促进西藏虎头兰生长分化的胶膜菌及其应用

1.本发明申请涉及植物学技术领域，具体涉及促进西藏虎头兰生长分化的胶膜菌及其应用。


背景技术：

2.西藏虎头兰（cymbidium tracyanum）是我国特有的花卉资源，多分布于南部森林中。在野外，该种类可附生于多种树木的枝干上，植株硕大、花色绚丽、花期较长，具有较高的观赏价值。西藏虎头兰是大花惠兰等兰属杂交品系的重要亲本，目前主要通过引种野生植株或种子无菌萌发获取幼苗以供品种选育使用。
3.兰科植物种子本身具有特殊的生物学特性，通常非常细小，没有胚乳。在自然条件下，兰科种子萌发成苗必须依靠特定的共生真菌来获取营养物质，成年植株的根系中也需要共生真菌定殖。兰科植物可通过自然分蘖和无菌播种等方式进行繁殖，前者繁殖系数低，后者依赖于对所需营养条件的细致摸索。目前西藏虎头兰已能通过无菌播种获得小苗，但无菌育苗的时间和技术成本较高，步骤繁琐，比如在种子萌发（约需1个月）、原球茎增殖继代（约需4个月）和生根壮苗（1个月）阶段需要不同的培养基，出瓶后需炼苗两周且生长慢易感病。与真菌共生培养获得的兰科幼苗，即共生苗或菌根苗，通常只需要较为贫瘠的培养条件，且生长发育快，出瓶后适应性更强。由于兰科种子与真菌的共生关系具有专一性，确定能与西藏虎头兰形成共生关系并促进生长分化的有效真菌是培育菌根苗的关键环节。目前针对药用兰科植物石斛属、白芨属及独蒜兰属等，已有相关专利涉及共生真菌在促生长方面的应用，但仍缺乏真菌在促进兰属幼苗分化方面的用途和方法的报道。


技术实现要素：

4.为解决或部分解决相关技术中存在的问题，本发明申请提供促进西藏虎头兰生长分化的胶膜菌及其应用。在pda平板培养基纯化培养胶膜菌菌株qs494后，与西藏虎头兰原球茎同时接种至共生培养基表面，约两周后，原球茎与真菌结成共生关系。五周后，接菌原球茎与不接菌原球茎的生长和分化显示出较大差异。三个月时，接种胶膜菌qs494的西藏虎头兰幼苗生长健壮，90%的个体分化出根。与未接种真菌组和印度梨形孢菌种接种组对比，接种胶膜菌qs494的西藏虎头兰的苗高和个体重量均有显著优势，证实胶膜菌qs494菌种对西藏虎头兰生长分化有较强的促进作用。
5.本发明申请第一方面提供了胶膜菌qs494（tulasnella sp.），其保藏编号为：cgmcc no. 25305。
6.本发明申请第二方面提供了上述胶膜菌qs494在西藏虎头兰繁育中的应用。
7.本发明申请第三方面提供了促进西藏虎头兰原球茎分化形成幼苗的方法，包括以下步骤：将保藏编号为：cgmcc no. 25305的胶膜菌qs494在培养皿内活化培养后切取菌片，与西藏虎头兰无菌原球茎同时播种在共生培养基上，在人工气候室中25℃培养条件下
获得共生幼苗。
8.应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明申请。
9.本发明的有益技术效果：（1）本发明首次选用两种兰科菌根真菌菌种（印度梨形孢和胶膜菌菌种qs494）与西藏虎头兰原球茎进行共生培养，其中胶膜菌菌种qs494能在三个月内促使西藏虎头兰原球茎快速分化成叶长约2 cm、根长约1 cm的优质共生幼苗，与无菌育苗相比，时间缩短了两个月。
10.（2）采用胶膜菌qs494进行西藏虎头兰育苗，可在贫瘠培养基上进行，原球茎形成后仅需一次转接。与之相比，无菌育苗需要先转接至增殖继代培养基，四个月后再转接至生根壮苗培养基，两类培养基营养成分繁杂且需添加激素。因此，利用本菌种进行共生育苗，可大大降低人力和资源成本，适于推广应用，具有代替无菌种苗繁育的应用价值。
11.生物保藏说明tulasnella sp.qs494，分类命名：tulasnella sp.（担子菌门伞菌纲鸡油菌目胶膜菌科），于2022年07月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no：25305。
附图说明
12.图1为本发明申请中胶膜菌qs494（cgmcc 25305）菌丝及念珠状细胞形态特征。菌丝细胞中的亮点为细胞核，白色箭头示细胞隔膜。hoechst 33342染液染色，荧光显微镜下观察。
13.图2为本发明申请中接种至oma培养基15天后的西藏虎头兰原球茎。左中右分别为不接菌对照组、接种胶膜菌qs494对照组、接种印度梨形孢对照组。箭头示真菌菌丝团。
14.图3为本发明申请中西藏虎头兰原球茎接种至oma培养基35天后长势对比。左中右分别为不接菌对照组、胶膜菌qs494接种组、印度梨形孢接种组。
15.图4本发明申请中西藏虎头兰原球茎接种至oma培养基90天后长势对比。左边上下两图为不接菌对照组，中间上下两图为胶膜菌qs494接种组，右边上下两图为印度梨形孢接种组。
16.图5为本发明申请中西藏虎头兰幼苗株高（左图）和个体重量（右图）对比，原球茎转接至oma培养基90天后测量。asymbiotic、symbio-qs494和symbio-si分别为不接菌对照组、胶膜菌qs494接种组、印度梨形孢接种组。株高用image j软件测量，未计入根长。数据为平均值 标准误（统计个体数≥40），柱状图上方字母（a-c）不同，则表示组间存在显著差异（单因素方差分析，lsd检验，p《0.05）。方差分析在spss16.0中完成，柱状图由sigmaplot 14.0软件制作。
具体实施方式
17.下面将参照附图更详细地描述本发明申请的可选实施方式。虽然附图中显示了本发明申请的可选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明申请而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明申请更加透彻和完整，并
且能够将本发明申请的范围完整地传达给本领域的技术人员。
18.在本发明申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明申请。在本发明申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
19.以下结合附图对本发明申请促进西藏虎头兰生长分化的胶膜菌及其应用进行详细说明，具体如下：胶膜菌qs494（tulasnella sp.），其保藏编号为：cgmcc no. 25305。
20.菌落形态呈乳白色，放射状发散生长，菌丝双核，易产生念珠状细胞（图1）。
21.菌株获取途径如下：取兰科菌根片段在解剖镜下横切成薄片，置于显微镜下观察真菌菌丝团(peloton)定殖情况。将菌丝团丰富的菌根片段置于盛有2% naclo的灭菌三角瓶中，浸泡4 min后用镊子取出，用无菌水泡洗3次。在超净台上，用无菌手术刀将菌根片段斜切，将剖面贴于pda培养平板上，25度倒置培养。待菌根片段边缘长出菌丝，切取菌丝到转接新的培养基上，得到纯菌落并进行编号。在平板培养基表面刮取菌丝，利用ctab法提取dna，进行pcr扩增及dna测序鉴定。将配制好的pda培养基灭菌后，分装入无菌的带硅胶塞的18*180 mm的玻璃试管中，每管分装量为试管的1/3，摆成斜面冷却待用。在超净台上将用无菌手术刀切取纯化菌株的菌丝块接种至试管的斜面上，注明菌株编号和日期。将接种好的试管置于培养箱中25℃培养，待菌丝即将长满斜面时，将试管转入4℃保存，并制作复份寄送到中国科学院微生物研究所菌保中心进行长期保藏。
22.促进西藏虎头兰原球茎分化形成幼苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：将胶膜菌菌株qs494，在pda平板培养基纯化培养后，与西藏虎头兰原球茎同时接种至共生培养基表面，约两周后，原球茎与真菌结成共生关系。五周后，接菌原球茎与不接菌原球茎的生长和分化显示出较大差异。三个月时，接种胶膜菌qs494的西藏虎头兰幼苗生长健壮，90%的个体分化出根。与未接种真菌组和印度梨形孢菌种接种组对比，接种胶膜菌qs494的西藏虎头兰的苗高和个体重量均有显著优势，证实胶膜菌qs494菌种对西藏虎头兰生长分化有较强的促进作用。
23.为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。
24.实施例1 胶膜菌菌株qs494促进西藏虎头兰原球茎生长分化的有效性实验：1、菌株活化：在超净台上，将前期冷藏的菌株切取一小块至新制备的培养平皿中央，封口编号，黑暗条件下倒置培养一周，以恢复其活力。菌株活化采用马铃薯葡萄糖培养基（potato dextrose agar，pda）培养基，制备方法如下：去皮马铃薯200 g 煮软后取滤液，加20 g 葡萄糖，15 g琼脂粉，煮沸定容至1l，分装至三角瓶，121℃、15 min高压灭菌，分装至培养皿冷却备用。
25.2、西藏虎头兰原球茎获得：将西藏虎头兰种子在ms培养基（murashige & skoog medium，sigma-aldrich）上无菌播种获得原球茎（具体方法可参考王莲辉等 2009 植物生理学通讯45:51）。
26.3、真菌和西藏虎头兰原球茎的共生培养实验选用燕麦琼脂培养基（oat meal agar，oma，燕麦4 g/l，琼脂8 g/l，煮沸定容灭菌分装备用）。在超净台上，将西藏虎头兰无菌原球茎用镊子拨散后接种至oma培养基上。将第一步活化的真菌切取菌片接种至oma平皿
中央。实验同时设置无菌对照组、qs494接种组和印度梨形孢接种组。其中无菌对照组除将无菌培养基菌片接种至oma培养平皿中央，其余处理与真菌接种组相同。印度梨形孢（serendipita indica）隶属于担子菌门伞菌纲腊壳菌目serendipitaceae，对部分兰科植物（如兰属杂交种和铁皮石斛等）表现出较强的促生长作用（详见吕祥涛等 2020东南园艺8:20；许凤来等 2021 热带亚热带植物学报 29:59）。同时设置印度梨形孢接种组，可直观反应胶膜菌菌株qs494对西藏虎头兰原球茎分化成苗的促进作用。本实验所用的印度梨形孢菌种购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏号为cgmcc no. 3.17686）。三个处理组均置于光照12 h/黑暗12 h，光强为1000 lx的培养室内，25℃恒温培养。
27.4、定期观察培养皿，在两周后，可见真菌菌丝布满培养皿表面，原球茎保持健康状态。取原球茎进行解剖观察，发现两个真菌接种组的原球茎基部皮层细胞中已定殖有共生真菌菌丝团（图2），说明两种真菌均能与西藏虎头兰结成共生关系。
28.5、五周后，无菌原球茎和接菌原球茎在生长及分化上体现出直观差异，具体表现为：无菌原球茎和接种初期无明显变化，但接菌原球茎多分化出1-2片嫩叶（图3）。
29.6、接种三个月后，无菌原球茎和接菌原球茎在生长及分化上体现出较大差异。具体表现为：不接菌对照组分化出叶片，40余个原球茎中，约33%的个体分化出根，但植株较小；胶膜菌qs494接种组和印度梨形孢接种组幼苗叶片长势均较好，但前一处理组90%的个体分化出根，后一处理组仅7.5%的个体分化出较短的根。经测量和统计苗高和个体重量，发现接种胶膜菌qs494的西藏虎头兰原球茎在生长和根系分化方面与不接菌对照组具有显著差异（图5）。
30.以上已经描述了本发明申请的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。