microbiology,19,291:144-150,2018；caì等,viruses,20；10(11),2018)。8.在酵母和哺乳动物细胞系统二者中，还将gfp蛋白用作用于肽展示或甚至肽文库的框架(kamb等,proc.natl.acadsci.usa,95:7508-7513,1998；wo2004005322)。作为用于随机肽的展示的框架蛋白的gfp蛋白可用于定义肽文库的特性。9.新gfp变体的开发中的进展寻求实现蛋白质的性质中的改进，以产生用于广泛研究目的的新试剂。通过突变，开发了新形式的gfp，其包含为了在人细胞系统中提高的生产而优化的dna序列，即，人源化gfp蛋白(cormack,等,gene173,33-38,1996；haas,等,currentbiology6,315-324,1996；yang,等,核酸sresearch24,4592-4593,1996)。10.在这些形式之一中，描述了增强型绿色荧光蛋白，“enhancedgreenfluorescentprotein”(egfp)(heim&cubitt,nature,373,pp.663-664,1995)11.起源于刺胞动物水母(维多利亚多管发光水母)的、由gfp10基因编码的gfp是238个氨基酸的蛋白质。所述蛋白质具有吸收蓝光(具有395nm处的主激发峰)并从蛋白质的中心中的生色团发射绿光(509nm处的主发射峰)的能力(morin&hastings,journalcellphysiology,77(3):313-8,1971；prasher等,gene15,111(2):229-33,1992)。生色团由六肽构成，起始于氨基酸64，通过丝氨酸、酪氨酸和甘氨酸(位置65、66和67处)的环化和氧化而由一级氨基酸序列衍生(shimomura,104(2),1979；cody等,biochemistry,32(5):1212-8,1993)。由gfp发射的光不依赖于表达它的细胞生物学物种并且不需要来自维多利亚多管发光水母的任何种类的底物、辅因子或其它基因产物(chalfie等,science,263(5148):802-5,1994)。gfp的这一性质允许其荧光在维多利亚多管发光水母以外的其它活细胞中被检测到，这是由于其可在细胞的蛋白质表达系统中被加工(ormo等,science273:1392-1395,1996；yang等,naturebiotech14:1246-1251,1996)。12.gfp的基础结构由11条反向平行的折叠的β链组成，所述β链缠绕以形成呈β桶形状的三级结构。每条链通过一个环结构域连接到下一条链，该环结构域投射(project)到桶的上、下表面，与环境相互作用。按照惯例，各链和环都可通过编号来识别，以便更好的描述蛋白质。13.定向突变实验显示gfp蛋白的某些生物化学性质由该桶结构引起。因此，一级结构中的氨基酸改变是加速蛋白质折叠、减少翻译产物的聚集、和增加溶液中蛋白质的稳定性的原因。14.特定环移动至蛋白质桶的空腔，形成α螺旋，其是蛋白质的荧光性质的原因(crone等,gfp-basedbiosensors,intech,2013)。蛋白质结构中的一些干预可干扰发射荧光的能力。某些氨基酸中的突变可从荧光发射的强度到波长进行改变，从而改变发光颜色。作为参与荧光生色团的内部残基的tyr66的突变可产生大量的具有改变的生色团或周围环境的结构的荧光蛋白变体。这些改变干扰不同波长下的光的吸收和发射，产生大范围的不同的发光颜色(heim&tsien,currentbiology,6(2):178-82,1996)。15.ph的变化也可干扰荧光强度。在生理学ph下，gfp在395nm处表现最大吸收，而其在475nm处吸收较少的光。然而，将ph提高至约12.0导致最大吸收出现在475nm范围内，而其在395nm处具有减少的吸收(ward等,photochemistryandphotobiology,35(6):803-808,1982)。16.核心蛋白的紧凑结构使gfp即使在例如由蛋白酶处理等不良条件下也高度稳定，使得该蛋白质通常作为报告蛋白而非常有用。17.已存在不同形式的gfp，但总是寻求通过添加新的功能或去除一些限制来改进蛋白质。egfp自身呈现为增强型的，其在面对f64l和s65t氨基酸的修饰时使蛋白质具有更好的灵活性(flexibility)(heim等,nature373:663-664,1995；li等,journalbiologychemistry,272(45):28545-9,1997)。即使当其蛋白质序列中具有异源序列的情况下，该增强允许gfp兼顾实现其预期的三维形状以及其表达荧光的能力(pedelacq等,natbiotechnology,24(1):79-88,2006)。18.gfab是在两个环结构域中接受外源序列的蛋白修饰形式。在其开发中，需要几轮定向进化以选择支持外源肽插入至两个近侧区(proximalregion)(即glu-172-asp-173和asp-102-asp-103)的三种突变的蛋白质克隆。作者使用未突变的蛋白质证明两条外源肽的插入阻止酵母细胞表面上的gfp荧光生产和蛋白质表达。在一系列的突变和选择后，在仅两个区域中的同时插入是可能的，但仍导致极大丧失gfp的固有活性，有时使其插入物的生产或表达变为不可能(pavoor等,pnas106(29):11895-11900,2009)。19.n-和c-末端环状排列的突变还表明，egfp可在编码序列中操作而不影响核心蛋白的结构方面(topell等,febsletters457(2):283-289,1999)。然而，对20种环状排列的蛋白质变体的分析表明了蛋白质对新末端的插入的耐受性(tolerance)低，以及在多数情况下，它们丧失形成生色团的能力。该事实表明，蛋白质序列的操作可强烈干扰其特性或甚至其细胞表达。20.已进行某些尝试以将多个表位同时插入至gfp的环区域，目的在于实现蛋白质用于靶特异性结合反应的用途。然而，鉴于gfp及其生色团的结构敏感性，所有这些努力都显示了有限的成功。21.gfp蛋白的其它突变蛋白显示发射其它类型的荧光光谱的改进形式。例如，heim等(procnatlacadsciusa,91(26):12501-4,1994)描述了通过在氨基酸66处含有组氨酸代替酪氨酸而发射蓝色荧光的突变蛋白。其后，heim等(nature,373(6516):663-4,1995)还描述了突变gfp蛋白，其通过在氨基酸65处由苏氨酸取代丝氨酸而具有类似于获得自海洋动物海肾(renillareniformis)的光谱，每单体的消光系数是来自多管水母属(aequorea)的天然gfp的波长峰的10倍以上。其它专利文献描述了显示例如蓝色、红色等除绿色以外的其它光发射光谱的突变gfp蛋白(us5625048,wo2004005322)。22.此外，其它gfp突变蛋白具有优化的激发光谱，特别地用于某些氩激光流式细胞仪(facs)设备中(us5804387)。仍有修饰以更好地在植物细胞系统中表达的突变gfp蛋白的描述(wo1996027675)。专利文献us5968750提出了已适应于在包括人的哺乳动物细胞中表达的人源化gfp。人源化gfp将用于阅读的偏好密码子(preferentialcodon)整合到人细胞基因表达系统。23.在现有技术中，显然如上述列出的专利文献中可看出，gfp能够在其5’或3’端包含基因而不干扰表达、三维缠结(threedimensionaltangling)、和荧光产生。此外，gfp已用作用于体内肽展示或甚至肽文库的载体。在肽文库的情况中，gfp可协助随机肽的展示，并由此协助定义肽文库的特征(kamb等,proc.natl.acad.sci.usa,95:7508-7513,1998；wo2004005322)。24.例如，abedi等(1998,nucleicacidsres.26:623-300)将肽插入至维多利亚多管发光水母的gfp蛋白中暴露的环的区域中，表明当在酵母和大肠杆菌(escherichiacoli)中表达时，gfp分子保留自体荧光。作者进一步阐明，gfp框架的荧光可用于监测肽的多样性、以及指定细胞中指定肽的存在或表达。然而，与天然gfp相比，gfp框架分子的荧光率相对低。kamb和abedi(us6025485)从增强型绿色荧光蛋白(egfp)制备gfp阵列的文库以增强荧光强度。25.此外，peele等(chem.&bio.8:521-534,2001)在哺乳动物细胞中使用egfp作为框架试验了具有不同结构性偏差的肽文库。anderson等进一步通过将肽插入具有四甘氨酸配体的gfp环以增强荧光强度(us20010003650)。happe等描述了人源化gfp，其可在哺乳动物细胞系统中大量表达，耐受肽插入、并维持自体荧光(wo2004005322)。26.然而，本
技术领域：
：中仍需要不仅展示合适的强度的荧光，并且还在细胞系统中以高水平表达的gfp分子框架。27.gfp分子中，对于肽展示同时保留自体荧光的耐受性存在可变性。因此，现有技术中需要开发可以高水平表达并且耐受插入、同时保留自体荧光的gfp。28.除了在末端处支持基因表达的能力以外，gfp可允许将表位插入至分子暴露于介质的表面环中。已进行多次尝试以将多个肽同时插入至gfp的环区域，可允许将蛋白质用于靶特异性结合反应。然而，鉴于gfp及其生色团的结构敏感性，所有这些努力都具有有限的成功。29.pavoor及其同事努力开发了一种经修饰以在两个环结构域中接受外源序列的蛋白。在该开发中，需要几轮的定向进化以选择支持两个近侧区(即glu-172-asp-173和asp-102-asp-103)中的外源肽的插入的三种突变的蛋白质克隆。作者使用未突变的蛋白质证明两条外源肽的插入阻止酵母细胞表面上的gfp荧光生产和蛋白质表达。在一系列的突变和选择后，在仅两个区域中的同时插入是可能的，但仍导致极大丧失gfp的固有活性，有时使其插入物的生产或表达变为不可能(pavoor等,pnas106(29):11895-11900,2009)。30.abedi等(nucleicacidsresearch26(2):623-30,1998)提出了环区域中的10个蛋白质位置，其中8个位置在β-折叠之间，用于肽表达。嵌合蛋白可用于需要细胞内表达的实验，因此荧光不受干扰性(uninterruptedness)将是限制因素。在该研究中，仅三种嵌合蛋白(其具有氨基酸157-158、172-173和194-195处的插入位点)显示荧光(减弱为原始的四分之一)；和仅两个插入位点(分别地研究)可具有肽而不丧失荧光。文献的作者进一步得出结论“令人好奇的是，即使在β-折叠中的结构扰动gfp是如何如此敏感的”。31.li等(photochemistryandphotobiology,84(1):111-9,2008)提出了嵌合蛋白(红色荧光蛋白-rfp)的研究，指出在该蛋白质中，六个遗传上不同的位点位于三个不同的环中，在那里可插入五个残基的序列而不干扰蛋白质发荧光的能力。然而，作者并未阐明同时使用这些位点来插入不同的肽。32.专利申请wo02090535提出了在蛋白质的5个不同环中非同时插入肽的荧光gfp。该专利申请在其描述性报告中表明同时在蛋白质的多于一个的环中插入肽的可能性，其增加文库的复杂度并允许在同一表面上展示蛋白质。然而，专利文献未证明该可能性，因为其仅提出了在5个不同的蛋白质环中一次一种的肽插入检验。值得注意的是，文献进一步强调了环1和环5其自身并未呈现为良好的插入位点，这是因为在这些位点处的肽插入阻止蛋白质表达。此外，其它专利文献提出了针对蛋白质环中肽表达的gfp变体，然而，这些研究未证明在gfp蛋白质环中不同插入位点中的多于4种肽的同时表达、而不丧失任何其基本特征的可行性(wo02090535、us2003224412、wo200134824)。技术实现要素：33.为了解决上述提及的问题，本发明将提供显著优点，由于容器蛋白可表达大量的不同的多氨基酸序列，特征在于多价容器蛋白，扩展其用于疫苗组合物目的的用途、用于研究和技术开发或疾病诊断的内参。现有技术中仍然存在开发如下容器蛋白的实际需要，所述容器蛋白不仅表现足够的荧光强度，还可在生产细胞系统中大量表达，此外，耐受多条外源多氨基酸序列的伴随展示同时仍表现可检测的自体荧光。34.在一方面，本发明涉及能够在容器蛋白上多于4个不同位点处同时展示多条外源多氨基酸序列的蛋白质容器。35.在另一方面，本发明涉及能够产生前述蛋白质容器的多核苷酸。36.在另一方面，本发明涉及包含前述多核苷酸的载体。37.在另一方面，本发明涉及包含前述多核苷酸的表达盒。38.在另一方面，本发明涉及用于生产所述蛋白质容器、和用于病原体识别或体外疾病诊断的方法。39.在另一方面，本发明涉及所述蛋白质容器用于诊断目的或作为疫苗组合物的用途。40.在另一方面，本发明涉及用于诊断目的或作为疫苗组合物的包含所述蛋白质容器的试剂盒。附图说明41.图1–通过亲和层析法的platcruzi蛋白的纯化。(a)使用液相层析系统、镍柱上的容器蛋白的洗脱谱。(b)通过收集的13-26洗脱液的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sdspage)的分析。由缓冲液b以升序进行洗脱。pm–分子量标记物。42.图2–通过elisa的、platcruzi与来自who提供的克氏锥虫(trypanosomacruzi)国际标准生物参照的血清的反应性。(a)识别tci株的患者血清的池，称为is09/188。(b)识别tcii株的患者血清的池，称为is09/186。43.图3–使用platcruzi容器蛋白作为抗原、来自患有慢性恰加斯病的患者的血清的抗体滴度的确定。lacens提供血清，500ng/孔的浓度和血清稀释度1:50-1:1000用于elisas。44.图4–针对来自患有不同疾病的患者的血清、通过elisa的platcruzi抗原的表现。以500ng/孔的浓度使用platcruzi抗原并以1:250稀释血清。45.图5–通过兔抗rxrabies2血清的狂犬病病毒特异性表位的检测。由rxrabies2免疫的兔抗体通过rxrabies2亲和层析法纯化并用作一抗，通过免疫印迹法，以检测粗提取物(*；第2列)或1x和0.5x的两个不同浓度下的半纯化提取物(分别地，第4列和第6列)中的rxrabies2。阴性对照：rx容器蛋白(第3列)和platcruzi(以两个浓度：1x和0.5x分别在第5列和第7列中)。46.图6–通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sdspage)的rxhoigg3蛋白的分析。a，不产生rxhoigg3的大肠杆菌的可溶性提取物。b，产生rxhoigg3细菌的水性不溶性部分。c，产生rxhoigg3细菌的可溶性部分。箭头表示rxhoigg3蛋白的位置。47.图7–通过elisa的igm抗rxoro抗体的检测。c-：阴性对照(来自无奥罗普切病毒感染的患者的血清)；c ：用于奥罗普切病毒感染的标准阳性血清。患者：奥罗普切病毒感染的疑似病例。oro ：对于奥罗普切病毒感染为阳性(igm抗rxoro抗体的检测)。oro-(阴性对照)：无对于rxoro的igm反应。蛋白质浓度：0.288μg/μl。截断(cutoff)：0.0613。48.图8–表示platcruzi、rxmayaro_igg和rxmayaro_igm蛋白的生产的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)。第1至8竖列表示：1)分子量；2)无重组蛋白的诱导的总细菌提取物；3)诱导platcruzi生产后的总细菌提取物；4)诱导rxmayaro_igg生产后的总细菌提取物；5)诱导rxmayaro_igm生产后的总细菌提取物；6)诱导platcruzi生产后的不溶性细菌蛋白；7)诱导rxmayaro_igg生产后的不溶性细菌蛋白；8)诱导rxmayaro_igm生产后的不溶性细菌蛋白。箭头指出表示platcruzi(第3列和第6列)、rxmayaro_igg(第4列和第7列)和rxmayaro_igm(第5列和第8列)的条带。49.图9–来自马雅罗病毒阳性患者(smay)和健康个体(sn)的血清的反应性，通过elisa，使用rxmayaro_igg蛋白。由缀合至碱性磷酸酶的抗igg免疫球蛋白进行显色(截断＝0.0210)。50.图10–来自被认为健康(sn)和对马雅罗病毒阳性(smay)的个体的血清的反应性，通过elisa，使用rxmayaro_igm蛋白。由缀合至碱性磷酸酶的抗igm免疫球蛋白进行显色(截断＝0.0547)。51.图11–显示来自platcruzi、txcruzi、rxptx、txneuza、和rxyfigg的不溶性(i)和可溶性(s)蛋白的产量的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)。第1至10列包括：1)诱导产生platcruzi的细菌的不溶性蛋白；2)诱导产生platcruzi的细菌的可溶性蛋白；3)诱导产生txcruzi的细菌的不溶性蛋白；4)诱导产生txcruzi的细菌的可溶性蛋白；5)诱导产生rxptx的细菌的不溶性蛋白；6)诱导产生rxptx的细菌的可溶性蛋白；7)诱导产生txneuza的细菌的不溶性蛋白；8)诱导产生txneuza的细菌的可溶性蛋白；9)诱导产生rxyfigg的细菌的不溶性蛋白；10)诱导产生rxyfigg的细菌的可溶性蛋白。箭头指出表示platcruzi(第1列和第2列)、txcruzi(第3列和第4列)、rxptx(第5列和第6列)、txneuza(第7列和第8列)和rxyfigg(第9列和第10列)的条带。52.图12–具有与来自covid-19阳性患者血清的igm抗体反应的sars-cov-2的多氨基酸的图案化纤维素膜(pictorialcellulosemembrane)，在以棋盘的形式由网格划定的区域中可视化为各种灰色阴影的斑点。各个正方形包括纤维素膜区域的反应斑点，其中以线性形式合成的不同的多肽序列共价结合至膜表面。膜中的物理位置和多氨基酸的序列之间的关系列于表18。组合的多氨基酸序列表示以下的编码序列：刺突蛋白sars-cov-2(s1：aa1-1273，a7-k19)、蛋白orf3a(of3：aa1-275，k22-n2)、膜糖蛋白(m：aa1-222，n5-o23)；orf6(of6：aa1-61，p2-p12)；orf7蛋白(of7：aa1-121，p15-q13)、orf8蛋白(of8：aa1-121，q16-r17)、核衣壳蛋白(n：aa1-419,r20-v17)、包膜蛋白(e：aa1-75，w1-w13)、orf10蛋白区域(of10：aa1-38,w15-w20)。各个多氨基酸具有15个氨基酸的长度和10个氨基酸的相邻、连续的重叠。53.图13–与来自covid19患者血清的igg抗体反应的sars-cov-2的图案化纤维素多氨基酸膜，在以网格的形式划定的区域中可视化为各种灰色阴影的斑点。各个正方形包括纤维素膜区域的反应斑点，其中以线性形式合成的不同的多肽序列共价结合至膜表面。膜中的物理位置和多氨基酸的序列之间的关系列于表19。组合的多氨基酸序列表示以下的编码序列：sars-cov-2orf3a蛋白(orf3：aa1-275，a7-c11)、膜糖蛋白(g：aa1-61，c14-e8)；orf6蛋白(orf6：aa1-61，e11-e21)；orf7蛋白(of7：aa1-121，e24-f22)、orf8蛋白(orf8：aa1-121，g1-g23)、刺突蛋白(s：aa1-1273，h1-r13)、核衣壳蛋白(n：aa1-419，r16-v1)、包膜蛋白(e：aa1-75，w1-w13)、orf10(orf10：aa1-38,w15-w20)。各个多氨基酸具有15个氨基酸的长度和10个氨基酸的相邻、连续的重叠。54.图14–具有与来自covid19患者血清的iga抗体反应的sars-cov-2的多氨基酸的图案化纤维素膜，在以网格图案的形式划定的区域中可视化为各种灰色阴影的斑点。各个正方形包括纤维素膜区的反应斑点，其中以线性形式合成的不同的多肽序列共价结合至膜表面。膜中的物理位置和多氨基酸的序列之间的关系列于表20。这些组合的多氨基酸序列表示以下的编码序列：sars-cov-2的刺突蛋白(s：aa1-1273,a6-k18)、orf3a(orf3：aa1-275,k21-n1)、膜糖蛋白(m：aa1-61,n4-o22)；orf6(orf6：aa1-61,p1-p11)；orf7(orf7：aa1-121,p14-q12)、orf8(orf8：aa1-121,q15-r13)、核衣壳蛋白(n：aa1-419,r16-v1)、包膜蛋白(e：aa1-75,区域v4-v16)、orf10(orf10：aa1-38,v19-v24)。各个多氨基酸具有15个氨基酸的长度和10个氨基酸的相邻、连续的重叠。55.图15–由碱性磷酸酶标记的抗人igm抗体显色的、来自患有covid的患者的血清对纤维素膜上合成的sars-cov-2肽的反应性(图12)。15a，表面糖蛋白；15b，orf3a；15c，膜糖蛋白；15d，orf6；15e，orf7；15f，orf8；15g，核蛋白；15h，e蛋白；15i，orf10。56.图16–由碱性磷酸酶标记的抗人igg抗体显色的、来自患有covid的患者的血清对纤维素膜上合成的sars-cov-2肽的反应性(图13)。16aorf3a；16b：膜糖蛋白；16c：orf6；16d：orf7；16e：orf8；16f：核蛋白；16g：e蛋白；16h：orf10。57.图17–由碱性磷酸酶标记的抗人igg抗体显色的、来自患有covid的患者的血清对纤维素膜上合成的sars-cov-2肽的反应性(图14)。17a，表面糖蛋白；17b，orf3a；17c，膜糖蛋白；17d，orf6；17e，orf7；17forf8；17g，核蛋白；17h，e蛋白；17i，orf10。58.图18–来自住院患者(n＝36)(组3)的血清的elisa，采用支链合成肽(sars-x1-sars-x8)，由抗igm二抗显色。59.图19–来自住院患者(n＝36)的血清的elisa，采用支链合成肽(sars-x1-sars-x8)、由抗igg二抗显色。60.图20–来自住院患者(n＝36)的血清的elisa，采用支链合成肽(sars-x4-sars-x8)、由抗iga二抗显色。61.图21–来自四个患者组(组1：无症状，2：疑似；3：住院，和4：免疫保护)的血清的elisa，采用sars-x3支链合成肽、由抗igm二抗显色。62.图22–来自四个患者组(组1：无症状，2：疑似；3：住院，和4：免疫保护)的血清的elisa，采用sars-x8支链合成肽、由抗igg二抗显色。63.图23–来自四个患者组(组1：无症状，2：疑似；3：住院，和4：免疫保护)的血清的elisa，采用合成肽sars-x7、由抗iga二抗显色。64.图24-对聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)进行电泳表明ag-covid19、具有六个组氨酸的尾的ag-covid19蛋白、tx-sars-igm、tx-sars2-igg、tx-sars2-g/m、tx-sars2-iga、tx-sars2-universal和tx-sars2-g5的生产。第1至10竖列，表示：1)分子量；2)无重组蛋白的诱导的总细菌提取物；3)诱导ag-covid19生产后的总细菌提取物；4)诱导具有六个组氨酸尾的ag-covid19蛋白生产后的总细菌提取物；5)诱导tx-sars2-igm蛋白生产后的总细菌提取物；6)诱导tx-sars2-igg蛋白生产后的总细菌提取物；7)诱导tx-sars2-g/m蛋白生产后的总细菌提取物；8)诱导tx-sars2-iga蛋白生产后的总细菌提取物；9)诱导tx-sars2-universal蛋白生产后的总细菌提取物和10)诱导tx-sars2-g5蛋白生产后的总细菌提取物。表示分子量标准的字母为a)250kda；b)130kda；c)100kda；d)70kda；e)55kda；f)35kda和g)25kda。65.图25-对聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)进行电泳表明通过亲和层析法的ag-covid19蛋白的纯化。(总)诱导生产后的总细菌提取物的谱；(ft)未结合在镍柱上的蛋白质的谱；(200)添加200mm咪唑后的ag-covid19蛋白的洗脱谱；(75)添加75mm咪唑后的ag-covid19蛋白的洗脱谱和(500)添加500mm咪唑后的ag-covid19蛋白的洗脱谱。66.图26-对聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)进行电泳表明通过亲和层析法的tx-sars2-g5蛋白的纯化。(总)诱导生产后的总细菌提取物的谱；(ft)未结合在镍柱上的蛋白质的谱；(200)添加200mm咪唑后的tx-sars2-g5蛋白的洗脱谱；(75)添加75mm咪唑后的tx-sars2-g5蛋白的洗脱谱和(500)添加500mm咪唑后的tx-sars2-g5蛋白的洗脱谱。67.图27–来自感染有疟疾、登革热或sars-cov-2并且仍被收治(住院)、康复、疑似或无症状的七组患者的血清的elisa。作为对照，使用了在流行前收集的来自健康人的血清的集合。ag-covid19蛋白用于elisa并且由抗人igg二抗显色结合抗体。68.图28-来自患有梅毒、疟疾、登革热或者被收治(住院)或疑似的sars-cov2的六组患者的血清的elisa检验。作为对照，使用了在流行前收集的来自健康人的血清的集合。tx-sars2-g5蛋白用于elisa并且由抗人igg二抗显色结合抗体。69.图29–在由ag-covid19蛋白免疫小鼠后2周或4周的小鼠中，针对ag-covid19、通过elisa的抗体滴定。70.图30–使用ag-covid19蛋白的抗体纯化。具体实施方式71.尽管本发明易受到不同实施方案的影响，但优选实施方案示于附图和以下详细讨论中，应理解，本说明书应考虑为本发明的原理的示例并且不旨在限制已在本文中说明和描述的本发明。72.在本文中将使用一些缩写。以下为缩写的列表：73.关于含氮碱基：74.c＝胞嘧啶；a＝腺嘌呤；t＝胸腺嘧啶；g＝鸟嘌呤75.关于氨基酸：76.i＝异亮氨酸；l＝亮氨酸；v＝缬氨酸；f＝苯丙氨酸；m＝甲硫氨酸；c＝半胱氨酸；a＝丙氨酸；g＝甘氨酸；p＝脯氨酸；t＝苏氨酸；s＝丝氨酸；y＝酪氨酸；w＝色氨酸；q＝谷氨酰胺；n＝天冬酰胺；h＝组氨酸；e＝谷氨酸；d＝天冬氨酸；k＝赖氨酸；r＝精氨酸。77.蛋白质容器78.本发明涉及蛋白质容器的生产和在各种方法和组合物中的使用，所述蛋白质容器基于本文中称为gfp的绿色荧光蛋白的序列，所述方法和组合物利用所述蛋白质容器以在多于四个的不同蛋白质位点处同时展示多条不同或相同的外源多氨基酸序列的能力，和进一步地表现充分的荧光强度的能力、在细胞蛋白生产系统中有效表达的能力、和用作用于研究、诊断、或在疫苗组合物中的试剂的能力。79.在第一实施方案中，本发明涉及支持在不同位点处同时插入四条以上的外源多氨基酸序列的稳定蛋白质结构。在另一实施方案中，蛋白质容器包括seqidno:1中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器包括seqidno:3中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器包括seqidno:77中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器在朝向外部环境的蛋白质环中呈现用于外源多氨基酸序列的插入位点。在另一实施方案中，外源多氨基酸序列的同时插入不干扰容器蛋白的生产条件。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列，用于疫苗组合物、用于诊断、或用于实验室试剂的开发。在另一实施方案中，在将外源多氨基酸序列同时插入至容器蛋白的蛋白质环时，外源多氨基酸序列不丧失它们的免疫原性特性。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15和seqidno:16。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:.18中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28和seqidno:29。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:20中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:30的多个拷贝。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:31中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:35、seqidno:36、seqidno:37、seqidno:38、seqidno:39和seqidno:40。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:.33中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:41、seqidno:42、seqidno:43和seqidno:44。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:45中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:47、seqidno:48、seqidno:49和seqidno:50。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:51中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:53、seqidno:54、seqidno:55、seqidno:56、seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59、seqidno:60、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:95和seqidno:96。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:64中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:65、seqidno:66、seqidno:67、seqidno:68、seqidno:69、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72、seqidno:73、seqidno:74和seqidno:97。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:75中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:79、seqidno:80、seqidno:81、seqidno:82、seqidno:83、seqidno:84、seqidno:85、seqidno:86、seqidno:87和seqidno:98。在另一实施方案中，蛋白质容器包含structuralbiology,26:54-61,2014)。84.可进一步体外修饰分离的容器蛋白用于不同用途。85.多核苷酸86.在第一实施方案中，本发明涉及一种多核苷酸，其包含seqidno:2、4、78、17、19、32、34、46、52、63、76、89、91、326-333任一者和它们的简并序列，能够分别地产生由seqidno:1、3、77、18、20、31、33、45、51、64、75、88、90、334-341限定的多肽。87.本发明还提供了通过任何表达系统从dna分子产生的分离的容器蛋白，所述dna分子包括含有编码选择的容器蛋白的核苷酸序列的调控元件。88.就一个或多个氨基酸残基的同一性或位置而言，通过氨基酸的缺失、添加、或取代，编码容器蛋白的dna序列不同于天然存在的gfp的形式的dna序列。但是，它们仍保留天然存在的形式固有的一些或全部特征，例如但不限于，荧光产生、特征三维形状、在不同系统中表达的能力、和接受外源肽的能力。89.编码本发明的容器蛋白的dna序列包括：整合用于通过某些表达系统的表达的偏好密码子；插入用于限制性酶的切割位点；插入用于促进表达载体构建的优化序列；插入增强子(facilitator)序列以包含待引入容器蛋白的选择的多氨基酸序列。所有这些策略在本领域中为已知的。90.此外，本发明进一步提供例如在seqidno:2、seqidno:4和seqidno:78中所描述的序列中添加编码容器蛋白的核苷酸序列的遗传元件。此外，提供了这样的元件，其包含编码容器蛋白的核苷酸序列，所述序列添加编码所选择的外源多氨基酸序列的dna。此类遗传元件包含描述于seqidno:17、seqidno:19、seqidno:32、seqidno:34、seqidno:46、seqidno:52、seqidno:63、seqidno:76、seqidno:89和seqidno:91中的序列。91.容器蛋白表达所需的调控元件包括用于结合至rna聚合酶的启动子序列和用于结合至核糖体的翻译起始序列。例如，细菌表达载体必须包括适合于细胞系统和翻译起始的起始密码子、启动子、shine-dalgarno序列。类似地，真核表达载体包括启动子、起始密码子、下游过程多腺苷酸化信号、和终止密码子。这样的载体可为市售获得的，或从已知的现有技术序列建立的。92.载体93.在第一实施方案中，本发明涉及包含如上所定义的多核苷酸的载体。94.从一个质粒至另一载体的转换可通过添加或删除限制性位点改变核苷酸序列而不修改氨基酸序列来实现，这可通过核酸扩增技术来完成。95.表达盒96.在第一实施方案中，本发明涉及包含如上所定义的多核苷酸的表达盒。97.其它系统中的优化表达可通过改变核苷酸序列以添加或删除限制性位点、并且还优化密码子用于与新表达系统的偏好密码子的比对而不改变最终氨基酸序列来实现。98.细胞99.在第一实施方案中，本发明涉及包含如上所定义的载体或表达盒的细胞。100.本发明进一步提供了含有编码容器蛋白、或添加来自编码所选择的外源多氨基酸序列的dna的容器蛋白的核苷酸序列的细胞，以起到用于容器蛋白的表达系统的作用。细胞可以是细菌、真菌、酵母、昆虫、植物、或甚至动物细胞。可将编码添加自编码所选择的外源多氨基酸序列的dna的容器蛋白的dna序列插入至病毒，所述病毒可用于容器蛋白的表达和生产，作为递送系统，例如杆状病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、甲病毒、疱疹病毒、痘病毒、逆转录病毒、慢病毒，但不限于这些。101.有各种将外源遗传物质引入细胞的方法，全部为现有技术中已知的。例如，外源dna物质可通过磷酸钙沉淀技术而引入至细胞。其它技术可用于本发明的开发，例如使用电穿孔、脂质体转染、显微注射、逆转录病毒载体和诸如腺病毒相关病毒系统等其它病毒载体系统等。102.本发明提供包括至少含有dna分子的细胞的活生物体，所述dna分子包含用于编码容器蛋白的序列的表达的调控元件。本发明可用于脊椎动物、非脊椎动物、植物和微生物中的容器蛋白的生产。103.容器蛋白的表达可在以下中进行，但不限于此：大肠杆菌(escherichiacoli)细胞、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(pichiapastoris)、甲醇毕赤酵母(pichiamethanolica)、博伊丁假丝酵母(candidaboidinii)、安格斯毕赤酵母(pichiaangusta)、哺乳动物细胞如cho细胞、hek293细胞或昆虫细胞如sf9细胞。所有现有技术中已知的原核或真核蛋白表达系统可用于生产容器蛋白。104.在本发明的一个开发中，携带用于容器蛋白的编码序列的病毒或噬菌体可感染特定种类的细菌或真核细胞并在该细胞系统中提供容器蛋白的表达。可通过检测容器蛋白的表达来容易地观察到感染。类似地，携带编码容器蛋白的序列的真核植物或动物细胞病毒可感染特定细胞类型并导致容器蛋白在真核细胞系统中的表达。105.蛋白质容器的生产方法106.在第一实施方案中，本发明涉及生产蛋白质容器的方法，包括将如上定义的多核苷酸引入感兴趣的感受态细胞；进行感受态细胞的培养并进行含有选择的外源多氨基酸的蛋白质容器的分离。在另一实施方案中，蛋白质容器不受到各种外源多氨基酸序列的插入的干扰。107.还可通过多种合成生物系统来生产容器蛋白。全合成基因的产生基本上与现有技术中广泛描述的三种基于连接的合成系统相关。108.本发明提供使用包括以下的蛋白质表达系统的生产容器蛋白的方法：将用于编码容器蛋白的dna序列加上用于编码选择的外源多氨基酸序列的dna引入感兴趣的感受态细胞，在有利于产生含有选择的多氨基酸序列的容器蛋白的条件下培养这些细胞，并分离含有选择的外源多氨基酸的容器蛋白。109.本发明进一步提供生产含有选择的外源多氨基酸的容器蛋白的技术。本发明展示用于表达含有选择的外源多氨基酸的容器蛋白的有效方法，其促进感兴趣的蛋白质的大量生产。可在不同细胞系统中进行容器蛋白的生产方法，例如酵母、植物、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、和转基因动物。可通过将可产生期望的氨基酸序列的密码子优化的核酸序列整合到适用于特定细胞系统的质粒中来使用各个系统。该质粒可包含赋予表达系统许多特性的元件，其包括但不限于，促进保留和复制的序列、可选择的标记物、用于转录的启动子序列、转录的rna的稳定化序列、核糖体结合位点。110.现有技术中已知用于分离表达的蛋白质的方法，并且在该方面，容器蛋白可通过任何技术容易地分离。多组氨酸尾的存在允许在细菌系统中的重组蛋白的表达后，纯化重组蛋白(hochuli等bio/technology6:1321-25；bornhorstandfalke,methodsenzymology326:245-54)。111.本发明进一步考虑了外源多氨基酸的选择(choice)和挑选(selection)。容器蛋白可以包含来自不同来源的不同多氨基酸序列，范围从包括哺乳动物的脊椎动物、无脊椎动物、植物、微生物、或病毒，以促进它们在不同介质中的表达、展示或使用。可使用不同的多氨基酸序列选择方法，例如通过对抗体或其它结合蛋白的结合亲和性的特定选择、或通过表位作图、或现有技术中已知的其它技术。112.多氨基酸序列是5至30个氨基酸的序列，其灵敏地或特异性地表示生物体，用于本技术中所描述的任何目的。多氨基酸序列可表示但不限于，这些实例：(i)线性b细胞表位；(ii)t细胞表位；(iii)中和表位；(iv)对病原体或非病原体来源为特异性的蛋白质区域；(v)邻近通常不是免疫应答的靶标的酶的活性位点的区域。这些表位区域可通过各种方法来识别，包括但不限于：斑点(spot)合成分析、随机肽文库、噬菌体展示、软件分析、使用x射线晶体学数据、表位数据库、或其它现有技术的方法。113.将外源多氨基酸序列在如上限定的位点处插入容器蛋白令人惊讶地不破坏或干扰蛋白质的遗传特性。在容器蛋白中已识别用于外源多氨基酸序列的8个引入位点(kiss等nucleicacidsres34:e132,2006；pavoor等procnatlacadsciusa106:11895-900,2009；abedi等,nucleicacidsres26:623-30,1998；zhong等biomoleng21:67-72,2004)。114.这些引入位点可在同一插入位点处串联地(intandem)包含一个、两个、或更多个不同外源多氨基酸序列，极大地扩大不同多氨基酸序列的表达。115.病原体识别或体外疾病诊断的方法116.在第一实施方案中，本发明涉及用于病原体识别或体外疾病诊断的方法，其特征在于，所述方法使用如上所定义的容器蛋白。在另一实施方案中，所述方法用于诊断恰加斯病、狂犬病、百日咳、黄热病、奥罗普切病毒病毒感染、马雅罗、ige超敏反应、屋尘螨(d.pteronyssinus)过敏、或covid-19。117.蛋白质容器的用途118.在第一实施方案中，本发明涉及所述蛋白质容器作为实验室试剂的用途。在进一步的实施方案中，本发明涉及所述蛋白质容器用于生产用于针对恰加斯病、狂犬病、百日咳、黄热病、奥罗普切病毒病毒感染、马雅罗、ige超敏反应、屋尘螨过敏、或covid-19的免疫的疫苗组合物的用途。119.此外，本发明涉及用于使用基于gfp的单一蛋白质容器的、多种多氨基酸序列的伴随表达的系统，用于不同用途，例如作为用于研究的试剂、用于诊断、或用于疫苗组合物。具体地，所述表达系统可起到有用的研究试剂的作用以通过结合表位来纯化抗体。此外，所述表达系统还可起到用于诊断慢性和传染性疾病的免疫学和/或分子学技术的作用。并且，所述表达系统可有利地用于含有用于动物和人的免疫的多种抗原的疫苗组合物。120.此外，本发明的一个实施方案是使用基于gfp的单一蛋白质容器的、多种多氨基酸序列的伴随生产的方法，用于不同用途，例如作为用于研究的试剂、用于诊断、或用于疫苗组合物。121.本发明进一步展示容器蛋白的某些用途。这些用途包括但不限于，蛋白质容器作为以下的用途：(i)作为细胞筛选检验中的报告分子，包括细胞内检验；(ii)作为用于展示随机或选择的肽文库的蛋白；(iii)作为抗原呈递蛋白，作为用于开发体外免疫学诊断试验的试剂，通常用于传染性、寄生性或其它免疫学疾病；(iv)作为用于选择、捕捉、筛选或纯化例如抗体等结合物质的抗原呈递蛋白；(v)作为用于疫苗组合物的抗原呈递蛋白；(vi)作为含有用于结合抗原的抗体序列的蛋白；(vii)作为具有被动免疫活性的抗原呈递蛋白。122.容器蛋白可通过特别地具有以下来用作疫苗组合物：(a)大量的、同时的免疫应答诱导多氨基酸序列，和(b)非免疫应答诱导核心蛋白的。123.诊断试剂盒124.在第一实施方案，本发明涉及包含如上所定义的蛋白质容器的诊断试剂盒。125.最后，通过下文中给出的实施例详细描述本发明。应强调的是，本发明不限于这些实施例，并且其还包括可开发的范围内的变化和修改。还值得注意的是，对巴西遗传遗产(braziliangeneticheritage)的所有生物序列的授权使用登记在sisgen，注册号ac53976。126.实施例127.实施例1-容器蛋白构建128.绿色荧光蛋白的不同实例之间的氨基酸序列，egfp(genbank:l29345.1；uniprotkb-p42212)、cycle-3(genbank:cah64883.1)、superfolder(genbank:aoh95453.1)、split(cabantous等sciencereports3:2854,2013)、superfast(fisher&delisa.plosone3:e2351,2008)，用于构建本发明的新的蛋白。通过intaglio软件(purgatorydesign,v3.9.4)进行序列比对和比较。自这些数据，进行某些变化使得容器蛋白可实现所需的特性。129.进行改变以产生限制性酶作用位点。设计这些位点的插入，使得可不改变gfp蛋白的物理化学特性，因此不影响本专利申请中所描述的性质或质量。此外，通过允许在基因工程方法和过程中的潜在使用，这些限制性位点的插入将允许这些蛋白的基因操纵，以将各种肽整合到蛋白质的不同区域中，从而向容器蛋白添加进一步的性质。130.操纵gfp蛋白的核苷酸序列以引入或替换核苷酸，从而产生新的限制性酶位点。由此，产生两种新的容器蛋白，“平台(platform)”蛋白和“rx”蛋白。131.基于egfp蛋白的核苷酸序列中的改变，导致容器蛋白中的以下氨基酸变化：[0132]“平台”蛋白[0133]位置16，氨基酸i；[0134]位置28，氨基酸f；[0135]位置30，氨基酸r；[0136]位置39，氨基酸i；[0137]位置43，氨基酸s；[0138]位置72，氨基酸s；[0139]位置99，氨基酸y；[0140]位置105，氨基酸t；[0141]位置111，氨基酸e；[0142]位置124，氨基酸v；[0143]位置128，氨基酸i；[0144]位置145，氨基酸f；[0145]位置153，氨基酸t；[0146]位置163，氨基酸a；[0147]位置166，氨基酸t；[0148]位置167，氨基酸v；[0149]位置171，氨基酸v；[0150]位置205，氨基酸t；[0151]位置206，氨基酸i；[0152]位置208，氨基酸l。[0153]“rx”蛋白[0154]位置16，氨基酸v；[0155]位置28，氨基酸s；[0156]位置30，氨基酸r；[0157]位置39，氨基酸i；[0158]位置43，氨基酸t；[0159]位置72，氨基酸a；[0160]位置99，氨基酸s；[0161]位置105，氨基酸k；[0162]位置111，氨基酸v；[0163]位置124，氨基酸v；[0164]位置128，氨基酸t；[0165]位置145，氨基酸f；[0166]位置153，氨基酸t；[0167]位置163，氨基酸a；[0168]位置166，氨基酸t；[0169]位置167，氨基酸v；[0170]位置171，氨基酸v；[0171]位置205，氨基酸t；[0172]位置206，氨基酸v；[0173]位置208，氨基酸s。[0174]对于所有的容器蛋白，仍可选择以下位置处的可选的氨基酸取代：[0175]位置39，氨基酸n；[0176]位置72，氨基酸s；[0177]位置99，氨基酸s；[0178]位置105，氨基酸y或k；[0179]位置206，氨基酸i；[0180]位置208，氨基酸l。[0181]一些突变的存在可影响蛋白质的生物化学特性。s30r突变正向地影响蛋白质的螺旋特性；y145f和i171v突变防止不期望的中间体的翻译；a206v或i突变降低新生蛋白(nascentprotein)的聚集的可能性。[0182]对容器蛋白“平台”和“rx”进行的其它改变，从包含新的核苷酸密码子至产生新的限制性位点，示于表1(下文)。[0183]表1[0184]氨基酸序列变化取代的核苷酸引入的核苷酸要使用的限制性酶d102_d103insv-gtcaatiig116_d117inst-acckpnil137_g138insk-aagafiiid191_p192insg-ggtrsriie213_k214insl-ctcsaci[0185]此外，容器蛋白“平台”和“rx”的核苷酸序列具有用于ndei和nhei的两个附加的限制性位点，位于蛋白质的5’氨基末端，来自序列catatggtggctagc(seqidno:5)的插入，和用于ecori和xhoi的另两个限制性位点，位于3’羧基末端，来自序列gaattctaatgactcgag(seqidno:6)的插入。此外，位于氨基末端的两个终止密码子和多组氨酸尾已整合到容器蛋白中。[0186]“平台”蛋白的氨基酸序列可示于seqidno:1并且其相应的核苷酸的序列描述于seqidno:2。[0187]“rx”蛋白的氨基酸序列可示于seqidno:3并且其相应的核苷酸的序列描述于seqidno:4。[0188]通过产生限制性位点而不改变原始蛋白质的三维结构，用于外源多氨基酸序列的10个新的插入位点允许出现在蛋白质中。各个新的插入位点将在本文中称为位置1至位置10。[0189]容器蛋白“平台”和“rx”的位置1至10在核苷酸和氨基酸序列中的位置示于表2(下文)。[0190]表2[0191][0192][0193]从不同gfp蛋白的氨基酸序列的比对来看，共有氨基酸序列指定为cgp(dai等proteinengineering,designandselection20(2):69-792007)。尽管表现高稳定性，该荧光蛋白通过定向进化为表现相对于cgp更好的稳定性来得到改进(kiss等proteinengineering,design&selection22(5):313-23,2009)。然而，由于三种突变的存在，增强的蛋白易于聚集。基于其晶体结构的分析，还整合了其它突变，导致聚集的消除和称为热绿色蛋白(thermalgreenprotein)(tgp)的蛋白质的生产(close等proteins83(7):1225-37,2015)。当用作蛋白质容器时，序列称为“tx”。“tx”蛋白的氨基酸序列可示于seqidno:77，并且其对应的核苷酸中的序列描述于seqidno:78。[0194]“tx”容器蛋白的位置1至13的核苷酸和氨基酸序列位置示于表3(下文)。在容器蛋白的氨基和羧基末端，两条多氨基酸序列可在两端连续插入。因此，插入位点1a和1b和13a和13b的特征在于其分别在氨基和羧基末端区域。[0195]表3[0196]蛋白质容器中的位置氨基酸序列中的位置1gahasvikpe2ng3ye4gaplpfs5afpe6edq7gd8nfppngpvmqkk9dg10eggg11kkdvrlpda12dkdyn13rysg[0197]实施例2–platcruzi蛋白的构造[0198]基因工程化“平台”容器蛋白以拥有克氏锥虫表位，本文中我们称其为platcruzi平台。对应于platcruzi蛋白的基因，本文中称为platcruzi基因，描述于核苷酸序列seqidno:17。[0199]考虑对用于恰加斯病的诊断试验的特异性和灵敏度的实验数据，从可获得的现有技术文献选择源自克氏锥虫的多氨基酸序列(peraltajm等jclinmicrobiol32:971-974,1994；houghtonrl等jinfectdis179:1226-1234,1999；thomas等clinexpimmunol123:465-471,2001；rabello等,1999；gruber&zingales,expparasitology,76(1):1-12,1993；lafaille等,molecularbiochemistryparasitology,35(2):127-36,1989)。选择本文中称为tcep1至tcep10的10条多氨基酸序列用于插入至“平台”蛋白中的10个插入位点，示于表4(下文)。[0200]在选择克氏锥虫多氨基酸序列后，通过化学合成、通过连接基因合成方法产生对应于platcruzi蛋白的合成基因并插入至质粒用于实验。对应于包含表位tcep1至tcep10的platcruzi基因的氨基酸序列描述于seqidno:18。[0201]表4[0202][0203]实施例3–platcruzi蛋白的开发[0204]通过现有技术的分子生物学技术、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成基因引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为platcruzi设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化技术、然后测序来分析质粒材料。[0205]使用的测序方法为酶促法、双脱氧法或链终止法，其是基于互补链的酶促合成，互补链的生长通过添加双脱氧核苷酸来停止(sanger等,proceedingnationalacademyofscience,74(12):5463-5467,1977)。该方法由以下步骤组成：测序反应(热循环仪中25个循环中的dna复制)，通过异丙醇/乙醇的dna沉淀，双链的变性(95℃，2分钟)和在abi3730xl自动测序仪(thermofischerscientific)中进行的核苷酸序列的阅读(otto等,.geneticsandmolecularresearch7:861-871,2008)。借助于4peaks程序(nucleobytes；macosx,2004)完成所获得的序列的分析。来自pet-28a载体(t7启动子和t7终止子)的引物用于反应。[0206]将分析的具有platcruzi的正确序列的质粒克隆转移至大肠杆菌菌株bl21以产生platcruzi蛋白。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。将菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在添加有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并维持相同的培养条件另外的3小时。[0207]对培养物进行离心并将沉淀重悬于尿素缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris-base、8m尿素，ph8.0)中。将溶液经histraptm亲和性柱，1ml，gehealthcarelifesciences，进行层析，这允许组氨酸标记的蛋白的高分辨率纯化。以0.5ml每分钟的流动速率将上清液施加至镍亲和性柱(histraptm，1ml，gehealthcarelifesciences)，所述柱先前在缓冲液a(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和5mm咪唑)中平衡。结合后，用10ml的缓冲液a洗涤树脂。以0.7ml/分钟的流动速率在100％梯度的缓冲液b(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和500mm咪唑)中洗脱蛋白45分钟。然后在280nm处对platcruzi纯化(黑线)并示于图1a。咪唑的百分比标记为红色。在约19至25ml的体积中洗脱蛋白。[0208]对重组蛋白的试样(1μg/孔)进行含有sds的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)(laemmli,nature227:680-685,1970)。分别在4％和11％的丙烯酰胺浓度下制备浓缩凝胶(浓缩胶(stackinggel))和分离凝胶(分离胶(runninggel))(表5，下文)。在变性条件下，在62.5mmtris-hcl缓冲液、ph6.8、2％sds、5％β-巯基乙醇、10％甘油中制备样品，并在95℃下煮5分钟(hamesbd,gelelectrophoresisofproteins:apracticalapproach.3.ed.oxford.1998)。电泳后，通过用考马斯亮蓝(comassieblue)r250(bio-rad,usa)染色来检测蛋白。kaleidoscopetmprestainedstandards标记物用作分子量参照(bio-rad,usa)。图1b，显示使用液相层析系统、使用镍-琼脂柱、通过亲和层析法的platcruzi蛋白的纯化。[0209]表5：用于制备4％样品浓缩胶和用于11％分离胶的试剂的体积和浓度[0210][0211]实施例4–自platcruzi的elisa的开发[0212]针对一组参照生物样品和由克氏锥虫感染的个体评价platcruzi蛋白的表现。将在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(50mm，ph9.6)中的platcruzi蛋白以0.1、0.25、0.5和1.0μg/孔的量添加至96孔elisa板中，在4℃下12-18小时。用添加有tween20(pbs-t，10mm磷酸钠-na3po4，150mm氯化钠–nacl和0.05％tween-20，ph7.4)的盐水-磷酸盐缓冲液(pbs)溶液洗涤孔，然后在37℃下用含有5％(重量/体积)脱水脱脂乳的1xpbs缓冲液孵育2小时。[0213]然后用pbs-t缓冲液洗涤孔3次，并在37℃下用2、4、8、16、32和64倍稀释的参照生物样品tcl(is09/188)或tcii(is09/186)(世界卫生组织(worldhealthorganization))孵育1小时。在孵育后，用pbs-t洗涤孔3次，并在37℃下、用以1:5000稀释的碱性磷酸酶标记的人igg抗体孵育1小时。再次用pbs-t洗涤3次并添加底物对硝基苯基磷酸盐(pnpp，1mg/ml，thermofischerscientific)。避光下30分钟后，在elisa读板机中测定405nm下的吸光度。[0214]无论platcruzi的使用量，结果显示使用的tci和tcii参照生物样品的全部稀释度中的令人满意的反应(图2a和2b)。结果强烈支持platcruzi用于识别由六种dtu(离散分型单元(discretetypingunit)或不同分型单元)中任一种导致的克氏锥虫感染的用途，覆盖完整地理范围(geographicrange)的流行(circulating)克氏锥虫株。当使用来自具有低或高抗体检测滴度的恰加斯病患者的血清时，可观察到相同的表现(图3)。[0215]如上所述制备含有500ng的platcruzi(在0.3m尿素中，ph8.0)的elisa板，用pbs-t洗涤3次后，以1:50、1:100、1:250、1:500、1:1000的不同稀释度，采用来自具有高抗克氏锥虫抗体指数的四名患者(6c-ce、9c-ce、15c-ce和12-se)和来自具有低抗克氏锥虫抗体指数的四名患者(3c-pb、6c-pb、16c-pb、和17c-pb)的血清，在37℃下孵育所述elisa板1小时。此后，用pbs-t洗涤孔3次，并用以1:5000稀释的碱性磷酸酶标记的人igg抗体孵育1小时。再次用pbs-t缓冲液洗涤孔3次，并添加底物对硝基苯基磷酸盐(pnpp，1mg/ml，thermofischerscientific)。30分钟后，在elisa读板机中测定405nm下的吸光度。[0216]结果显示，对于具有低抗体滴度的血清，1:50、1:100和1:250稀释度下的阅读信号明确地高于由阴性对照达到的阈值，表明platcruzi平台用于检测高和低抗体患者血清二者中的抗克氏锥虫抗体的潜力。[0217]用于实验目的的患者血清样品的使用由fiocruz的伦理委员会(ethicscommitteeoffiocruz)批准，依据授权书cep/ioc-caae:52892216.8.0000.5248。[0218]实施例5–platcruzielisa的灵敏度和特异性[0219]采用来自诊断为克氏锥虫的患者的71份血清、加上来自诊断为利什曼病(leishmaniasis)(对于克氏锥虫为阴性)的患者的18份血清、诊断为登革热(对于克氏锥虫为阴性)的患者的20份血清、和39份阴性血清(其它传染病和未感染的个体)，以1:250的稀释度，在37℃下孵育elisa板1小时，所述elisa板为在上述实施例中开发的含有500ng的platcruzi(0.3m尿素，ph8.0)的elisa板。其后，对板进行洗涤和抗体标记，如上所述进行显色和阅读过程。[0220]来自接受者操作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲线相关分析，结果指出使用platcruzi平台的优异灵敏度和特异性(图4)。对于先前识别为对克氏锥虫为阳性的血清，未观察到假阴性结果；以及对于已知对克氏锥虫为阴性的其它血清，包括对于其它传染性疾病为阳性的血清，未观察到假阳性。灵敏度和特异性指数二者皆为100％。[0221]实施例6–rxrabies2蛋白的开发[0222]对“rx”蛋白测试其表达来自其它微生物、包括病毒的表位的性能和能力。文献指出大量的特定多氨基酸序列可用作用于中和抗体的靶标。然而，病毒株之间观察到的序列中的小的变化可干扰中和。因此，彻底研究最佳使用的多氨基酸序列需要大量的病毒的生物学以及其与其宿主的相互作用的流行病学的知识。[0223]考虑到对用于诊断由狂犬病病毒导致的疾病的特异性和灵敏度的实验数据，从可获得的现有技术文献选择狂犬病病毒多氨基酸序列(kuzmina等,jantivirantiretrovir5:2:37-43,2013；cai等,microbesinfect12:948-955,2010)。[0224]选择本文中称为raep1至raep10的10条多氨基酸序列用于插入至rx蛋白中的10个插入位点，如下所述。这些多氨基酸序列与rx蛋白的序列的组合产生rxrabies2蛋白。对应于rxrabies2蛋白的基因，本文中称为rxrabies2基因，描述于核苷酸序列seqidno:19。对应于包含多氨基酸序列raep1至raep10的rxrabies2基因的氨基酸序列描述于seqidno:20。[0225]表6[0226]多氨基酸序列蛋白质中的位置原始表位蛋白序列seqidno.raep11抗原位点1cklklcgvlglseqidno.21raep22抗原位点1cklklcgcsglseqidno.22raep33抗原位点1cklklcgvpglseqidno.23raep44-vderglykseqidno.24raep55-wvamqtsnseqidno.25raep66抗原位点iiiksvrtwneiseqidno.26raep88g5抗原位点lhdfhsdseqidno.27raep99g5抗原位点lhdfrsdseqidno.28raep1010g5抗原位点lhdlhsdseqidno.29[0227]已合成包含编码rx蛋白的序列和上表6中所述的编码多氨基酸序列的序列的合成基因。[0228]通过现有技术分子生物学技术、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成基因引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为rxrabies2设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化技术、然后测序技术来分析质粒材料，以与platcruzi中所描述的相同的方法进行。[0229]将分析的具有rxrabies2的正确序列的质粒克隆转移至大肠杆菌菌株bl21以产生rxrabies2蛋白。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在具有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并在37℃下维持相同的培养条件另外的3小时。[0230]对培养物进行离心并将沉淀重悬于尿素缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris-base、8m尿素，ph8.0)中。以0.5ml每分钟的流动速率，将溶液经histraptm亲和性柱，1ml，gehealthcarelifesciences，进行层析，这允许组氨酸标记的蛋白的高分辨率纯化，所述柱先前在缓冲液a(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和5mm咪唑)中平衡。结合后，用10ml的缓冲液a洗涤树脂。以0.7ml/分钟的流动速率在100％梯度的缓冲液b(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和500mm咪唑)中洗脱蛋白45分钟。[0231]在三种不同培养物体积：3、25和50ml中分析rxrabies2生产。如表7(下文中)中所示，rxrabies2的表达为平均123μg/ml。[0232]表7[0233][0234]实施例7–rxrabies2蛋白作为疫苗组合物[0235]如上述实施例中所描述的产生rxrabies2蛋白。将100μg的蛋白悬浮于弗氏不完全佐剂(freud’sincompleteadjuvant)(0.5ml)并肌内接种至两只6月龄雄性新西兰兔的四头肌(quadricep)。在初始接种后7天和14天，用悬浮于pbs中的rx狂犬病蛋白(100μg/0.5ml)再接种兔。[0236]在接种第一剂的疫苗组合物21天后，从动物收集血液。通过离心收集血浆并通过结合吸附至硝化纤维素膜的rx-rabies2蛋白来进行亲和性纯化。[0237]如下文中所述制备含有rx-rabies2蛋白的硝化纤维素膜以从潜在污染物分离rx-rabies2蛋白。电泳后，使用现有技术免疫印迹技术将蛋白质转移至硝化纤维素膜。[0238]11％sds-page凝胶的制备，如上述实施例和表5中所述；[0239]将10μg的rx-rabies2蛋白施加至11％sds-page凝胶(表5)并使其经受100伏特的电泳电流约2小时；[0240]蛋白质至硝化纤维素膜的转移：使用具有转移缓冲液(25mmtrisbase、192mm甘氨酸和20％甲醇)的trans-blotcell(bio-rad,usa)，在100v下1小时，将蛋白质转移至硝化纤维素膜；[0241]用ponceausred(ponceaus0.1％，乙酸5％)染色以确认重组蛋白的存在。[0242]剪切膜以使得特别地获得仅具有rxrabies2蛋白的一块；[0243]然后使膜在蒸馏水中脱色并置于tbs(0.1％)中12至18小时(过夜)；[0244]用封闭液(含有0.05％(v/v)tween20(tbs-t)和5％(w/v)脱脂奶粉的25mmtris-hcl、125mmnaclph7.4(tbs))孵育过夜，然后再次在封闭液中孵育膜1小时，然后用tbs-t洗涤3次每次5分钟，并用tbs再进行3次洗涤每次5分钟。[0245]将来自免疫的兔的血清在tbs中以1:500稀释，然后在搅拌下、将10ml置于与含有rxrabies2蛋白的硝化纤维素膜片段接触1小时，然后用tbs-t洗涤3次每次5分钟，并再次用tbs洗涤3次每次5分钟。然后，通过添加1ml的100mm甘氨酸(ph3.0)来释放特异性结合的抗体。通过添加100μl的1mtris(ph9.0)将溶液的ph升高至7以纯化兔抗体。特异性结合抗原的抗体的纯化在使用这些抗体用于疗法中是重要步骤，因为其允许显著降低待施用的量同时最小化潜在的不良反应。[0246]不同的提取物用于表明产生的兔抗体结合rxrabies2的特异性能力。使用以下：[0247]具有rx蛋白表达的细菌粗提取物，使用如platcruzi中所提及的相同条件获得；[0248]细菌粗提取物中的rxrabies2蛋白，并以1x和0.5x浓度纯化；[0249]1x和0.5x浓度下的纯化的platcruzi蛋白。[0250]如上所述，对潜在配体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(11％sds-page，表5)，然后转移至硝化纤维素膜并进行免疫印迹法，其细节已针对rxrabies2进行了描述。[0251]在搅拌下，用如上所述的纯化的抗rxrabies2血清孵育膜1小时。然后，用tbs-t洗涤3次每次5分钟，再用tbs洗涤3次每次5分钟。其后，用以1:10,000稀释的过氧化物酶与抗兔igg二抗孵育膜1小时。在用二抗孵育后，进行用tbs-t洗涤3次每次5分钟和用tbs洗涤3次每次5分钟。借助于sigmafasttmdabperoxidasesubstratetablet进行显色。[0252]结果显示通过接种rxrabies2产生的兔抗体与含有狂犬病病毒2蛋白的配体的特异性结合。图5显示仅在泳道(lane)2、4、和6中读取条带，其含有rxrabies2蛋白的细菌粗提取物，以及分别为1x浓度和0.5x浓度的纯化和稀释的rxrabies2蛋白。[0253]还可通过泳道3、5和7中的条带的缺失而观察到免疫应答的特异性，包含(i)无表位引入的rx容器蛋白、(ii)分别地1x和0.5x稀释的platcruzi平台。这些结果确证免疫应答限于狂犬病病毒表位，表明rx蛋白自身不是免疫原性的。[0254]实施例8–rxholgg3蛋白的开发[0255]从马免疫球蛋白的多氨基酸序列的作图研究(de-simone等,toxicon78:83-93,2014；wagner等,journalofimmunology173:3230-3242,2004)，鉴定了通过人igg和ige识别的马igg3多氨基酸的序列，其适用于实验室检验以诊断马血清过敏。[0256]将多氨基酸序列dvlftwyvdgtev(seqidno:30)在位置1、5、6、8、9和10处整合到rx蛋白中，产生rxholgg3蛋白。rxholgg3蛋白的氨基酸序列描述于seqidno:31。rxholgg3蛋白的核苷酸序列描述于seqidno:32。合成包含编码rx蛋白的序列和编码如上所述的多氨基酸序列(seqidno:30)的序列的合成基因。[0257]通过现有技术分子生物学技术、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成基因引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为rxhoigg3蛋白设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化技术、然后测序来分析质粒材料，已在platcruzi中详细描述。[0258]将分析的具有rxhoigg3的正确序列的质粒克隆转移至大肠杆菌菌株bl21以产生rxhoigg3蛋白。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在具有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并维持相同的培养条件另外的3小时。[0259]对培养物进行离心并将沉淀重悬于尿素缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris-base、8m尿素，ph8.0)中。使用镍亲和性柱(histraptm，1ml，gehealthcarelifesciences)并以0.5ml每分钟流动，对溶液进行层析，所述柱先前在缓冲液a(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和5mm咪唑)中平衡。结合后，用10ml的缓冲液a洗涤树脂。以0.7ml/分钟的流动速率在100％梯度的缓冲液b(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和500mm咪唑)中洗脱蛋白45分钟。可在11％sds-page电泳(表5)后的洗脱液中证明rxholgg3蛋白的生产。结果示于图6，并且显示rxholgg3作为重组蛋白的表达。在未诱导的可溶性细菌提取物(图6，第1列)未检测到条带，以及在不溶性(第2列)和可溶性(第3列)部分中各自检测到条带。[0260]实施例9–rxoro蛋白的开发[0261]从奥罗普切病毒(oropouchevirus)(株q71mj4和q9j945，uniprot)的多氨基酸序列作图研究(acrani等,journalofgeneralvirology96:513–523,2014tilston-lunel等,journalofgeneralvirology96(pt7):1636–1650,2015)，考虑到它们的诊断潜力，我们从现有技术中可获得的斑点合成或肽微阵列技术选择多氨基酸序列。选择本文中称为orep1至orep7的六条多氨基酸序列用于插入至rx蛋白中的9个插入位点，如下表8中所示：[0262]表8[0263][0264]上述这些多氨基酸序列与rx蛋白的组合产生rxoro蛋白。对应于包含多氨基酸序列orep1至orep6的rxoro基因的氨基酸序列描述于seqidno.33。对应于rxoro蛋白的基因，本文中称为rxoro基因，描述于核苷酸序列seqidno.34。[0265]通过现有技术分子生物学技术、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成rxoro基因引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为rxoro设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化和其后的测序技术来分析质粒材料，如platcruzi中所述。[0266]将分析的具有rxoro蛋白的正确序列的质粒转移至大肠杆菌菌株bl21。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在具有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并维持相同的培养条件另外的3小时。[0267]对培养物进行离心并将沉淀重悬于尿素缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris-base、8m尿素，ph8.0)中。使用镍亲和性柱(histraptm，1ml，gehealthcarelifesciences)并以0.5ml每分钟流动，对溶液进行层析，所述柱先前在缓冲液a(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和5mm咪唑)中平衡。结合后，用10ml的缓冲液a洗涤树脂。以0.7ml/分钟的流动速率在100％梯度的缓冲液b(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和500mm咪唑)中洗脱蛋白45分钟。以三种不同的细菌生长体积检验rxoro生产：3、25和50ml。rxoro的表达水平为平均203μg/ml，结果示于表9。[0268]表9[0269][0270]实施例10–来自rxoro的elisa的开发[0271]自针对一组由奥罗普切病毒感染影响的个体的血清评价rxoro蛋白的性能。将在溶液(0.3m尿素，ph8.0)中的rxoro蛋白以500ng/孔的量添加至96孔elisa板，在4℃下12-18小时。用添加有tween20的盐水-磷酸盐缓冲液(pbs)(pbs-t，10mm磷酸钠-na3po4，150mm氯化钠–nacl和0.05％tween-20，ph7.4)洗涤孔，然后在37℃下用含有5％(重量/体积)脱脂奶粉的1xpbs缓冲液孵育2小时。[0272]然后，用pbs-t缓冲液洗涤孔3次，并在37℃下、用1:100稀释的来自疑似奥罗普切病毒感染的患者的98份血清样品和来自健康患者的51份血清样品孵育1小时。孵育后，用pbs-t洗涤孔3次，然后在37℃下、用以1:5000稀释的碱性磷酸酶标记的人igg抗体孵育1小时。再次用pbs-t缓冲液洗涤孔3次并添加对硝基苯基磷酸盐(pnpp，1mg/ml，thermofischerscientific)。避光下30分钟后，在elisa读板机中测定405nm下的吸光度。[0273]结果指出使用rxoro的优异灵敏度和特异性(图7)。结果强烈支持rxoro用于奥罗普切病毒病毒感染的检测的用途。[0274]用于实验目的的患者血清样品的使用由fiocruz的伦理委员会批准，依据授权书cep/ioc-caae:52892216.8.0000.5248。[0275]实施例11-rxmayaro_igg蛋白的开发[0276]从马雅罗病毒(株q8qz73和q8qz72，uniprot)的多氨基酸序列作图研究(espósito等,genomeannouncement3:e01372-15,2015)，考虑到它们的诊断潜力，我们从可获得的现有技术文献选择多氨基酸序列。选择本文中称为mgep1至mgep4的四条多氨基酸序列用于插入至rx蛋白中的9个插入位点，如下表10中所示：[0277]表10[0278]多氨基酸序列蛋白质中的位置原始表位蛋白序列seqidno.mgep11nsp2klsatdwsaiseqidno.41mgep23capsidkpkpqpekseqidno.42mgep34nsp1kkmtpsdqiseqidno.43mgep45nsp3velpwpletiseqidno.44mgep26capsidkpkpqpekseqidno.42mgep17nsp2klsatdwsaiseqidno.41mgep48nsp3velpwpletiseqidno.44mgep39nsp1kkmtpsdqiseqidno.43mgep110nsp2klsatdwsaiseqidno.41[0279]上述这些多氨基酸序列与rx蛋白的序列的组合产生rxmayaro_igg蛋白。对应于包含多氨基酸序列mgep1至mgep4的rxmayaro_igg基因的氨基酸序列描述于seqidno.45。对应于rxmayaro_igg蛋白的基因，本文中称为rxmayaro_igg基因，描述于核苷酸序列seqidno.46。[0280]通过现有技术已知的分子生物学技术、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成rxmayaro_igg基因引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为rxmayaro_igg设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化技术、然后测序来分析质粒材料，如platcruzi中所引用。[0281]将分析的具有rxmayaro_igg蛋白的正确序列的质粒转移至大肠杆菌菌株bl21。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在具有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并维持相同的培养条件另外的3小时。[0282]对培养物进行离心并将沉淀重悬于尿素缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris-base、8m尿素，ph8.0)中。以0.5ml每分钟的流动速率在镍亲和性柱(histraptm，1ml，gehealthcarelifesciences)上对溶液进行层析，所述柱先前在缓冲液a(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和5mm咪唑)中平衡。结合后，用10ml的缓冲液a洗涤树脂。以0.7ml/分钟的流动速率在100％梯度的缓冲液b(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和500mm咪唑)中洗脱蛋白45分钟。可在来自进行11％sds-page电泳(表5)的洗脱液中证实rxmayaro_igg蛋白的生产。还通过sds-page检验rxmayaro_igg蛋白以确证其生产并确定其在可溶性和不溶性部分之间的分布。如图8中所示，第4列和第7列(箭头)显示rxmayaro_igg作为可溶性和不可溶性产生。[0283]以3种不同生长体积检验rxmayaro_igg生产：3、25和50ml。如表11(下文)中所示，rxmayaro_igg的表达水平为平均130μg/ml。[0284]表11[0285][0286]实施例12–来自rxmayaro_igg的elisa的开发[0287]针对一组来自由mayaro病毒感染影响的个体的血清评价rxmayaro_igg蛋白的性能。将在溶液(0.3m尿素，ph8.0)中的rxmayaro_igg蛋白以500ng/孔的量添加至96孔elisa板，在4℃下12-18小时。用添加有tween20的盐水-磷酸盐缓冲液(pbs)(pbs-t，10mm磷酸钠-na3po4，150mm氯化钠–nacl和0.05％tween-20，ph7.4)洗涤孔，然后在37℃下用含有5％(重量/体积)脱脂奶粉的1xpbs缓冲液孵育2小时。[0288]然后，用pbs-t缓冲液洗涤孔，并在37℃下、用1:100稀释的来自疑似马雅罗病毒感染的患者的血清的6份样品和来自健康患者的血清的29份样品孵育1小时。孵育后，用pbs-t洗涤孔3次，然后在37℃下、用以1:5000稀释的碱性磷酸酶标记的人igg抗体孵育1小时。再次用pbs-t缓冲液洗涤孔3次并添加对硝基苯基磷酸盐(pnpp，1mg/ml，thermofischerscientific)。避光下30分钟后，在elisa读板机中测定405nm下的吸光度。[0289]结果指出使用rxmayaro_igg的优异灵敏度和特异性(图9)。结果强烈支持rxmayaro_igg用于马雅罗病毒感染的检测的用途。[0290]用于实验目的的患者血清样品的使用由fiocruz的伦理委员会批准，依据授权书cep/ioc-caae:52892216.8.0000.5248。[0291]实施例13-rxmayaro_igm蛋白的开发[0292]从马雅罗病毒(株q8qz73和q8qz72，uniprot)的多氨基酸序列的作图研究(espósito等,genomeannouncement3:e01372-15,2015)，考虑到它们的诊断潜力，我们从可获得的现有技术文献选择多氨基酸序列。选择本文中称为mmep1至mmep4的四条多氨基酸序列用于插入至rx蛋白中的9个插入位点，如表12(下文)中所示：[0293]表12[0294][0295]上述这些多氨基酸序列与rx蛋白的序列的组合产生rxmayaro_igm蛋白。对应于包含多氨基酸序列mmep1至mmep4的rxmayaro_igm基因的氨基酸序列描述于seqidno.51。对应于rxmayaro_igm蛋白的基因，本文中称为rxmayaro_igm基因，描述于核苷酸序列seqidno.52。[0296]通过现有技术已知的分子生物学技术、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成rxmayaro_igm基因引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为rxmayaro_igm设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化技术、然后测序来分析质粒材料，如在platcruzi中先前所描述的。[0297]将分析的具有rxmayaro_igm蛋白的正确序列的质粒转移至大肠杆菌菌株bl21。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在添加有卡那霉素(30μg/ml)相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并维持相同的培养条件另外的3小时。[0298]对培养物进行离心并将沉淀重悬于尿素缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris-base、8m尿素，ph8.0)中。以0.5ml每分钟的流动速率在镍亲和性柱(histraptm，1ml，gehealthcarelifesciences)上对溶液进行层析，所述柱先前在缓冲液a(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和5mm咪唑)中平衡。结合后，用10ml的缓冲液a洗涤树脂。以0.7ml/分钟的流动速率在100％梯度的缓冲液b(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和500mm咪唑)中洗脱蛋白45分钟。[0299]可通过进行sds-page电泳在洗脱液中证明rxmayaro_igm蛋白的生产，并且可观察到其在可溶性和不溶性部分之间的分布。如图8中所示，第5列和第8列(箭头)显示rxmayaro_igm作为可溶性和不溶性产生。[0300]还以三种不同生长体积检验rxmayaro_igm生产：3、25和50ml。如表13(下文)中所示，rxmayaro_igm的表达水平为平均205μg/ml。[0301]表13[0302][0303]实施例14–基于rxmayaro_igm的elisa的开发[0304]针对一组来自由马雅罗病毒感染影响的个体的血清评价rxmayaro_igm蛋白的性能。将在溶液(0.3m尿素，ph8.0)中的rxmayaro_igm蛋白以500ng/孔的量添加至96孔elisa板，在4℃下12-18小时。用添加tween20的盐水-磷酸盐缓冲液(pbs)(pbs-t，10mm磷酸钠-na3po4，150mm氯化钠–nacl和0.05％tween-20，ph7.4)洗涤孔，然后在37℃下用含有5％(重量/体积)脱脂奶粉的1xpbs缓冲液孵育2小时。[0305]然后，用pbs-t缓冲液洗涤孔3次，并在37℃下、用1:100稀释的来自疑似马雅罗病毒感染的患者的6份血清样品和来自健康患者的29份血清样品孵育1小时。孵育后，用pbs-t洗涤孔3次，然后在37℃下、用以1:5000稀释的碱性磷酸酶标记的人igm抗体孵育1小时。再次用pbs-t缓冲液洗涤孔3次并添加对硝基苯基磷酸盐(pnpp，1mg/ml，thermofischerscientific)。避光下30分钟后，在elisa读板机中测定405nm下的吸光度。[0306]结果指出使用rxmayaro_igm的优异灵敏度和特异性(图10)。结果强烈支持rxmayaro_igm用于马雅罗病毒感染的检测的用途。[0307]用于实验目的的患者血清样品的使用由fiocruz的伦理委员会批准，依据授权书cep/ioc-caae:52892216.8.0000.5248。[0308]实施例15–蛋白质rxptx开发[0309]从导致百日咳的细菌毒素蛋白百日咳鲍特氏菌(bordetellapertussis)(p04977；p04978；p04979；p0a3r5和p04981：uniprot)的多氨基酸序列的作图研究，考虑到它们的诊断潜力，从可获得的现有技术文献选择多氨基酸序列。选择本文中称为ptxep1至ptxep10的10条多氨基酸序列用于插入至rx蛋白中的9个插入位点，如下表14中所示。在本实施例中，在两个表位中使用间隔区(seqidno:95:sywkgs)而将所述两个表位置于位置1处。还使用另一间隔区(seqidno:96:eaakeaak)而将两个表位插入位置10处。引入这些间隔区的目的在于在连续的多氨基酸之间产生惰性物理空间(inertphysicalspace)，因此有助于防止邻近抗体之间的结合竞争。[0310]表14[0311][0312]上述这些多氨基酸序列与rx蛋白的序列组合产生蛋白rxptx。对应于包含表位ptxep1至ptxep10的rxptx基因的氨基酸序列描述于seqidno.64。对应于rxptx蛋白的基因，本文中称为rxptx基因，描述于核苷酸序列seqidno.63。[0313]通过现有技术分子生物学方法、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成基因rxptx引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为rxptx设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化和其后的测序技术来分析质粒材料，如在platcruzi中先前所描述的。[0314]将分析的具有rxptx蛋白的正确序列的质粒转移至大肠杆菌菌株bl21。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在添加有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并维持相同的培养条件另外的3小时。[0315]对培养物进行离心并将沉淀重悬于2ml的具有cellytic(0.5x)的pbs中，在4℃下1小时。在另一次离心后，收集上清液并将沉淀重悬于与上清液相同体积的8m尿素溶液(ph8.0)中。将相等的体积上样至sds-page凝胶(11％，表5)。[0316]通过sds-page电泳检验rxptx蛋白以证明其生产并确定其在可溶性和不溶性部分之间的分布。如图11中所示，第5列和第6列(箭头)显示rxptx作为可溶性和不溶性产生，在不溶性部分中具有更高比例。[0317]实施例16–rxyfigg蛋白的开发[0318]从黄热病病毒(p03314-uniprot档案中的株17dd和序列)的多氨基酸序列的作图研究，考虑到它们的诊断潜力，从可获得的现有技术文献选择多氨基酸序列。选择本文中称为yfiggep1至yfiggep10的10条多氨基酸序列用于插入至rx蛋白中的9个插入位点，如下表15中所示。在两个表位中使用间隔区(seqidno:97:tsywkgs)而将所述两个表位置于位置10处。间隔区具有在连续表位之间产生物理空间的功能，有助于防止与抗体的相互作用。[0319]表15[0320][0321]上述这些多氨基酸的序列与rx蛋白的组合产生rxyfigg蛋白。对应于包含表位yfiggep1至yfiggep10的rxyfigg基因的氨基酸序列描述于seqidno.75。对应于rxyfigg蛋白的基因，本文中称为rxyfigg基因，描述于核苷酸序列seqidno.76。[0322]通过现有技术分子生物学方法、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成基因rxyfigg引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为rxyfigg设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化和其后的测序技术来分析质粒材料，如在platcruzi中先前所描述的。[0323]将分析的具有rxyfigg的正确序列的质粒转移至大肠杆菌菌株bl21，以产生rxyfigg蛋白。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在37℃下在lb培养基中生长过夜，然后再接种在具有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并在37℃下维持相同的培养条件另外的3小时。[0324]对培养物进行离心并将沉淀重悬于2ml的具有cellytic(0.5x)的pbs中，在4℃下1小时。在另一次离心后，收集上清液并将沉淀重悬于与上清液相同体积的8m尿素溶液(ph8.0)中。将相等的体积上样至sds-page凝胶(11％，表5)。通过sds-page电泳检验蛋白rxyfigg以证明其生产并确定其在可溶性和不溶性部分之间的分布。如图11中所示，第9列和第10列(箭头)显示rxyfigg作为可溶性和不溶性产生，在不溶性部分中具有更高比例。[0325]实施例17–txneuza蛋白的开发[0326]基因操纵容器蛋白“tx”以具有来自作为人中呼吸过敏(respiratoryallergy)的主要原因的屋尘螨(dermatophogoidespteronyssinus)的t细胞表位，我们在本文中称为txneuza平台。对应于txneuza蛋白的基因，本文中称为txneuza基因，描述于核苷酸序列seqidno:89。[0327]从屋尘螨的t细胞多氨基酸序列的作图研究，考虑到它们对于由屋尘螨导致的过敏的诊断潜力，从可获得的现有技术文献选择多氨基酸序列(hinz等,clinexpallergy45:1601-1612,2015；oseroff等,clinexpallergy47:577-592,2017)。选择本文中称为neuzaep1至neuzaep9的9条多氨基酸序列用于插入至tx蛋白中的9个插入位点，如下表16中所示。在本实施例中，在两个表位中使用间隔区(seqidno:98:ggsg)而将两个表位置于位置12处。[0328]表16[0329][0330]上述这些表位与tx蛋白的序列的组合产生txneuza蛋白。对应于包含表位neuzaep1至neuzaep9的txneuza基因的氨基酸序列描述于seqidno:88。[0331]通过现有技术分子生物学方法、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成基因txneuza引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为txneuza设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化和其后的测序技术来分析质粒材料，如在platcruzi中先前所描述的。[0332]将分析的具有txneuza的正确序列的质粒转移至大肠杆菌菌株bl21，以产生txneuza蛋白。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在37℃下在lb培养基中生长过夜，然后再接种在具有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并在37℃下维持相同的培养条件另外的3小时。[0333]对培养物进行离心并将沉淀重悬于2ml的具有cellytic(0.5x)的pbs中，在4℃下1小时。在另一次离心后，收集上清液并将沉淀重悬于与上清液相同体积的8m尿素溶液(ph8.0)中。将相等的体积上样至sds-page凝胶(11％，表5)。通过sds-page检验txneuza蛋白以证明其生产并确定其在可溶性和不溶性部分之间的分布。如图11中所示，第7列和第8列(箭头)显示txneuza作为不溶性产生。[0334]实施例18–txcruzi蛋白的开发8.0)中。将相等的体积上样至sds-page凝胶(11％，表5)。[0343]通过sds-page检验txcruzi蛋白以证明其生产并确定其在可溶性和不溶性部分之间的分布。如图11中所示，第3列和第4列(箭头)显示txcruzi作为可溶性和不溶性产生。与platcruzi(第1列和第2列)相比，txcruzi显示产生的可溶性蛋白的比例的提高，这可归因于tx作为容器蛋白的使用。[0344]实施例19-sars-cov-2肽文库在纤维素膜上的合成和与来自sars-cov-2阳性和阴性个体的血清的反应性[0345]基于在中国武汉市分离并公布于genbank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/mn908947.3？report＝genbank)的sars-cov-2的基因组序列，合成覆盖sars-cov-2病毒的orf3a、orf6、orf7、orf8、orf10、n、m、s、e的所有蛋白质编码区域的多肽文库，并如下注释：[0346]未由sars-cov-2病毒编码的4种多肽包含在肽文库列表中，以表示用于人血清的反应性的阳性对照。表18中，a1，v5(ihlvnnessevivhk，破伤风梭菌(clostriduiumtetani)前体肽)，a2，v6(gypkdgnafnnldr，破伤风梭菌)，a3，v7(kevpaltavetgatg，人骨髓灰质炎病毒)，a4，v8(ypydvpdyagypyd，三血凝素肽(triplehemagglutininpeptide))用作这样的对照。表19和20中，a1，v4(ihlvnnessevivhk，破伤风梭菌前体肽)，a2，v5(gypkdgnafnnldr，破伤风梭菌)，a3，v6(kevpaltavetgatg，人骨髓灰质炎病毒)，a4，v8(ypydvpdyagypyd，三血凝素肽)用作这样的对照。[0347]作为阴性对照，无肽斑点反应物用于表18中的a5、a6、k20、k21、n3、n4、o24、p1、p13、p14、q14、q15、r15、r16、v3、v4、v9-v24、w14，和表19和表20中的a5、k19、k20、n2、n3、o23、o24、p12、p13、q13、q14、r15、r15、v2、v3、v17、v18。[0348]合成线性多氨基酸的关系示于表18、表19、和表20。[0349]表18–用于图12中对来自患者血清的igm反应性表位作图的合成的sars-cov-2多氨基酸的列表。[0350][0351][0352][0353]表19-用于图13中对来自患者血清的igg反应性表位作图的合成的sars-cov-2多氨基酸的列表。[0354][0355][0356][0357]表20-用于图14中对来自患者血清的iga反应性表位作图的合成的sars-cov-2多氨基酸的列表。[0358][0359][0360][0361]实施例20–纤维素膜上sars-cov-2的多氨基酸文库的合成[0362]根据制造商的说明、使用auto-spotrobotasp-222auto-spotrobot、根据标准斑点合成技术在amino-peg500-uc540纤维素膜上制备描述于实施例19的多肽文库。合成具有15个残基的长度和10个相邻残基的重叠的多氨基酸，覆盖蛋白质的完整长度。[0363]合成后，用在tbs-t缓冲液(50mmtris、nacl；136mm，2mmkcl；0.05％，tween-20；ph7.4)中制备的1.5％bsa(牛血清白蛋白)封闭膜的游离位点90分钟。然后，用患者血清(n＝3；1:100，在含有0.75％bsa的tbs-t中稀释)孵育膜，并用tbs-t洗涤4次。其后，用山羊igg抗igm(mu，kpl)、抗igg(h l链，thermoscientific)或抗人iga(α链特异性，calbiochem)(1:5000，在tbs-t中制备)孵育膜1.5h，然后用tbs-t和cbs(含有50mmnacl的柠檬酸钠缓冲液，ph7.0)洗涤。然后，添加化学发光底物(0.25mm)和nitro-block-iitmenhancer(appliedbiosystems,usa)以完成反应。[0364]在odysseyfc设备(li-corbioscience)上检测化学发光信号并使用totallabtl100软件(v2009，nonlineardynamics，usa)量化信号的强度。用microsoftexcel程序分析数据，仅将信号强度(si)大于或等于在各个膜中斑点的集合中获得的最高值的30％的斑点包含在多氨基酸的特征中。作为阴性对照，使用各个膜的背景信号强度。[0365]实施例21–来自sars-cov-2的支链多氨基酸的合成[0366]根据制造商的说明、使用schimadzu合成器型号pss8上的f-moc固相多氨基酸合成策略合成多个支链多氨基酸(sars-x1-sars-x8)。wangkcore树脂(双赖氨酸核，k4)(novabiochem)用作用于支链多氨基酸的合成的固体支撑物。待缀合的第一个氨基酸是位于多肽序列的c末端部分的氨基酸，最后一个位于n-起始。在完成支链多氨基酸的合成的所有循环后，根据用于生产合成多氨基酸和氨基酸侧链的保护基团的去保护的现有技术使用的标准过程(guy和fields,methodsemzymol289,67-83,1997)、通过由裂解混合物(cleavagecocktail)(三氟乙酸、三异丙基硅烷、和乙二醇)处理，所述支链多氨基酸从固体支撑物脱离。对于合成的质量控制，通过hplc和maldi-tof分析各个多氨基酸。[0367]sars-cov-2的s蛋白的合成多氨基酸x1、x2和x5分别包括seqidno:100、101和104。sars-cov-2的n蛋白的合成多氨基酸x3和x6分别包括seqidno:102和105。sars-cov-2的e蛋白的合成多氨基酸x4包括seqidno:103。由s和se基因之间的开放阅读框(orf8)编码的sars-cov-2蛋白的合成多氨基酸x7和x8分别包括seqidno:106和107。[0368]在s和se基因之间的小开放阅读框(orf)中发现编码x8蛋白的基因。在m和n基因之间的orf的组成中发现编码orf6、x4和x5蛋白的基因。[0369]合成支链多肽的列表示于表21。[0370]表21-sars-cov-2蛋白的合成支链肽[0371][0372]实施例22–人血清样品组[0373]将134个人血清样品分为5组。所述组为：[0374]-组0：来自供血库(hemorio)的2016年之前获得的10个健康人血清样品(血清#1-#10)；[0375]-组1：来自根据who病例定义确定的“无症状sars患者”的26个血清样品(#1-#26)；[0376]-组2：来自“疑似患者”的24个血清样品(#27-#50)；[0377]-组3：来自根据who病例定义确定的“sars住院患者(严重疾病)”的38个血清样品(#51-#88)；[0378]-组4：来自“对sars免疫保护的患者”的36个血清样品(#89-#124)。[0379]血清#1-#26，高体温恢复至正常温度，对sars-cov-2为rt-pcr ，抗sars-cov-2抗体的sd快速检测(standarddiagnosticinc.)为阴性。[0380]#27-#50：患者具有对sars-cov-2诊断为rt-pcr ，且抗sars-cov-2抗体sd快速检测为阴性。[0381]#51-#88：住院个体具有恶化的sars-cov-2的体征和症状，快速rt-pcr检测 ，对于抗sars-cov-2抗体的sd为阳性。[0382]#89-#124：免疫保护的个体定义为康复的患者，住院或非住院的，所述患者诊断为sars-cov-2阳性或不诊断为sars-cov-2阳性，有时未通过rt-pcr 的诊断，但显示特征症状。[0383]实施例23-sars-cov-2相关igm多氨基酸的识别[0384]为了识别可由抗sars-cov-2igm抗体特异性识别的潜在多氨基酸，通过包括s、orf3a、m、orf6、orf7、orf8、n、e、orf10的所有区域和对照多氨基酸的sars-cov-2斑点多肽文库合成阵列来分析来自感染的患者的血清样品。[0385]肽阵列用于检测来自感染的个体的人血清对多氨基酸的潜在结合活性。肽阵列覆盖15个氨基酸长度的肽序列，在相邻斑点中具有10个氨基酸重叠。这样的线性多氨基酸包括以下sars-cov-2蛋白：[0386]-刺突蛋白(s)：aa1-1273(斑点a7-k19)，[0387]-orf3a蛋白(orf3)：aa1-275(斑点k22-n2)，[0388]-膜糖蛋白(m)：aa1-222(斑点n5-o23)，[0389]-orf6蛋白(orf6)：aa1-61(斑点p2-p12)，[0390]-orf7蛋白(orf7)：aa1-121(斑点p15-q13)，[0391]-orf8蛋白(orf8)：aa1-121(斑点q16-r17)，[0392]-核衣壳蛋白(n)：aa1-419(斑点r20-v17)，[0393]-包膜蛋白(e)：aa1-75(斑点w1-w13)[0394]-orf10蛋白(orf10)：aa1-38(斑点w15-w20)[0395]-阳性对照多氨基酸：a1和v5(破伤风梭菌前体肽)，a2和v6(破伤风梭菌前体肽)，a3和v7(人骨髓灰质炎病毒肽)，a4和v8(三血凝素表位)[0396]-无反应性斑点作为阴性对照。[0397]使用在纤维素膜上共价合成的多氨基酸(斑点)和来自患者#55、#60和#74(组3)的血清池(n＝3)，分析人抗igm抗体对各种sars-cov-2(s、orf3a、m、orf6、orf7、orf8、n、e、orf10)合成多氨基酸和对照多氨基酸(实施例19和20)的血清学免疫应答，如图12中所示，由表18补充。[0398]图15a至15i显示来自采用山羊抗人igm二抗显色的、用人血清孵育的膜斑点的信号量化结果。[0399]当由抗人igm抗体显色时，人血清已显示与来自不同病毒蛋白的多氨基酸的显著反应性，如图15a至15i中所示，表明即使在感染的初期阶段，大量的不同多氨基酸也具有用于诊断疾病的极大潜力。[0400]实施例24–sars-相关igg表位的识别[0401]为了识别可由抗sars-cov-2igg抗体特异性识别的潜在表位，通过包括s、orf3a、m、orf6、orf7、orf8、n、e、orf10的所有区域和对照多氨基酸的sars-cov-2斑点多氨基酸文库合成阵列来分析来自感染的患者的血清样品。[0402]肽阵列用于检测来自感染的个体的人血清对多氨基酸的潜在结合活性。肽阵列覆盖15个氨基酸长度的肽序列，在相邻斑点中具有10个氨基酸重叠。这样的线性多氨基酸包括以下sars-cov-2蛋白：[0403]-orf3a蛋白(of3a)：aa1-275(斑点a7-c11)，[0404]-膜糖蛋白(m)：aa1-222(斑点c14-e8)，[0405]-orf6蛋白(of6)：aa1-61(斑点e11-e21)，[0406]-orf7蛋白(of7(：aa1-121(斑点e24-f22)，[0407]-orf8蛋白(of8)：aa1-121(斑点g1-g23)，[0408]-刺突蛋白(s)：aa1-1273(斑点h1-r13)，[0409]-核衣壳蛋白(n)：aa1-419(斑点r16-v1)，[0410]-包膜蛋白(e)：aa1-75(斑点w1-w13)，[0411]-orf10蛋白(of10)：aa1-38(斑点w15-w20)，[0412]-阳性对照多肽：a1和v4(破伤风梭菌前体肽)，a2和v5(破伤风梭菌前体肽)，a3和v6(人骨髓灰质炎病毒肽)，a4和v7(三血凝素表位)[0413]-无反应物斑点作为阴性对照[0414]使用在纤维素膜上共价合成的肽(斑点)和来自患者#55、#60和#74(组3)的血清池(n＝3)，分析igg抗体对各种sars-cov-2(orf3a、m、orf6、orf7、orf8、s、n、e、orf10)合成多氨基酸和对照多氨基酸的血清学免疫应答，如图13中所示，由表19补充。[0415]图16a至16h显示来自采用山羊抗人igg二抗显色的、用人血清孵育的膜斑点的信号量化结果。[0416]当由抗人igg抗体显色时，人血清已显示与来自不同病毒蛋白的多氨基酸的显著反应性，如图16a至16h中所示，表明即使在感染的急性期之后的阶段中，大量的不同多氨基酸具有用于诊断疾病的极大潜力。[0417]实施例25–与sars相关的多氨基酸iga的识别[0418]为了识别可由抗sars-cov-2iga抗体特异性识别的潜在多氨基酸，通过包括s、orf3a、m、orf6、orf7、orf8、n、e、orf10的所有区域和对照多氨基酸的sars-cov-2斑点多氨基酸文库合成阵列来分析来自感染的患者的血清样品。[0419]肽阵列用于检测来自感染的个体的人血清对多氨基酸的潜在结合活性。肽阵列覆盖15个氨基酸长度的肽序列，在相邻斑点中具有10个氨基酸重叠。这样的线性多氨基酸包括以下sars-cov-2蛋白：[0420]-刺突蛋白(s)：aa1-1273(斑点a6-k18)，[0421]-orf3a蛋白(orf3)：aa1-275(斑点k21-n1)，[0422]-膜糖蛋白(m)：aa1-222(n4-o22)，[0423]-orf6蛋白(orf6)：aa1-61(p2-p12)，[0424]-orf7蛋白(orf7)：aa1-121(p15-q13)，[0425]-orf8蛋白(orf8)：aa1-121(q16-r17)，[0426]-核衣壳蛋白(n)：aa1-419(斑点r20-v17)，[0427]-包膜蛋白(e)：aa1-75(斑点w1-w-13)，[0428]-orf10蛋白(orf10)：aa1-38(斑点w15-w20)，[0429]-阳性对照多肽：a1和v4(破伤风梭菌前体肽)，a2和v5(破伤风梭菌前体肽)，a3和v6(人骨髓灰质炎病毒肽)，a4和v7(三血凝素表位)，[0430]-无反应物斑点作为阴性对照。[0431]使用在纤维素膜上共价合成的肽(斑点)和来自患者#55、#60和#74(组3)的血清池(n＝3)，分析iga抗体对各种sars-cov-2(orf3a、m、orf6、orf7、orf8、s、n、e、orf10)的合成多氨基酸和对照多氨基酸的b细胞免疫应答，如图14中所示，由表20补充。[0432]图17a至17i显示来自采用山羊igg抗人iga二抗显色的、用人血清孵育的膜斑点的信号量化结果。[0433]当由抗人iga抗体显色时，人血清已显示与不同病毒蛋白的多氨基酸的显著反应性，如图17a至17i中所示，表明通过主要存在于粘膜中的这类抗体，大量的不同多氨基酸具有用于诊断疾病的极大潜力。[0434]实施例26–用于检测抗sars-cov-2抗体的酶联免疫吸附测定elisa[0435]酶联免疫吸附测定(elisa)用于在患者血清中筛选抗sars-cov-2抗体。通过用1μg/孔的支链多氨基酸包被96孔聚苯乙烯板来进行elisa。为了比较结果，平行且同时地进行各组的实验。为了减少试验之间的性能可能的差异变化，采用反应性指数(ri)，其定义为从截断o.d.450减去靶标的o.d.450。在pbs/bsa1％和二抗山羊抗人igm(merck-sigma)、8000x生物素标记的山羊抗人igg(merck-sigma)中将原始人血清稀释100倍(100x)，接着用hrp标记的高灵敏度中性亲和素(neutravidin)(thermofisherscientific)孵育。由碱性磷酸酶标记的山羊抗人iga(kpl)显色抗iga应答。tmb(3,3’,5,5’四甲基联苯胺)用作底物(thermofisherscientific)，当反应性指数大于1时，将免疫应答定义为显著提高的。[0436]结果显示，支链多氨基酸sars-x1至sars-x8针对抗sars-cov2抗体的反应性有差异，这些差异与检测的人抗体的种类(igm、igg或iga)和诊断有sars-cov2的患者的状态相关，如从图18至23的分析中可以看出。观察这样的差异允许设计诊断试验，可提供比简单的对于抗sars-cov2抗体为阳性或阴性诊断更准确或可靠的信息。因此，除了检测igm、igg、或iga抗体以外，诊断试验还可设计成指示个体是否应住院，即使在不存在症状的情况下。[0437]实施例27–用于sars-cov-2的容器蛋白的开发[0438]基因操纵“tx”容器蛋白以具有sars-cov-2表位。选择来自sars-cov-2感染的个体的血清的反应性表位用于构建8种tx蛋白：ag-covid19、agcovid19(h)、tx-sars2-igm、tx-sars2-igg、tx-sars2-g/m、tx-sars2-iga、tx-sars2-universal和tx-sars-g5(非rbd)。[0439]对应于ag-covid19、agcovid19(h)、tx-sars2-igm、tx-sars2-igg、tx-sars2-g/m、tx-sars2-iga、tx-sars2-universal、和tx-sars-g5(非rbd)蛋白的基因，本文中分别称为ag-covid19基因、ag-covid19(h)基因、tx-sars2-igm基因、tx-sars2-igg基因、tx-sars2-g/m基因、tx-sars2-iga基因、tx-sars2-universal基因、和tx-sars-g5(非rbd)基因，描述于核苷酸序列seqidno:108至seqidno:115。对应于ag-covid19、agcovid19(h)、tx-sars2-igm、tx-sars2-igg、tx-sars2-g/m、tx-sars2-iga、tx-sars2-universal和tx-sars-g5(无rbd)蛋白的氨基酸序列分别描述于seqidno116至123。[0440]从sars-cov-2表位序列作图研究，考虑到如实施例19至26中所阐明的它们的诊断潜力，具有多氨基酸的上述8种蛋白质示于表22至28。[0441]表22-ag-covid19和agcovid19蛋白(h)[0442][0443]表23-tx-sars2-igm[0444][0445]表24-tx-sars2-igg[0446][0447]表25-tx-sars2-g/m[0448][0449]表26-tx-sars2-iga[0450][0451]表27-tx-sars2-universal[0452][0453]表28-tx-sars2-g5[0454][0455]实施例28具有来自sars-cov-2的多氨基酸的容器蛋白的表达[0456]使用利用针对bamhi和xhoi酶的限制性位点、具有编码各蛋白的基因的pet24质粒，表达ag-covid19、ag-covid19(h)、tx-sars2-igm、tx-sars2-igg、tx-sars2-g/m、tx-sars2-iga、tx-sars2-universal和tx-sars-g5(非rbd)蛋白。将包含针对特定蛋白的基因的各质粒转移至大肠杆菌bl21菌株，以促进上述列出的8种不同蛋白的表达。[0457]将菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在添加有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株表达t7rna聚合酶。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并在37℃下维持相同的培养条件另外的3小时。[0458]对各细菌菌株的培养物进行离心并将沉淀重悬于在150mmnacl和50mmtris，ph8.0中的10％cellytictm(sigma,br)中。对重组蛋白的试样(1μg/孔)进行含有sds的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)(laemmli,nature227:680-685,1970)。分别在4％和11％的丙烯酰胺浓度下制备浓缩凝胶(浓缩胶)和分离凝胶(分离胶)(表5，下文)。在变性条件下，在62.5mmtris-hcl缓冲液,ph6.8、2％sds、5％β-巯基乙醇、10％甘油中制备样品，并在95℃下煮5分钟(hamesbd,gelelectrophoresisofproteins:apracticalapproach.3.ed.oxford.1998)。电泳后，通过用考马斯亮蓝simplybluer250(thermofisher,br)染色来检测蛋白。标记物pagerulerplusprestainedstandards用作分子量参照(thermofisher,br)。图24，显示ag-covid19(第3列)、ag-covid19(h)(第4列)、tx-sars2-igm(第5列)、tx-sars2-igg(第6列)、tx-sars2-g/m(第7列)、tx-sars2-iga(第8列)、tx-sars2-universal(第9列)和tx-sars-g5(非rbd)(第10列)的条带。第1列显示分子量标记物：a)250kda；b)130kda；c)100kda；d)70kda；e)55kda；f)35kda和g)25kda。第2列显示未诱导的细菌的总提取物。[0459]可选地，还对培养物进行离心并将沉淀重悬于尿素缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris-base、8m尿素，ph8.0)中。通过镍亲和性柱(histraptm，1ml，gehealthcarelifesciences)ml每分钟对溶液进行层析，所述柱先前在缓冲液a(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和5mm咪唑)中平衡。结合后，用10ml的缓冲液a洗涤树脂。以0.7ml/分钟的流动速率在具有75mm、200mm、和500mm咪唑的缓冲液b(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl)中梯度洗脱蛋白45分钟。图25显示对应于具有六个组氨酸尾的ag-covid19蛋白的模式，表明200mm洗脱浓度。图26显示对应于通过使用200mm咪唑的亲和性纯化的sars2-g5蛋白的模式(由75mm进行的洗脱显示污染物)。[0460]结果显示，tx容器蛋白可很容易地用于产生新的且不同的蛋白。此外，可使用相同的表达方案进行具有不同多氨基酸的不同容器蛋白的表达，以极大地节约投入、时间、和基础设施。六个组氨酸尾的包含显示为用于以高纯度水平纯化的潜在促进剂。[0461]实施例29–使用ag-covid19和sars2-g5蛋白检测抗sars-cov-2抗体的酶联免疫吸附测定(elisa)[0462]酶联免疫吸附测定(elisa)用于筛选抗sars-cov-2抗体的存在。针对一组来自受到sars-cov-2病毒感染影响的个体的血清，评价ag-covid19和sars2-g5蛋白的性能。[0463]通过在4℃下、用ag-covid19蛋白(图27)或tx-sars2-g5蛋白(图28)的溶液(0.3m尿素，ph8.0)以1μg/孔包被96孔聚苯乙烯板12-18小时来进行elisa。用添加有tween20(pbs-t，10mm磷酸钠-na3po4，150mm氯化钠–nacl和0.05％tween-20，ph7.4)的盐水-磷酸盐缓冲液(pbs)溶液洗涤孔，然后在37℃下用含有5％(重量/体积)脱脂奶粉的1xpbs缓冲液孵育2小时。[0464]然后，用pbs-t缓冲液洗涤孔3次，并在37℃下、用在pbs/bsa1％中1:100稀释的人血清样品孵育1小时。孵育后，用pbs-t洗涤孔3次，然后在37℃下用以1:8000稀释的生物素标记的山羊抗人igg抗体(merck-sigma)孵育1小时。其后，添加hrp标记的高灵敏度中性亲和素(thermofisherscientific)。再次用pbs-t缓冲液洗涤孔3次并使用tmb底物(3.3’,5.5’四甲基联苯胺，thermofisherscientific)。避光下30分钟后，在elisa读板机中测定405nm处的吸光度。[0465]结果显示，通过表明优异的灵敏度和特异性指数，ag-covid19蛋白(图27)和tx-sars2-g5蛋白(图28)已证明有利地用于检测针对sars-cov-2的抗体。如从图27和28可以看出的，具有来自sars-cov-2的多氨基酸的蛋白在来自sars-cov-2流行前收集的个体、健康或受到例如登革热、疟疾、和梅毒等疾病影响的个体的血清中未检测到抗体。不同地，蛋白质在来自对sars-cov-2诊断为阳性(有症状或无症状)的个体、住院或已康复的患者的血清中检测到抗体。[0466]实施例30-ag-covid19蛋白作为疫苗组合物[0467]根据本专利申请中所描述的方案生产并纯化ag-covid19蛋白。在第0、14、21、和28天，用悬浮于弗氏不完全佐剂(25μl)中的在25μl的pbs中的10μg的ag-covid19蛋白对三只小鼠进行接种。使用接种pbs的动物进行阴性对照。在每次再接种前收集来自动物的血液样品并进行elisa。通过离心从收集的血液分离血浆并进行系列稀释以进行抗体测定(图29)。结果显示，在自第一次注射后四周后，针对ag-covid19的优异的抗体产生。[0468]实施例31-ag-covid19蛋白用于抗sars-cov-2抗体的纯化的用途[0469]使用抗体亲和性原理进行来自诊断有covid19的患者的血清的抗sars-cov-2抗体的纯化。ag-covid19蛋白缀合至由cnbr(gehealthcare,usa)激活的sepharosetm4b。在10mlpbs中稀释来自sars-cov-2阳性患者的10ml血清样品，并使其经受sepharose-ag-covid191小时。然后将混合物置于层析柱。在溶液穿过柱后，将10ml的pbs添加至层析系统，然后添加5ml的ph4的100mm柠檬酸钠缓冲液。随着从柱回收，顺序收集0.5ml的级分并通过280nm处的分光光度法定量抗体的存在。将各级分的吸光度转换为蛋白质浓度并作为级分的体积的函数作图。[0470]结果表明，ag-covid19蛋白可有用地作为来自先前感染有sars-cov-2的患者的抗体的亲和性纯化的内参neican(input)(图30)，表明其在产生用于被动免疫以应对covid-19流行病的可用的内参中的重要性。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：中仍需要不仅展示合适的强度的荧光，并且还在细胞系统中以高水平表达的gfp分子框架。27.gfp分子中，对于肽展示同时保留自体荧光的耐受性存在可变性。因此，现有技术中需要开发可以高水平表达并且耐受插入、同时保留自体荧光的gfp。28.除了在末端处支持基因表达的能力以外，gfp可允许将表位插入至分子暴露于介质的表面环中。已进行多次尝试以将多个肽同时插入至gfp的环区域，可允许将蛋白质用于靶特异性结合反应。然而，鉴于gfp及其生色团的结构敏感性，所有这些努力都具有有限的成功。29.pavoor及其同事努力开发了一种经修饰以在两个环结构域中接受外源序列的蛋白。在该开发中，需要几轮的定向进化以选择支持两个近侧区(即glu-172-asp-173和asp-102-asp-103)中的外源肽的插入的三种突变的蛋白质克隆。作者使用未突变的蛋白质证明两条外源肽的插入阻止酵母细胞表面上的gfp荧光生产和蛋白质表达。在一系列的突变和选择后，在仅两个区域中的同时插入是可能的，但仍导致极大丧失gfp的固有活性，有时使其插入物的生产或表达变为不可能(pavoor等,pnas106(29):11895-11900,2009)。30.abedi等(nucleicacidsresearch26(2):623-30,1998)提出了环区域中的10个蛋白质位置，其中8个位置在β-折叠之间，用于肽表达。嵌合蛋白可用于需要细胞内表达的实验，因此荧光不受干扰性(uninterruptedness)将是限制因素。在该研究中，仅三种嵌合蛋白(其具有氨基酸157-158、172-173和194-195处的插入位点)显示荧光(减弱为原始的四分之一)；和仅两个插入位点(分别地研究)可具有肽而不丧失荧光。文献的作者进一步得出结论“令人好奇的是，即使在β-折叠中的结构扰动gfp是如何如此敏感的”。31.li等(photochemistryandphotobiology,84(1):111-9,2008)提出了嵌合蛋白(红色荧光蛋白-rfp)的研究，指出在该蛋白质中，六个遗传上不同的位点位于三个不同的环中，在那里可插入五个残基的序列而不干扰蛋白质发荧光的能力。然而，作者并未阐明同时使用这些位点来插入不同的肽。32.专利申请wo02090535提出了在蛋白质的5个不同环中非同时插入肽的荧光gfp。该专利申请在其描述性报告中表明同时在蛋白质的多于一个的环中插入肽的可能性，其增加文库的复杂度并允许在同一表面上展示蛋白质。然而，专利文献未证明该可能性，因为其仅提出了在5个不同的蛋白质环中一次一种的肽插入检验。值得注意的是，文献进一步强调了环1和环5其自身并未呈现为良好的插入位点，这是因为在这些位点处的肽插入阻止蛋白质表达。此外，其它专利文献提出了针对蛋白质环中肽表达的gfp变体，然而，这些研究未证明在gfp蛋白质环中不同插入位点中的多于4种肽的同时表达、而不丧失任何其基本特征的可行性(wo02090535、us2003224412、wo200134824)。技术实现要素：33.为了解决上述提及的问题，本发明将提供显著优点，由于容器蛋白可表达大量的不同的多氨基酸序列，特征在于多价容器蛋白，扩展其用于疫苗组合物目的的用途、用于研究和技术开发或疾病诊断的内参。现有技术中仍然存在开发如下容器蛋白的实际需要，所述容器蛋白不仅表现足够的荧光强度，还可在生产细胞系统中大量表达，此外，耐受多条外源多氨基酸序列的伴随展示同时仍表现可检测的自体荧光。34.在一方面，本发明涉及能够在容器蛋白上多于4个不同位点处同时展示多条外源多氨基酸序列的蛋白质容器。35.在另一方面，本发明涉及能够产生前述蛋白质容器的多核苷酸。36.在另一方面，本发明涉及包含前述多核苷酸的载体。37.在另一方面，本发明涉及包含前述多核苷酸的表达盒。38.在另一方面，本发明涉及用于生产所述蛋白质容器、和用于病原体识别或体外疾病诊断的方法。39.在另一方面，本发明涉及所述蛋白质容器用于诊断目的或作为疫苗组合物的用途。40.在另一方面，本发明涉及用于诊断目的或作为疫苗组合物的包含所述蛋白质容器的试剂盒。附图说明41.图1–通过亲和层析法的platcruzi蛋白的纯化。(a)使用液相层析系统、镍柱上的容器蛋白的洗脱谱。(b)通过收集的13-26洗脱液的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sdspage)的分析。由缓冲液b以升序进行洗脱。pm–分子量标记物。42.图2–通过elisa的、platcruzi与来自who提供的克氏锥虫(trypanosomacruzi)国际标准生物参照的血清的反应性。(a)识别tci株的患者血清的池，称为is09/188。(b)识别tcii株的患者血清的池，称为is09/186。43.图3–使用platcruzi容器蛋白作为抗原、来自患有慢性恰加斯病的患者的血清的抗体滴度的确定。lacens提供血清，500ng/孔的浓度和血清稀释度1:50-1:1000用于elisas。44.图4–针对来自患有不同疾病的患者的血清、通过elisa的platcruzi抗原的表现。以500ng/孔的浓度使用platcruzi抗原并以1:250稀释血清。45.图5–通过兔抗rxrabies2血清的狂犬病病毒特异性表位的检测。由rxrabies2免疫的兔抗体通过rxrabies2亲和层析法纯化并用作一抗，通过免疫印迹法，以检测粗提取物(*；第2列)或1x和0.5x的两个不同浓度下的半纯化提取物(分别地，第4列和第6列)中的rxrabies2。阴性对照：rx容器蛋白(第3列)和platcruzi(以两个浓度：1x和0.5x分别在第5列和第7列中)。46.图6–通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sdspage)的rxhoigg3蛋白的分析。a，不产生rxhoigg3的大肠杆菌的可溶性提取物。b，产生rxhoigg3细菌的水性不溶性部分。c，产生rxhoigg3细菌的可溶性部分。箭头表示rxhoigg3蛋白的位置。47.图7–通过elisa的igm抗rxoro抗体的检测。c-：阴性对照(来自无奥罗普切病毒感染的患者的血清)；c ：用于奥罗普切病毒感染的标准阳性血清。患者：奥罗普切病毒感染的疑似病例。oro ：对于奥罗普切病毒感染为阳性(igm抗rxoro抗体的检测)。oro-(阴性对照)：无对于rxoro的igm反应。蛋白质浓度：0.288μg/μl。截断(cutoff)：0.0613。48.图8–表示platcruzi、rxmayaro_igg和rxmayaro_igm蛋白的生产的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)。第1至8竖列表示：1)分子量；2)无重组蛋白的诱导的总细菌提取物；3)诱导platcruzi生产后的总细菌提取物；4)诱导rxmayaro_igg生产后的总细菌提取物；5)诱导rxmayaro_igm生产后的总细菌提取物；6)诱导platcruzi生产后的不溶性细菌蛋白；7)诱导rxmayaro_igg生产后的不溶性细菌蛋白；8)诱导rxmayaro_igm生产后的不溶性细菌蛋白。箭头指出表示platcruzi(第3列和第6列)、rxmayaro_igg(第4列和第7列)和rxmayaro_igm(第5列和第8列)的条带。49.图9–来自马雅罗病毒阳性患者(smay)和健康个体(sn)的血清的反应性，通过elisa，使用rxmayaro_igg蛋白。由缀合至碱性磷酸酶的抗igg免疫球蛋白进行显色(截断＝0.0210)。50.图10–来自被认为健康(sn)和对马雅罗病毒阳性(smay)的个体的血清的反应性，通过elisa，使用rxmayaro_igm蛋白。由缀合至碱性磷酸酶的抗igm免疫球蛋白进行显色(截断＝0.0547)。51.图11–显示来自platcruzi、txcruzi、rxptx、txneuza、和rxyfigg的不溶性(i)和可溶性(s)蛋白的产量的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)。第1至10列包括：1)诱导产生platcruzi的细菌的不溶性蛋白；2)诱导产生platcruzi的细菌的可溶性蛋白；3)诱导产生txcruzi的细菌的不溶性蛋白；4)诱导产生txcruzi的细菌的可溶性蛋白；5)诱导产生rxptx的细菌的不溶性蛋白；6)诱导产生rxptx的细菌的可溶性蛋白；7)诱导产生txneuza的细菌的不溶性蛋白；8)诱导产生txneuza的细菌的可溶性蛋白；9)诱导产生rxyfigg的细菌的不溶性蛋白；10)诱导产生rxyfigg的细菌的可溶性蛋白。箭头指出表示platcruzi(第1列和第2列)、txcruzi(第3列和第4列)、rxptx(第5列和第6列)、txneuza(第7列和第8列)和rxyfigg(第9列和第10列)的条带。52.图12–具有与来自covid-19阳性患者血清的igm抗体反应的sars-cov-2的多氨基酸的图案化纤维素膜(pictorialcellulosemembrane)，在以棋盘的形式由网格划定的区域中可视化为各种灰色阴影的斑点。各个正方形包括纤维素膜区域的反应斑点，其中以线性形式合成的不同的多肽序列共价结合至膜表面。膜中的物理位置和多氨基酸的序列之间的关系列于表18。组合的多氨基酸序列表示以下的编码序列：刺突蛋白sars-cov-2(s1：aa1-1273，a7-k19)、蛋白orf3a(of3：aa1-275，k22-n2)、膜糖蛋白(m：aa1-222，n5-o23)；orf6(of6：aa1-61，p2-p12)；orf7蛋白(of7：aa1-121，p15-q13)、orf8蛋白(of8：aa1-121，q16-r17)、核衣壳蛋白(n：aa1-419,r20-v17)、包膜蛋白(e：aa1-75，w1-w13)、orf10蛋白区域(of10：aa1-38,w15-w20)。各个多氨基酸具有15个氨基酸的长度和10个氨基酸的相邻、连续的重叠。53.图13–与来自covid19患者血清的igg抗体反应的sars-cov-2的图案化纤维素多氨基酸膜，在以网格的形式划定的区域中可视化为各种灰色阴影的斑点。各个正方形包括纤维素膜区域的反应斑点，其中以线性形式合成的不同的多肽序列共价结合至膜表面。膜中的物理位置和多氨基酸的序列之间的关系列于表19。组合的多氨基酸序列表示以下的编码序列：sars-cov-2orf3a蛋白(orf3：aa1-275，a7-c11)、膜糖蛋白(g：aa1-61，c14-e8)；orf6蛋白(orf6：aa1-61，e11-e21)；orf7蛋白(of7：aa1-121，e24-f22)、orf8蛋白(orf8：aa1-121，g1-g23)、刺突蛋白(s：aa1-1273，h1-r13)、核衣壳蛋白(n：aa1-419，r16-v1)、包膜蛋白(e：aa1-75，w1-w13)、orf10(orf10：aa1-38,w15-w20)。各个多氨基酸具有15个氨基酸的长度和10个氨基酸的相邻、连续的重叠。54.图14–具有与来自covid19患者血清的iga抗体反应的sars-cov-2的多氨基酸的图案化纤维素膜，在以网格图案的形式划定的区域中可视化为各种灰色阴影的斑点。各个正方形包括纤维素膜区的反应斑点，其中以线性形式合成的不同的多肽序列共价结合至膜表面。膜中的物理位置和多氨基酸的序列之间的关系列于表20。这些组合的多氨基酸序列表示以下的编码序列：sars-cov-2的刺突蛋白(s：aa1-1273,a6-k18)、orf3a(orf3：aa1-275,k21-n1)、膜糖蛋白(m：aa1-61,n4-o22)；orf6(orf6：aa1-61,p1-p11)；orf7(orf7：aa1-121,p14-q12)、orf8(orf8：aa1-121,q15-r13)、核衣壳蛋白(n：aa1-419,r16-v1)、包膜蛋白(e：aa1-75,区域v4-v16)、orf10(orf10：aa1-38,v19-v24)。各个多氨基酸具有15个氨基酸的长度和10个氨基酸的相邻、连续的重叠。55.图15–由碱性磷酸酶标记的抗人igm抗体显色的、来自患有covid的患者的血清对纤维素膜上合成的sars-cov-2肽的反应性(图12)。15a，表面糖蛋白；15b，orf3a；15c，膜糖蛋白；15d，orf6；15e，orf7；15f，orf8；15g，核蛋白；15h，e蛋白；15i，orf10。56.图16–由碱性磷酸酶标记的抗人igg抗体显色的、来自患有covid的患者的血清对纤维素膜上合成的sars-cov-2肽的反应性(图13)。16aorf3a；16b：膜糖蛋白；16c：orf6；16d：orf7；16e：orf8；16f：核蛋白；16g：e蛋白；16h：orf10。57.图17–由碱性磷酸酶标记的抗人igg抗体显色的、来自患有covid的患者的血清对纤维素膜上合成的sars-cov-2肽的反应性(图14)。17a，表面糖蛋白；17b，orf3a；17c，膜糖蛋白；17d，orf6；17e，orf7；17forf8；17g，核蛋白；17h，e蛋白；17i，orf10。58.图18–来自住院患者(n＝36)(组3)的血清的elisa，采用支链合成肽(sars-x1-sars-x8)，由抗igm二抗显色。59.图19–来自住院患者(n＝36)的血清的elisa，采用支链合成肽(sars-x1-sars-x8)、由抗igg二抗显色。60.图20–来自住院患者(n＝36)的血清的elisa，采用支链合成肽(sars-x4-sars-x8)、由抗iga二抗显色。61.图21–来自四个患者组(组1：无症状，2：疑似；3：住院，和4：免疫保护)的血清的elisa，采用sars-x3支链合成肽、由抗igm二抗显色。62.图22–来自四个患者组(组1：无症状，2：疑似；3：住院，和4：免疫保护)的血清的elisa，采用sars-x8支链合成肽、由抗igg二抗显色。63.图23–来自四个患者组(组1：无症状，2：疑似；3：住院，和4：免疫保护)的血清的elisa，采用合成肽sars-x7、由抗iga二抗显色。64.图24-对聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)进行电泳表明ag-covid19、具有六个组氨酸的尾的ag-covid19蛋白、tx-sars-igm、tx-sars2-igg、tx-sars2-g/m、tx-sars2-iga、tx-sars2-universal和tx-sars2-g5的生产。第1至10竖列，表示：1)分子量；2)无重组蛋白的诱导的总细菌提取物；3)诱导ag-covid19生产后的总细菌提取物；4)诱导具有六个组氨酸尾的ag-covid19蛋白生产后的总细菌提取物；5)诱导tx-sars2-igm蛋白生产后的总细菌提取物；6)诱导tx-sars2-igg蛋白生产后的总细菌提取物；7)诱导tx-sars2-g/m蛋白生产后的总细菌提取物；8)诱导tx-sars2-iga蛋白生产后的总细菌提取物；9)诱导tx-sars2-universal蛋白生产后的总细菌提取物和10)诱导tx-sars2-g5蛋白生产后的总细菌提取物。表示分子量标准的字母为a)250kda；b)130kda；c)100kda；d)70kda；e)55kda；f)35kda和g)25kda。65.图25-对聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)进行电泳表明通过亲和层析法的ag-covid19蛋白的纯化。(总)诱导生产后的总细菌提取物的谱；(ft)未结合在镍柱上的蛋白质的谱；(200)添加200mm咪唑后的ag-covid19蛋白的洗脱谱；(75)添加75mm咪唑后的ag-covid19蛋白的洗脱谱和(500)添加500mm咪唑后的ag-covid19蛋白的洗脱谱。66.图26-对聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)进行电泳表明通过亲和层析法的tx-sars2-g5蛋白的纯化。(总)诱导生产后的总细菌提取物的谱；(ft)未结合在镍柱上的蛋白质的谱；(200)添加200mm咪唑后的tx-sars2-g5蛋白的洗脱谱；(75)添加75mm咪唑后的tx-sars2-g5蛋白的洗脱谱和(500)添加500mm咪唑后的tx-sars2-g5蛋白的洗脱谱。67.图27–来自感染有疟疾、登革热或sars-cov-2并且仍被收治(住院)、康复、疑似或无症状的七组患者的血清的elisa。作为对照，使用了在流行前收集的来自健康人的血清的集合。ag-covid19蛋白用于elisa并且由抗人igg二抗显色结合抗体。68.图28-来自患有梅毒、疟疾、登革热或者被收治(住院)或疑似的sars-cov2的六组患者的血清的elisa检验。作为对照，使用了在流行前收集的来自健康人的血清的集合。tx-sars2-g5蛋白用于elisa并且由抗人igg二抗显色结合抗体。69.图29–在由ag-covid19蛋白免疫小鼠后2周或4周的小鼠中，针对ag-covid19、通过elisa的抗体滴定。70.图30–使用ag-covid19蛋白的抗体纯化。具体实施方式71.尽管本发明易受到不同实施方案的影响，但优选实施方案示于附图和以下详细讨论中，应理解，本说明书应考虑为本发明的原理的示例并且不旨在限制已在本文中说明和描述的本发明。72.在本文中将使用一些缩写。以下为缩写的列表：73.关于含氮碱基：74.c＝胞嘧啶；a＝腺嘌呤；t＝胸腺嘧啶；g＝鸟嘌呤75.关于氨基酸：76.i＝异亮氨酸；l＝亮氨酸；v＝缬氨酸；f＝苯丙氨酸；m＝甲硫氨酸；c＝半胱氨酸；a＝丙氨酸；g＝甘氨酸；p＝脯氨酸；t＝苏氨酸；s＝丝氨酸；y＝酪氨酸；w＝色氨酸；q＝谷氨酰胺；n＝天冬酰胺；h＝组氨酸；e＝谷氨酸；d＝天冬氨酸；k＝赖氨酸；r＝精氨酸。77.蛋白质容器78.本发明涉及蛋白质容器的生产和在各种方法和组合物中的使用，所述蛋白质容器基于本文中称为gfp的绿色荧光蛋白的序列，所述方法和组合物利用所述蛋白质容器以在多于四个的不同蛋白质位点处同时展示多条不同或相同的外源多氨基酸序列的能力，和进一步地表现充分的荧光强度的能力、在细胞蛋白生产系统中有效表达的能力、和用作用于研究、诊断、或在疫苗组合物中的试剂的能力。79.在第一实施方案中，本发明涉及支持在不同位点处同时插入四条以上的外源多氨基酸序列的稳定蛋白质结构。在另一实施方案中，蛋白质容器包括seqidno:1中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器包括seqidno:3中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器包括seqidno:77中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器在朝向外部环境的蛋白质环中呈现用于外源多氨基酸序列的插入位点。在另一实施方案中，外源多氨基酸序列的同时插入不干扰容器蛋白的生产条件。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列，用于疫苗组合物、用于诊断、或用于实验室试剂的开发。在另一实施方案中，在将外源多氨基酸序列同时插入至容器蛋白的蛋白质环时，外源多氨基酸序列不丧失它们的免疫原性特性。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15和seqidno:16。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:.18中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28和seqidno:29。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:20中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:30的多个拷贝。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:31中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:35、seqidno:36、seqidno:37、seqidno:38、seqidno:39和seqidno:40。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:.33中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:41、seqidno:42、seqidno:43和seqidno:44。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:45中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:47、seqidno:48、seqidno:49和seqidno:50。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:51中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:53、seqidno:54、seqidno:55、seqidno:56、seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59、seqidno:60、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:95和seqidno:96。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:64中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:65、seqidno:66、seqidno:67、seqidno:68、seqidno:69、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72、seqidno:73、seqidno:74和seqidno:97。在另一实施方案中，蛋白质容器包含seqidno:75中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，蛋白质容器同时包含外源多氨基酸序列seqidno:79、seqidno:80、seqidno:81、seqidno:82、seqidno:83、seqidno:84、seqidno:85、seqidno:86、seqidno:87和seqidno:98。在另一实施方案中，蛋白质容器包含structuralbiology,26:54-61,2014)。84.可进一步体外修饰分离的容器蛋白用于不同用途。85.多核苷酸86.在第一实施方案中，本发明涉及一种多核苷酸，其包含seqidno:2、4、78、17、19、32、34、46、52、63、76、89、91、326-333任一者和它们的简并序列，能够分别地产生由seqidno:1、3、77、18、20、31、33、45、51、64、75、88、90、334-341限定的多肽。87.本发明还提供了通过任何表达系统从dna分子产生的分离的容器蛋白，所述dna分子包括含有编码选择的容器蛋白的核苷酸序列的调控元件。88.就一个或多个氨基酸残基的同一性或位置而言，通过氨基酸的缺失、添加、或取代，编码容器蛋白的dna序列不同于天然存在的gfp的形式的dna序列。但是，它们仍保留天然存在的形式固有的一些或全部特征，例如但不限于，荧光产生、特征三维形状、在不同系统中表达的能力、和接受外源肽的能力。89.编码本发明的容器蛋白的dna序列包括：整合用于通过某些表达系统的表达的偏好密码子；插入用于限制性酶的切割位点；插入用于促进表达载体构建的优化序列；插入增强子(facilitator)序列以包含待引入容器蛋白的选择的多氨基酸序列。所有这些策略在本领域中为已知的。90.此外，本发明进一步提供例如在seqidno:2、seqidno:4和seqidno:78中所描述的序列中添加编码容器蛋白的核苷酸序列的遗传元件。此外，提供了这样的元件，其包含编码容器蛋白的核苷酸序列，所述序列添加编码所选择的外源多氨基酸序列的dna。此类遗传元件包含描述于seqidno:17、seqidno:19、seqidno:32、seqidno:34、seqidno:46、seqidno:52、seqidno:63、seqidno:76、seqidno:89和seqidno:91中的序列。91.容器蛋白表达所需的调控元件包括用于结合至rna聚合酶的启动子序列和用于结合至核糖体的翻译起始序列。例如，细菌表达载体必须包括适合于细胞系统和翻译起始的起始密码子、启动子、shine-dalgarno序列。类似地，真核表达载体包括启动子、起始密码子、下游过程多腺苷酸化信号、和终止密码子。这样的载体可为市售获得的，或从已知的现有技术序列建立的。92.载体93.在第一实施方案中，本发明涉及包含如上所定义的多核苷酸的载体。94.从一个质粒至另一载体的转换可通过添加或删除限制性位点改变核苷酸序列而不修改氨基酸序列来实现，这可通过核酸扩增技术来完成。95.表达盒96.在第一实施方案中，本发明涉及包含如上所定义的多核苷酸的表达盒。97.其它系统中的优化表达可通过改变核苷酸序列以添加或删除限制性位点、并且还优化密码子用于与新表达系统的偏好密码子的比对而不改变最终氨基酸序列来实现。98.细胞99.在第一实施方案中，本发明涉及包含如上所定义的载体或表达盒的细胞。100.本发明进一步提供了含有编码容器蛋白、或添加来自编码所选择的外源多氨基酸序列的dna的容器蛋白的核苷酸序列的细胞，以起到用于容器蛋白的表达系统的作用。细胞可以是细菌、真菌、酵母、昆虫、植物、或甚至动物细胞。可将编码添加自编码所选择的外源多氨基酸序列的dna的容器蛋白的dna序列插入至病毒，所述病毒可用于容器蛋白的表达和生产，作为递送系统，例如杆状病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、甲病毒、疱疹病毒、痘病毒、逆转录病毒、慢病毒，但不限于这些。101.有各种将外源遗传物质引入细胞的方法，全部为现有技术中已知的。例如，外源dna物质可通过磷酸钙沉淀技术而引入至细胞。其它技术可用于本发明的开发，例如使用电穿孔、脂质体转染、显微注射、逆转录病毒载体和诸如腺病毒相关病毒系统等其它病毒载体系统等。102.本发明提供包括至少含有dna分子的细胞的活生物体，所述dna分子包含用于编码容器蛋白的序列的表达的调控元件。本发明可用于脊椎动物、非脊椎动物、植物和微生物中的容器蛋白的生产。103.容器蛋白的表达可在以下中进行，但不限于此：大肠杆菌(escherichiacoli)细胞、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(pichiapastoris)、甲醇毕赤酵母(pichiamethanolica)、博伊丁假丝酵母(candidaboidinii)、安格斯毕赤酵母(pichiaangusta)、哺乳动物细胞如cho细胞、hek293细胞或昆虫细胞如sf9细胞。所有现有技术中已知的原核或真核蛋白表达系统可用于生产容器蛋白。104.在本发明的一个开发中，携带用于容器蛋白的编码序列的病毒或噬菌体可感染特定种类的细菌或真核细胞并在该细胞系统中提供容器蛋白的表达。可通过检测容器蛋白的表达来容易地观察到感染。类似地，携带编码容器蛋白的序列的真核植物或动物细胞病毒可感染特定细胞类型并导致容器蛋白在真核细胞系统中的表达。105.蛋白质容器的生产方法106.在第一实施方案中，本发明涉及生产蛋白质容器的方法，包括将如上定义的多核苷酸引入感兴趣的感受态细胞；进行感受态细胞的培养并进行含有选择的外源多氨基酸的蛋白质容器的分离。在另一实施方案中，蛋白质容器不受到各种外源多氨基酸序列的插入的干扰。107.还可通过多种合成生物系统来生产容器蛋白。全合成基因的产生基本上与现有技术中广泛描述的三种基于连接的合成系统相关。108.本发明提供使用包括以下的蛋白质表达系统的生产容器蛋白的方法：将用于编码容器蛋白的dna序列加上用于编码选择的外源多氨基酸序列的dna引入感兴趣的感受态细胞，在有利于产生含有选择的多氨基酸序列的容器蛋白的条件下培养这些细胞，并分离含有选择的外源多氨基酸的容器蛋白。109.本发明进一步提供生产含有选择的外源多氨基酸的容器蛋白的技术。本发明展示用于表达含有选择的外源多氨基酸的容器蛋白的有效方法，其促进感兴趣的蛋白质的大量生产。可在不同细胞系统中进行容器蛋白的生产方法，例如酵母、植物、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、和转基因动物。可通过将可产生期望的氨基酸序列的密码子优化的核酸序列整合到适用于特定细胞系统的质粒中来使用各个系统。该质粒可包含赋予表达系统许多特性的元件，其包括但不限于，促进保留和复制的序列、可选择的标记物、用于转录的启动子序列、转录的rna的稳定化序列、核糖体结合位点。110.现有技术中已知用于分离表达的蛋白质的方法，并且在该方面，容器蛋白可通过任何技术容易地分离。多组氨酸尾的存在允许在细菌系统中的重组蛋白的表达后，纯化重组蛋白(hochuli等bio/technology6:1321-25；bornhorstandfalke,methodsenzymology326:245-54)。111.本发明进一步考虑了外源多氨基酸的选择(choice)和挑选(selection)。容器蛋白可以包含来自不同来源的不同多氨基酸序列，范围从包括哺乳动物的脊椎动物、无脊椎动物、植物、微生物、或病毒，以促进它们在不同介质中的表达、展示或使用。可使用不同的多氨基酸序列选择方法，例如通过对抗体或其它结合蛋白的结合亲和性的特定选择、或通过表位作图、或现有技术中已知的其它技术。112.多氨基酸序列是5至30个氨基酸的序列，其灵敏地或特异性地表示生物体，用于本技术中所描述的任何目的。多氨基酸序列可表示但不限于，这些实例：(i)线性b细胞表位；(ii)t细胞表位；(iii)中和表位；(iv)对病原体或非病原体来源为特异性的蛋白质区域；(v)邻近通常不是免疫应答的靶标的酶的活性位点的区域。这些表位区域可通过各种方法来识别，包括但不限于：斑点(spot)合成分析、随机肽文库、噬菌体展示、软件分析、使用x射线晶体学数据、表位数据库、或其它现有技术的方法。113.将外源多氨基酸序列在如上限定的位点处插入容器蛋白令人惊讶地不破坏或干扰蛋白质的遗传特性。在容器蛋白中已识别用于外源多氨基酸序列的8个引入位点(kiss等nucleicacidsres34:e132,2006；pavoor等procnatlacadsciusa106:11895-900,2009；abedi等,nucleicacidsres26:623-30,1998；zhong等biomoleng21:67-72,2004)。114.这些引入位点可在同一插入位点处串联地(intandem)包含一个、两个、或更多个不同外源多氨基酸序列，极大地扩大不同多氨基酸序列的表达。115.病原体识别或体外疾病诊断的方法116.在第一实施方案中，本发明涉及用于病原体识别或体外疾病诊断的方法，其特征在于，所述方法使用如上所定义的容器蛋白。在另一实施方案中，所述方法用于诊断恰加斯病、狂犬病、百日咳、黄热病、奥罗普切病毒病毒感染、马雅罗、ige超敏反应、屋尘螨(d.pteronyssinus)过敏、或covid-19。117.蛋白质容器的用途118.在第一实施方案中，本发明涉及所述蛋白质容器作为实验室试剂的用途。在进一步的实施方案中，本发明涉及所述蛋白质容器用于生产用于针对恰加斯病、狂犬病、百日咳、黄热病、奥罗普切病毒病毒感染、马雅罗、ige超敏反应、屋尘螨过敏、或covid-19的免疫的疫苗组合物的用途。119.此外，本发明涉及用于使用基于gfp的单一蛋白质容器的、多种多氨基酸序列的伴随表达的系统，用于不同用途，例如作为用于研究的试剂、用于诊断、或用于疫苗组合物。具体地，所述表达系统可起到有用的研究试剂的作用以通过结合表位来纯化抗体。此外，所述表达系统还可起到用于诊断慢性和传染性疾病的免疫学和/或分子学技术的作用。并且，所述表达系统可有利地用于含有用于动物和人的免疫的多种抗原的疫苗组合物。120.此外，本发明的一个实施方案是使用基于gfp的单一蛋白质容器的、多种多氨基酸序列的伴随生产的方法，用于不同用途，例如作为用于研究的试剂、用于诊断、或用于疫苗组合物。121.本发明进一步展示容器蛋白的某些用途。这些用途包括但不限于，蛋白质容器作为以下的用途：(i)作为细胞筛选检验中的报告分子，包括细胞内检验；(ii)作为用于展示随机或选择的肽文库的蛋白；(iii)作为抗原呈递蛋白，作为用于开发体外免疫学诊断试验的试剂，通常用于传染性、寄生性或其它免疫学疾病；(iv)作为用于选择、捕捉、筛选或纯化例如抗体等结合物质的抗原呈递蛋白；(v)作为用于疫苗组合物的抗原呈递蛋白；(vi)作为含有用于结合抗原的抗体序列的蛋白；(vii)作为具有被动免疫活性的抗原呈递蛋白。122.容器蛋白可通过特别地具有以下来用作疫苗组合物：(a)大量的、同时的免疫应答诱导多氨基酸序列，和(b)非免疫应答诱导核心蛋白的。123.诊断试剂盒124.在第一实施方案，本发明涉及包含如上所定义的蛋白质容器的诊断试剂盒。125.最后，通过下文中给出的实施例详细描述本发明。应强调的是，本发明不限于这些实施例，并且其还包括可开发的范围内的变化和修改。还值得注意的是，对巴西遗传遗产(braziliangeneticheritage)的所有生物序列的授权使用登记在sisgen，注册号ac53976。126.实施例127.实施例1-容器蛋白构建128.绿色荧光蛋白的不同实例之间的氨基酸序列，egfp(genbank:l29345.1；uniprotkb-p42212)、cycle-3(genbank:cah64883.1)、superfolder(genbank:aoh95453.1)、split(cabantous等sciencereports3:2854,2013)、superfast(fisher&delisa.plosone3:e2351,2008)，用于构建本发明的新的蛋白。通过intaglio软件(purgatorydesign,v3.9.4)进行序列比对和比较。自这些数据，进行某些变化使得容器蛋白可实现所需的特性。129.进行改变以产生限制性酶作用位点。设计这些位点的插入，使得可不改变gfp蛋白的物理化学特性，因此不影响本专利申请中所描述的性质或质量。此外，通过允许在基因工程方法和过程中的潜在使用，这些限制性位点的插入将允许这些蛋白的基因操纵，以将各种肽整合到蛋白质的不同区域中，从而向容器蛋白添加进一步的性质。130.操纵gfp蛋白的核苷酸序列以引入或替换核苷酸，从而产生新的限制性酶位点。由此，产生两种新的容器蛋白，“平台(platform)”蛋白和“rx”蛋白。131.基于egfp蛋白的核苷酸序列中的改变，导致容器蛋白中的以下氨基酸变化：[0132]“平台”蛋白[0133]位置16，氨基酸i；[0134]位置28，氨基酸f；[0135]位置30，氨基酸r；[0136]位置39，氨基酸i；[0137]位置43，氨基酸s；[0138]位置72，氨基酸s；[0139]位置99，氨基酸y；[0140]位置105，氨基酸t；[0141]位置111，氨基酸e；[0142]位置124，氨基酸v；[0143]位置128，氨基酸i；[0144]位置145，氨基酸f；[0145]位置153，氨基酸t；[0146]位置163，氨基酸a；[0147]位置166，氨基酸t；[0148]位置167，氨基酸v；[0149]位置171，氨基酸v；[0150]位置205，氨基酸t；[0151]位置206，氨基酸i；[0152]位置208，氨基酸l。[0153]“rx”蛋白[0154]位置16，氨基酸v；[0155]位置28，氨基酸s；[0156]位置30，氨基酸r；[0157]位置39，氨基酸i；[0158]位置43，氨基酸t；[0159]位置72，氨基酸a；[0160]位置99，氨基酸s；[0161]位置105，氨基酸k；[0162]位置111，氨基酸v；[0163]位置124，氨基酸v；[0164]位置128，氨基酸t；[0165]位置145，氨基酸f；[0166]位置153，氨基酸t；[0167]位置163，氨基酸a；[0168]位置166，氨基酸t；[0169]位置167，氨基酸v；[0170]位置171，氨基酸v；[0171]位置205，氨基酸t；[0172]位置206，氨基酸v；[0173]位置208，氨基酸s。[0174]对于所有的容器蛋白，仍可选择以下位置处的可选的氨基酸取代：[0175]位置39，氨基酸n；[0176]位置72，氨基酸s；[0177]位置99，氨基酸s；[0178]位置105，氨基酸y或k；[0179]位置206，氨基酸i；[0180]位置208，氨基酸l。[0181]一些突变的存在可影响蛋白质的生物化学特性。s30r突变正向地影响蛋白质的螺旋特性；y145f和i171v突变防止不期望的中间体的翻译；a206v或i突变降低新生蛋白(nascentprotein)的聚集的可能性。[0182]对容器蛋白“平台”和“rx”进行的其它改变，从包含新的核苷酸密码子至产生新的限制性位点，示于表1(下文)。[0183]表1[0184]氨基酸序列变化取代的核苷酸引入的核苷酸要使用的限制性酶d102_d103insv-gtcaatiig116_d117inst-acckpnil137_g138insk-aagafiiid191_p192insg-ggtrsriie213_k214insl-ctcsaci[0185]此外，容器蛋白“平台”和“rx”的核苷酸序列具有用于ndei和nhei的两个附加的限制性位点，位于蛋白质的5’氨基末端，来自序列catatggtggctagc(seqidno:5)的插入，和用于ecori和xhoi的另两个限制性位点，位于3’羧基末端，来自序列gaattctaatgactcgag(seqidno:6)的插入。此外，位于氨基末端的两个终止密码子和多组氨酸尾已整合到容器蛋白中。[0186]“平台”蛋白的氨基酸序列可示于seqidno:1并且其相应的核苷酸的序列描述于seqidno:2。[0187]“rx”蛋白的氨基酸序列可示于seqidno:3并且其相应的核苷酸的序列描述于seqidno:4。[0188]通过产生限制性位点而不改变原始蛋白质的三维结构，用于外源多氨基酸序列的10个新的插入位点允许出现在蛋白质中。各个新的插入位点将在本文中称为位置1至位置10。[0189]容器蛋白“平台”和“rx”的位置1至10在核苷酸和氨基酸序列中的位置示于表2(下文)。[0190]表2[0191][0192][0193]从不同gfp蛋白的氨基酸序列的比对来看，共有氨基酸序列指定为cgp(dai等proteinengineering,designandselection20(2):69-792007)。尽管表现高稳定性，该荧光蛋白通过定向进化为表现相对于cgp更好的稳定性来得到改进(kiss等proteinengineering,design&selection22(5):313-23,2009)。然而，由于三种突变的存在，增强的蛋白易于聚集。基于其晶体结构的分析，还整合了其它突变，导致聚集的消除和称为热绿色蛋白(thermalgreenprotein)(tgp)的蛋白质的生产(close等proteins83(7):1225-37,2015)。当用作蛋白质容器时，序列称为“tx”。“tx”蛋白的氨基酸序列可示于seqidno:77，并且其对应的核苷酸中的序列描述于seqidno:78。[0194]“tx”容器蛋白的位置1至13的核苷酸和氨基酸序列位置示于表3(下文)。在容器蛋白的氨基和羧基末端，两条多氨基酸序列可在两端连续插入。因此，插入位点1a和1b和13a和13b的特征在于其分别在氨基和羧基末端区域。[0195]表3[0196]蛋白质容器中的位置氨基酸序列中的位置1gahasvikpe2ng3ye4gaplpfs5afpe6edq7gd8nfppngpvmqkk9dg10eggg11kkdvrlpda12dkdyn13rysg[0197]实施例2–platcruzi蛋白的构造[0198]基因工程化“平台”容器蛋白以拥有克氏锥虫表位，本文中我们称其为platcruzi平台。对应于platcruzi蛋白的基因，本文中称为platcruzi基因，描述于核苷酸序列seqidno:17。[0199]考虑对用于恰加斯病的诊断试验的特异性和灵敏度的实验数据，从可获得的现有技术文献选择源自克氏锥虫的多氨基酸序列(peraltajm等jclinmicrobiol32:971-974,1994；houghtonrl等jinfectdis179:1226-1234,1999；thomas等clinexpimmunol123:465-471,2001；rabello等,1999；gruber&zingales,expparasitology,76(1):1-12,1993；lafaille等,molecularbiochemistryparasitology,35(2):127-36,1989)。选择本文中称为tcep1至tcep10的10条多氨基酸序列用于插入至“平台”蛋白中的10个插入位点，示于表4(下文)。[0200]在选择克氏锥虫多氨基酸序列后，通过化学合成、通过连接基因合成方法产生对应于platcruzi蛋白的合成基因并插入至质粒用于实验。对应于包含表位tcep1至tcep10的platcruzi基因的氨基酸序列描述于seqidno:18。[0201]表4[0202][0203]实施例3–platcruzi蛋白的开发[0204]通过现有技术的分子生物学技术、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成基因引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为platcruzi设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化技术、然后测序来分析质粒材料。[0205]使用的测序方法为酶促法、双脱氧法或链终止法，其是基于互补链的酶促合成，互补链的生长通过添加双脱氧核苷酸来停止(sanger等,proceedingnationalacademyofscience,74(12):5463-5467,1977)。该方法由以下步骤组成：测序反应(热循环仪中25个循环中的dna复制)，通过异丙醇/乙醇的dna沉淀，双链的变性(95℃，2分钟)和在abi3730xl自动测序仪(thermofischerscientific)中进行的核苷酸序列的阅读(otto等,.geneticsandmolecularresearch7:861-871,2008)。借助于4peaks程序(nucleobytes；macosx,2004)完成所获得的序列的分析。来自pet-28a载体(t7启动子和t7终止子)的引物用于反应。[0206]将分析的具有platcruzi的正确序列的质粒克隆转移至大肠杆菌菌株bl21以产生platcruzi蛋白。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。将菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在添加有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并维持相同的培养条件另外的3小时。[0207]对培养物进行离心并将沉淀重悬于尿素缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris-base、8m尿素，ph8.0)中。将溶液经histraptm亲和性柱，1ml，gehealthcarelifesciences，进行层析，这允许组氨酸标记的蛋白的高分辨率纯化。以0.5ml每分钟的流动速率将上清液施加至镍亲和性柱(histraptm，1ml，gehealthcarelifesciences)，所述柱先前在缓冲液a(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和5mm咪唑)中平衡。结合后，用10ml的缓冲液a洗涤树脂。以0.7ml/分钟的流动速率在100％梯度的缓冲液b(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和500mm咪唑)中洗脱蛋白45分钟。然后在280nm处对platcruzi纯化(黑线)并示于图1a。咪唑的百分比标记为红色。在约19至25ml的体积中洗脱蛋白。[0208]对重组蛋白的试样(1μg/孔)进行含有sds的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)(laemmli,nature227:680-685,1970)。分别在4％和11％的丙烯酰胺浓度下制备浓缩凝胶(浓缩胶(stackinggel))和分离凝胶(分离胶(runninggel))(表5，下文)。在变性条件下，在62.5mmtris-hcl缓冲液、ph6.8、2％sds、5％β-巯基乙醇、10％甘油中制备样品，并在95℃下煮5分钟(hamesbd,gelelectrophoresisofproteins:apracticalapproach.3.ed.oxford.1998)。电泳后，通过用考马斯亮蓝(comassieblue)r250(bio-rad,usa)染色来检测蛋白。kaleidoscopetmprestainedstandards标记物用作分子量参照(bio-rad,usa)。图1b，显示使用液相层析系统、使用镍-琼脂柱、通过亲和层析法的platcruzi蛋白的纯化。[0209]表5：用于制备4％样品浓缩胶和用于11％分离胶的试剂的体积和浓度[0210][0211]实施例4–自platcruzi的elisa的开发[0212]针对一组参照生物样品和由克氏锥虫感染的个体评价platcruzi蛋白的表现。将在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(50mm，ph9.6)中的platcruzi蛋白以0.1、0.25、0.5和1.0μg/孔的量添加至96孔elisa板中，在4℃下12-18小时。用添加有tween20(pbs-t，10mm磷酸钠-na3po4，150mm氯化钠–nacl和0.05％tween-20，ph7.4)的盐水-磷酸盐缓冲液(pbs)溶液洗涤孔，然后在37℃下用含有5％(重量/体积)脱水脱脂乳的1xpbs缓冲液孵育2小时。[0213]然后用pbs-t缓冲液洗涤孔3次，并在37℃下用2、4、8、16、32和64倍稀释的参照生物样品tcl(is09/188)或tcii(is09/186)(世界卫生组织(worldhealthorganization))孵育1小时。在孵育后，用pbs-t洗涤孔3次，并在37℃下、用以1:5000稀释的碱性磷酸酶标记的人igg抗体孵育1小时。再次用pbs-t洗涤3次并添加底物对硝基苯基磷酸盐(pnpp，1mg/ml，thermofischerscientific)。避光下30分钟后，在elisa读板机中测定405nm下的吸光度。[0214]无论platcruzi的使用量，结果显示使用的tci和tcii参照生物样品的全部稀释度中的令人满意的反应(图2a和2b)。结果强烈支持platcruzi用于识别由六种dtu(离散分型单元(discretetypingunit)或不同分型单元)中任一种导致的克氏锥虫感染的用途，覆盖完整地理范围(geographicrange)的流行(circulating)克氏锥虫株。当使用来自具有低或高抗体检测滴度的恰加斯病患者的血清时，可观察到相同的表现(图3)。[0215]如上所述制备含有500ng的platcruzi(在0.3m尿素中，ph8.0)的elisa板，用pbs-t洗涤3次后，以1:50、1:100、1:250、1:500、1:1000的不同稀释度，采用来自具有高抗克氏锥虫抗体指数的四名患者(6c-ce、9c-ce、15c-ce和12-se)和来自具有低抗克氏锥虫抗体指数的四名患者(3c-pb、6c-pb、16c-pb、和17c-pb)的血清，在37℃下孵育所述elisa板1小时。此后，用pbs-t洗涤孔3次，并用以1:5000稀释的碱性磷酸酶标记的人igg抗体孵育1小时。再次用pbs-t缓冲液洗涤孔3次，并添加底物对硝基苯基磷酸盐(pnpp，1mg/ml，thermofischerscientific)。30分钟后，在elisa读板机中测定405nm下的吸光度。[0216]结果显示，对于具有低抗体滴度的血清，1:50、1:100和1:250稀释度下的阅读信号明确地高于由阴性对照达到的阈值，表明platcruzi平台用于检测高和低抗体患者血清二者中的抗克氏锥虫抗体的潜力。[0217]用于实验目的的患者血清样品的使用由fiocruz的伦理委员会(ethicscommitteeoffiocruz)批准，依据授权书cep/ioc-caae:52892216.8.0000.5248。[0218]实施例5–platcruzielisa的灵敏度和特异性[0219]采用来自诊断为克氏锥虫的患者的71份血清、加上来自诊断为利什曼病(leishmaniasis)(对于克氏锥虫为阴性)的患者的18份血清、诊断为登革热(对于克氏锥虫为阴性)的患者的20份血清、和39份阴性血清(其它传染病和未感染的个体)，以1:250的稀释度，在37℃下孵育elisa板1小时，所述elisa板为在上述实施例中开发的含有500ng的platcruzi(0.3m尿素，ph8.0)的elisa板。其后，对板进行洗涤和抗体标记，如上所述进行显色和阅读过程。[0220]来自接受者操作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲线相关分析，结果指出使用platcruzi平台的优异灵敏度和特异性(图4)。对于先前识别为对克氏锥虫为阳性的血清，未观察到假阴性结果；以及对于已知对克氏锥虫为阴性的其它血清，包括对于其它传染性疾病为阳性的血清，未观察到假阳性。灵敏度和特异性指数二者皆为100％。[0221]实施例6–rxrabies2蛋白的开发[0222]对“rx”蛋白测试其表达来自其它微生物、包括病毒的表位的性能和能力。文献指出大量的特定多氨基酸序列可用作用于中和抗体的靶标。然而，病毒株之间观察到的序列中的小的变化可干扰中和。因此，彻底研究最佳使用的多氨基酸序列需要大量的病毒的生物学以及其与其宿主的相互作用的流行病学的知识。[0223]考虑到对用于诊断由狂犬病病毒导致的疾病的特异性和灵敏度的实验数据，从可获得的现有技术文献选择狂犬病病毒多氨基酸序列(kuzmina等,jantivirantiretrovir5:2:37-43,2013；cai等,microbesinfect12:948-955,2010)。[0224]选择本文中称为raep1至raep10的10条多氨基酸序列用于插入至rx蛋白中的10个插入位点，如下所述。这些多氨基酸序列与rx蛋白的序列的组合产生rxrabies2蛋白。对应于rxrabies2蛋白的基因，本文中称为rxrabies2基因，描述于核苷酸序列seqidno:19。对应于包含多氨基酸序列raep1至raep10的rxrabies2基因的氨基酸序列描述于seqidno:20。[0225]表6[0226]多氨基酸序列蛋白质中的位置原始表位蛋白序列seqidno.raep11抗原位点1cklklcgvlglseqidno.21raep22抗原位点1cklklcgcsglseqidno.22raep33抗原位点1cklklcgvpglseqidno.23raep44-vderglykseqidno.24raep55-wvamqtsnseqidno.25raep66抗原位点iiiksvrtwneiseqidno.26raep88g5抗原位点lhdfhsdseqidno.27raep99g5抗原位点lhdfrsdseqidno.28raep1010g5抗原位点lhdlhsdseqidno.29[0227]已合成包含编码rx蛋白的序列和上表6中所述的编码多氨基酸序列的序列的合成基因。[0228]通过现有技术分子生物学技术、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成基因引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为rxrabies2设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化技术、然后测序技术来分析质粒材料，以与platcruzi中所描述的相同的方法进行。[0229]将分析的具有rxrabies2的正确序列的质粒克隆转移至大肠杆菌菌株bl21以产生rxrabies2蛋白。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在具有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并在37℃下维持相同的培养条件另外的3小时。[0230]对培养物进行离心并将沉淀重悬于尿素缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris-base、8m尿素，ph8.0)中。以0.5ml每分钟的流动速率，将溶液经histraptm亲和性柱，1ml，gehealthcarelifesciences，进行层析，这允许组氨酸标记的蛋白的高分辨率纯化，所述柱先前在缓冲液a(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和5mm咪唑)中平衡。结合后，用10ml的缓冲液a洗涤树脂。以0.7ml/分钟的流动速率在100％梯度的缓冲液b(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和500mm咪唑)中洗脱蛋白45分钟。[0231]在三种不同培养物体积：3、25和50ml中分析rxrabies2生产。如表7(下文中)中所示，rxrabies2的表达为平均123μg/ml。[0232]表7[0233][0234]实施例7–rxrabies2蛋白作为疫苗组合物[0235]如上述实施例中所描述的产生rxrabies2蛋白。将100μg的蛋白悬浮于弗氏不完全佐剂(freud’sincompleteadjuvant)(0.5ml)并肌内接种至两只6月龄雄性新西兰兔的四头肌(quadricep)。在初始接种后7天和14天，用悬浮于pbs中的rx狂犬病蛋白(100μg/0.5ml)再接种兔。[0236]在接种第一剂的疫苗组合物21天后，从动物收集血液。通过离心收集血浆并通过结合吸附至硝化纤维素膜的rx-rabies2蛋白来进行亲和性纯化。[0237]如下文中所述制备含有rx-rabies2蛋白的硝化纤维素膜以从潜在污染物分离rx-rabies2蛋白。电泳后，使用现有技术免疫印迹技术将蛋白质转移至硝化纤维素膜。[0238]11％sds-page凝胶的制备，如上述实施例和表5中所述；[0239]将10μg的rx-rabies2蛋白施加至11％sds-page凝胶(表5)并使其经受100伏特的电泳电流约2小时；[0240]蛋白质至硝化纤维素膜的转移：使用具有转移缓冲液(25mmtrisbase、192mm甘氨酸和20％甲醇)的trans-blotcell(bio-rad,usa)，在100v下1小时，将蛋白质转移至硝化纤维素膜；[0241]用ponceausred(ponceaus0.1％，乙酸5％)染色以确认重组蛋白的存在。[0242]剪切膜以使得特别地获得仅具有rxrabies2蛋白的一块；[0243]然后使膜在蒸馏水中脱色并置于tbs(0.1％)中12至18小时(过夜)；[0244]用封闭液(含有0.05％(v/v)tween20(tbs-t)和5％(w/v)脱脂奶粉的25mmtris-hcl、125mmnaclph7.4(tbs))孵育过夜，然后再次在封闭液中孵育膜1小时，然后用tbs-t洗涤3次每次5分钟，并用tbs再进行3次洗涤每次5分钟。[0245]将来自免疫的兔的血清在tbs中以1:500稀释，然后在搅拌下、将10ml置于与含有rxrabies2蛋白的硝化纤维素膜片段接触1小时，然后用tbs-t洗涤3次每次5分钟，并再次用tbs洗涤3次每次5分钟。然后，通过添加1ml的100mm甘氨酸(ph3.0)来释放特异性结合的抗体。通过添加100μl的1mtris(ph9.0)将溶液的ph升高至7以纯化兔抗体。特异性结合抗原的抗体的纯化在使用这些抗体用于疗法中是重要步骤，因为其允许显著降低待施用的量同时最小化潜在的不良反应。[0246]不同的提取物用于表明产生的兔抗体结合rxrabies2的特异性能力。使用以下：[0247]具有rx蛋白表达的细菌粗提取物，使用如platcruzi中所提及的相同条件获得；[0248]细菌粗提取物中的rxrabies2蛋白，并以1x和0.5x浓度纯化；[0249]1x和0.5x浓度下的纯化的platcruzi蛋白。[0250]如上所述，对潜在配体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(11％sds-page，表5)，然后转移至硝化纤维素膜并进行免疫印迹法，其细节已针对rxrabies2进行了描述。[0251]在搅拌下，用如上所述的纯化的抗rxrabies2血清孵育膜1小时。然后，用tbs-t洗涤3次每次5分钟，再用tbs洗涤3次每次5分钟。其后，用以1:10,000稀释的过氧化物酶与抗兔igg二抗孵育膜1小时。在用二抗孵育后，进行用tbs-t洗涤3次每次5分钟和用tbs洗涤3次每次5分钟。借助于sigmafasttmdabperoxidasesubstratetablet进行显色。[0252]结果显示通过接种rxrabies2产生的兔抗体与含有狂犬病病毒2蛋白的配体的特异性结合。图5显示仅在泳道(lane)2、4、和6中读取条带，其含有rxrabies2蛋白的细菌粗提取物，以及分别为1x浓度和0.5x浓度的纯化和稀释的rxrabies2蛋白。[0253]还可通过泳道3、5和7中的条带的缺失而观察到免疫应答的特异性，包含(i)无表位引入的rx容器蛋白、(ii)分别地1x和0.5x稀释的platcruzi平台。这些结果确证免疫应答限于狂犬病病毒表位，表明rx蛋白自身不是免疫原性的。[0254]实施例8–rxholgg3蛋白的开发[0255]从马免疫球蛋白的多氨基酸序列的作图研究(de-simone等,toxicon78:83-93,2014；wagner等,journalofimmunology173:3230-3242,2004)，鉴定了通过人igg和ige识别的马igg3多氨基酸的序列，其适用于实验室检验以诊断马血清过敏。[0256]将多氨基酸序列dvlftwyvdgtev(seqidno:30)在位置1、5、6、8、9和10处整合到rx蛋白中，产生rxholgg3蛋白。rxholgg3蛋白的氨基酸序列描述于seqidno:31。rxholgg3蛋白的核苷酸序列描述于seqidno:32。合成包含编码rx蛋白的序列和编码如上所述的多氨基酸序列(seqidno:30)的序列的合成基因。[0257]通过现有技术分子生物学技术、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成基因引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为rxhoigg3蛋白设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化技术、然后测序来分析质粒材料，已在platcruzi中详细描述。[0258]将分析的具有rxhoigg3的正确序列的质粒克隆转移至大肠杆菌菌株bl21以产生rxhoigg3蛋白。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在具有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并维持相同的培养条件另外的3小时。[0259]对培养物进行离心并将沉淀重悬于尿素缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris-base、8m尿素，ph8.0)中。使用镍亲和性柱(histraptm，1ml，gehealthcarelifesciences)并以0.5ml每分钟流动，对溶液进行层析，所述柱先前在缓冲液a(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和5mm咪唑)中平衡。结合后，用10ml的缓冲液a洗涤树脂。以0.7ml/分钟的流动速率在100％梯度的缓冲液b(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和500mm咪唑)中洗脱蛋白45分钟。可在11％sds-page电泳(表5)后的洗脱液中证明rxholgg3蛋白的生产。结果示于图6，并且显示rxholgg3作为重组蛋白的表达。在未诱导的可溶性细菌提取物(图6，第1列)未检测到条带，以及在不溶性(第2列)和可溶性(第3列)部分中各自检测到条带。[0260]实施例9–rxoro蛋白的开发[0261]从奥罗普切病毒(oropouchevirus)(株q71mj4和q9j945，uniprot)的多氨基酸序列作图研究(acrani等,journalofgeneralvirology96:513–523,2014tilston-lunel等,journalofgeneralvirology96(pt7):1636–1650,2015)，考虑到它们的诊断潜力，我们从现有技术中可获得的斑点合成或肽微阵列技术选择多氨基酸序列。选择本文中称为orep1至orep7的六条多氨基酸序列用于插入至rx蛋白中的9个插入位点，如下表8中所示：[0262]表8[0263][0264]上述这些多氨基酸序列与rx蛋白的组合产生rxoro蛋白。对应于包含多氨基酸序列orep1至orep6的rxoro基因的氨基酸序列描述于seqidno.33。对应于rxoro蛋白的基因，本文中称为rxoro基因，描述于核苷酸序列seqidno.34。[0265]通过现有技术分子生物学技术、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成rxoro基因引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为rxoro设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化和其后的测序技术来分析质粒材料，如platcruzi中所述。[0266]将分析的具有rxoro蛋白的正确序列的质粒转移至大肠杆菌菌株bl21。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在具有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并维持相同的培养条件另外的3小时。[0267]对培养物进行离心并将沉淀重悬于尿素缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris-base、8m尿素，ph8.0)中。使用镍亲和性柱(histraptm，1ml，gehealthcarelifesciences)并以0.5ml每分钟流动，对溶液进行层析，所述柱先前在缓冲液a(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和5mm咪唑)中平衡。结合后，用10ml的缓冲液a洗涤树脂。以0.7ml/分钟的流动速率在100％梯度的缓冲液b(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和500mm咪唑)中洗脱蛋白45分钟。以三种不同的细菌生长体积检验rxoro生产：3、25和50ml。rxoro的表达水平为平均203μg/ml，结果示于表9。[0268]表9[0269][0270]实施例10–来自rxoro的elisa的开发[0271]自针对一组由奥罗普切病毒感染影响的个体的血清评价rxoro蛋白的性能。将在溶液(0.3m尿素，ph8.0)中的rxoro蛋白以500ng/孔的量添加至96孔elisa板，在4℃下12-18小时。用添加有tween20的盐水-磷酸盐缓冲液(pbs)(pbs-t，10mm磷酸钠-na3po4，150mm氯化钠–nacl和0.05％tween-20，ph7.4)洗涤孔，然后在37℃下用含有5％(重量/体积)脱脂奶粉的1xpbs缓冲液孵育2小时。[0272]然后，用pbs-t缓冲液洗涤孔3次，并在37℃下、用1:100稀释的来自疑似奥罗普切病毒感染的患者的98份血清样品和来自健康患者的51份血清样品孵育1小时。孵育后，用pbs-t洗涤孔3次，然后在37℃下、用以1:5000稀释的碱性磷酸酶标记的人igg抗体孵育1小时。再次用pbs-t缓冲液洗涤孔3次并添加对硝基苯基磷酸盐(pnpp，1mg/ml，thermofischerscientific)。避光下30分钟后，在elisa读板机中测定405nm下的吸光度。[0273]结果指出使用rxoro的优异灵敏度和特异性(图7)。结果强烈支持rxoro用于奥罗普切病毒病毒感染的检测的用途。[0274]用于实验目的的患者血清样品的使用由fiocruz的伦理委员会批准，依据授权书cep/ioc-caae:52892216.8.0000.5248。[0275]实施例11-rxmayaro_igg蛋白的开发[0276]从马雅罗病毒(株q8qz73和q8qz72，uniprot)的多氨基酸序列作图研究(espósito等,genomeannouncement3:e01372-15,2015)，考虑到它们的诊断潜力，我们从可获得的现有技术文献选择多氨基酸序列。选择本文中称为mgep1至mgep4的四条多氨基酸序列用于插入至rx蛋白中的9个插入位点，如下表10中所示：[0277]表10[0278]多氨基酸序列蛋白质中的位置原始表位蛋白序列seqidno.mgep11nsp2klsatdwsaiseqidno.41mgep23capsidkpkpqpekseqidno.42mgep34nsp1kkmtpsdqiseqidno.43mgep45nsp3velpwpletiseqidno.44mgep26capsidkpkpqpekseqidno.42mgep17nsp2klsatdwsaiseqidno.41mgep48nsp3velpwpletiseqidno.44mgep39nsp1kkmtpsdqiseqidno.43mgep110nsp2klsatdwsaiseqidno.41[0279]上述这些多氨基酸序列与rx蛋白的序列的组合产生rxmayaro_igg蛋白。对应于包含多氨基酸序列mgep1至mgep4的rxmayaro_igg基因的氨基酸序列描述于seqidno.45。对应于rxmayaro_igg蛋白的基因，本文中称为rxmayaro_igg基因，描述于核苷酸序列seqidno.46。[0280]通过现有技术已知的分子生物学技术、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成rxmayaro_igg基因引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为rxmayaro_igg设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化技术、然后测序来分析质粒材料，如platcruzi中所引用。[0281]将分析的具有rxmayaro_igg蛋白的正确序列的质粒转移至大肠杆菌菌株bl21。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在具有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并维持相同的培养条件另外的3小时。[0282]对培养物进行离心并将沉淀重悬于尿素缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris-base、8m尿素，ph8.0)中。以0.5ml每分钟的流动速率在镍亲和性柱(histraptm，1ml，gehealthcarelifesciences)上对溶液进行层析，所述柱先前在缓冲液a(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和5mm咪唑)中平衡。结合后，用10ml的缓冲液a洗涤树脂。以0.7ml/分钟的流动速率在100％梯度的缓冲液b(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和500mm咪唑)中洗脱蛋白45分钟。可在来自进行11％sds-page电泳(表5)的洗脱液中证实rxmayaro_igg蛋白的生产。还通过sds-page检验rxmayaro_igg蛋白以确证其生产并确定其在可溶性和不溶性部分之间的分布。如图8中所示，第4列和第7列(箭头)显示rxmayaro_igg作为可溶性和不可溶性产生。[0283]以3种不同生长体积检验rxmayaro_igg生产：3、25和50ml。如表11(下文)中所示，rxmayaro_igg的表达水平为平均130μg/ml。[0284]表11[0285][0286]实施例12–来自rxmayaro_igg的elisa的开发[0287]针对一组来自由mayaro病毒感染影响的个体的血清评价rxmayaro_igg蛋白的性能。将在溶液(0.3m尿素，ph8.0)中的rxmayaro_igg蛋白以500ng/孔的量添加至96孔elisa板，在4℃下12-18小时。用添加有tween20的盐水-磷酸盐缓冲液(pbs)(pbs-t，10mm磷酸钠-na3po4，150mm氯化钠–nacl和0.05％tween-20，ph7.4)洗涤孔，然后在37℃下用含有5％(重量/体积)脱脂奶粉的1xpbs缓冲液孵育2小时。[0288]然后，用pbs-t缓冲液洗涤孔，并在37℃下、用1:100稀释的来自疑似马雅罗病毒感染的患者的血清的6份样品和来自健康患者的血清的29份样品孵育1小时。孵育后，用pbs-t洗涤孔3次，然后在37℃下、用以1:5000稀释的碱性磷酸酶标记的人igg抗体孵育1小时。再次用pbs-t缓冲液洗涤孔3次并添加对硝基苯基磷酸盐(pnpp，1mg/ml，thermofischerscientific)。避光下30分钟后，在elisa读板机中测定405nm下的吸光度。[0289]结果指出使用rxmayaro_igg的优异灵敏度和特异性(图9)。结果强烈支持rxmayaro_igg用于马雅罗病毒感染的检测的用途。[0290]用于实验目的的患者血清样品的使用由fiocruz的伦理委员会批准，依据授权书cep/ioc-caae:52892216.8.0000.5248。[0291]实施例13-rxmayaro_igm蛋白的开发[0292]从马雅罗病毒(株q8qz73和q8qz72，uniprot)的多氨基酸序列的作图研究(espósito等,genomeannouncement3:e01372-15,2015)，考虑到它们的诊断潜力，我们从可获得的现有技术文献选择多氨基酸序列。选择本文中称为mmep1至mmep4的四条多氨基酸序列用于插入至rx蛋白中的9个插入位点，如表12(下文)中所示：[0293]表12[0294][0295]上述这些多氨基酸序列与rx蛋白的序列的组合产生rxmayaro_igm蛋白。对应于包含多氨基酸序列mmep1至mmep4的rxmayaro_igm基因的氨基酸序列描述于seqidno.51。对应于rxmayaro_igm蛋白的基因，本文中称为rxmayaro_igm基因，描述于核苷酸序列seqidno.52。[0296]通过现有技术已知的分子生物学技术、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成rxmayaro_igm基因引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为rxmayaro_igm设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化技术、然后测序来分析质粒材料，如在platcruzi中先前所描述的。[0297]将分析的具有rxmayaro_igm蛋白的正确序列的质粒转移至大肠杆菌菌株bl21。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在添加有卡那霉素(30μg/ml)相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并维持相同的培养条件另外的3小时。[0298]对培养物进行离心并将沉淀重悬于尿素缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris-base、8m尿素，ph8.0)中。以0.5ml每分钟的流动速率在镍亲和性柱(histraptm，1ml，gehealthcarelifesciences)上对溶液进行层析，所述柱先前在缓冲液a(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和5mm咪唑)中平衡。结合后，用10ml的缓冲液a洗涤树脂。以0.7ml/分钟的流动速率在100％梯度的缓冲液b(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和500mm咪唑)中洗脱蛋白45分钟。[0299]可通过进行sds-page电泳在洗脱液中证明rxmayaro_igm蛋白的生产，并且可观察到其在可溶性和不溶性部分之间的分布。如图8中所示，第5列和第8列(箭头)显示rxmayaro_igm作为可溶性和不溶性产生。[0300]还以三种不同生长体积检验rxmayaro_igm生产：3、25和50ml。如表13(下文)中所示，rxmayaro_igm的表达水平为平均205μg/ml。[0301]表13[0302][0303]实施例14–基于rxmayaro_igm的elisa的开发[0304]针对一组来自由马雅罗病毒感染影响的个体的血清评价rxmayaro_igm蛋白的性能。将在溶液(0.3m尿素，ph8.0)中的rxmayaro_igm蛋白以500ng/孔的量添加至96孔elisa板，在4℃下12-18小时。用添加tween20的盐水-磷酸盐缓冲液(pbs)(pbs-t，10mm磷酸钠-na3po4，150mm氯化钠–nacl和0.05％tween-20，ph7.4)洗涤孔，然后在37℃下用含有5％(重量/体积)脱脂奶粉的1xpbs缓冲液孵育2小时。[0305]然后，用pbs-t缓冲液洗涤孔3次，并在37℃下、用1:100稀释的来自疑似马雅罗病毒感染的患者的6份血清样品和来自健康患者的29份血清样品孵育1小时。孵育后，用pbs-t洗涤孔3次，然后在37℃下、用以1:5000稀释的碱性磷酸酶标记的人igm抗体孵育1小时。再次用pbs-t缓冲液洗涤孔3次并添加对硝基苯基磷酸盐(pnpp，1mg/ml，thermofischerscientific)。避光下30分钟后，在elisa读板机中测定405nm下的吸光度。[0306]结果指出使用rxmayaro_igm的优异灵敏度和特异性(图10)。结果强烈支持rxmayaro_igm用于马雅罗病毒感染的检测的用途。[0307]用于实验目的的患者血清样品的使用由fiocruz的伦理委员会批准，依据授权书cep/ioc-caae:52892216.8.0000.5248。[0308]实施例15–蛋白质rxptx开发[0309]从导致百日咳的细菌毒素蛋白百日咳鲍特氏菌(bordetellapertussis)(p04977；p04978；p04979；p0a3r5和p04981：uniprot)的多氨基酸序列的作图研究，考虑到它们的诊断潜力，从可获得的现有技术文献选择多氨基酸序列。选择本文中称为ptxep1至ptxep10的10条多氨基酸序列用于插入至rx蛋白中的9个插入位点，如下表14中所示。在本实施例中，在两个表位中使用间隔区(seqidno:95:sywkgs)而将所述两个表位置于位置1处。还使用另一间隔区(seqidno:96:eaakeaak)而将两个表位插入位置10处。引入这些间隔区的目的在于在连续的多氨基酸之间产生惰性物理空间(inertphysicalspace)，因此有助于防止邻近抗体之间的结合竞争。[0310]表14[0311][0312]上述这些多氨基酸序列与rx蛋白的序列组合产生蛋白rxptx。对应于包含表位ptxep1至ptxep10的rxptx基因的氨基酸序列描述于seqidno.64。对应于rxptx蛋白的基因，本文中称为rxptx基因，描述于核苷酸序列seqidno.63。[0313]通过现有技术分子生物学方法、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成基因rxptx引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为rxptx设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化和其后的测序技术来分析质粒材料，如在platcruzi中先前所描述的。[0314]将分析的具有rxptx蛋白的正确序列的质粒转移至大肠杆菌菌株bl21。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在添加有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并维持相同的培养条件另外的3小时。[0315]对培养物进行离心并将沉淀重悬于2ml的具有cellytic(0.5x)的pbs中，在4℃下1小时。在另一次离心后，收集上清液并将沉淀重悬于与上清液相同体积的8m尿素溶液(ph8.0)中。将相等的体积上样至sds-page凝胶(11％，表5)。[0316]通过sds-page电泳检验rxptx蛋白以证明其生产并确定其在可溶性和不溶性部分之间的分布。如图11中所示，第5列和第6列(箭头)显示rxptx作为可溶性和不溶性产生，在不溶性部分中具有更高比例。[0317]实施例16–rxyfigg蛋白的开发[0318]从黄热病病毒(p03314-uniprot档案中的株17dd和序列)的多氨基酸序列的作图研究，考虑到它们的诊断潜力，从可获得的现有技术文献选择多氨基酸序列。选择本文中称为yfiggep1至yfiggep10的10条多氨基酸序列用于插入至rx蛋白中的9个插入位点，如下表15中所示。在两个表位中使用间隔区(seqidno:97:tsywkgs)而将所述两个表位置于位置10处。间隔区具有在连续表位之间产生物理空间的功能，有助于防止与抗体的相互作用。[0319]表15[0320][0321]上述这些多氨基酸的序列与rx蛋白的组合产生rxyfigg蛋白。对应于包含表位yfiggep1至yfiggep10的rxyfigg基因的氨基酸序列描述于seqidno.75。对应于rxyfigg蛋白的基因，本文中称为rxyfigg基因，描述于核苷酸序列seqidno.76。[0322]通过现有技术分子生物学方法、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成基因rxyfigg引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为rxyfigg设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化和其后的测序技术来分析质粒材料，如在platcruzi中先前所描述的。[0323]将分析的具有rxyfigg的正确序列的质粒转移至大肠杆菌菌株bl21，以产生rxyfigg蛋白。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在37℃下在lb培养基中生长过夜，然后再接种在具有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并在37℃下维持相同的培养条件另外的3小时。[0324]对培养物进行离心并将沉淀重悬于2ml的具有cellytic(0.5x)的pbs中，在4℃下1小时。在另一次离心后，收集上清液并将沉淀重悬于与上清液相同体积的8m尿素溶液(ph8.0)中。将相等的体积上样至sds-page凝胶(11％，表5)。通过sds-page电泳检验蛋白rxyfigg以证明其生产并确定其在可溶性和不溶性部分之间的分布。如图11中所示，第9列和第10列(箭头)显示rxyfigg作为可溶性和不溶性产生，在不溶性部分中具有更高比例。[0325]实施例17–txneuza蛋白的开发[0326]基因操纵容器蛋白“tx”以具有来自作为人中呼吸过敏(respiratoryallergy)的主要原因的屋尘螨(dermatophogoidespteronyssinus)的t细胞表位，我们在本文中称为txneuza平台。对应于txneuza蛋白的基因，本文中称为txneuza基因，描述于核苷酸序列seqidno:89。[0327]从屋尘螨的t细胞多氨基酸序列的作图研究，考虑到它们对于由屋尘螨导致的过敏的诊断潜力，从可获得的现有技术文献选择多氨基酸序列(hinz等,clinexpallergy45:1601-1612,2015；oseroff等,clinexpallergy47:577-592,2017)。选择本文中称为neuzaep1至neuzaep9的9条多氨基酸序列用于插入至tx蛋白中的9个插入位点，如下表16中所示。在本实施例中，在两个表位中使用间隔区(seqidno:98:ggsg)而将两个表位置于位置12处。[0328]表16[0329][0330]上述这些表位与tx蛋白的序列的组合产生txneuza蛋白。对应于包含表位neuzaep1至neuzaep9的txneuza基因的氨基酸序列描述于seqidno:88。[0331]通过现有技术分子生物学方法、使用用于酶ndei和xhol的限制性位点将合成基因txneuza引入pet28a质粒。为了识别合成基因是否与为txneuza设计的序列配对，转化大肠杆菌的dh5α菌株并通过限制性酶消化和其后的测序技术来分析质粒材料，如在platcruzi中先前所描述的。[0332]将分析的具有txneuza的正确序列的质粒转移至大肠杆菌菌株bl21，以产生txneuza蛋白。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株可表达t7rna聚合酶。bl21菌株在37℃下在lb培养基中生长过夜，然后再接种在具有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并在37℃下维持相同的培养条件另外的3小时。[0333]对培养物进行离心并将沉淀重悬于2ml的具有cellytic(0.5x)的pbs中，在4℃下1小时。在另一次离心后，收集上清液并将沉淀重悬于与上清液相同体积的8m尿素溶液(ph8.0)中。将相等的体积上样至sds-page凝胶(11％，表5)。通过sds-page检验txneuza蛋白以证明其生产并确定其在可溶性和不溶性部分之间的分布。如图11中所示，第7列和第8列(箭头)显示txneuza作为不溶性产生。[0334]实施例18–txcruzi蛋白的开发8.0)中。将相等的体积上样至sds-page凝胶(11％，表5)。[0343]通过sds-page检验txcruzi蛋白以证明其生产并确定其在可溶性和不溶性部分之间的分布。如图11中所示，第3列和第4列(箭头)显示txcruzi作为可溶性和不溶性产生。与platcruzi(第1列和第2列)相比，txcruzi显示产生的可溶性蛋白的比例的提高，这可归因于tx作为容器蛋白的使用。[0344]实施例19-sars-cov-2肽文库在纤维素膜上的合成和与来自sars-cov-2阳性和阴性个体的血清的反应性[0345]基于在中国武汉市分离并公布于genbank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/mn908947.3？report＝genbank)的sars-cov-2的基因组序列，合成覆盖sars-cov-2病毒的orf3a、orf6、orf7、orf8、orf10、n、m、s、e的所有蛋白质编码区域的多肽文库，并如下注释：[0346]未由sars-cov-2病毒编码的4种多肽包含在肽文库列表中，以表示用于人血清的反应性的阳性对照。表18中，a1，v5(ihlvnnessevivhk，破伤风梭菌(clostriduiumtetani)前体肽)，a2，v6(gypkdgnafnnldr，破伤风梭菌)，a3，v7(kevpaltavetgatg，人骨髓灰质炎病毒)，a4，v8(ypydvpdyagypyd，三血凝素肽(triplehemagglutininpeptide))用作这样的对照。表19和20中，a1，v4(ihlvnnessevivhk，破伤风梭菌前体肽)，a2，v5(gypkdgnafnnldr，破伤风梭菌)，a3，v6(kevpaltavetgatg，人骨髓灰质炎病毒)，a4，v8(ypydvpdyagypyd，三血凝素肽)用作这样的对照。[0347]作为阴性对照，无肽斑点反应物用于表18中的a5、a6、k20、k21、n3、n4、o24、p1、p13、p14、q14、q15、r15、r16、v3、v4、v9-v24、w14，和表19和表20中的a5、k19、k20、n2、n3、o23、o24、p12、p13、q13、q14、r15、r15、v2、v3、v17、v18。[0348]合成线性多氨基酸的关系示于表18、表19、和表20。[0349]表18–用于图12中对来自患者血清的igm反应性表位作图的合成的sars-cov-2多氨基酸的列表。[0350][0351][0352][0353]表19-用于图13中对来自患者血清的igg反应性表位作图的合成的sars-cov-2多氨基酸的列表。[0354][0355][0356][0357]表20-用于图14中对来自患者血清的iga反应性表位作图的合成的sars-cov-2多氨基酸的列表。[0358][0359][0360][0361]实施例20–纤维素膜上sars-cov-2的多氨基酸文库的合成[0362]根据制造商的说明、使用auto-spotrobotasp-222auto-spotrobot、根据标准斑点合成技术在amino-peg500-uc540纤维素膜上制备描述于实施例19的多肽文库。合成具有15个残基的长度和10个相邻残基的重叠的多氨基酸，覆盖蛋白质的完整长度。[0363]合成后，用在tbs-t缓冲液(50mmtris、nacl；136mm，2mmkcl；0.05％，tween-20；ph7.4)中制备的1.5％bsa(牛血清白蛋白)封闭膜的游离位点90分钟。然后，用患者血清(n＝3；1:100，在含有0.75％bsa的tbs-t中稀释)孵育膜，并用tbs-t洗涤4次。其后，用山羊igg抗igm(mu，kpl)、抗igg(h l链，thermoscientific)或抗人iga(α链特异性，calbiochem)(1:5000，在tbs-t中制备)孵育膜1.5h，然后用tbs-t和cbs(含有50mmnacl的柠檬酸钠缓冲液，ph7.0)洗涤。然后，添加化学发光底物(0.25mm)和nitro-block-iitmenhancer(appliedbiosystems,usa)以完成反应。[0364]在odysseyfc设备(li-corbioscience)上检测化学发光信号并使用totallabtl100软件(v2009，nonlineardynamics，usa)量化信号的强度。用microsoftexcel程序分析数据，仅将信号强度(si)大于或等于在各个膜中斑点的集合中获得的最高值的30％的斑点包含在多氨基酸的特征中。作为阴性对照，使用各个膜的背景信号强度。[0365]实施例21–来自sars-cov-2的支链多氨基酸的合成[0366]根据制造商的说明、使用schimadzu合成器型号pss8上的f-moc固相多氨基酸合成策略合成多个支链多氨基酸(sars-x1-sars-x8)。wangkcore树脂(双赖氨酸核，k4)(novabiochem)用作用于支链多氨基酸的合成的固体支撑物。待缀合的第一个氨基酸是位于多肽序列的c末端部分的氨基酸，最后一个位于n-起始。在完成支链多氨基酸的合成的所有循环后，根据用于生产合成多氨基酸和氨基酸侧链的保护基团的去保护的现有技术使用的标准过程(guy和fields,methodsemzymol289,67-83,1997)、通过由裂解混合物(cleavagecocktail)(三氟乙酸、三异丙基硅烷、和乙二醇)处理，所述支链多氨基酸从固体支撑物脱离。对于合成的质量控制，通过hplc和maldi-tof分析各个多氨基酸。[0367]sars-cov-2的s蛋白的合成多氨基酸x1、x2和x5分别包括seqidno:100、101和104。sars-cov-2的n蛋白的合成多氨基酸x3和x6分别包括seqidno:102和105。sars-cov-2的e蛋白的合成多氨基酸x4包括seqidno:103。由s和se基因之间的开放阅读框(orf8)编码的sars-cov-2蛋白的合成多氨基酸x7和x8分别包括seqidno:106和107。[0368]在s和se基因之间的小开放阅读框(orf)中发现编码x8蛋白的基因。在m和n基因之间的orf的组成中发现编码orf6、x4和x5蛋白的基因。[0369]合成支链多肽的列表示于表21。[0370]表21-sars-cov-2蛋白的合成支链肽[0371][0372]实施例22–人血清样品组[0373]将134个人血清样品分为5组。所述组为：[0374]-组0：来自供血库(hemorio)的2016年之前获得的10个健康人血清样品(血清#1-#10)；[0375]-组1：来自根据who病例定义确定的“无症状sars患者”的26个血清样品(#1-#26)；[0376]-组2：来自“疑似患者”的24个血清样品(#27-#50)；[0377]-组3：来自根据who病例定义确定的“sars住院患者(严重疾病)”的38个血清样品(#51-#88)；[0378]-组4：来自“对sars免疫保护的患者”的36个血清样品(#89-#124)。[0379]血清#1-#26，高体温恢复至正常温度，对sars-cov-2为rt-pcr ，抗sars-cov-2抗体的sd快速检测(standarddiagnosticinc.)为阴性。[0380]#27-#50：患者具有对sars-cov-2诊断为rt-pcr ，且抗sars-cov-2抗体sd快速检测为阴性。[0381]#51-#88：住院个体具有恶化的sars-cov-2的体征和症状，快速rt-pcr检测 ，对于抗sars-cov-2抗体的sd为阳性。[0382]#89-#124：免疫保护的个体定义为康复的患者，住院或非住院的，所述患者诊断为sars-cov-2阳性或不诊断为sars-cov-2阳性，有时未通过rt-pcr 的诊断，但显示特征症状。[0383]实施例23-sars-cov-2相关igm多氨基酸的识别[0384]为了识别可由抗sars-cov-2igm抗体特异性识别的潜在多氨基酸，通过包括s、orf3a、m、orf6、orf7、orf8、n、e、orf10的所有区域和对照多氨基酸的sars-cov-2斑点多肽文库合成阵列来分析来自感染的患者的血清样品。[0385]肽阵列用于检测来自感染的个体的人血清对多氨基酸的潜在结合活性。肽阵列覆盖15个氨基酸长度的肽序列，在相邻斑点中具有10个氨基酸重叠。这样的线性多氨基酸包括以下sars-cov-2蛋白：[0386]-刺突蛋白(s)：aa1-1273(斑点a7-k19)，[0387]-orf3a蛋白(orf3)：aa1-275(斑点k22-n2)，[0388]-膜糖蛋白(m)：aa1-222(斑点n5-o23)，[0389]-orf6蛋白(orf6)：aa1-61(斑点p2-p12)，[0390]-orf7蛋白(orf7)：aa1-121(斑点p15-q13)，[0391]-orf8蛋白(orf8)：aa1-121(斑点q16-r17)，[0392]-核衣壳蛋白(n)：aa1-419(斑点r20-v17)，[0393]-包膜蛋白(e)：aa1-75(斑点w1-w13)[0394]-orf10蛋白(orf10)：aa1-38(斑点w15-w20)[0395]-阳性对照多氨基酸：a1和v5(破伤风梭菌前体肽)，a2和v6(破伤风梭菌前体肽)，a3和v7(人骨髓灰质炎病毒肽)，a4和v8(三血凝素表位)[0396]-无反应性斑点作为阴性对照。[0397]使用在纤维素膜上共价合成的多氨基酸(斑点)和来自患者#55、#60和#74(组3)的血清池(n＝3)，分析人抗igm抗体对各种sars-cov-2(s、orf3a、m、orf6、orf7、orf8、n、e、orf10)合成多氨基酸和对照多氨基酸(实施例19和20)的血清学免疫应答，如图12中所示，由表18补充。[0398]图15a至15i显示来自采用山羊抗人igm二抗显色的、用人血清孵育的膜斑点的信号量化结果。[0399]当由抗人igm抗体显色时，人血清已显示与来自不同病毒蛋白的多氨基酸的显著反应性，如图15a至15i中所示，表明即使在感染的初期阶段，大量的不同多氨基酸也具有用于诊断疾病的极大潜力。[0400]实施例24–sars-相关igg表位的识别[0401]为了识别可由抗sars-cov-2igg抗体特异性识别的潜在表位，通过包括s、orf3a、m、orf6、orf7、orf8、n、e、orf10的所有区域和对照多氨基酸的sars-cov-2斑点多氨基酸文库合成阵列来分析来自感染的患者的血清样品。[0402]肽阵列用于检测来自感染的个体的人血清对多氨基酸的潜在结合活性。肽阵列覆盖15个氨基酸长度的肽序列，在相邻斑点中具有10个氨基酸重叠。这样的线性多氨基酸包括以下sars-cov-2蛋白：[0403]-orf3a蛋白(of3a)：aa1-275(斑点a7-c11)，[0404]-膜糖蛋白(m)：aa1-222(斑点c14-e8)，[0405]-orf6蛋白(of6)：aa1-61(斑点e11-e21)，[0406]-orf7蛋白(of7(：aa1-121(斑点e24-f22)，[0407]-orf8蛋白(of8)：aa1-121(斑点g1-g23)，[0408]-刺突蛋白(s)：aa1-1273(斑点h1-r13)，[0409]-核衣壳蛋白(n)：aa1-419(斑点r16-v1)，[0410]-包膜蛋白(e)：aa1-75(斑点w1-w13)，[0411]-orf10蛋白(of10)：aa1-38(斑点w15-w20)，[0412]-阳性对照多肽：a1和v4(破伤风梭菌前体肽)，a2和v5(破伤风梭菌前体肽)，a3和v6(人骨髓灰质炎病毒肽)，a4和v7(三血凝素表位)[0413]-无反应物斑点作为阴性对照[0414]使用在纤维素膜上共价合成的肽(斑点)和来自患者#55、#60和#74(组3)的血清池(n＝3)，分析igg抗体对各种sars-cov-2(orf3a、m、orf6、orf7、orf8、s、n、e、orf10)合成多氨基酸和对照多氨基酸的血清学免疫应答，如图13中所示，由表19补充。[0415]图16a至16h显示来自采用山羊抗人igg二抗显色的、用人血清孵育的膜斑点的信号量化结果。[0416]当由抗人igg抗体显色时，人血清已显示与来自不同病毒蛋白的多氨基酸的显著反应性，如图16a至16h中所示，表明即使在感染的急性期之后的阶段中，大量的不同多氨基酸具有用于诊断疾病的极大潜力。[0417]实施例25–与sars相关的多氨基酸iga的识别[0418]为了识别可由抗sars-cov-2iga抗体特异性识别的潜在多氨基酸，通过包括s、orf3a、m、orf6、orf7、orf8、n、e、orf10的所有区域和对照多氨基酸的sars-cov-2斑点多氨基酸文库合成阵列来分析来自感染的患者的血清样品。[0419]肽阵列用于检测来自感染的个体的人血清对多氨基酸的潜在结合活性。肽阵列覆盖15个氨基酸长度的肽序列，在相邻斑点中具有10个氨基酸重叠。这样的线性多氨基酸包括以下sars-cov-2蛋白：[0420]-刺突蛋白(s)：aa1-1273(斑点a6-k18)，[0421]-orf3a蛋白(orf3)：aa1-275(斑点k21-n1)，[0422]-膜糖蛋白(m)：aa1-222(n4-o22)，[0423]-orf6蛋白(orf6)：aa1-61(p2-p12)，[0424]-orf7蛋白(orf7)：aa1-121(p15-q13)，[0425]-orf8蛋白(orf8)：aa1-121(q16-r17)，[0426]-核衣壳蛋白(n)：aa1-419(斑点r20-v17)，[0427]-包膜蛋白(e)：aa1-75(斑点w1-w-13)，[0428]-orf10蛋白(orf10)：aa1-38(斑点w15-w20)，[0429]-阳性对照多肽：a1和v4(破伤风梭菌前体肽)，a2和v5(破伤风梭菌前体肽)，a3和v6(人骨髓灰质炎病毒肽)，a4和v7(三血凝素表位)，[0430]-无反应物斑点作为阴性对照。[0431]使用在纤维素膜上共价合成的肽(斑点)和来自患者#55、#60和#74(组3)的血清池(n＝3)，分析iga抗体对各种sars-cov-2(orf3a、m、orf6、orf7、orf8、s、n、e、orf10)的合成多氨基酸和对照多氨基酸的b细胞免疫应答，如图14中所示，由表20补充。[0432]图17a至17i显示来自采用山羊igg抗人iga二抗显色的、用人血清孵育的膜斑点的信号量化结果。[0433]当由抗人iga抗体显色时，人血清已显示与不同病毒蛋白的多氨基酸的显著反应性，如图17a至17i中所示，表明通过主要存在于粘膜中的这类抗体，大量的不同多氨基酸具有用于诊断疾病的极大潜力。[0434]实施例26–用于检测抗sars-cov-2抗体的酶联免疫吸附测定elisa[0435]酶联免疫吸附测定(elisa)用于在患者血清中筛选抗sars-cov-2抗体。通过用1μg/孔的支链多氨基酸包被96孔聚苯乙烯板来进行elisa。为了比较结果，平行且同时地进行各组的实验。为了减少试验之间的性能可能的差异变化，采用反应性指数(ri)，其定义为从截断o.d.450减去靶标的o.d.450。在pbs/bsa1％和二抗山羊抗人igm(merck-sigma)、8000x生物素标记的山羊抗人igg(merck-sigma)中将原始人血清稀释100倍(100x)，接着用hrp标记的高灵敏度中性亲和素(neutravidin)(thermofisherscientific)孵育。由碱性磷酸酶标记的山羊抗人iga(kpl)显色抗iga应答。tmb(3,3’,5,5’四甲基联苯胺)用作底物(thermofisherscientific)，当反应性指数大于1时，将免疫应答定义为显著提高的。[0436]结果显示，支链多氨基酸sars-x1至sars-x8针对抗sars-cov2抗体的反应性有差异，这些差异与检测的人抗体的种类(igm、igg或iga)和诊断有sars-cov2的患者的状态相关，如从图18至23的分析中可以看出。观察这样的差异允许设计诊断试验，可提供比简单的对于抗sars-cov2抗体为阳性或阴性诊断更准确或可靠的信息。因此，除了检测igm、igg、或iga抗体以外，诊断试验还可设计成指示个体是否应住院，即使在不存在症状的情况下。[0437]实施例27–用于sars-cov-2的容器蛋白的开发[0438]基因操纵“tx”容器蛋白以具有sars-cov-2表位。选择来自sars-cov-2感染的个体的血清的反应性表位用于构建8种tx蛋白：ag-covid19、agcovid19(h)、tx-sars2-igm、tx-sars2-igg、tx-sars2-g/m、tx-sars2-iga、tx-sars2-universal和tx-sars-g5(非rbd)。[0439]对应于ag-covid19、agcovid19(h)、tx-sars2-igm、tx-sars2-igg、tx-sars2-g/m、tx-sars2-iga、tx-sars2-universal、和tx-sars-g5(非rbd)蛋白的基因，本文中分别称为ag-covid19基因、ag-covid19(h)基因、tx-sars2-igm基因、tx-sars2-igg基因、tx-sars2-g/m基因、tx-sars2-iga基因、tx-sars2-universal基因、和tx-sars-g5(非rbd)基因，描述于核苷酸序列seqidno:108至seqidno:115。对应于ag-covid19、agcovid19(h)、tx-sars2-igm、tx-sars2-igg、tx-sars2-g/m、tx-sars2-iga、tx-sars2-universal和tx-sars-g5(无rbd)蛋白的氨基酸序列分别描述于seqidno116至123。[0440]从sars-cov-2表位序列作图研究，考虑到如实施例19至26中所阐明的它们的诊断潜力，具有多氨基酸的上述8种蛋白质示于表22至28。[0441]表22-ag-covid19和agcovid19蛋白(h)[0442][0443]表23-tx-sars2-igm[0444][0445]表24-tx-sars2-igg[0446][0447]表25-tx-sars2-g/m[0448][0449]表26-tx-sars2-iga[0450][0451]表27-tx-sars2-universal[0452][0453]表28-tx-sars2-g5[0454][0455]实施例28具有来自sars-cov-2的多氨基酸的容器蛋白的表达[0456]使用利用针对bamhi和xhoi酶的限制性位点、具有编码各蛋白的基因的pet24质粒，表达ag-covid19、ag-covid19(h)、tx-sars2-igm、tx-sars2-igg、tx-sars2-g/m、tx-sars2-iga、tx-sars2-universal和tx-sars-g5(非rbd)蛋白。将包含针对特定蛋白的基因的各质粒转移至大肠杆菌bl21菌株，以促进上述列出的8种不同蛋白的表达。[0457]将菌株在lb培养基中生长过夜，然后再接种在添加有卡那霉素(30μg/ml)的相同培养基中，在200rpm下的摇床上直至其达到0.6-0.8(600nm)的浊度的光密度。当由异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导时，bl21菌株表达t7rna聚合酶。然后，将iptg(q.s.p.1mm)添加至培养物并在37℃下维持相同的培养条件另外的3小时。[0458]对各细菌菌株的培养物进行离心并将沉淀重悬于在150mmnacl和50mmtris，ph8.0中的10％cellytictm(sigma,br)中。对重组蛋白的试样(1μg/孔)进行含有sds的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)(laemmli,nature227:680-685,1970)。分别在4％和11％的丙烯酰胺浓度下制备浓缩凝胶(浓缩胶)和分离凝胶(分离胶)(表5，下文)。在变性条件下，在62.5mmtris-hcl缓冲液,ph6.8、2％sds、5％β-巯基乙醇、10％甘油中制备样品，并在95℃下煮5分钟(hamesbd,gelelectrophoresisofproteins:apracticalapproach.3.ed.oxford.1998)。电泳后，通过用考马斯亮蓝simplybluer250(thermofisher,br)染色来检测蛋白。标记物pagerulerplusprestainedstandards用作分子量参照(thermofisher,br)。图24，显示ag-covid19(第3列)、ag-covid19(h)(第4列)、tx-sars2-igm(第5列)、tx-sars2-igg(第6列)、tx-sars2-g/m(第7列)、tx-sars2-iga(第8列)、tx-sars2-universal(第9列)和tx-sars-g5(非rbd)(第10列)的条带。第1列显示分子量标记物：a)250kda；b)130kda；c)100kda；d)70kda；e)55kda；f)35kda和g)25kda。第2列显示未诱导的细菌的总提取物。[0459]可选地，还对培养物进行离心并将沉淀重悬于尿素缓冲液(100mmnah2po4、10mmtris-base、8m尿素，ph8.0)中。通过镍亲和性柱(histraptm，1ml，gehealthcarelifesciences)ml每分钟对溶液进行层析，所述柱先前在缓冲液a(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl和5mm咪唑)中平衡。结合后，用10ml的缓冲液a洗涤树脂。以0.7ml/分钟的流动速率在具有75mm、200mm、和500mm咪唑的缓冲液b(50mmtris-hcl,ph8.0、100mmnacl)中梯度洗脱蛋白45分钟。图25显示对应于具有六个组氨酸尾的ag-covid19蛋白的模式，表明200mm洗脱浓度。图26显示对应于通过使用200mm咪唑的亲和性纯化的sars2-g5蛋白的模式(由75mm进行的洗脱显示污染物)。[0460]结果显示，tx容器蛋白可很容易地用于产生新的且不同的蛋白。此外，可使用相同的表达方案进行具有不同多氨基酸的不同容器蛋白的表达，以极大地节约投入、时间、和基础设施。六个组氨酸尾的包含显示为用于以高纯度水平纯化的潜在促进剂。[0461]实施例29–使用ag-covid19和sars2-g5蛋白检测抗sars-cov-2抗体的酶联免疫吸附测定(elisa)[0462]酶联免疫吸附测定(elisa)用于筛选抗sars-cov-2抗体的存在。针对一组来自受到sars-cov-2病毒感染影响的个体的血清，评价ag-covid19和sars2-g5蛋白的性能。[0463]通过在4℃下、用ag-covid19蛋白(图27)或tx-sars2-g5蛋白(图28)的溶液(0.3m尿素，ph8.0)以1μg/孔包被96孔聚苯乙烯板12-18小时来进行elisa。用添加有tween20(pbs-t，10mm磷酸钠-na3po4，150mm氯化钠–nacl和0.05％tween-20，ph7.4)的盐水-磷酸盐缓冲液(pbs)溶液洗涤孔，然后在37℃下用含有5％(重量/体积)脱脂奶粉的1xpbs缓冲液孵育2小时。[0464]然后，用pbs-t缓冲液洗涤孔3次，并在37℃下、用在pbs/bsa1％中1:100稀释的人血清样品孵育1小时。孵育后，用pbs-t洗涤孔3次，然后在37℃下用以1:8000稀释的生物素标记的山羊抗人igg抗体(merck-sigma)孵育1小时。其后，添加hrp标记的高灵敏度中性亲和素(thermofisherscientific)。再次用pbs-t缓冲液洗涤孔3次并使用tmb底物(3.3’,5.5’四甲基联苯胺，thermofisherscientific)。避光下30分钟后，在elisa读板机中测定405nm处的吸光度。[0465]结果显示，通过表明优异的灵敏度和特异性指数，ag-covid19蛋白(图27)和tx-sars2-g5蛋白(图28)已证明有利地用于检测针对sars-cov-2的抗体。如从图27和28可以看出的，具有来自sars-cov-2的多氨基酸的蛋白在来自sars-cov-2流行前收集的个体、健康或受到例如登革热、疟疾、和梅毒等疾病影响的个体的血清中未检测到抗体。不同地，蛋白质在来自对sars-cov-2诊断为阳性(有症状或无症状)的个体、住院或已康复的患者的血清中检测到抗体。[0466]实施例30-ag-covid19蛋白作为疫苗组合物[0467]根据本专利申请中所描述的方案生产并纯化ag-covid19蛋白。在第0、14、21、和28天，用悬浮于弗氏不完全佐剂(25μl)中的在25μl的pbs中的10μg的ag-covid19蛋白对三只小鼠进行接种。使用接种pbs的动物进行阴性对照。在每次再接种前收集来自动物的血液样品并进行elisa。通过离心从收集的血液分离血浆并进行系列稀释以进行抗体测定(图29)。结果显示，在自第一次注射后四周后，针对ag-covid19的优异的抗体产生。[0468]实施例31-ag-covid19蛋白用于抗sars-cov-2抗体的纯化的用途[0469]使用抗体亲和性原理进行来自诊断有covid19的患者的血清的抗sars-cov-2抗体的纯化。ag-covid19蛋白缀合至由cnbr(gehealthcare,usa)激活的sepharosetm4b。在10mlpbs中稀释来自sars-cov-2阳性患者的10ml血清样品，并使其经受sepharose-ag-covid191小时。然后将混合物置于层析柱。在溶液穿过柱后，将10ml的pbs添加至层析系统，然后添加5ml的ph4的100mm柠檬酸钠缓冲液。随着从柱回收，顺序收集0.5ml的级分并通过280nm处的分光光度法定量抗体的存在。将各级分的吸光度转换为蛋白质浓度并作为级分的体积的函数作图。[0470]结果表明，ag-covid19蛋白可有用地作为来自先前感染有sars-cov-2的患者的抗体的亲和性纯化的内参neican(input)(图30)，表明其在产生用于被动免疫以应对covid-19流行病的可用的内参中的重要性。当前第1页12当前第1页12
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