调节人体微生态的复合菌及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及益生菌领域，具体涉及调节人体微生态的复合菌及其制备方法和应用。


背景技术：

2.人体微生态系统包括口腔、皮肤、泌尿道、呼吸道、阴道和肠道6个微生态系统，其中，肠道微生态系统最重要也最复杂，根据文献：蒋建文, 李兰娟. 人体微生态与疾病的研究现状和展望[j]. 传染病信息, 2016(5):7.的记载可知，肠道微生态与感染性疾病、肥胖和糖尿病等代谢性疾病、肝病以及肠道疾病等均密切相关。
[0003]
人体微生态失调指正常的微生物群之间和正常微生物群与宿主之间的微生态平衡，在外环境影响下，由生理性组合转变为病理性组合状态。微生态失调包括：
①
菌群失调，即有益菌数量和密度下降，菌膜屏障作用削弱；
②
菌群易立，即微生物种群间斗争，以及
③
外籍菌入群等。当人体微生态失调时，将会造成相关疾病的发生，而根据研究发现人体微生态的平衡则有助于疾病的防治。
[0004]
相关研究表明益生菌与人体微生态之间存在密切的联系，如文献：申兵兵, 许梅花. 乳酸菌与人体微环境之间相互关系的研究[j]. 家庭医药.就医选药, 2017(12).研究发现，乳酸菌作为益生菌在人体肠道微生态平衡、疾病防治和保健中起着至关重要的作用。文献：金苏, 蔡东联. 评估丹尼斯克乳双歧杆菌bi07及嗜酸乳杆菌ncfm对人体肠道消化系统微生态环境改善功效的研究[j]. 中华疾病控制杂志, 2010(2):3.研究了丹尼斯克乳双歧杆菌bi07及嗜酸乳杆菌ncfm对肠道消化系统微生态环境改善效果，结果发现，上述两种菌可以有效改善人体肠道消化系统微生态环境,志愿者体内双歧杆菌、乳杆菌活菌数显著增加,产气荚膜杆菌活菌数显著减少。文献：田洪涛, 张柏林, 贾英民等. 双歧杆菌与人体胃肠道微生态[j].河北农业大学学报, 2000.则研究了肠道双歧杆菌与微生态平衡间的相关关系。
[0005]
基于以上研究，相关菌剂被用以调节人体微生态平衡，如专利cn107308190a公开了调节人体微生态平衡的益生菌组合物及其培养物、制剂、用途，该益生菌组合物由副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、植物乳杆菌植物亚种和瑞士乳杆菌制备而成，进而可以用于预防和治疗婴湿疹等免疫系统疾病以及多种类型肠炎。
[0006]
再如专利cn101406489b公开了微生态复合菌剂的制备方法，该微生态复合菌剂主要由纳豆芽孢杆菌、乳酸克鲁维酵母菌、嗜酸乳杆菌和大豆低聚糖组成。制备方法：培养；扩大培养；转入高菌浓度培养液继续培养、离心；加入辅料，预冻、真空冷冻干燥，之后加入大豆低聚糖，即得到微生态复合菌剂，该微生态复合菌剂具有较多的有益活菌总数和存活率。
[0007]
但目前，单一益生菌调节微生态的能力有限，而复合菌虽能够通过竞争等调节微生态，但也通常存在着的多菌种活性低以及培养基安全性差等问题。因此，针对以上问题，寻找一种能够有效调节肠道微生态的复合菌十分必要。


技术实现要素：

[0008]
本发明针对现有技术存在的问题，提供了调节人体微生态的复合菌及其制备方法和应用，制得的复合菌可调节肠道微生态，从而降低感染性疾病、肥胖、糖尿病等代谢疾病的得病风险。
[0009]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：本发明提供了一种复合菌的制备方法，包括以下步骤：（1）将植物乳杆菌接入培养基后，好氧发酵，得到发酵液a；（2）将鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌接入培养基后，厌氧发酵，得到发酵液b；（3）将发酵液a和发酵液b混合后，离心浓缩，得到活性菌泥，干燥，即得复合菌；所述培养基包括：蛋白胨、甘蔗糖蜜、酵母膏、磷酸氢二钾、柠檬酸钠、玉米低聚肽粉、棉籽低聚糖、五水合硫酸镁、吐温-80、烟酰胺、d-异抗坏血酸钠、花生四烯酸油脂、维生素b1。
[0010]
进一步地，所述培养基包括：4-6g/l蛋白胨、2-4g/l甘蔗糖蜜、3-6g/l酵母膏、3-6g/l磷酸氢二钾、0.5-3g/l柠檬酸钠、8-16g/l玉米低聚肽粉、0.5-4.5g/l棉籽低聚糖、0.5-2g/l五水合硫酸镁、0.5-5ml/l吐温-80、1-6g/l烟酰胺、d-异抗坏血酸钠35-40mg/l、花生四烯酸油脂20-40mg/l、维生素b
1 2-10mg/l。在实际操作时，使用去离子水补足1l。
[0011]
优选地，所述培养基包括：5g/l蛋白胨、3g/l甘蔗糖蜜、5g/l酵母膏、5g/l磷酸氢二钾、2g/l柠檬酸钠、10g/l玉米低聚肽粉、1g/l棉籽低聚糖、1g/l五水合硫酸镁、1.5ml/l吐温-80、2g/l烟酰胺、d-异抗坏血酸钠36mg/l、花生四烯酸油脂28mg/l、维生素b
1 3mg/l。在实际操作时，使用去离子水补足1l。
[0012]
进一步地，所述双歧杆菌包括婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌中的一种或多种。优选为婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和长双歧杆菌；进一步优选为体积比为1:1:1:1:1的婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和长双歧杆菌。
[0013]
进一步地，按体积百分比计，所述鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和双歧杆菌在培养基中的接种量为2-5%；所述植物乳杆菌在培养基中的接种量为1-2%。
[0014]
进一步地，所述鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌的接种量的体积比为1:1:1。
[0015]
进一步地，所述好氧发酵的温度为35-37℃，时间为24h，转速为150-200r/min；所述厌氧发酵的温度为35-37℃，时间为48h，转速为110-150r/min。
[0016]
进一步地，本发明还提供了上述的制备方法得到的复合菌。
[0017]
进一步地，本发明还提供的上述的制备方法得到的复合菌能够用于制备调节人体微生态产品。
[0018]
进一步地，所述调节人体微生态产品包括菌粉、含片、发酵乳、软糖或饮料。
[0019]
进一步地，所述调节人体微生态产品的原料还包括辅料；进一步地，所述辅料包括抗性糊精、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、全脂乳粉、海藻粉。
[0020]
本发明所取得的技术效果是：1.本发明选取鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、植物乳杆菌进行搭配培养，
在实际操作时，根据实际情况对不同菌种分别进行好氧发酵与厌氧发酵，降低动力消耗。同时，将培养基进行优化，具体地，合理添加培养基成分，添加的棉籽低聚糖（又称棉子低聚糖）在辅助增殖有益菌方面存在着优良的效果，该棉籽低聚糖配合d-异抗坏血酸钠、花生四烯酸油脂共同使用，效果更优，进而得到的培养基能够有效促进益生菌活性的提高、生长，增加对碳源等成分的利用率，保证菌体的稳定性。
[0021]
2.本发明最终制备得到的复合菌能够直接或间接通过与辅料等进行搭配使用制得制剂能够直接补充正常生理细菌，同时益生菌代谢过程产生乳酸、醋酸以及其他有机酸，能够降低肠道ph值，形成肠道酸环境，清理肠道中致病菌，进而高效调节人体微生态，尤其可调节肠道微生态，从而降低感染性疾病、肥胖、糖尿病等代谢疾病的得病风险。
具体实施方式
[0022]
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0023]
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
[0024]
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
[0025]
值得说明的是，本发明中使用的菌体分别为：婴儿双歧杆菌ccfm687，鼠李糖乳杆菌ccfm0528，植物乳杆菌cn2018，干酪乳杆菌cn1566，青春双歧杆菌ccfm1173，动物双歧杆菌ccfm1155，两歧双歧杆菌ccfm1167，鼠李糖乳杆菌ccfm1219，长双歧杆菌ccfm760，其余原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。
[0026]
实施例1一种复合菌的制备方法，包括以下步骤：（1）将植物乳杆菌接入培养基后（接种量占培养基中培养液的2% v/v），好氧发酵，温度为35℃，时间为24h，转速为200r/min，得到发酵液a；（2）将体积比为1:1:1鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌（体积比为1:1:1:1:1婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和长双歧杆菌），接入培养基后（接种量占培养基中培养液的1% v/v），厌氧发酵，温度为35℃，时间为48h，转速为150r/min，得到发酵液b；（3）将发酵液a和发酵液b混合后，离心浓缩，得到活性菌泥，干燥，即得复合菌；其中，培养基包括：4g/l蛋白胨、2g/l甘蔗糖蜜、3g/l酵母膏、3g/l磷酸氢二钾、0.5g/l柠檬酸钠、8g/l玉米低聚肽粉、0.5g/l棉籽低聚糖、0.5g/l五水合硫酸镁、0.5ml/l吐温-80、1g/l烟酰胺、d-异抗坏血酸钠35mg/l、花生四烯酸油脂20mg/l、维生素b
1 2mg/l。在实际操作时，使用去离子水补足1l。
[0027]
实施例2
一种复合菌的制备方法，包括以下步骤：（1）将植物乳杆菌接入培养基后（接种量占培养基中培养液的5% v/v），好氧发酵，温度为37℃，时间为24h，转速为150r/min，得到发酵液a；（2）将体积比为1:1:1鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌（体积比为1:1:1:1:1婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和长双歧杆菌），接入培养基后（接种量占培养基中培养液的2% v/v），厌氧发酵，温度为37℃，时间为48h，转速为110r/min，得到发酵液b；（3）将发酵液a和发酵液b混合后，离心浓缩，得到活性菌泥，干燥，即得复合菌；其中，培养基包括：6g/l蛋白胨、4g/l甘蔗糖蜜、6g/l酵母膏、6g/l磷酸氢二钾、3g/l柠檬酸钠、16g/l玉米低聚肽粉、4.5g/l棉籽低聚糖、2g/l五水合硫酸镁、5ml/l吐温-80、6g/l烟酰胺、d-异抗坏血酸钠40mg/l、花生四烯酸油脂40mg/l、维生素b
1 10mg/l。在实际操作时，使用去离子水补足1l。
[0028]
实施例3一种复合菌的制备方法，包括以下步骤：（1）将植物乳杆菌接入培养基后（接种量占培养基中培养液的2-5% v/v），好氧发酵，温度为35-37℃，时间为24h，转速为150-200r/min，得到发酵液a；（2）将体积比为1:1:1鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌（体积比为1:1:1:1:1婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和长双歧杆菌），接入培养基后（接种量占培养基中培养液的2% v/v），厌氧发酵，温度为36℃，时间为48h，转速为110-150r/min，得到发酵液b；（3）将发酵液a和发酵液b混合后，离心浓缩，得到活性菌泥，干燥，即得复合菌；其中，培养基包括：5g/l蛋白胨、3g/l甘蔗糖蜜、5g/l酵母膏、5g/l磷酸氢二钾、2g/l柠檬酸钠、10g/l玉米低聚肽粉、1g/l棉籽低聚糖、1g/l五水合硫酸镁、1.5ml/l吐温-80、2g/l烟酰胺、d-异抗坏血酸钠36mg/l、花生四烯酸油脂28mg/l、维生素b
1 3mg/l。在实际操作时，使用去离子水补足1l。
[0029]
实施例4一种复合菌的制备方法，包括以下步骤：（1）将植物乳杆菌接入培养基后（接种量占培养基中培养液的2% v/v），好氧发酵，温度为35℃，时间为24h，转速为200r/min，得到发酵液a；（2）将体积比为1:1:1鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、婴儿双歧杆菌，接入培养基后（接种量占培养基中培养液的1% v/v），厌氧发酵，温度为35℃，时间为48h，转速为150r/min，得到发酵液b；（3）将发酵液a和发酵液b混合后，离心浓缩，得到活性菌泥，干燥，即得复合菌；其中，培养基包括：4g/l蛋白胨、2g/l甘蔗糖蜜、3g/l酵母膏、3g/l磷酸氢二钾、0.5g/l柠檬酸钠、8g/l玉米低聚肽粉、0.5g/l棉籽低聚糖、0.5g/l五水合硫酸镁、0.5ml/l吐温-80、1g/l烟酰胺、d-异抗坏血酸钠35mg/l、花生四烯酸油脂20mg/l、维生素b
1 2mg/l。在实际操作时，使用去离子水补足1l。
[0030]
实施例5一种复合菌的制备方法，包括以下步骤：
（1）将植物乳杆菌接入培养基后（接种量占培养基中培养液的5% v/v），好氧发酵，温度为37℃，时间为24h，转速为150r/min，得到发酵液a；（2）将体积比为1:1:1鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌（体积比为1:1的动物双歧杆菌、青春双歧杆菌），接入培养基后（接种量占培养基中培养液的2% v/v），厌氧发酵，温度为37℃，时间为48h，转速为110r/min，得到发酵液b；（3）将发酵液a和发酵液b混合后，离心浓缩，得到活性菌泥，干燥，即得复合菌；其中，培养基包括：6g/l蛋白胨、4g/l甘蔗糖蜜、6g/l酵母膏、6g/l磷酸氢二钾、3g/l柠檬酸钠、16g/l玉米低聚肽粉、4.5g/l棉籽低聚糖、2g/l五水合硫酸镁、5ml/l吐温-80、6g/l烟酰胺、d-异抗坏血酸钠40mg/l、花生四烯酸油脂40mg/l、维生素b
1 10mg/l。在实际操作时，使用去离子水补足1l。
[0031]
对比例1一种复合菌的制备方法，包括以下步骤：（1）将植物乳杆菌接入培养基后（接种量占培养基中培养液的2% v/v），好氧发酵，温度为35℃，时间为24h，转速为200r/min，得到发酵液a；（2）将体积比为1:1:1凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌（体积比为1:1:1:1:1婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和长双歧杆菌），接入培养基后（接种量占培养基中培养液的1% v/v），厌氧发酵，温度为35℃，时间为48h，转速为150r/min，得到发酵液b；（3）将发酵液a和发酵液b混合后，离心浓缩，得到活性菌泥，干燥，即得复合菌；其中，培养基包括：4g/l蛋白胨、2g/l甘蔗糖蜜、3g/l酵母膏、3g/l磷酸氢二钾、0.5g/l柠檬酸钠、8g/l玉米低聚肽粉、0.5g/l棉籽低聚糖、0.5g/l五水合硫酸镁、0.5ml/l吐温-80、1g/l烟酰胺、d-异抗坏血酸钠35mg/l、花生四烯酸油脂20mg/l、维生素b
1 2mg/l。在实际操作时，使用去离子水补足1l。
[0032]
也即，与实施例1的区别仅在于，将培养基中的鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌分别替换为等量凝结芽孢杆菌atcc7050、等量嗜酸乳杆菌atcc4356。
[0033]
对比例2一种复合菌的制备方法，包括以下步骤：（1）将植物乳杆菌接入培养基后（接种量占培养基中培养液的2% v/v），好氧发酵，温度为35℃，时间为24h，转速为200r/min，得到发酵液a；（2）将体积比为1:1:1凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌（体积比为1:1:1:1:1婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和长双歧杆菌），接入培养基后（接种量占培养基中培养液的1% v/v），厌氧发酵，温度为35℃，时间为48h，转速为150r/min，得到发酵液b；（3）将发酵液a和发酵液b混合后，离心浓缩，得到活性菌泥，干燥，即得复合菌；其中，培养基包括：4g/l蛋白胨、2g/l甘蔗糖蜜、3g/l酵母膏、3g/l磷酸氢二钾、0.5g/l柠檬酸钠、8g/l玉米低聚肽粉、0.5g/l棉籽低聚糖、0.5g/l五水合硫酸镁、0.5ml/l吐温-80、1g/l烟酰胺、花生四烯酸油脂55mg/l、维生素b
1 2mg/l。在实际操作时，使用去离子水补足1l。
[0034]
也即，与实施例1的区别仅在于，将d-异抗坏血酸替换为等量的花生四烯酸油脂。
[0035]
对比例3一种复合菌的制备方法，包括以下步骤：（1）将植物乳杆菌接入培养基后（接种量占培养基中培养液的2% v/v），好氧发酵，温度为35℃，时间为24h，转速为200r/min，得到发酵液a；（2）将体积比为1:1:1凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌（体积比为1:1:1:1:1婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和长双歧杆菌），接入培养基后（接种量占培养基中培养液的1% v/v），厌氧发酵，温度为35℃，时间为48h，转速为150r/min，得到发酵液b；（3）将发酵液a和发酵液b混合后，离心浓缩，得到活性菌泥，干燥，即得复合菌；其中，培养基包括：4g/l蛋白胨、2g/l甘蔗糖蜜、3g/l酵母膏、3g/l磷酸氢二钾、0.5g/l柠檬酸钠、8g/l玉米低聚肽粉、0.5g/l棉籽低聚糖、0.5g/l五水合硫酸镁、0.5ml/l吐温-80、1g/l烟酰胺、d-异抗坏血酸钠55mg/l、维生素b
1 2mg/l。在实际操作时，使用去离子水补足1l。
[0036]
也即，与实施例1的区别仅在于，将花生四烯酸油脂替换为等量的d-异抗坏血酸钠。
[0037]
对比例4一种复合菌的制备方法，包括以下步骤：（1）将植物乳杆菌接入培养基后（接种量占培养基中培养液的2% v/v），好氧发酵，温度为35℃，时间为24h，转速为200r/min，得到发酵液a；（2）将体积比为1:1:1凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌（体积比为1:1:1:1:1婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和长双歧杆菌），接入培养基后（接种量占培养基中培养液的1% v/v），厌氧发酵，温度为35℃，时间为48h，转速为150r/min，得到发酵液b；（3）将发酵液a和发酵液b混合后，离心浓缩，得到活性菌泥，干燥，即得复合菌；其中，培养基包括：4g/l蛋白胨、2g/l甘蔗糖蜜、3g/l酵母膏、3g/l磷酸氢二钾、0.5g/l柠檬酸钠、8g/l玉米低聚肽粉、0.5g/l五水合硫酸镁、0.5ml/l吐温-80、1g/l烟酰胺、维生素b
1 2mg/l。在实际操作时，使用去离子水补足1l。
[0038]
也即，与实施例1的区别在于，培养基中不添加花生四烯酸油脂、d-异抗坏血酸钠、棉籽低聚糖。
[0039]
应用实施例1一种调节人体微生态产品：将实施例1的复合菌与抗性糊精、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、全脂乳粉、海藻粉混合即得。
[0040]
应用实施例2一种调节人体微生态产品：将实施例2的复合菌与抗性糊精、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、全脂乳粉、海藻粉混合即得。
[0041]
应用实施例3一种调节人体微生态产品：将实施例3的复合菌与抗性糊精、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、全脂乳粉、海藻粉混合即得。
[0042]
一、肠道菌群调节作用试验
试验动物：c57bl/6j小鼠，雄性；试验方法：将小鼠随机分为对照组和实例组，每组6只，实例组灌胃各实例中复合菌，灌胃量为0.4g/kg
·
d，时间为2周，对照组灌胃等量生理盐水；收集灌胃前和灌胃后各个小鼠的新鲜粪便0.1g进行肠道菌群的检测，具体地，将样品加生理盐水稀释后，振荡均质，稀释后滴加至培养基上50μl，待培养基吸干后，tsc培养基，37℃厌氧培养48h，待菌落长出后，检测产气荚膜梭菌clostridium perfringens的细菌数量，结果以对数值lgcfu
·
g-1
表示，结果如下表所示：表1 小鼠肠道菌群数量情况（
±
s）（注：与模型对照组相比，*：p＜0.05，**：p＜0.01。
[0043]
二、排便试验试验动物：8周龄km小鼠，雄性；试验方法：
①
墨汁配置：将阿拉伯胶与水混合后煮沸，加入活性炭粉，继续煮沸，冷却备用；
②
造模：将小鼠禁食不进禁水喂养1天后，使用0.025%复方地芬诺脂造模；
②
给予受试物：造模30min后，将造模成功的小鼠随机分为模型对照组和实例组，每组6只，实例组分别灌胃不同实例中的复合菌，灌胃量为0.4g/kg
·
d，模型对照组灌胃等量生理盐水，另外选取6只未造模小鼠作为空白组给予等量生理盐水，各组小鼠均给予配制好的墨汁6h后观察小鼠排便情况，将首粒排便平均时间统计至表2中。
[0044]
表2 小鼠排便情况由以上试验结果可知，本发明中的复合菌能够有效调节肠道微生态平衡、缩短首粒排黑时间，综合考虑，选择实施例3对应的方法作为最优复合菌的制备方法，将该复合菌
搭配人体可食辅料，如抗性糊精、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、全脂乳粉、海藻粉等，进行配合生产得到的产品能够有效调节人体肠道微生态。
[0045]
除以上案例外，实施例4-5对应的方法主要探究了替换双歧杆菌菌种对产品的影响，最终得到的产品同样也具有与实施例1-3类似相近似的性能，表明双歧杆菌的种类对产品本身的效果影响不大，但在尝试替换其他菌种后，由于发酵条件的不适应性，最终产品的效果将差强人意。
[0046]
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。