一种分步酶解法提取牛血红蛋白抗氧化肽的方法

1.本发明涉及抗氧化肽领域，尤其涉及一种分步酶解法提取牛血红蛋白抗氧化肽的方法。


背景技术：

2.近年来，随着人口的快速增长以及自然资源的匾乏，传统蛋白源已经难以满足需要，开发利用新型蛋白源十分必要。在肉类屠宰加工过程中所产生的动物血液，是一种珍贵的蛋白质资源，可以广泛应用于食品、制药、饲料、化妆品以及工业等领域。但目前只有小部分血液被应用，综合利用率不足30％，大部分废弃血液被直接排放到环境中，既造成了资源浪费，又引起了环境污染。
3.2021年，我国肉牛总出栏量约为4707万头，较2020年同比增长3.1％，牛血产量约为94万吨。按照牛的放血量约为75％计算，2021年我国可收集牛血总量高达70万吨。但其中被真正加以利用的血液却非常少。因此，为了减少蛋白质资源的浪费和对环境的污染，探索新的血液资源利用途径，进一步提高动物血液的利用率具有重要意义。
4.近年来，许多研究者从不同的原料中分离纯化出多种生物活性肽。活性肽具有特异性高、毒性低等优点，在长期服用的治疗中极具潜力。抗氧化肽是活性肽中的一种，它能够有效清除自由基，减少人体由自由基引起的蛋白质变性、脂质过氧化，降低关节炎、糖尿病、高血压等多种疾病风险。现有研究有cn114410723a《一种具有良好乳化性的豌豆抗氧化肽及其制备方法》分别加入碱性蛋白酶、胃蛋白酶和风味蛋白酶进行单独酶解，得到具有良好乳化性的豌豆抗氧化肽。cn114591402a《一种辣木抗氧化肽及其制备方法和应用》以辣木蛋白为原料，采用碱性蛋白酶进行酶解得到辣木蛋白酶解液，再经分离纯化得到辣木抗氧化肽。采用枯草芽孢杆菌联合碱性蛋白酶制备出具有体外抗氧化活性的牦牛血抗氧化肽，再利用sephadex g-25凝胶层析法纯化得到高抗氧化性肽。
5.牛血红蛋白作为牛血中含量最为丰富的蛋白质，经酶解后生成的小分子抗氧化肽，既有利于人体的消化吸收，还具有功能特性。由此开发牛血红蛋白制品和功能性食品，既提高了牛血的经济价值，又解决了牛血排放造成的资源浪费和环境污染问题。
6.但目前，尚未报道分步酶解牛血红蛋白制备抗氧化肽及其抗氧化活性的相关研究。本发明针对这一问题进行研究，希望通过分步酶解法生产抗氧化能力更强的活性肽。


技术实现要素：

7.针对上述背景技术所提出的问题，本发明的目的是：旨在提供一种牛血红蛋白抗氧化肽及其制备方法。
8.为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
9.本发明的第一个目的时提供一种牛血红蛋白抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)将牛血离心分层，弃去上层血浆，用生理盐水洗涤红血球，继续离心去除生理
盐水，生理盐水重复洗涤，使红血球充分破胞，离心收集上清液为血红蛋白液；
11.(2)将所述血红蛋白液用风味蛋白酶酶解，酶解后灭酶处理，再加入碱性蛋白酶酶解，酶解后再灭酶处理，冷却至室温；
12.(3)离心去除杂质，收集上清液，即获得牛血红蛋白的酶解液；
13.(4)将牛血红蛋白酶解液进行冷冻干燥，得到牛血红蛋白抗氧化肽。
14.进一步的，步骤(1)中所述(牛血/红血球)离心时间为5-20min，优选的，步骤1中所述(牛血/红血球)离心时间为10min。
15.进一步的，步骤(1)所述离心力为4000～6000g，这样的设计，保证了离心分离效果。
16.进一步的，步骤(1)采用冻融法使红血球充分破胞，优选的，冻融条件为-20℃～-80℃，这样的设计，保证红血球的破裂效果。
17.进一步的，步骤(2)中，风味蛋白酶酶解条件为血红蛋白液浓度40～50g/l，酶解温度50～55℃，风味蛋白酶的添加量4000～5000u/g，ph7.5～8.0，时间120～300min，这样的设计，酶解质量好。
18.优选的，步骤(2)中，风味蛋白酶酶解条件为血红蛋白液浓度40～45g/l，风味蛋白酶的添加量3800u/g，酶解时间120～180min；更优选的，酶解时间130min。
19.进一步的，步骤(2)中，碱性蛋白酶酶解条件为酶解温度40-45℃，碱性蛋白酶的添加量2000～3000u/g，ph9～10，时间60-90min。这样的设计，酶解液抗氧化活性强。
20.优选的，步骤(2)中，碱性蛋白酶酶解条件为酶解温度40℃；优选的，步骤(2)中，碱性蛋白酶酶解时间60min。
21.优选的，步骤(2)中，碱性蛋白酶酶添加量2900u/g。
22.进一步的，步骤(2)中，所述灭酶处理为采用沸水浴法进行灭酶处理，灭酶处理时间为10～20min，这样的设计，保证灭酶效果。
23.进一步的，步骤(3)中，离心时间为10～15min；离心条件为3000～5000g，这样的设计，保证了酶解液的离心分离。
24.本发明的第二个目的是提供一种牛血红蛋白抗氧化肽，采用前述牛血红蛋白抗氧化肽的制备方法制备得到。
25.本发明所述：
26.abts：2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基
27.本发明技术方案具有以下有益效果：
28.(1)本发明所述制备方法所用原料为牛血红蛋白，产量高且价格低廉。
29.(2)本发明所述制备方法采用分步酶解法对牛血红蛋白进行酶解，酶解效果好，能有效地将牛血红蛋白酶解成抗氧化肽。且制备工艺简单、过程温和，较好地保留了牛血红蛋白肽的多功能活性。
30.(3)本发明所述牛血红蛋白肽具有良好的抗氧化活性，可以作为天然抗氧化剂，应用食品工业、制药工业、饲料工业等。
31.(4)本发明的制备过程未涉及任何有机溶剂，操作条件温和，最大程度地保留了牛血红蛋白肽的活性，保证了产品的安全性。
32.(5)本发明的制备过程操作简便，成本低，适合工业化生产。
附图说明
33.图1蛋白酶种类对一次酶解液水解度及abts清除能力的影响；
34.图2底物浓度对一次酶解液水解度及abts清除能力的影响；
35.图3酶添加量对一次酶解液水解度及abts清除能力的影响；
36.图4温度对一次酶解液水解度及abts清除能力的影响；
37.图5ph对一次酶解液水解度及abts清除能力的影响；
38.图6时间对一次酶解液水解度及abts清除能力的影响；
39.图7蛋白酶种类对二次酶解液水解度及abts清除能力的影响；
40.图8酶添加量对二次酶解液水解度及abts清除能力的影响；
41.图9温度对二次酶解液水解度及abts清除能力的影响；
42.图10ph对二次酶解液水解度及abts清除能力的影响；
43.图11时间对二次酶解液水解度及abts清除能力的影响；
44.注：图中大写字母不同表示abts自由基清除能力存在显著差异，小写字母不同表示水解度存在差异(p《0.05)。
具体实施方式
45.以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
46.实施例1制备一种牛血红蛋白抗氧化肽
47.(1)将牛血4000g离心10min，弃去上层血浆，用生理盐水洗涤红血球，继续离心5～10min去除生理盐水，生理盐水重复洗涤两次，-20℃冻融法使红血球充分破胞，收集滤液为血红蛋白液。
48.(2)将所述血红蛋白液用风味蛋白酶酶解，酶解后沸水浴灭酶，再加入碱性蛋白酶酶解，酶解后再沸水浴灭酶10min，冷却至室温。
49.(3)4000g离心10min取上清液，获得牛血红蛋白的酶解液。
50.(4)将牛血红蛋白酶解液进行冷冻干燥后，得到的粉末即含有牛血红蛋白抗氧化肽。
51.(5)对上述牛血红蛋白抗氧化肽粉末进行以下抗氧化性能分析。
52.实施例2
53.(1)步骤(2)中一次酶解蛋白酶的筛选
54.选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶六种蛋白酶作为预筛选酶，选取底物浓度40g/l、酶添加量2000u/g，分别在各自最适酶解条件下酶解时间300min，以一次酶解产物的水解度和abts自由基清除能力为考察指标。
55.以一次酶解产物的水解度和abts自由基清除能力为指标，牛血红蛋白经六种不同蛋白酶的酶解效果如图1所示，风味蛋白酶酶解产物具有最高的水解度40.79％和abts自由基清除能力166.37μmol te/g protein，明显优于其他蛋白酶，因此选择风味蛋白酶酶解血红蛋白液。
56.(2)单因素试验
57.按照实施例1所述方法，以牛血红蛋白酶解后一次酶解产物的水解度和abts自由
基清除能力为指标。设置以下方案分别作为单因素变量进行考察：
58.①
血红蛋白液浓度(30、40、50、60、70g/l)，
59.②
酶添加量(1000、2000、3000、4000、5000u/g)，
60.③
酶解温度(40、45、50、55、60℃)，
61.④
酶解ph(6.5、7、7.5、8、8.5)，
62.⑤
酶解时间(60、120、180、240、300min)，
63.对牛血红蛋白一次酶解产物的水解度和abts自由基清除能力的影响，确定制备最佳牛血红蛋白抗氧化肽的一次酶解条件。
64.①
底物浓度对酶解产物的水解度和abts自由基清除能力的影响
65.在试验条件酶添加量2000u/g、温度50℃、ph＝7.5、酶解时间120min，研究不同底物浓度对蛋白水解的影响。如图2所示，酶解产物的水解度和abts自由基清除能力随底物浓度的增加呈先上升后下降，底物浓度为40g/l时，水解度和abts自由基清除能力分别达最大值37.72％和166.37μmol te/g protein。底物浓度较低或过高时，不利于蛋白酶与蛋白质分子之间的相互作用，蛋白水解作用被影响，自由基清除能力受到抑制。
66.②
酶添加量对酶解产物的水解度和abts自由基清除能力的影响
67.在试验条件底物浓度40g/l、温度50℃、ph＝7.5、酶解时间120min，研究不同酶添加量对蛋白水解的影响。如图3所示，随着酶添加量的增多，水解度和abts自由基清除能力先增加后趋于平缓，酶添加量4000u/g时，abts自由基清除能力达到最大199.52μmol te/g protein，此时继续增大酶添加量，水解度继续提高，但abts自由基清除能力不再发生显著变化。因为蛋白酶与底物浓度之间达到一种饱和状态，继续提高蛋白酶添加量，不再提高酶解产物的水解度和自由基清除能力。
68.③
酶解温度对酶解产物的水解度和abts自由基清除能力的影响
69.在试验条件底物浓度40g/l、酶添加量2000u/g、ph＝7.5、酶解时间120min，研究不同酶解温度对蛋白水解的影响。如图4所示，酶解产物的水解度和abts自由基清除能力随温度的升高呈先上升后下降，在50℃时水解度和abts自由基清除能力分别达最大值37.16％和164.30μmol te/g protein；这可能与风味蛋白酶的最适温度有关，温度过高会对酶的空间结构产生影响，降低酶活。
70.④
酶解ph对酶解产物的水解度和abts自由基清除能力的影响
71.在试验条件底物浓度40g/l、酶添加量2000u/g、温度50℃、酶解时间120min，研究不同酶解ph对蛋白水解的影响。如图5所示，酶解产物的水解度和abts自由基清除能力随ph的变化呈先上升后下降，在ph＝7.5时水解度和abts自由基清除能力分别达最大值37.84％和163.85μmol te/g protein；这可能与风味蛋白酶的最适ph有关，ph过高或过低会对蛋白酶的酶活造成影响。
72.⑤
酶解时间对酶解产物的水解度和abts自由基清除能力的影响
73.在试验条件底物浓度40g/l、酶添加量2000u/g、温度50℃、ph＝7.5，研究不同酶解时间对蛋白水解的影响。如图6所示，酶解产物的水解度和abts自由基清除能力随着酶解时间的延长，先升高后趋于平稳，在酶解时间120min时abts自由基清除能力达最大值164.48μmol te/g protein。这可能是随着酶解时间的延长，风味蛋白酶可作用肽键几乎完全断裂，酶解产物的水解度和自由基清除能力不再发生变化。
74.实施例3
75.(1)步骤(2)中二次酶解蛋白酶的筛选
76.选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶五种蛋白酶作为预筛选酶，选取酶添加量2000u/g，酶解时间60min，分别在各自最适酶解条件下对一次酶解产物进行酶解，以二次酶解产物的水解度和abts自由基清除能力为考察指标。
77.以二次酶解产物的水解度和abts自由基清除能力为指标，一次酶解产物经五种不同蛋白酶的酶解效果如图7所示，碱性蛋白酶的二次酶解产物具有最高的水解度46.06％和abts自由基清除能力314.15μmol te/g protein，明显优于其他蛋白酶，因此选择碱性蛋白酶酶解一次酶解产物。
78.(2)单因素试验
79.按照实施例1所述方法，以二次酶解产物的水解度和abts自由基清除能力为指标。设置以下方案分别作为单因素变量进行考察：
80.①
酶添加量(1000、2000、3000、4000、5000u/g)，
81.②
酶解温度(30、35、40、45、50℃)，
82.③
酶解ph(8、8.5、9、9.5、10、10.5、11)，
83.④
酶解时间(0、30、60、90、120min)，
84.对二次酶解产物的水解度和abts自由基清除能力的影响，确定制备最佳牛血红蛋白抗氧化肽的二次酶解条件。
85.①
酶添加量对二次酶解产物的水解度和abts自由基清除能力的影响
86.在试验条件温度40℃、ph＝10.5、酶解时间60min，研究不同酶添加量对蛋白水解的影响。如图8所示，随着酶添加量的增多，水解度和abts自由基清除能力呈先上升后下降，酶添加量2000u/g时，水解度达最大值45.96％；酶添加量3000u/g时，abts自由基清除能力达最大值319.69μmol te/g protein。因为蛋白酶添加量过多，可能会造成酶解产物转化为类蛋白。
87.②
酶解温度对二次酶解产物的水解度和abts自由基清除能力的影响
88.在试验条件酶添加量2000u/g、ph＝10.5、酶解时间60min，研究不同酶解温度对蛋白水解的影响。如图9所示，酶解产物的水解度和abts自由基清除能力随温度的升高呈先上升后下降，在40℃时水解度和abts自由基清除能力分别达最大值45.82％和317.83μmol te/g protein；这是由于温度过高或过低，均会碱性蛋白酶的酶活有影响。
89.③
酶解ph对二次酶解产物的水解度和abts自由基清除能力的影响
90.在试验条件酶添加量2000u/g、温度40℃、酶解时间60min，研究不同酶解ph对蛋白水解的影响。如图10所示，酶解产物的水解度和abts自由基清除能力随ph的变化呈先上升后下降，在ph＝10时水解度分别达最大值47.03％，在ph＝9时abts自由基清除能力达最大值327.28μmol te/g protein；这可能与碱性蛋白酶的最适ph有关，ph过高或过低会对蛋白酶的酶活造成影响。
91.④
酶解时间对二次酶解产物的水解度和abts自由基清除能力的影响
92.在试验条件酶添加量2000u/g、温度50℃、ph＝10.5，研究不同酶解时间对蛋白水解的影响。如图11所示，酶解产物的水解度和abts自由基清除能力随着酶解时间的延长，先升高后下降，酶解时间60min时酶解产物的水解度和abts自由基清除能力分别达最大值
46.06％和314.15μmol te/g protein，可能是随着酶解时间的延长，酶解得的抗氧化多肽会进一步水解成氨基酸，故选择60min为最适酶解时间。
93.实施例4
94.响应面试验设计及结果
95.在单因素试验的基础上，采用box-behnken试验设计原理，以一次酶添加量、一次酶解时间、二次酶添加量、二次酶解时间四个因素为变量，abts自由基清除能力作为唯一的响应值，进行4因素3水平的试验设计，进行响应面优化试验设计，进一步优化牛血红蛋白抗氧化多肽的工艺参数。因素水平见表1。
96.表1响应曲面法因素水平表
[0097][0098]
通过响应面优化结果分析，得到牛血红蛋白的最佳酶解工艺条件为一次酶添加量3780.57u/g、一次酶解时间131.48min、二次酶添加量2860.22u/g、二次酶解时间62.61min，abts自由基清除能力为334.65μmol te/g protein。按试验可操作性将最佳条件调整为一次酶添加量3800u/g、一次酶解时间130min、二次酶添加量2900u/g、二次酶解时间60min。此条件下进行试验，abts自由基清除能力为333.63
±
6.29μmol te/g protein，与理论值无显著差异。
[0099]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。