一种红曲米高产GABA菌株及发酵方法

一种红曲米高产gaba菌株及发酵方法
技术领域
1.本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种红曲米高产gaba菌株及发酵方法。


背景技术：

2.红曲霉(monascus sp.)是中国传统的食药两用腐生真菌，生长的最适ph为3.5～5，能耐ph 3.5。生长温度为26～42℃，最适温度32℃～35℃，能耐10％乙醇，由它制作的红曲米(red yeast rice)历史悠久，红曲米的代谢产物众多，有色素(黄色素、橙色素和红色素)、monacolin k和gaba(γ-aminobutyric acid)，广泛用于生活医疗中降血脂、保健等功效。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，gaba)作为一种独特的四碳非蛋白氨基酸，抑制性神经递质，具有调节心血管活动、调节心律失常、营养神经细胞等生理功能，可以治疗癫痫和高血压，但是原菌株的产量较低，因此通过发酵条件的优化从而寻求到高产gaba的发酵方法至关重要。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种红曲米高产gaba菌株及发酵方法，gaba产量达到5.608mg
·
g-1
。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
5.本发明提供了一种红曲米高产gaba菌株monascus anka ma-25。
6.本发明还提供了所述菌株monascus anka ma-25在发酵生产gaba中的应用。
7.本发明还提供了一种红曲米高产gaba的发酵方法，以大米培养基为基质，接种所述菌株monascus anka ma-25发酵生产gaba。
8.优选的是，所述大米培养基组分包括大米和水，所述大米与水的比例为5:4。
9.更优选的是，所述大米培养基还包括葡萄糖0.25-1.25％、麦芽糖0.25-1.25％、谷氨酸0.5-1.50％；还添加有硫酸铵0.2-0.3％。
10.优选的是，所述接种量为大米培养基体积的10-15％。
11.优选的是，所述大米培养基初始ph 5.5-7.5。
12.优选的是，所述发酵温度28-32℃。
13.优选的是，所述发酵培养9-11d。
14.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
15.本发明提供了一种红曲米高产gaba菌株monascus anka ma-25，具有gaba高产的能力，达到4.651mg
·
g-1
，且遗传稳定性好。
16.本发明还提供了所述菌株的高产gaba的发酵培养基及发酵方法，通过调节碳氮源、初始ph等，优化菌株monascus anka ma-25产gaba能力达到5.608mg
·
g-1
，较优化前提升20.58％。
附图说明
17.图1：碳源、氮源单因素对gaba产量的影响；
18.图2；培养温度、培养时间、初始ph单因素对gaba产量的影响；
19.图3：响应面法立体分析及等高线图。
具体实施方式
20.本发明提供了一种红曲米高产gaba菌株monascus anka ma-25，该菌株具备gaba高产能力，产量能够达到4.651mg
·
g-1
以上。
21.本发明还提供了一种红曲米高产gaba的发酵方法，以大米培养基为基质，接种所述菌株monascus anka ma-25发酵生产gaba。
22.本发明优选大米培养基组分包括大米和水，所述大米与水的比例为5:4(体积比)，进一步优选大米为粳米；作为一种可实施方式，制备方法包括以下步骤：粳米20g，按照米：水＝5:4的比例(体积比)添加水后分装到100ml小三角瓶中，121℃灭菌30min。
23.本发明还对上述大米培养基进行了优化，以进一步提升菌株monascus anka ma-25的产gaba能力。优选大米培养基还包括葡萄糖0.25-1.25％，进一步优选葡萄糖0.58％；麦芽糖0.25-1.25％，进一步优选麦芽糖0.58％；谷氨酸0.5-1.50％，进一步优选谷氨酸1.18％；进一步优选包括硫酸铵0.2-0.3％，更优选硫酸铵0.25％；更优选还包括nah2po4、mgso4。所述百分比为大米培养基质量浓度。
24.本发明还对上述发酵培养过程中的条件进行了优化，以进一步提升菌株monascus anka ma-25的产gaba能力。优选菌株monascus anka ma-25接种量为大米培养基体积的10％-15％，进一步优选10％；优选大米培养基初始ph为5.5-7.5，进一步优选ph 6-7，更优选ph为6.08；优选发酵温度28-32℃，进一步优选30℃；优选发酵培养9-11d，进一步优选9d。在本发明大米培养基及发酵条件下，菌株monascus anka ma-25产gaba能力达到5.608mg
·
g-1
，较优化前提升20.58％。
25.若无特殊说明，本发明所使用的方法均为常规方法，所使用的试剂、材料均可通过商业途径获得。
26.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
27.实施例1
28.一种红曲米高产gaba的发酵方法，步骤如下：
29.通过斜面培养、种子培养获得菌株monascus anka ma-25种子液，以大米培养基作为基础培养基，按大米培养基体积的10％接种种子液，发酵温度30℃，发酵9d；
30.大米培养基组成：粳米20g，米：水＝5:4，葡萄糖0.58％，麦芽糖0.58％，谷氨酸1.18％，ph 6.08。
31.实施例2
32.一种红曲米高产gaba的发酵方法，步骤如下：
33.与实施例1的区别在于：接种量15％，发酵温度28℃，发酵11d；大米培养基组成：粳米20g，米：水＝5:4，葡萄糖0.25％，麦芽糖0.25％，谷氨酸0.5％，硫酸铵0.25％，ph 5.5。
34.实施例3
25遗传稳定较好。
55.表1菌株monascus anka ma-25发酵红曲米粉gaba含量
[0056][0057]
实施例5
[0058]
单因素试验-碳源对gaba产量的影响
[0059]
以基础培养基为基质，ma-25种子液按照10％的接种量接种，于30℃的培养箱中培养7d，分别选择葡萄糖、葡萄糖 麦芽糖(1:1)、麦芽糖、碳酸氢铵、蔗糖为碳源，添加量为1％的加入到基础培养基中筛选促进gaba合成的碳源。
[0060]
试验结果：
[0061]
由图1可知，葡萄糖 麦芽糖作为碳源时发酵液中gaba含量最高，为5.067mg
·
g-1
，显著高于其它碳源(p＜0.05)，表明葡萄糖 麦芽糖是最适碳源。
[0062]
实施例6
[0063]
单因素试验-氮源对gaba产量的影响
[0064]
以基础培养基为基质，ma-25种子液按照10％的接种量接种，于30℃的培养箱中培养7d，按照1％的添加量分别加入蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、硫酸铵、硝酸铵、尿素为唯一的氮源，筛选有利于gaba合成的氮源。
[0065]
试验结果：
[0066]
由图1可知，硫酸铵作为氮源时发酵液中gaba含量最高，产量为4.341mg
·
g-1
，表明硫酸铵为最适氮源。
[0067]
实施例7
[0068]
单因素试验-初始ph对gaba产量的影响
[0069]
以基础培养基为基质，调整灭菌前的基础培养基的ph，以4.0为初始ph，1.0一个梯度，逐渐增加至8.0配制，种子液按照10％的接种量接种，于30℃的培养箱中培养7d，考察gaba的产量。
[0070]
试验结果：
[0071]
如图2所示，筛选结果显示ph 6条件下，gaba的含量为4.165mg
·
g-1
，且显著高于其它酸碱度(p＜0.05)，则ph 6为最适ph。
[0072]
实施例8
[0073]
单因素试验-培养时间对gaba产量的影响
[0074]
将ma-25种子液以10％的接种量接种于基础培养基，30℃，分别培养5、6、7、8、9、10、11d，筛选最适合gaba积累的培养时间。
[0075]
试验结果：
[0076]
如图2所示，在培养9d时，gaba含量达到最大值(5.155mg
·
g-1
)，之后趋于稳定，培养9、10、11d之间差异不显著(p＞0.05)，故选择9d作为发酵终点。
[0077]
实施例9
[0078]
单因素试验-培养温度对gaba产量的影响
[0079]
将ma-25种子液以10％的接种量接种在基础培养中，选择20、25、30、35℃四个不同的温度下培养7d，筛选出有利于gaba合成的最适温度。
[0080]
试验结果：
[0081]
如图2所示，gaba含量随着培养温度的升高而增大，当温度为30℃时gaba含量最高(5.157mg
·
g-1
)，因此gaba合成的最适温度为30℃。
[0082]
实施例10
[0083]
plackett-burman(pb)实验设计
[0084]
选用实验次数n＝12的pb设计，对初始ph(x1)、(葡萄糖 麦芽糖)(x2)、硫酸铵(x3)、谷氨酸(x4)、nah2po4(x5)、培养温度(x6)、接种量(x7)、mgso4(x8)8个因素进行考察，每个因素分别取高、低两个水平，高水平是低水平的1.5倍，响应值为每毫克红曲米中gaba的含量(y)。
[0085]
试验结果：
[0086]
在单因素优化实验结果的基础上，对培养条件的8个因素进行pb重要性筛选，3个虚拟因素，实验设计和结果如表2所示。
[0087]
利用design expert软件对8个因素的主效应进行分析(表3)，谷氨酸(x1)、葡萄糖 麦芽糖(x2)、初始ph(x4)、培养温度(x6)、硫酸铵(x3)这5种因素的p值均小于0.05，表明这5种因素对产gaba的影响显著。另外模型的p为0.0142，方差分析的可信度r2＝98.29，证明该模型显著性极高，可对本研究模拟进行较好地解释。
[0088]
表2 plackett-burman实验结果
[0089][0090]
注：图中不同字母代表差异性显著(p＜0.01)。
[0091]
表3 plackett-burman试验因素水平及效应
[0092][0093]
实施例11
[0094]
响应面实验设计
[0095]
根据plackett-burman(pb)实验设计的结果，选择影响度较大的三个因素进一步
做响应面实验。
[0096]
根据box-benhnken的中心组合实验设计原理，进一步进行三因素三水平的响应面分析实验，根据最陡爬坡实验来确定中心组合实验因素与水平，三因素的水平见表4。实验数据用design expert软件经多项式回归分析，并对拟合方程做显著性检验，其统计学上的显著性由f检验确定。
[0097]
表4响应面分析试验因素及水平
[0098][0099]
试验结果：
[0100]
响应面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充分接近真实情形，对pb实验结果确定的前3种极显著性实验因素(谷氨酸、葡萄糖 麦芽糖、初始ph)进行爬坡实验，使其浓度尽量靠近最佳水平值区域，最陡爬坡法以实验值变化的梯度方向为爬坡方向(法线方向)，由plackett-burman实验可知，在ma-25菌株生产gaba的发酵中，根据这3个因素效应大小的比例设定它们变化方向及步长。结果显示(表5)，第四组实验的gaba含量达到最高，继而产量下降，所以以第4组的条件作为下一步响应面实验的中心点，即谷氨酸1.25％，葡萄糖 麦芽糖1.0％，初始ph6.0，并根据此结果，确定响应面试验中3因素和3水平。
[0101]
表5最陡爬坡试验设计及其结果
[0102][0103]
注：图中不同字母代表差异性显著(p＜0.05)。
[0104]
实施例12
[0105]
box-behnken试验设计及结果
[0106]
(1)采用box-behnken试验设计三因素三水平的box-behnken响应面分析法对培养基进行优化(表6)。
[0107]
表6 box-behnken试验设计和结果
[0108][0109]
注：图中不同字母代表差异性显著(p＜0.05)。
[0110]
(2)模型方程的建立与方差分析
[0111]
运用构建好的二阶经验模型来进行分析。对试验模型进行二阶回归拟合，得到回归方程为
[0112]
y＝5.59-0.11x1 0.096x2 0.028x3 0.092x1x2 0.064x1x3 0.078x2x
3-0.13x
12-0.13x
22-0.11x
32
。
[0113]
式中：y为gaba含量(mg
·
g-1
)；x1、x2、x3分别代表谷氨酸、葡萄糖 麦芽糖和ph。
[0114]
由模型的方差分析可知(表7)p为0.0055，说明该模型方程高度显著，可靠性极高。且该方程的决定系数r2为95.98，说明该模型与实际拟合良好，可以用于培养红曲霉产gaba发酵条件分析和预测。而且失拟项的影响不显著(0.0756)，表明该模型能够较好地模拟发酵情况。在模型参数中，x1、x2、x
12
、x
22
对gaba产量均有极显著影响(p＜0.01)，x3对gaba产量影响不显著，而x1和x2，x2和x3之间的相互作用对gaba的合成具有显著影响(p＜0.05)，各因素对gaba产量的主次效应为:x1(谷氨酸)＞x2(葡萄糖 麦芽糖)＞x3(ph)。
[0115]
表7 box-behnken试验设计结果方差分析
[0116][0117]
注：**表示差异极显著，p＜0.01；*表示差异显著，p＜0.05；-表示差异不显著，p＞
0.05。
[0118]
(3)响应面分析
[0119]
为了考察因素交互项对gaba产量的影响，在其他因素条件不变的情况下，考察交互项对提取率的影响，对模型进行降维分析，经design-expert v8.0.6软件分析所得的响应面，如图3所示。
[0120]
通过design-expert 8.0.6optimization计算出最佳gaba合成的培养条件，培养条件是谷氨酸1.18％，葡萄糖 麦芽糖是1.16％，ph为6.08，最终预测gaba产量为5.62mg
·
g-1
。在最优条件下进行验证实验，实验值(5.608
±
0.11)mg
·
g-1
，接近理论gaba产量，说明响应面法建立的红曲霉产gaba数学模型具有稳定可靠性，试验结果与模型符合良好。
[0121]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。