抗宿主病。优选地，免疫紊乱是由自身免疫反应引起或加重的，即是免疫紊乱；因此，免疫紊乱优选是其中t细胞(优选cd8 t细胞)在缺乏外源刺激的情况下溶解受试者的自体细胞和/或引起炎症反应的紊乱。优选地，自身免疫性疾病是红斑狼疮(狼疮)。
47.技术人员也理解术语“免疫肿瘤学治疗”。术语优选涉及通过调节受试者的免疫反应来治疗癌症。该调节可能诱导、增强或抑制该免疫反应。
48.本发明还涉及包含根据本发明的pd-l1多肽、根据本发明的多核苷酸和/或根据本发明的载体的宿主细胞。
49.如本文所用，术语“宿主细胞”涉及能够接收、优选维持和/或表达本发明的pd-l1多肽、多核苷酸和/或载体的任何细胞。更优选地，宿主细胞能够表达本文所述在该多核苷酸和/或载体上编码的pd-l1多肽。优选地，细胞是细菌细胞，更优选是本领域已知的普通实验室细菌菌株细胞，最优选是埃希氏杆菌菌株，特别是大肠杆菌菌株。同样优选地，宿主细胞是真核细胞，优选是酵母细胞，例如面包酵母菌株细胞，或是动物细胞。更优选地，宿主细胞是昆虫细胞或哺乳动物细胞，优选来自如上所述的哺乳动物受试者，尤其是小鼠或大鼠细胞。最优选地，宿主细胞是人类细胞。然而，也设想宿主细胞是植物细胞。
50.本发明还涉及一种非人类转基因生物体，其包含本发明的宿主细胞、根据本发明的pd-l1多肽、根据本发明的多核苷酸和/或根据本发明的载体。
51.所用术语“非人类转基因生物体”涉及任何多细胞生物，尤其包括除人以外的植物和动物。优选地，非人类转基因生物体是受试者，优选如上所述哺乳动物受试者，但不是人类受试者。同样优选地，受试者是植物，优选单子叶植物或双子叶植物。
52.本发明还涉及制备根据权利要求任一项所述pd-l1多肽的方法，其包括：
53.(i)在宿主细胞中表达根据本发明的多核苷酸；和
54.(ii)获得pd-l1多肽。
55.本发明进一步涉及通过上述方法获得的pd-l1多肽。
56.制备pd-l1多肽的方法优选为体外方法。优选地，方法在gmp和/或glp条件下进行。此外，该方法可包括进一步的步骤，例如，在步骤(i)之前提供包括合适表达构建体的宿主细胞的步骤，和/或一个或多个用于纯化pd-l1多肽的纯化步骤。此外，自动化设备可协助或执行一个或多个步骤。
57.本发明还提供治疗和/或预防受试者器官衰竭的方法，特别是治疗患有脓毒症的受试者的器官衰竭的方法，该方法包括(a)向该受试者施用治疗有效量的pd-l1多肽或(b)施用治疗有效量的编码该pd-l1多肽的多核苷酸。
58.上文描述了关于器官衰竭类型、待治疗的受试者、脓毒症和融合多肽或多核苷酸的本发明的典型方面，并进行必要的修正以应用于本发明治疗和/或预防受试者器官衰竭的方法。优选地，方法包括在施用融合多肽或编码其的多核苷酸之前通过确定脓毒症的存在来识别待治疗的受试者。
59.同样优选地，方法包括在施用融合多肽后监测受试者的器官衰竭迹象，如果必要，再次或以不同剂量施用融合多肽或编码其的多核苷酸。
60.鉴于上述情况，特别设想了以下实施方案：
61.1.一种pd-l1多肽，其包含至少一个与seq id no:8具有至少70％同一性的第一氨基酸序列，以及至少一个与seq id no:10具有至少70％同一性的第二序列，其中，所述多肽在下述至少一个位置处携带氨基酸取代：v54、y56、q63、q66、v68、a69、p76、i115、a121、d122、y123、k124和r125，其中，如果所述多肽在位置y56、c113或i115处包含氨基酸取代，则所述多肽携带至少一个进一步的上述取代；其中所述氨基酸位置是基于小鼠pd-l1的氨基酸序列(seq id no:6)。
62.2.一种pd-l1多肽，其包含至少一个与seq id no:8具有至少70％同一性的第一氨基酸序列，以及至少一个与seq id no:10具有至少70％同一性的第二序列，其中所述多肽至少在氨基酸位置y56和p76处携带氨基酸取代，其中所述氨基酸位置是基于小鼠pd-l1的氨基酸序列(seq id no:6)。
63.3.一种pd-l1多肽，其包含至少一个与seq id no:8具有至少70％同一性的第一氨基酸序列，以及至少一个与seq id no:10具有至少70％同一性的第二序列，其中所述多肽在第一氨基酸序列的下述氨基酸位置中的至少一个位置处携带至少一个氨基酸取代：v54、y56、q63、q66、v68、a69、p76；以及在第二氨基酸序列的下述氨基酸位置中的至少一个位置处携带至少一个氨基酸取代：i115、a121、d122、y123、k124和r125，其中所述氨基酸位置是基于小鼠pd-l1的氨基酸序列(seq id no:6)。
64.4.实施方案1至3中任一个所述的pd-l1多肽，其中该第一氨基酸序列与seq id no:8具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％的同一性，和/或其中该第二氨基酸序列与seq id no:10具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％的同一性。
65.5.实施方案1至4中任一个所述的pd-l1多肽，其中所述多肽包含至少一个选自seq id no:7和seq id no:8的第一氨基酸序列，以及至少一个选自seq id:9和seq id:10的第二序列，包含至少一个该氨基酸取代。
66.6.实施方案1至5中任一个所述的pd-l1多肽，其中该多肽包含与seq id no:5的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，优选地由与seq id no:5的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列组成。
67.7.实施方案1至6中任一个所述的pd-l1多肽，其中该多肽包含与seq id no:5的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％同一性的氨基酸序列，优选地由与seq id no:5的氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％同一性的氨基酸序列组成。
68.8.实施方案1至7中任一个所述的pd-l1多肽，其中该多肽包含seq id no:4或seq id no 5的氨基酸序列，优选地由seq id no:4或seq id no 5的氨基酸序列组成。
69.9.实施方案1至8中任一个所述的pd-l1多肽，其中该多肽在位置p76处包含至少一个的氨基酸取代。
70.10.实施方案1至9中任一个所述的pd-l1多肽，其中所述多肽在第一氨基酸序列的下述氨基酸位置中的至少一个位置处携带至少一个氨基酸取代：v54、y56、q63、q66、v68、a69、p76；以及在第二氨基酸序列的下述氨基酸位置中的至少一个位置处携带至少一个氨基酸取代：i115、a121、d122、y123、k124和r125。
71.11.实施方案1至10中任一个所述的pd-l1多肽，其中所述多肽至少在氨基酸位置y56和p76处携带氨基酸取代。
72.12.实施方案1至11中任一个所述的pd-l1多肽，其中所述pd-l1多肽是pd-l1的变体。
73.13.实施方案1至12中任一个所述的pd-l1多肽，其中所述pd-l1多肽在氨基酸位置c113处携带至少一个进一步的取代。
74.14.实施方案1至13中任一个所述的pd-l1多肽，其中所述pd-l1多肽在氨基酸位置v54、q66、v68、a69和/或i115中的至少一个位置处携带至少一个进一步的取代。
75.15.实施方案1至14中任一个所述的pd-l1多肽，其中(i)该q63取代不是q63n取代，(ii)该a69取代不是a69h取代，(iii)该p76取代不是p76v取代，和/或(iv)该i115取代不是i115m取代。
76.16.实施方案1至16中任一个所述的pd-l1多肽，其中(i)该v54取代是v54l取代，(ii)该y56取代是y56g、y56a、y56d或y56s取代，(iii)该q63取代是q63h取代，(iv)该q66取代是q66r取代，(v)该v68取代是v68e取代，(vi)该a69取代是a69t或a69s取代，(vii)该p76取代是p76f或p76h取代，和/或(viii)该i115取代是i115l取代。
77.17.实施方案1至16中任一个所述的pd-l1多肽，其中该多肽包含下述取代：(i)y56s、p76f和i115l；(ii)v54l、y56d、q66r、v68e、a69s和p76h；(iii)y56g、q63h、p76f和i15l；(iv)y56a、q63h、a69t和p76f；或(v)y56a、q63h和p76h。
78.18.实施方案1至17中任一个所述的pd-l1多肽，其中所述pd-l1多肽包含如seq id no:16至seq id no:20中所示的任何一个氨基酸序列，优选地由如seq id no:16至seq id no:20中所示的任何一个氨基酸序列组成；优选地，其中所述pd-l1多肽包含如seq id no:16或seq id no:17所示的氨基酸序列，优选地由如seq id no:16或seq id no:17所示的氨基酸序列组成。
79.19.实施方案1至18中任一个所述的pd-l1多肽，其中所述pd-l1多肽包含在融合多肽和/或多肽复合物中。
80.20.实施方案1至19中任一个所述的pd-l1多肽，其中该融合多肽进一步包含至少一种延长所述融合多肽体内半衰期的多肽
81.21.实施方案1至20中任一个所述的pd-l1多肽，其中该融合多肽进一步包含至少一个抗体片段和/或卵清蛋白或其片段；优选地，其中该融合多肽进一步包含免疫球蛋白的fc片段。
82.22.实施方案1至21中任一个所述的pd-l1多肽，其中该多肽包含如seq id no:21或22所示的氨基酸序列，优选地由如seq id no:21或22所示的氨基酸序列组成，优选地由包含seq id no:23或24的核苷酸序列的多核苷酸编码。
83.23.实施方案1至22中任一个所述的pd-l1多肽，其中所述pd-l1多肽还包含能够特异性结合细胞毒性t细胞的部分，优选免疫球蛋白或其片段。
84.24.实施方案23所述的pd-l1多肽，其中该免疫球蛋白是人类igg。
85.25.实施方案1至24中任一个所述的pd-l1多肽，其中能够特异性结合细胞毒性t细胞的该部分选自下组：包括能够结合cd8的mhc-i复合物的部分的多肽、能够结合cd28的cd80的部分、多肽是能够特异结合cd8的抗体或其片段、多肽是能够特异结合cd28的抗体或其片段。
86.26.编码根据实施方案1至25中任一个所述pd-l1多肽的多核苷酸。
87.27.实施方案26所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与如seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少60％同一性的序列，优选地由与如seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少60％同一性的序列组成；优选地，所述多核苷酸包含seq id no:11或seq id no:12的序列，优选地由如seq id no:11或seq id no:12的序列组成。
88.28.实施方案1至25中任一个所述的pd-l1多肽或实施方案26或27所述的多核苷酸，其作药物使用。
89.29.实施方案1至25中任一个所述的pd-l1多肽或实施方案26或27所述的多核苷酸用于治疗和/或预防患有脓毒症的受试者的器官衰竭，用于治疗免疫紊乱优选狼疮，和/或用于免疫肿瘤学治疗。
90.30.根据实施方案29所述的pd-l1多肽或多核苷酸，其中该器官衰竭是cd8细胞毒性t细胞依赖性多器官衰竭和/或由炎症反应引起，优选地由全身炎症反应综合征(sirs)或脓毒症引起。
91.31.根据实施方案29或30所述的pd-l1多肽或多核苷酸，其中该受试者是哺乳动物，优选人类。
92.32.根据实施方案29至31中任一个所述的pd-l1多肽或多核苷酸，其中该多肽或多核苷酸在施用后抑制受试者中脓毒症诱导的细胞毒性t细胞。
93.33.根据实施方案29至32中任一个所述的pd-l1多肽或多核苷酸，其中该pd-l1多肽或该多核苷酸在施用后诱导受试者细胞毒性t细胞对脓毒症引起的激活的持久耐受性。
94.34.一种载体，其包含实施方案26或27所述的多核苷酸。
95.35.一种宿主细胞，其包含实施方案1至26中任一个所述的pd-l1多肽、实施方案26或27所述的多核苷酸和/或实施方案34所述的载体。
96.36.一种非人类转基因生物体，其包含实施方案35所述的宿主细胞、实施方案1至26中任一个所述的pd-l1多肽、实施方案26或27所述的多核苷酸和/或实施方案34所述的载体。
97.37.制备根据实施方案中任一项所述的pd-l1多肽的方法，包括：
98.(i)在宿主细胞中表达实施方案26或27所述的多核苷酸；和
99.(ii)获得所述pd-l1多肽。
100.38.通过实施方案37的方法获得的pd-l1多肽。
101.本说明书中引用的所有参考文献均以引用方式以其全部公开内容以及本说明书中特别提到的公开内容并入本说明书中。
附图说明
102.图1：竞争性噬菌体elisa。在噬菌体上展示5种pd-l1变体(214、243、291、246和258)和未修饰的pd-l1野生型(wt)，并测试其与表面固定化的pd-1(黑色)的结合。在类似的实验中，与溶液中的50nm(深灰色)或500nm(浅灰色)的pd-1竞争，以近似计算结合亲和力。记录的信号对应于450nm处的光密度(od)。
103.图2:pd-l1变体0258与pd-l1 ig可变结构域(pdb:3bik)的结构比较。(a)克隆0258(右侧图)中已突变的野生型pd-l1(左侧图)中的氨基酸位置的并排比较。氨基酸显示为棒状。(b)结构排列表明相同的结构构象。(c)-(e)野生型(wt)pd-l1(c)和两个指定的工程化
pd-l1变体(d，e)的代表性生物层干涉感应图。原始数据(粗线)使用1:1朗缪尔(langmuir)相互作用模型(细线)进行拟合。
104.图3:pd-l1野生型和两个工程化变体(214和258)远端ig样结构域gst融合的下拉实验。细菌表达的gst融合物被固定在谷胱甘肽珠上，并与稳定表达鼠pd-1-egfp构建体的jurkat细胞的细胞裂解液孵育。wb
–
蛋白印迹(western blot)。
105.图4:pd-l1的ig样v型结构域的fc融合蛋白。(a)纯化的pd-l1-fc融合蛋白的sds-page分析。从左至右：非还原的即野生型(wt)(200)的二硫键连接的二聚体(78kda)和还原的单体(39kda)以及两个工程化的pd-l1变体(214和258)。(b)pd-l1 fc融合蛋白二硫键连接的二聚体的结构域排列。
106.图5：重组pd-l1-fc嵌合体预防ctl依赖性细胞毒性。以hepa1-6细胞为靶细胞，以衍生自ot-i小鼠的cd8 t细胞为效应细胞，确定了细胞毒性t细胞依赖性的肝细胞杀伤。celltrackerorange染色的hepa1-6细胞用ova257-264肽脉冲处理2小时。然后，经hepa1-6细胞与衍生自ot-i小鼠脾脏的富集cd8 t细胞以5:1(效应细胞：靶细胞)的比例共同培养。同时，以指定浓度添加重组pd-l1-fc嵌合体(wt、214和258)。通过facs分析检测存活的靶细胞数量。提供了四个独立实验的数据。数据表示平均值
±
标准差(sd)(*p《0.05，**p《0.01)。
107.图6：mlr期间phi258对细胞参数的影响。从四个buffy coats分离出pbmc，并在第0天，在添加或不添加不同浓度(50ng/ml
–
50μg/ml)的phi258的情况下，将两个供体(每个供体2x105)的pbmcs在t细胞培养基中共培养6天。然后，通过流式细胞仪分析细胞。(a，b)cd4 (a)和cd8 (b)t细胞上pd-1的表达。(c)总细胞群中的活细胞。(d)cd127
low cd25
high
调节性t细胞(t regs)与总cd4 t细胞。显示了单个数据点和平均值
±
sem。邓恩多重比较试验。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
108.图7：phi258对mlr期间细胞因子产生的影响。从四个buffy coats分离出pbmcs，并在第0天，在添加或不添加不同浓度(50ng/ml
–
50μg/ml)的phi258的情况下，将两个供体(每个供体2x105)的pbmcs在t细胞培养基中共培养6天。第6天用流式细胞仪珠阵列分析上清液中的细胞因子水平。显示了单个数据点和平均值
±
sem。邓恩多重比较试验。*p《0.05；**p《0.01。
109.图8：mlr期间phi258与phi200(野生型)的比较。从四个buffy coats分离出pbmcs，并在第0天，在添加或不添加phi258或phi200(每个10μg/ml)的情况下，将两个供体(每个供体2x105)的pbmcs在t细胞培养基中共培养6天。(a)通过流式细胞仪珠阵列分析上清液中的细胞因子水平，并通过facs测定总细胞群中的活细胞。显示了单个数据点和平均值
±
sem。邓恩多重比较试验。**p《0.01；***p《0.001。
实施例
110.本发明将只是通过以下实例进行说明。无论如何，上述实施例不得以限制本发明范围的方式进行解释。
111.实施例1
112.构建了展示在丝状噬菌体m13表面的2x109个pd-l1突变体的文库。使用野生型pd-1和pd-l1晶体复合物的公开结构为指导，我们仅设计了pd-l1的远端ig样结构域(鼠pd-l1上的18-132个氨基酸)，并且为了提高展示水平，我们在构建文库之前在鼠pd-ll部分额外
引入了c113r突变。根据晶体结构，我们选择了pd-l1的14个氨基酸残基进行随机化，这些残基埋藏在界面中并与pd-1进行侧链接触。
113.使用具有c83s取代的重组鼠pd-1蛋白(31-150个氨基酸)作为抗原进行噬菌体筛选，重组鼠pd-1蛋白与avitag肽融合，在体内生物素化并从大肠杆菌中纯化。经过几轮筛选后，用elisa分析富集的噬菌体克隆的结合，并对筛选的pd-l1变体进行测序。在竞争性噬菌体ic
50 elisa中，通过在含有pd-1-fc的溶液中与500nm或50nm竞争，检测了5个pd-l1变体的结合特性(图1)。选择所有5个克隆进行进一步的表征，并在大肠杆菌中表达为his标签融合体。筛选的变体的序列及其对pd-1-fc的亲和力(通过octet装置上的生物层干涉法(bli)测量)表明，与以同一格式表达的pd-l1 wt相比，变体214和258在与表面固定化的鼠pd-1fc结合方面具有多达30倍的优势。
114.表1和表2显示了筛选的pd-l1变体的氨基酸序列和亲和力。氨基酸位点54、56、63、66、68、69、76、113、115和121-125被随机化。对于筛选的变体，短横线代表相对于野生型序列，氨基酸没有变化。通过生物层干涉法获得变体与鼠pd-1相互作用的kd值；n/a
–
没有得到。表2显示r113，因为如上所述，鼠序列的原始c113在构建文库之前已经被取代。
115.表1
[0116][0117]
表2
[0118][0119]
进一步分析了克隆0258(以下也称为phi258)和0214。这两种变体的代表性bli感应图如图2所示。克隆0258与pd-l1 ig样可变结构域的结构叠加的低rmsd值表明突变不改变天然构象。这一结果表明，，亲和力的增加是由于分子内接触的优化，而不是由于克隆0258与pd-1的结合拓扑相对于未修饰的pd-l1 ig样可变结构域的变化(图2a、b、c)。此外，使用稳定表达鼠pd-1-egfp融合构建体的jurkat细胞裂解物，我们使用wt pd-l1和变体0214及0258进行了下拉分析。这两个工程化变体与pd-1-egfp的相互作用比野生型构建体或gst对照更强烈(图3)。
[0120]
同时，我们克隆并表达了pd-l1变体，作为与人fc的融合蛋白，用于在哺乳动物细
胞中表达。pd-l1wt和pd-l1变体作为fc融合蛋白的建立提高了后续体内实验中的高生物利用度。此外，哺乳动物的表达系统允许以比细菌更好的产率优化分子内二硫键的形成。
[0121]
在表达和纯化fc融合蛋白后，在蛋白a柱上的一步纯化，我们获得了良好纯度和200mg/l expi293f培养物的平均产量(图4)。为了验证纯化蛋白是否仍与pd-1结合，我们像以前一样确定了pd-1/pd-l1的亲和力。由于fc融合体的二聚化引起的结合亲和力，变体的亲和力显示结合分别从2.54和2.14nm增加到88和77pm。在类似的实验中，我们观察到对野生型蛋白的亲和力约为600pm，表明pd-l1变体在体外对pd-1的亲和力提高了约8倍。
[0122]
我们通过检测变体和wt对照存在下的t细胞的细胞毒性，验证了pd-l1-fc融合蛋白的免疫抑制作用。细胞毒性t细胞衍生自ot-i小鼠，其对mhc在小鼠细胞表面呈递的卵清蛋白衍生的肽敏感。为了诱导t细胞活性，用卵清蛋白对小鼠衍生的肝细胞系hepa1进行脉冲处理，并通过facs监测细胞死亡来测量细胞毒性(图5)。
[0123]
实施例2
[0124]
为了分析phi258(即上文所述的pd-l1变异体258)对人类环境中同种异体淋巴细胞激活的影响，我们使用来自健康匿名人类献血者的血沉棕黄层(buffy coats)的pbmcs进行了混合淋巴细胞反应(mlr)分析。将两个供体的pbmcs各自混合并在添加或不添加不同浓度(50ng/ml
–
50μg/ml)的phi258的t细胞生长培养基中维持长达6天，。
[0125]
首先，在第6天通过流式细胞仪分析细胞，以确定cd4 和cd8 t细胞上pd-1的表达。即使在极低剂量下与phi258孵育也会强烈干扰两种t细胞亚群表面pd-1的检测(图6a、b)，表明pd-1结合与facs抗体存在竞争或pd-1内化。接下来，确定活细胞的比例作为mlr的函数。phi258在浓度》5μg/ml时显著增加活细胞数量(图6c)。因此，phi258可能阻止了mlr期间的细胞杀伤。如图6d中调节性t细胞的示例性显示，相对细胞组成没有改变。
[0126]
接下来，通过流式细胞珠阵列测定mlr期间指示白细胞激活的细胞因子产生。phi258在浓度》5μg/ml时显著抑制促炎细胞因子ifn-γ和tnf-α的分泌，而在较低浓度时的效果更参差(图7)。重要的是，phi258没有抑制抗炎细胞因子il-10的产生(图7)。
[0127]
pd-1在t细胞激活后被上调，这发生在t细胞激活后约3天。为了分析pd-1的表达是phi258发挥作用所需要的，比较了mlr期间第3天和第6天的ifn-γ水平。此外，未修饰的pd-l1(phi200)用作对照。在第3天，phi258或phi200都不影响ifn-γ水平。然而，phi258(而非phi200)在第6天强烈抑制了ifn-γ的水平(图8a)。与其在限制炎性细胞因子生成方面缺乏功效相对应，phi200也不影响mlr培养物中的细胞活力，这与phi258相反(图8b)。
[0128]
总之，phi258在mlr培养物中与人类t细胞上的pd-1高效结合，并抑制炎症细胞因子水平和细胞杀伤，但不抑制抗炎特征如il-10表达和调节性t细胞水平。
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