用轴突导向因子-1化合物治疗高脂血疾患的方法与流程

用轴突导向因子-1化合物治疗高脂血疾患的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年5月30日提交的美国专利申请号62/854,870的权益，该申请以全文引用的方式并入本文中。
3.参考通过efs-web提交的序列表
4.大小为12.1kb的名为“20190527_034044_203p1_seq_st25”的序列表的ascii文本文件的内容于2019年5月27日创建，并通过efs-web以电子方式提交，随附本技术以全文引用的方式并入本文中。


背景技术：
1.技术领域
5.本发明一般涉及用于治疗高脂血症和相关疾病和病症的轴突导向因子-1化合物及其组合物。
6.2.相关技术的描述
7.轴突导向因子和它们的受体是本领域熟知的，如在us 5,565,331；us 6,096,866；us 6,017,714；us 6,309,638；us 6,670,451；以及us 8,168,593中；并且在us20060019896和us20060025335中举例说明。
8.轴突导向因子-1是一种众所周知在神经元发育中引导脊椎动物的连合轴突中起确定的作用的分泌性分子。参见kennedy等人.(1994)cell 78:425
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35；serafini等人.(1994)cell 78:409
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24；以及serafini等人.(1996)cell 87:1001
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14。最近的研究进一步证明了轴突导向因子-1在内皮细胞增殖、迁移和血管生成信号传导以及上皮细胞的形态发生中的关键作用。参见park等人.(2004)pnas usa 101:16210
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5；carmeliet等人.(2005)nature 436:193
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200；nguyen等人.(2006)pnas usa 103:6530
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5；wilson等人.(2006)science 313:640
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4；liu等人.(2004)curr biol 14:897
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905。已经在哺乳动物的神经元、血管系统和其他细胞类型中表征了至少八种轴突导向因子受体。这些包括在结肠直肠癌(dcc)、unc5a、b、c、d、再生蛋白、α6β4和α3β1整联蛋白中缺失。参见tessier-lavigne等人.(1996)science 274:1123
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33；huber等人.(2003)annu rev neurosci 26:509
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63；cirulli等人.(2007)nat rev mol cell biol 8:296
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306；以及yebra等人.(2003)dev cell 5:695
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707。轴突导向因子-1与dcc的结合介导轴突的吸引性生长，以及内皮细胞中的阳性血管生成信号传导。相反，unc5b受体似乎是排斥的，介导细胞效应诸如丝状伪足收缩，特别是在发育中的毛细血管中。参见lu等人.(2004)nature 432:179
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86；以及larrivee等人.(2007)genes dev 21:2433
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47。


技术实现要素：

9.在一些实施方案中，本发明提供了治疗、减轻或抑制受试者的高脂血疾患的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种轴突导向因子-1化合物。在一些实施
方案中，轴突导向因子-1化合物是具有包含如下seq id no:1、基本上由其组成或由其组成的氨基酸序列的肽：
10.x1-x2-x3-c-x4-x5-x6-x7-t-x8-g (seq id no:1)
11.其中
12.x1为ala、asn、cys、d-cys、ser或thr，优选地x1为cys、d-cys、ser或thr，并且其中x1可以连接至第四个氨基酸位置处的半胱氨酸或环氧乙烷化合物；
13.x2存在或不存在，并且如果存在，则x2为ala、asp、ile、leu、met、phe、pro、trp或val，优选地x2为leu或pro；
14.x3存在或不存在，并且如果存在，则x3为asn、arg、asp、cys、gln、glu、gly、ser、thr或tyr，优选地x3为asn或asp；
15.x4为arg、his或lys，优选地x4为arg或lys；
16.x5为arg、asp、glu、his、lys、phe、trp或tyr，优选地x5为asn、asp或his；
17.x6为asn、cys、gln、gly、ser、thr、tyr或val，优选地x6为asn或gly；
18.x7存在或不存在，并且如果存在，则x7为asn、gly、his、ile、thr或val，优选地x7为val；并且
19.x8存在或不存在，并且如果存在，则x8为ala、asn、ile、leu、met、phe、pro、thr、trp或val，优选地x8为ala；并且
20.其中x2、x3、或x2和x3两者都存在；并且
21.其中第10和第11个氨基酸位置处的一个或两个氨基酸残基可以是d-氨基酸。在一些实施方案中，环氧乙烷化合物是聚乙二醇(peg)、聚环氧乙烷(peo)和聚氧乙烯(poe)、甲氧基聚乙二醇(mpeg)、或单甲氧基聚乙二醇(mpeg)或二乙二醇(mini-peg)，优选地所述环氧乙烷化合物是mini-peg。在一些实施方案中，轴突导向因子1化合物是具有包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的氨基酸序列的肽：seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16或seq id no:17。在一些实施方案中，轴突导向因子1化合物的长度为约8
–
60、约8
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55、约8
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50、约8
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45、约8
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40、约8
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35、约8
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30、约8
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25、约8
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20、约8
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15、约8
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12、8
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11、约9
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60、约9
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55、约9
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50、约9
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45、约9
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40、约9
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35、约9
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30、约9
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25、约9
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20、约9
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15、约9
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12或9
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11个氨基酸残基。在一些实施方案中，轴突导向因子1化合物的长度为8、9、10或11个氨基酸残基。在一些实施方案中，轴突导向因子1化合物是包含与seq id no:9具有至少90％序列同一性的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成的肽。
22.在一些实施方案中，每日施用一种或多种轴突导向因子-1化合物导致总体重比对照低约95-100％。在一些实施方案中，每日施用一种或多种轴突导向因子-1化合物：持续至少约4周导致总体重比对照低约20％；持续至少约8周导致总体重比对照低约45％；持续至少约12周导致总体重比对照低约65％；或持续至少约16周导致总体重比对照低约90％。在一些实施方案中，每日施用一种或多种轴突导向因子-1化合物：持续至少约4周导致肝脏脂肪含量比对照低约10％；持续至少约8周导致肝脏脂肪含量比对照低约25％；持续至少约12周导致肝脏脂肪含量比对照低约35％；或持续至少约16周导致肝脏脂肪含量比对照低约50％。在一些实施方案中，每日施用一种或多种轴突导向因子-1化合物导致动脉粥样硬化
病变与对照相比降低约66-100％。在一些实施方案中，每日施用一种或多种轴突导向因子-1化合物：持续至少约4周导致动脉粥样硬化病变比对照低约10％；持续至少约8周导致动脉粥样硬化病变比对照低约25％；持续至少约12周导致动脉粥样硬化病变比对照低约35％；或持续至少约16周导致动脉粥样硬化病变比对照低约50％。在一些实施方案中，每日施用一种或多种轴突导向因子-1化合物导致总胆固醇、甘油三酯和/或ldl水平与对照相比降低约66-100％。在一些实施方案中，每日施用一种或多种轴突导向因子-1化合物：持续至少约4周导致总胆固醇水平比对照低约20％；持续至少约8周导致总胆固醇水平比对照低约40％；持续至少约12周导致总胆固醇水平比对照低约60％；或持续至少约16周导致总胆固醇水平比对照低约80％。在一些实施方案中，每日施用一种或多种轴突导向因子-1化合物：持续至少约4周导致ldl水平比对照低约15％；持续至少约8周导致ldl水平比对照低约30％；持续至少约12周导致ldl水平比对照低约45％；或持续至少约16周导致ldl水平比对照低约60％。在一些实施方案中，ldl水平是ldl胆固醇(ldl-c)的水平。在一些实施方案中，一种或多种轴突导向因子-1化合物以治疗有效量施用。在一些实施方案中，一种或多种轴突导向因子-1化合物以药物组合物的形式施用。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人。
23.前述一般性描述和以下详细描述都仅仅是示例性和解释性的，并且旨在提供对所要求保护的本发明的进一步解释。任何附图被包括以提供对本发明的进一步理解，并且被并入本说明书并构成本说明书的一部分，示出了本发明的若干实施方案，并且与说明书一起用于解释本发明的原理。
24.附图简述
25.通过参考附图进一步理解本发明，其中：
26.图1：轴突导向因子-1输注预防了体重增加并减轻了饲喂高脂肪饮食的apoe-/-小鼠中的损伤形成。将apoe-/-小鼠用高脂肪饮食(42％脂肪)饲喂16周，输注或不输注轴突导向因子-1(15ng/天)。体重变化和肝脏大小有显著差异(图a)。进行油红-o染色以观察病变形成。轴突导向因子-1显著消除了病变形成(图b和图c)。
27.图2：轴突导向因子-1输注改善了饲喂高脂肪饮食的apoe-/-小鼠的血浆脂质分布。血浆胆固醇和甘油三酯的水平随着轴突导向因子-1输注而强烈降低，而hdl-胆固醇水平没有差异。
28.图3：轴突导向因子-1和肽在高脂肪饲喂的apoe无效小鼠中强烈降脂、抗动脉粥样硬化和抗肥胖。12-14周的apoe无效雄性小鼠用高脂肪饮食(42％，harlan laboratories)饲喂16周，输注或不输注轴突导向因子-1(15ng/天)或v1 v2肽。(图a-图b)由轴突导向因子-1/v1 v2强烈抑制主动脉病变形成。*p《0.01vs.ctrl.(图c-图f)血浆脂质分布的变化。**p《0.01，***p《0.001vs.ctrl。
29.图4-图5：轴突导向因子-1输注降低饲喂高脂肪饮食的apoe-/-小鼠中主动脉根部的脂肪纹积聚。四只动物中有四只(＝100％)出现ctrl(图4)，而输注轴突导向因子-1的七只动物中仅有三只(＝43％)出现脂肪纹(图5)。黑色箭头指示脂肪纹。
30.图6-图7：轴突导向因子-1输注减少了主动脉根部的巨噬细胞浸润。使用抗mac3(cd107)抗体进行免疫组织化学以显现巨噬细胞积聚。双盲选择主动脉根部反应最强的区域。ctrl动物(图6)与轴突导向因子-1输注的动物(图7)相比具有更强的信号。白色箭头指
示mac3阳性细胞。
31.图8：轴突导向因子-1输注通过unc5b减弱单核细胞与内皮的粘附。使用钙黄绿素-am标记在单核细胞上进行单核细胞-ec粘附测定(图a)。结果显示轴突导向因子-1处理对ec抑制单核细胞粘附，但unc5b抗体预处理对单核细胞的作用降低(n＝7，**p《0.01vs ctrl)。(图b)中所示的是响应于轴突导向因子-1处理的单核细胞的免疫印迹分析。在轴突导向因子-1存在下单核细胞中unc5b裂解水平增加(n＝5，***p《0.0001)。
32.图9：轴突导向因子-1通过unc5b抑制单核细胞迁移。在存在或不存在unc5b抗体的情况下对从骨髓分离的单核细胞进行transwell迁移测定。通过拮抗unc5b逆转轴突导向因子-1对单核细胞迁移的抑制。
33.图10：轴突导向因子-1被p47phox上调，并且增强了轴突导向因子-1对p47phox依赖性小鼠中单核细胞迁移的抑制。轴突导向因子-1对单核细胞迁移的抑制在p47phox缺陷小鼠中更为显著(上图)。unc5b表达在p47phox无效小鼠中显著上调(下图)。
34.图11：轴突导向因子-1减弱体外血管平滑肌细胞(vsmc)迁移和体内巨噬细胞浸润。在不存在或存在药理学抑制剂的情况下，将vsmc和ec共培养并进行transwell迁移测定。数据表明轴突导向因子-1对vsmc迁移的no、cgmp和p38 mapk依赖性衰减。用mac-3染色的三尖瓣/主动脉根的图像(数据未显示)表明在高脂肪饲喂的apoe无效小鼠中通过轴突导向因子-1输注减少巨噬细胞浸润。
35.图12：轴突导向因子-1输注减轻了雄性和雌性受试者的新生内膜形成和再狭窄。通过穿过引导器造成股动脉损伤，并通过渗透微型泵输注轴突导向因子-1。(图a)和(图c)第4周的h&e图像(图b)和(图d)内膜与中膜比的分组数据。n＝4-8，*p《0.01(图b)，n＝3-4(图d)，比例尺＝100μm。
具体实施方式
36.轴突导向因子-1和轴突导向因子-1肽在向受试者施用时表现出心脏保护活性。参见pct/us2011/038277；pct/us2015/023248；li&cai(2015)am j physiol cell physiol 309:c100
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106；以及nguyen&cai(2006)pnas usa 103:6530
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5，其全部内容以引用的方式并入本文中。
37.如本文所公开，施用轴突导向因子-1化合物消除了体重增加和脂肪肝，并减少了损伤形成。施用轴突导向因子-1化合物还显著降低了受试者的总胆固醇和甘油三酯水平。另外，施用轴突导向因子-1化合物抑制单核细胞与内皮细胞(ec)的粘附，并增加单核细胞中的unc5b裂解。即，轴突导向因子-1化合物从内皮排斥单核细胞并增加单核细胞凋亡，从而表明轴突导向因子-1化合物可预防或抑制斑块破裂，并可因此逆转动脉粥样硬化病变的最早阶段。
38.轴突导向因子-1化合物减少身体脂肪、脂肪沉积和脂肪肝
39.apoe-/-小鼠即使在正常食物饮食下也随着它们的年龄增长而患上高脂血症和动脉粥样硬化。将apoe-/-小鼠分成轴突导向因子-1处理组和对照组(ctrl)，并且给两者施用高脂肪饮食(hfd)。如本文所用，“高脂肪饮食”是指其中受试者每日热量摄入的至少约40％为脂肪卡路里(即来自脂肪的卡路里)的饮食。轴突导向因子-1组在hfd开始前一天输注轴突导向因子-1，并且轴突导向因子-1输注持续16周(图1，图a)，而对照组在不输注任何轴突
导向因子-1的情况下饲喂hfd。在hfd 16周后，两组小鼠的外观明显不同。
40.如图1、图b中所示，对照组的体重增加是显著的，而轴突导向因子-1组保持不变。对照组表现出较高的脂肪量和脂肪肝，类似于具有较高动脉粥样硬化风险的受试者。因此，轴突导向因子-1化合物抑制和/或减少身体脂肪和脂肪沉积。轴突导向因子-1化合物还抑制、减少和/或治疗脂肪肝。
41.轴突导向因子-1化合物减少动脉粥样硬化病变
42.为了观察受试者主动脉中的任何动脉粥样硬化病变，进行油红-o染色。与对照组相比，轴突导向因子-1组表现出显著更低的病变发生率(图1，图c，图d)。因此，轴突导向因子-1化合物抑制、减少和/或治疗动脉粥样硬化病变。
43.轴突导向因子-1化合物减少高脂血症
44.患有动脉粥样硬化的受试者的典型脂质分布是(a)高水平的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(ldl)和甘油三酯，以及(b)低水平的高密度脂蛋白胆固醇(hdl)。因此，检查受试者的血浆脂质分布。如图2、图a-图c中所示，与对照组相比，轴突导向因子-1组的总胆固醇和甘油三酯水平显著较低，而hdl-胆固醇水平相似。因此，轴突导向因子-1化合物显著降低受试者的总胆固醇和ldl。
45.施用轴突导向因子-1肽、v1和v2也导致较低的主动脉损伤(图3，图a、图b)。虽然v1和v2导致甘油三酯(图3，图d)和hdl-胆固醇(图3，图e)水平与由轴突导向因子-1提供的水平相似，但是与轴突导向因子-1相比，v1和v2导致略低的总胆固醇水平(图3，图c)。
46.轴突导向因子-1化合物减少动脉中脂肪沉积
47.由apoe敲除诱导并由hfd加速的高胆固醇血症导致脂肪纹的形成，脂肪纹是在动脉粥样硬化发展过程中形成的第一个肉眼可见的损伤。脂肪纹积聚引发了发病机制如纤维化和斑块破裂的后续恶性循环。脂肪纹最常见于主动脉根部，其可通过三尖瓣的独特结构识别。
48.筛选对照组和轴突导向因子-1组的主动脉根的脂肪纹(图4，图5)。对照组的所有受试者均表现出大的脂肪纹。另一方面，轴突导向因子-1组的七名受试者中只有三名(43％)出现脂肪纹(相对于未用轴突导向因子-1处理的hfd饲喂的apoe小鼠中的100％)，该脂肪纹相对小于对照组的脂肪纹。因此，轴突导向因子-1化合物抑制和/或减少脂肪纹的发生和在主动脉根中的累积。因此，轴突导向因子-1化合物可用于抑制或减少由脂肪纹积聚引起的病状，例如纤维化和/或斑块破裂。
49.轴突导向因子-1化合物抑制动脉巨噬细胞浸润
50.在动脉粥样硬化环境下，循环单核细胞保留在内皮上，并在内皮下区域分化成巨噬细胞。分化的巨噬细胞与修饰的ldl诸如ox-ldl反应以形成泡沫细胞。泡沫细胞捕获各种免疫细胞，诸如t细胞、树突细胞和肥大细胞。该反应进一步募集更多的炎性细胞和修饰的ldl，导致动脉粥样硬化病变的起始和脂肪纹阶段。因此，巨噬细胞积聚是动脉粥样化形成的早期迹象。
51.免疫化学染色用于评价对照组和轴突导向因子-1组受试者中的巨噬细胞积聚。如图6和图7中所示，与对照相比，输注轴突导向因子-1的受试者中mac-3(cd107)阳性细胞的累积显著较少。这些结果与图5中所示的脂肪纹形成数据一致。因此，轴突导向因子-1抑制或减少巨噬细胞积聚、泡沫细胞形成、脂肪纹形成和积聚以及动脉粥样化形成。
52.轴突导向因子-1化合物通过unc5b抑制单核细胞与内皮细胞的粘附
53.单核细胞，动脉粥样硬化中炎症反应的主要来源，表达作为轴突导向因子-1的显性受体的unc5b。unc5b受体是轴突导向因子-1的排斥受体。因为表达unc5b的单核细胞可以被内皮细胞(ec)中表达的轴突导向因子-1排斥，所以进行单核细胞-ec粘附测定。图8、图a显示用轴突导向因子-1处理ec导致对单核细胞粘附的23％抑制。ec的轴突导向因子-1处理对用unc5b抗体预处理以掩蔽受体的单核细胞的单核细胞粘附没有影响。这些结果表明，轴突导向因子-1的抗粘附作用是由unc5b介导的。
54.当轴突导向因子-1与unc5b结合时，unc5b的细胞内死亡结构域被切割并且表达unc5b的细胞进行凋亡。因此，测定了响应于轴突导向因子-1处理的unc5b的裂解。结果显示轴突导向因子-1显著增加unc5b的裂解(图8、图b)，从而表明轴突导向因子-1结合增加单核细胞中的死亡结构域活化。
55.这些结果表明，轴突导向因子-1的抗炎作用至少部分由单核细胞经由unc5b表达的抗吸引和促凋亡介导。
56.因此，本发明提供了用于治疗、减轻或抑制受试者的高脂血疾患的轴突导向因子-1化合物和组合物。如本文所用，“高脂血疾患”是指由高脂血症引起或与高脂血症相关的疾患。这类高脂血疾患包括高脂血症、高胆固醇血症、肥胖、脂肪肝、动脉中脂肪沉积、动脉巨噬细胞浸润、动脉粥样硬化病变、单核细胞迁移、血管平滑肌细胞迁移、单核细胞与内皮细胞粘附、新生内膜形成和再狭窄。在一些实施方案中，受试者已被诊断患有高脂血疾患。在一些实施方案中，受试者需要治疗高脂血疾患。在一些实施方案中，受试者已被诊断为患有高脂血疾患。在一些实施方案中，高脂血疾患是高脂血症、高胆固醇血症、肥胖、脂肪肝、动脉中脂肪沉积、动脉巨噬细胞浸润、动脉粥样硬化病变、单核细胞迁移、血管平滑肌细胞迁移或单核细胞与内皮细胞粘附。
57.如本文所用，“突导向因子-1化合物”是指全长人轴突导向因子-1蛋白(gi 148613884)，与全长人轴突导向因子-1蛋白具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％序列同一性的蛋白质以及轴突导向因子-1肽。轴突导向因子-1化合物可以表现出或可以不表现出与全长人轴突导向因子-1蛋白相同或相似的活性。然而，在一些实施方案中，轴突导向因子-1化合物，例如轴突导向因子-1肽表现出与全长人轴突导向因子-1蛋白基本上相似的活性。在一些实施方案中，轴突导向因子-1化合物，例如轴突导向因子-1肽表现出显著更好的活性和/或与全长人轴突导向因子-1蛋白不同的生物活性。
58.如本文所用，“轴突导向因子-1肽”是指包含以下seq id no:1、基本上由其组成或由其组成的肽或蛋白质：
59.x1-x2-x3-c-x4-x5-x6-x7-t-x8-g (seq id no:1)
60.其中
61.x1为ala、asn、cys、d-cys、ser或thr，优选地x1为cys、ser或thr；
62.x2存在或不存在，并且如果存在，则x2为ala、asp、ile、leu、met、phe、pro、trp或val，优选地x2为leu或pro；
63.x3存在或不存在，并且如果存在，则x3为asn、arg、asp、cys、gln、glu、gly、ser、thr或tyr，优选地x3为asn或asp；
64.x4为arg、his或lys，优选地x4为arg或lys；
65.x5为arg、asp、glu、his、lys、phe、trp或tyr，优选地x5为asn、asp或his；
66.x6为asn、cys、gln、gly、ser、thr、tyr或val，优选地x6为asn或gly；
67.x7存在或不存在，并且如果存在，则x7为asn、gly、his、ile、thr或val，优选地x7为val；并且
68.x8存在或不存在，并且如果存在，则x8为ala、asn、ile、leu、met、phe、pro、thr、trp或val，优选地x8为ala；并且
69.其中x2、x3、或x2和x3两者都存在。
70.在一些实施方案中，当x1是cys时，其通过二硫键共价连接至第四个氨基酸位置处的半胱氨酸残基或环氧乙烷化合物。在一些实施方案中，当x1是d-cys时，第10个氨基酸位置处的甘氨酸残基是d-氨基酸，c末端处的最后一个氨基酸残基是d-氨基酸，或第10个氨基酸位置处的甘氨酸残基和c末端处的最后一个氨基酸残基都是d-氨基酸。
71.在一些实施方案中，环氧乙烷化合物是聚乙二醇(peg)、聚环氧乙烷(peo)和聚氧乙烯(poe)、甲氧基聚乙二醇(mpeg)、或单甲氧基聚乙二醇(mpeg)或二乙二醇(mini-peg)，优选地所述环氧乙烷化合物是mini-peg。
72.在一些实施方案中，轴突导向因子-1肽的长度为约8-60、约8-55、约8-50、约8-45、约8-40、约8-35、约8-30、约8-20、约8-15、约8-12、8-11、约9-60、约9-55、约9-50、约9-45、约9-40、约9-35、约9-30、约9-20、约9-15、约9-12或9-11个氨基酸残基。在一些实施方案中，轴突导向因子-1肽的长度为8、9、10或11个氨基酸残基。
73.如本文所用，“包含”给定序列的肽是指该肽可在n端、c端或两者处包括另外的氨基酸残基、氨基酸异构体和/或氨基酸类似物。另外的残基可以改变或可以不改变给定序列的活性或功能，即具有附加残基、异构体或类似物的肽与给定序列本身(没有另外的残基、异构体或类似物)相比可以具有不同的活性或功能。如本文所用，“基本上由给定序列组成”的肽是指该肽可在n端、c端或两者处包括另外的氨基酸残基、氨基酸异构体和/或氨基酸类似物，只要它们不实质上改变给定序列的功能或活性即可，即具有另外的残基、异构体或类似物的肽具有与给定序列本身的活性和功能基本上相似的活性和功能。如本文所用，“由给定序列组成”的肽意指该肽在n端或c端不包括另外的氨基酸残基、氨基酸异构体和/或氨基酸类似物。
74.在一些实施方案中，可以分离轴突导向因子-1化合物。如本文所用，“分离的”化合物是指从其天然环境中分离的化合物。例如，分离的肽是不具有其天然氨基酸的肽，所述天然氨基酸对应于全长多肽，侧接n端、c端或两者。例如，分离的v1-9aa肽是指具有v1的氨基酸残基(304-312aa)的肽，其可以在其n端、c端或两者处具有非天然氨基酸，但在其c端处的第9个氨基酸残基之后不具有脯氨酸氨基酸残基，或在其n端紧接半胱氨酸氨基酸残基之前不具有缬氨酸氨基酸残基，或两者。作为另一个实例，分离的肽可以是固定在底物上的肽，所述肽不与所述底物天然缔合。作为另一个实例，分离的肽可以是与另一个分子(例如peg化合物，例如mpeg)连接的肽，所述肽不与所述另一个分子天然缔合。
75.在一些实施方案中，轴突导向因子-1化合物可包含一种或多种天然氨基酸、非天然氨基酸或它们的组合。肽的氨基酸残基可以是d-异构体、l-异构体或两者。所述肽可由α-氨基酸、β-氨基酸、天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物或它们的组合组成。氨基酸类
似物包括β-氨基酸和其中氨基或羧基被类似反应性基团取代(例如，用仲胺或叔胺取代伯胺，或用酯取代羧基)的氨基酸。
76.β-氨基酸类似物的实例包括环状β-氨基酸类似物；β-丙氨酸；i-β-苯基丙氨酸；i-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-乙酸；i-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；i-3-氨基-4-(2,4-二氯苯基)丁酸；i-3-氨基-4-(2-氯苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；i-3-氨基-4-(2-甲基苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；i-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；i-3-氨基-4-(2-三氟甲基苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(3,4-二氯苯基)丁酸；i-3-氨基-4-(3,4-二氟苯基)丁酸；i-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；i-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(3-甲基苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；i-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；i-3-氨基-4-(3-三氟甲基苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(4-氯苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(4-氟苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(4-甲基苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸；i-3-氨基-4-(4-三氟甲基苯基)-丁酸；i-3-氨基-4-五氟-苯基丁酸；i-3-氨基-5-己烯酸；i-3-氨基-5-己炔酸；i-3-氨基-5-苯基戊酸；i-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；(s)-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-乙酸；(s)-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2,4-二氯苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-氯苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-三氟甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3,4-二氯苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(3,4-二氟苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-三氟甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-氯苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-氟苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-三氟甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-五氟-苯基丁酸；(s)-3-氨基-5-己烯酸；(s)-3-氨基-5-己炔酸；(s)-3-氨基-5-苯基戊酸；(s)-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；1,2,5,6-四氢吡啶-3-羧酸；1,2,5,6-四氢吡啶-4-羧酸；3-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(2-噻吩基)-丙酸；3-氨基-3-(3-溴苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-甲氧基苯基)-丙酸；3-氨基-4,4,4-三氟-丁酸；3-氨基己二酸；d-β-苯基丙氨酸；β-亮氨酸；l-β-高丙氨酸；l-β-高天冬氨酸γ-苄基酯；l-β-高谷氨酸δ-苄基酯；l-β-高异亮氨酸；l-β-高亮氨酸；l-β-高甲硫氨酸；l-β-高苯基丙氨酸；l-β-高脯氨酸；l-β-高色氨酸；l-β-高缬氨酸；l-nω-苄氧羰基-β-高赖氨酸；nω-l-β-高精氨酸；o-苄基-l-β-高羟基脯氨酸；o-苄基-l-β-高丝氨酸；o-苄基-l-β-高苏氨酸；o-苄基-l-β-高酪氨酸；γ-三苯甲基-l-β-高天冬酰胺；i-β-苯基丙氨酸；l-β-高天冬氨酸γ-叔丁酯；l-β-高谷氨酸δ-叔丁酯；l-nω-β-高赖氨酸；nδ-三苯甲基-l-β-高谷氨酰胺；nω-2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基-l-β-高精氨酸；o-叔丁基-l-β-高羟基-脯氨酸；o-叔丁基-l-β-高丝氨酸；
精氨酸；以及nω-硝基-l-精氨酸。
79.天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸类似物的实例包括α-甲基-d-天冬氨酸；α-甲基-谷氨酸；α-甲基-l-天冬氨酸；γ-亚甲基-谷氨酸；(n-γ-乙基)-l-谷氨酰胺；[n-α-(4-氨基苯甲酰基)]-l-谷氨酸；2,6-二氨基庚二酸；l-α-氨基辛二酸；d-2-氨基己二酸；d-α-氨基辛二酸；α-氨基庚二酸；亚氨基二乙酸；l-2-氨基己二酸；苏型-β-甲基-天冬氨酸；γ-羧基-d-谷氨酸γ,γ-二-叔丁酯；γ-羧基-l-谷氨酸γ,γ-二-叔丁酯；glu(oall)-oh；l-asu(otbu)—oh；以及焦谷氨酸。
[0080]
半胱氨酸和甲硫氨酸的氨基酸类似物的实例包括cys(法呢基)-oh、cys(法呢基)-ome、α-甲基-甲硫氨酸、cys(2-羟乙基)-oh、cys(3-氨基丙基)-oh、2-氨基-4-(乙硫基)丁酸、丁硫氨酸、丁硫氨酸亚砜亚胺、乙硫氨酸、甲硫氨酸甲基氯化锍、硒代甲硫氨酸、磺基丙氨酸、[2-(4-吡啶基)乙基]-dl-青霉胺、[2-(4-吡啶基)乙基]-l-半胱氨酸、4-甲氧基苄基-d-青霉胺、4-甲氧基苄基-l-青霉胺、4-甲基苄基-d-青霉胺、4-甲基苄基-l-青霉胺、苄基-d-半胱氨酸、苄基-l-半胱氨酸、苄基-dl-高半胱氨酸、氨基甲酰基-l-半胱氨酸、羧乙基-l-半胱氨酸、羧甲基-l-半胱氨酸、二苯基甲基-l-半胱氨酸、乙基-l-半胱氨酸、甲基-l-半胱氨酸、叔丁基-d-半胱氨酸、三苯甲基-l-高半胱氨酸、三苯甲基-d-青霉胺、胱硫醚、高胱氨酸、l-高胱氨酸、(2-氨基乙基)-l-半胱氨酸、硒代-l-半胱氨酸、胱硫醚、cys(stbu)—oh以及乙酰氨基甲基-d-青霉胺。
[0081]
苯丙氨酸和酪氨酸的氨基酸类似物的实例包括β-甲基-苯丙氨酸、β-羟基苯丙氨酸、α-甲基-3-甲氧基-dl-苯丙氨酸、α-甲基-d-苯丙氨酸、α-甲基-l-苯丙氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、2,4-二氯-苯丙氨酸、2-(三氟甲基)-d-苯丙氨酸、2-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸、2-溴-d-苯丙氨酸、2-溴-l-苯丙氨酸、2-氯-d-苯丙氨酸、2-氯-l-苯丙氨酸、2-氰基-d-苯丙氨酸、2-氰基-l-苯丙氨酸、2-氟-d-苯丙氨酸、2-氟-l-苯丙氨酸、2-甲基-d-苯丙氨酸、2-甲基-l-苯丙氨酸、2-硝基-d-苯丙氨酸、2-硝基-l-苯丙氨酸、2；4；5-三羟基-苯丙氨酸、3,4,5-三氟-d-苯丙氨酸、3,4,5-三氟-l-苯丙氨酸、3,4-二氯-d-苯丙氨酸、3,4-二氯-l-苯丙氨酸、3,4-二氟-d-苯丙氨酸、3,4-二氟-l-苯丙氨酸、3,4-二羟基-l-苯丙氨酸、3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸、3,5,3
′‑
三碘-l-甲状腺原氨酸、3,5-二碘-d-酪氨酸、3,5-二碘-l-酪氨酸、3,5-二碘-l-甲状腺原氨酸、3-(三氟甲基)-d-苯丙氨酸、3-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸、3-氨基-l-酪氨酸、3-溴-d-苯丙氨酸、3-溴-l-苯丙氨酸、3-氯-d-苯丙氨酸、3-氯-l-苯丙氨酸、3-氯-l-酪氨酸、3-氰基-d-苯丙氨酸、3-氰基-l-苯丙氨酸、3-氟-d-苯丙氨酸、3-氟-l-苯丙氨酸、3-氟-酪氨酸、3-碘-d-苯丙氨酸、3-碘-l-苯丙氨酸、3-碘-l-酪氨酸、3-甲氧基-l-酪氨酸、3-甲基-d-苯丙氨酸、3-甲基-l-苯丙氨酸、3-硝基-d-苯丙氨酸、3-硝基-l-苯丙氨酸、3-硝基-l-酪氨酸、4-(三氟甲基)-d-苯丙氨酸、4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸、4-氨基-d-苯丙氨酸、4-氨基-l-苯丙氨酸、4-苯甲酰基-d-苯丙氨酸、4-苯甲酰基-l-苯丙氨酸、4-二(2-氯乙基)氨基-l-苯丙氨酸、4-溴-d-苯丙氨酸、4-溴-l-苯丙氨酸、4-氯-d-苯丙氨酸、4-氯-l-苯丙氨酸、4-氰基-d-苯丙氨酸、4-氰基-l-苯丙氨酸、4-氟-d-苯丙氨酸、4-氟-l-苯丙氨酸、4-碘-d-苯丙氨酸、4-碘-l-苯丙氨酸、高苯丙氨酸、甲状腺素、3,3-二苯丙氨酸、甲状腺原氨酸、乙基-酪氨酸以及甲基-酪氨酸。
[0082]
脯氨酸的氨基酸类似物的实例包括3,4-去氢-脯氨酸、4-氟-脯氨酸、顺式-4-羟基-脯氨酸、噻唑烷-2-羧酸以及反式-4-氟-脯氨酸。
[0083]
丝氨酸和苏氨酸的氨基酸类似物的实例包括3-氨基-2-羟基-5-甲基己酸、2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、2-氨基-3-乙氧基丁酸、2-氨基-3-甲氧基丁酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-氨基-3-苄氧基丙酸、2-氨基-3-苄氧基丙酸、2-氨基-3-乙氧基丙酸、4-氨基-3-羟基丁酸以及α-甲基丝氨酸。
[0084]
色氨酸的氨基酸类似物的实例包括α-甲基-色氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-d-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-l-丙氨酸；1-甲基-色氨酸；4-甲基-色氨酸；5-苄氧基-色氨酸；5-溴-色氨酸；5-氯-色氨酸；5-氟-色氨酸；5-羟基-色氨酸；5-羟基-l-色氨酸；5-甲氧基-色氨酸；5-甲氧基-l-色氨酸；5-甲基-色氨酸；6-溴-色氨酸；6-氯-d-色氨酸；6-氯-色氨酸；6-氟-色氨酸；6-甲基-色氨酸；7-苄氧基-色氨酸；7-溴-色氨酸；7-甲基-色氨酸；d-1,2,3,4-四氢-去甲哈尔满-3-羧酸；6-甲氧基-1,2,3,4-四氢去甲哈尔满-1-羧酸；7-氮杂色氨酸；l-1,2,3,4-四氢-去甲哈尔满-3-羧酸；5-甲氧基-2-甲基-色氨酸；以及6-氯-l-色氨酸。
[0085]
在一些实施方案中，轴突导向因子-1化合物可包含一个或多个非必需氨基酸。非必需氨基酸残基可以是可以从多肽的野生型序列改变而不破坏或基本上不改变其必需的生物学或生物化学活性(例如，受体结合或活化)的残基。
[0086]
在一些实施方案中，轴突导向因子-1化合物可包含一个或多个保守的氨基酸取代。在一些实施方案中，保守的氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有侧链的氨基酸残基替代的取代。具有碱性侧链的氨基酸包括arg、his和lys，具有酸性侧链的氨基酸包括asp和glu，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸包括asn、cys、gln、gly、ser、thr和tyr，具有非极性侧链的氨基酸包括ala、ile、leu、met、phe、pro、trp和val，具有i-支链侧链的氨基酸包括ile、thr和val，并且具有芳族侧链的氨基酸包括his、phe、trp和tyr。在一些实施方案中，保守的氨基酸取代是极高度保守的取代、高度保守的取代或如下表中所示的保守取代：
[0087][0088]
如本文所公开，轴突导向因子-1化合物显示有效治疗高脂血疾患。因此，在一些实施方案中，一种或多种轴突导向因子-1化合物可用于治疗、抑制或减轻受试者的高脂血疾患。在一些实施方案中，待用一种或多种轴突导向因子-1化合物治疗的受试者患有高脂血疾患。在一些实施方案中，受试者已被诊断为患有高脂血疾患。在一些实施方案中，受试者
表现出与一种或多种高脂血疾患相关的症状。在一些实施方案中，受试者需要治疗高脂血疾患。“需要治疗高脂血疾患”的受试者包括处于高脂血疾患风险，患有高脂血疾患，表现出高脂血疾患的症状，具有高胆固醇水平或具有高ldl水平的那些受试者。
[0089]
轴突导向因子-1化合物和组合物以及施用
[0090]
一种或多种轴突导向因子-1化合物的施用可以通过直接施用或通过施用编码一种或多种轴突导向因子-1化合物的一种或多种核酸分子来实现。
[0091]
在一些实施方案中，向受试者施用治疗有效量的一种或多种轴突导向因子-1化合物。如本文所用，“治疗有效量”是指与对照(诸如安慰剂)相比可用于治疗、缓解、改善、预防或抑制受试者的给定疾病或疾患(诸如高脂血疾患或其症状)的量。例如，在一些实施方案中，治疗有效量是在受试者中具有有益效果的量，例如，与正常对照和/或阴性对照相比，在受试者中降低高水平的胆固醇和/或高水平的ldl。在一些实施方案中，治疗有效量是与正常对照和/或阴性对照相比抑制或减少高脂血疾患的体征和/或症状(诸如高水平的胆固醇和/或高水平的ldl)的量。本领域技术人员将理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的量，包括给定疾病或疾患的程度、先前治疗、受试者的一般健康和年龄等。然而，治疗有效量可以通过本领域的方法容易地确定。在一些实施方案中，根据本发明的轴突导向因子-1化合物的治疗有效量在约1ng/kg至约100mg/kg体重、约0.001mg/kg至约100mg/kg体重、约0.01mg/kg至约10mg/kg体重、约0.01mg/kg至约5mg/kg体重、约0.01mg/kg至约3mg/kg体重、约0.01mg/kg至约2mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg或约0.01mg/kg至约0.5mg/kg体重的范围内。在一些实施方案中，将约1ng/kg至约25ng/kg，优选地约10ng/kg至约20ng/kg，并且更优选地约15ng/kg体重的一种或多种轴突导向因子-1化合物在给定的时间段(例如约3周)内每天向受试者施用。在一些实施方案中，施用是皮下的。在一些实施方案中，施用模式提供一种或多种轴突导向因子-1化合物的控制释放。在一些实施方案中，一种或多种轴突导向因子-1化合物可以使用皮下植入的药物递送装置诸如渗透微型泵施用。在一些实施方案中，一种或多种轴突导向因子-1化合物以缓释组合物的形式皮下施用，例如通过注射。参见，例如schaefer等人.(2016)journal of drug delivery 2016:2407459。
[0092]
应当注意，用治疗有效量治疗受试者可以作为单剂量或作为一系列的几个剂量施用。用于治疗的剂量可以在给定的治疗过程中增加或减少。对于给定的一组疾患和给定的受试者的最佳剂量可以由本领域技术人员使用本领域中的剂量确定测试和/或诊断测定来确定。剂量确定测试和/或诊断测定可用于在治疗过程中监测和调节剂量。在一些实施方案中，一种或多种轴突导向因子-1化合物以组合物的形式施用。
[0093]
在一些实施方案中，组合物包含一种或多种轴突导向因子-1化合物，基本上由其组成或由其组成。如本文所用，“包含”一种或多种轴突导向因子-1化合物的组合物意指组合物可含有其他化合物，包括不是轴突导向因子-1化合物的蛋白质(例如轴突导向因子-1化合物)。如本文所用，“基本上由一种或多种轴突导向因子-1化合物组成”的组合物意指该组合物可以包含除轴突导向因子-1化合物之外的蛋白质，只要另外的蛋白质不实质上改变包含在组合物中的轴突导向因子-1化合物的活性或功能。如本文所用，“由一种或多种轴突导向因子-1化合物组成”的组合物意指该组合物除一种或多种轴突导向因子-1化合物之外不含蛋白质。由一种或多种轴突导向因子-1化合物组成的组合物可包含除蛋白质以外的成分，例如药学上可接受的载体、表面活性剂、防腐剂等。在一些实施方案中，由一种或多种轴
突导向因子-1化合物组成的组合物可含有可包括肽污染物的可忽略量的污染物，例如一种或多种轴突导向因子-1化合物的较小片段，其可由例如一种或多种轴突导向因子-1化合物的合成、后续加工、储存条件和/或蛋白质降解产生。
[0094]
在一些实施方案中，组合物可包含一种或多种纯化的轴突导向因子-1化合物，基本上由其组成，或由其组成。如本文所用，“纯化的”轴突导向因子-1化合物意指已经从轴突导向因子-1化合物中除去一定量的与轴突导向因子-1化合物天然缔合的大分子组分。如本文所用，包含一种或多种纯化的轴突导向因子-1化合物、基本上由其组成或由其组成的组合物意指该组合物不含一定量的与一种或多种轴突导向因子-1化合物天然缔合的大分子组分和/或用于合成轴突导向因子-1化合物的试剂。在一些实施方案中，从一种或多种轴突导向因子-1化合物中除去(或不存在于组合物中)的量为大分子组分和/或试剂的至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。在一些实施方案中，组合物不含至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的与一种或多种轴突导向因子-1化合物天然缔合的大分子组分和/或用于合成一种或多种轴突导向因子-1化合物的试剂。在一些实施方案中，本发明的组合物仅由一种或多种轴突导向因子-1化合物例如固体或结晶形式的一种或多种轴突导向因子-1化合物组成。
[0095]
在一些实施方案中，根据本发明的组合物包含一种或多种轴突导向因子-1化合物和药学上可接受的载体。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指通过人的手添加到组合物中的载体或稀释剂，其通常对预期接受者无毒并且不显著抑制包含在组合物中的一种或多种轴突导向因子-1化合物的活性。在一些实施方案中，根据本发明的组合物可包含一种或多种本领域已知的赋形剂、稀释剂、助剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、增稠剂、胶凝剂、发泡剂、表面活性剂、粘合剂、悬浮剂、崩解剂、润湿剂、溶剂、增塑剂、填充剂、着色剂、分散剂、调味剂和/或类似物。
[0096]
根据本发明的组合物通常包含约0.1－99％的一种或多种轴突导向因子-1化合物。在一些实施方案中，根据本发明的组合物包含一种或多种轴突导向因子-1肽和全长轴突导向因子-1蛋白，诸如全长人轴突导向因子-1蛋白。在一些实施方案中，组合物是协同组合物，例如包含协同量的第一轴突导向因子-1化合物和第二轴突导向因子-1化合物的组合物。
[0097]
在一些实施方案中，一种或多种轴突导向因子-1化合物以游离酸或游离碱的形式包含在本发明的组合物中。在一些实施方案中，一种或多种轴突导向因子-1化合物以药学上可接受的盐诸如酸或碱加成盐的形式包含在组合物中。药学上可接受的盐是指一种或多种轴突导向因子-1化合物的任何盐形式，其通常对预期接受者无毒并且不显著抑制包含在组合物中的一种或多种轴突导向因子-1化合物或其他活性剂的活性。在一些实施方案中，一种或多种轴突导向因子-1化合物以水合物或前药的形式提供。
[0098]
包含一种或多种轴突导向因子-1化合物的组合物可以通过全身途径和/或通过局部途径施用。合适的施用途径示例性地包括静脉内、口服、含服、肠胃外、鞘内、脑室内、腹膜内、心内、动脉内、膀胱内、眼部、眼内、直肠、阴道、皮下、皮内、透皮、肌内、局部、鼻内和经粘膜。在一些实施方案中，一种或多种轴突导向因子-1化合物及其组合物静脉内或通过心室
内注射施用。
[0099]
在一些实施方案中，可以使用本领域已知的方法和组合物修饰根据本发明的轴突导向因子-1化合物和组合物以改善它们的生物半衰期、稳定性、功效、生物利用度、生物活性或它们的组合。例如，在一些实施方案中，可以对轴突导向因子-1化合物进行环化以产生抗蛋白水解降解的环肽。环化可以使用本领域已知的方法通过二硫键、羊毛硫氨酸、双咔唑、肼或内酰胺桥在肽序列的侧链或末端之间进行。
[0100]
在一些实施方案中，轴突导向因子-1化合物可以与诸如维生素b12、脂质或环氧乙烷化合物的分子缀合，所述环氧乙烷化合物例如聚乙二醇(peg)、聚环氧乙烷(peo)和聚氧乙烯(poe)、甲氧基聚乙二醇(mpeg)、单甲氧基聚乙二醇(mpeg)、二乙二醇(mini-peg)等。环氧乙烷化合物可以进一步用例如胺结合末端官能团诸如n-羟基琥珀酰亚胺酯、n-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯和脂族醛，或硫醇结合基团诸如马来酰亚胺、吡啶基二硫化物和乙烯基磺酸酯官能化。因为氨基基团(α-氨基和ε-赖氨酸氨基)和半胱氨酸残基非常适合于缀合，所以轴突导向因子-1化合物可以进一步包含一个或多个氨基酸残基用于缀合至环氧乙烷分子或本领域已知的载体化合物。缀合肽的药代动力学和药效学性质可通过使用特定接头进一步修饰。例如，丙基和戊基接头可用于提供具有松散构象的缀合物，而苯基接头可用于提供更致密的构象以及邻近c端的屏蔽结构域。应注意，相对于松散构象，致密构象通常在维持生物活性、延长血浆半衰期、降低蛋白水解敏感性和免疫原性方面更有效。
[0101]
在一些实施方案中，轴突导向因子-1化合物可以使用本领域已知的方法例如原位化学反应或定点诱变来超糖基化。超糖基化可导致n-连接或o-连接的蛋白质糖基化。给定轴突导向因子-1化合物的清除率可通过选择特定糖来优化。例如，聚唾液酸(psa)具有不同的大小，并且其清除率取决于聚合物的类型和分子大小。因此，例如，具有高分子量的psa可适用于递送低分子量的轴突导向因子-1化合物，而具有低分子量的psa可适用于递送具有高分子量的轴突导向因子-1化合物。糖的类型可用于将轴突导向因子-1化合物靶向至特定组织或细胞。例如，与甘露糖缀合的轴突导向因子-1化合物可被甘露糖特异性凝集素例如甘露糖受体和甘露聚糖结合蛋白识别，并被肝脏吸收。在一些实施方案中，可以将轴突导向因子-1化合物超糖基化以改善它们在不同环境条件下的物理和化学稳定性，例如抑制在应激条件下的失活并减少由生产和储存条件引起的聚集。
[0102]
在一些实施方案中，药物递送系统，诸如微粒、纳米颗粒(尺寸范围为10至1000nm的颗粒)、纳米乳液、脂质体等可用于提供对敏感蛋白质的保护、延长释放、降低施用频率、增加患者顺应性和控制血浆水平。可以使用各种天然或合成的微粒和纳米颗粒，它们可以是生物可降解的和/或生物相容的聚合物。微粒和纳米颗粒可以由脂质、聚合物和/或金属制成。聚合物微粒和纳米颗粒可以由天然或合成聚合物诸如淀粉、藻酸盐、胶原、壳聚糖、聚己内酯(pcl)、聚乳酸(pla)、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(plga)等制造。在一些实施方案中，纳米颗粒是固体脂质纳米颗粒(sln)、碳纳米管、纳米球、纳米胶囊等。在一些实施方案中，聚合物是亲水性的。在一些实施方案中，聚合物是硫醇化的聚合物。
[0103]
由于药物从微粒和纳米颗粒中释放的速率和程度可取决于聚合物的组成和制造方法，可选择给定的组成和制造方法，例如喷雾干燥、冻干、微挤出和双重乳液，以赋予期望的药物释放曲线。因为在微粒或纳米颗粒之中或之上掺入的肽片段在制剂开发期间可能易于在水-有机界面变性，所以可使用不同的稳定赋形剂和组合物来防止聚集和变性。例如，
可以将peg和糖，例如peg(mw 5000)和麦芽糖与α-胰凝乳蛋白酶一起添加到组合物中以减少聚集和变性。另外，可以使用化学修饰的肽片段，例如缀合的肽片段和超糖基化的肽片段。
[0104]
蛋白质稳定性也可以通过所选择的制造方法来实现。例如，为了防止水-有机界面处的降解，可以使用被称为技术的非水方法。固态的肽片段也可以使用水包油固体(s/o/w)方法包封，例如，喷雾-或喷雾-冷冻-干燥的肽片段或负载肽的固体纳米颗粒可以使用s/o/w方法包封在微球中。疏水离子对(hip)络合可用于增强蛋白质稳定性并增加对微粒和纳米颗粒的包封效率。在疏水离子对(hip)络合中，肽的可电离官能团与含有带相反电荷官能团的离子对试剂(例如表面活性剂或聚合物)络合，导致形成hip络合物，其中亲水蛋白质分子以疏水络合物形式存在。
[0105]
在一些实施方案中，合成或天然来源和各种大小例如20nm至几百微米的脂质体可用于递送肽片段。根据制备方法，脂质体可以是小单层囊泡(25-50nm)、大单层囊泡(100-200nm)、巨大单层囊泡(1-2μm)和多层囊泡(mlv；1μm-2μm)。被递送的肽片段可以被包封在脂质体中或吸附在表面上。可以优化脂质体的大小和表面性质以获得期望的结果。例如，单层和多层脂质体在血管内给药后几小时至几天提供持续释放。延长的药物释放可以通过多囊脂质体(也称为技术)实现。与ulv和mlv不同，多囊脂质体由被脂质层网络包围的非同心的多个水性室组成，其赋予增加的稳定性水平和更长的药物释放持续时间。可以进一步修饰脂质体以实现期望的结果。例如，脂质体可被peg化或具有其他表面修饰以便干扰网状内皮系统的识别和摄取并提供增加的循环时间。
[0106]
适用于本发明的示例性脂质体包括多层囊泡(mlv)、寡层囊泡(olv)、单层囊泡(uv)、小单层囊泡(suv)、中型单层囊泡(muv)、大单层囊泡(luv)、巨单层囊泡(guv)、多囊泡(mvv)、通过反相蒸发方法制备的单层或寡层囊泡(rev)、通过反相蒸发方法制备的多层囊泡(mlv-rev)、稳定的多层囊泡(splv)、冷冻和解冻的mlv(fatmlv)、通过挤出方法制备的囊泡(vet)、通过弗氏压碎器制备的囊泡(fpv)、通过融合制备的囊泡(fuv)、脱水-再水化囊泡(drv)和泡状体(bsv)。
[0107]
脂质体可以包含另外的脂质，例如，载体脂质，包括棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、磷脂酰胆碱(pc；卵磷脂)、磷脂酸(pa)、磷脂酰甘油(pg)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰丝氨酸(ps)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二硬脂酰磷脂酰甘油(dspg)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(dmpg)、二棕榈酰磷脂酸(dppa)；二肉豆蔻酰磷脂酸(dmpa)、二硬脂酰磷脂酸(dspa)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(dpps)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(dmps)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(dsps)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)等，或它们的组合。在一些实施方案中，脂质体还包含固醇(例如胆固醇)。
[0108]
在一些实施方案中，胶束可用于递送轴突导向因子-1化合物。磷脂诸如dspe-peg、共聚体系peg-pe、pla-peg和超支化聚([胺-酯]-共聚-[d,l-丙交酯])和聚离子络合物可用于增加稳定性和药代动力学。
[0109]
热敏凝胶可用于递送轴突导向因子-1化合物。包含peg、pcl、pla、聚(乙交酯)、plga、聚(n-异丙基丙烯酰胺)、聚环氧乙烷、壳聚糖等的热可逆嵌段共聚物可用于提供肽片段的控制释放。热敏凝胶的实例包括plga-peg-plga三嵌段共聚物凝胶和pluronic f-127
(pf127)。聚电解质复合物和/或peg化可用于提供蛋白质从凝胶的持续释放。微粒和/或纳米颗粒也可以与凝胶组合使用以提供持续的药物递送。
[0110]
轴突导向因子-1化合物可以化学合成，或在细胞系统或无细胞系统中重组表达。合成方法包括液相合成、固相合成和微波辅助的肽合成。可以通过酰化、烷基化、酰胺化、精氨酰化、聚谷氨酰胺化、多糖基化、丁酰化、γ-羧化、糖基化、丙二酰化、羟基化、碘化、核苷酸添加(例如，adp-核糖基化)、氧化、磷酸化、腺苷酰化、丙酰化、s-谷胱甘肽化、s-亚硝基化、琥珀酰化、硫酸化、糖化、棕榈酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化或异戊烯化(例如，法呢基化或香叶基香叶基化)、糖基磷脂酰肌醇化、脂酰化、黄素部分的连接(例如，fmn或fad)、血红素c的连接、磷酸泛酰巯基乙胺化、亚视黄基席夫碱形成、双硫酰胺形成、乙醇胺磷酸甘油连接、次黄嘌呤形成、生物素化、聚乙二醇化、isg化、sumu化、泛素化、拟素化、类泛素化、瓜氨酸化、脱酰胺化、消去化、氨甲酰化或它们的组合来修饰。
[0111]
包含一种或多种轴突导向因子-1化合物的组合物可进行本领域已知的一轮或多轮纯化或浓缩步骤以除去杂质和/或浓缩肽片段。因此，在一些实施方案中，本发明提供了具有天然未发现的纯度和/或组成的肽组合物。在一些情况下，肽组合物是至多30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％或100％纯的肽片段。在一些情况下，肽组合物是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％或100％纯的肽片段。在一些情况下，组合物不含杂质。在一些情况下，肽组合物中肽片段的量为总组合物的至多30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、90重量％、95重量％、99重量％、99.9重量％或100％重量。在一些情况下，肽组合物中肽片段的量为总组合物的至少30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、90重量％、95重量％、99重量％、99.9重量％或100重量％。
[0112]
本发明的组合物包括含有一种或多种轴突导向因子-1化合物的药物组合物。术语“药物组合物”是指适用于受试者的药物用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂，例如一种或多种根据本发明的轴突导向因子-1化合物，和药学上可接受的载体。术语“有效量”是指足以产生所需结果的剂量或量。所需结果可包括接受者的剂量或量的客观或主观改善，例如长期存活、疾病状态的有效预防等。在一些实施方案中，“有效量”小于治疗有效量。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的一种或多种轴突导向因子-1化合物。根据本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种补充剂。补充剂包括前列腺素类似物、内皮素受体拮抗剂(era)、5型磷酸二酯酶(pde-5)抑制剂和可溶性鸟苷酸环化酶(sgc)刺激剂。
[0113]
根据本发明的一种或多种轴突导向因子-1化合物可以优选以药物组合物的形式向受试者施用。优选地，受试者是哺乳动物，更优选地，受试者是人。优选的药物组合物是包含治疗有效量的至少一种轴突导向因子-1化合物和药学上可接受的媒介物的药物组合物。
[0114]
本发明的药物组合物可以使用本领域已知的方法配制用于预期的递送途径，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、眼内、鞘内、关节内、滑膜内、池、肝内、病灶内注射、颅内注射、输注和/或吸入施用途径。根据本发明的药物组合物可包含以下中的一种或多种：ph缓冲溶液，佐剂(例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂)、脂质体制剂、纳米颗粒、分散体、悬浮液或乳液，以及用于重构为无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。可以使用本领域的方法优化本发明的组合物和制剂以提高稳定性和功效。参见，例如carra等人.(2007)vaccine 25:
4149
–
4158。
[0115]
本发明的组合物可以通过任何合适的途径向受试者施用，包括口服、透皮、皮下、鼻内、吸入、肌内和血管内施用。应当理解，优选的给药途径和药物制剂将随受试者的疾患和年龄、待治疗疾患的性质、所需的治疗效果和所用的特定轴突导向因子-1化合物而变化。
[0116]
如本文所用，“药学上可接受的媒介物”或“药学上可接受的载体”可互换使用并且是指溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，其与药物施用相容并且符合适用的标准和法规，例如美国药典和国家处方集(usp-nf)书中阐述的用于药物施用的药典标准。因此，例如，不包括非无菌水作为用于至少静脉内给药的药学上可接受的载体。药学上可接受的媒介物包括本领域已知的媒介物。参见例如remington:the science and practice of pharmacy.第20版.(2000)lippincott williams&wilkins.baltimore,md。
[0117]
本发明的药物组合物可以以剂量单位形式提供。如本文所用，“剂量单位形式”是指适合作为单一剂量用于待治疗的受试者的物理离散单位；每个单位含有预定量的一种或多种轴突导向因子-1化合物，其经计算与所需的药学上可接受的载体结合产生所需的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格由给定的轴突导向因子-1化合物的独特特征和待实现的期望的治疗效果，以及在配制用于治疗个体的这样的活性化合物的领域中固有的限制来决定并直接取决于它们。
[0118]
轴突导向因子-1化合物及其组合物的毒性和治疗功效可以使用细胞培养物和/或实验动物和本领域的药物程序来确定。例如，可以通过本领域的方法测定致死剂量、lc
50
(表示为对50％群体致死的浓度
×
暴露时间的剂量)或ld
50
(对50％群体致死的剂量)和ed
50
(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为ld
50
/ed
50
的比率。优选表现出大治疗指数的轴突导向因子-1化合物。虽然可以使用导致毒性副作用的轴突导向因子-1化合物，但应小心设计将此类化合物靶向治疗部位的递送系统，以使对未感染细胞的潜在损害最小化，从而减少副作用。
[0119]
获自细胞培养测定和/或动物研究的数据可用于配制一系列用于人的剂量。优选的剂量提供一定范围的循环浓度，其包括具有很少或没有毒性的ed
50
。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的施用途径而变化。根据本发明的一种或多种轴突导向因子-1化合物的治疗有效量和剂量最初可以从细胞培养测定中估计。可以在动物模型中配制剂量以实现包括如在细胞培养物中测定的ic
50
(即，实现症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。所述信息可用于更准确地测定人中的有用剂量。可例如通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。另外，适合于给定受试者的剂量可以由主治医师或合格的执业医师基于各种临床因素来确定。
[0120]
以下实施例旨在说明而非限制本发明。
[0121]
材料和方法
[0122]
轴突导向因子-1化合物
[0123]
以下是示例性轴突导向因子-1化合物：
[0124]
v1p：(mini-peg)-cdcrhntag(seq id no:2)
[0125]
v2p：(mini-peg)-clncrhntag(seq id no:3)
[0126]
v3p：(mini-peg)-cpckdgvtigit(seq id no:4)
[0127]
v1s：sdcrhntag(seq id no:5)
[0128]
v1t：tdcrhntag(seq id no:6)
[0129]
v1c：cdcrhntag(seq id no:7)，其中半胱氨酸残基通过二硫键连接
[0130]
v1d：dcdcrhntadg(seq id no:8)，其中“d”表示氨基酸残基是d-氨基酸
[0131]
全长人类轴突导向因子-1蛋白gi 148613884(seq id no:9)
[0132]
v1-9aa：cdcrhntag(seq id no:10)
[0133]
v2-10aa：clncrhntag(seq id no:11)
[0134]
v3-11aa：cpckdgvtgit(seq id no:12)
[0135]
v1:ckcnghaarcvrdrddslvcdcrhntagpecdrckpfhydrpwqratareanec(seq id no:13)
[0136]
v2:cncnlharrcrfnmelyklsgrksggvclncrhntagrhchyckegyyrdmgkpithrkac(seq id no:14)
[0137]
v3:cdchpvgaagktcnqttgqcpckdgvtgitcnrcakgyqqsrspiapc(seq id no:15)
[0138]
v2-缺失：nlharrcrfnmelyklsgrksggvclncrhntagrh(seq id no:16)
[0139]
v3-缺失：hpvgaagktcnqttgqcpckdgvtgit(seq id no:17)
[0140]
试剂
[0141]
小鼠重组轴突导向因子-1购自r&d systems(minneapolis,mn)。胆固醇、甘油三酯和hdl-胆固醇的测定试剂盒都购自pointe scientific(canton,mi)。甘油三酯和hdl-胆固醇的标准溶液也购自pointe scientific。使用获自sigma-aldrich(st louis,mo)的粉末制备胆固醇测定的标准品。用于巨噬细胞染色的抗体、大鼠抗小鼠cd107b(mac3)购自bd biosciences(san jose,ca)。m1巨噬细胞标记物il-1β小鼠单克隆抗体和m2巨噬细胞标记物精氨酸酶-1兔单克隆抗体购自cell signaling technology(danvers,ma)。4'6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐(dapi)溶液来自invitrogen(carlsbad,ca)。制备histopaque 1083(sigma-aldrich,st louis,mo)和钙黄绿素am(calbiochem,germany)用于单核细胞分离和标记。unc5b的两种不同抗体购自abcam(cambridge,ma)和enzo life sciences(farmingdale,ny)。
[0142]
动物
[0143]
所有动物程序均由加利福尼亚大学洛杉矶分校动物护理和使用委员会(ucla)批准。apoe-/-小鼠的种畜购自jackson laboratory(bar harbor,me,品系b6.129p2-apoe
tmlunc
/j)并在室内饲养直至实验使用。在开始高脂肪饮食(hfd/42％脂肪；harlan laboratories,madison,wi)16周之前，十二至十四周龄的雄性动物每天输注或不输注轴突导向因子-1(15ng/天)。
[0144]
使用渗透泵的轴突导向因子-1化合物输注
[0145]
使用渗透泵通过输注递送轴突导向因子-1化合物。为了完成16周的治疗，在hfd期间更换渗透泵两次。每只动物使用两个6周泵和一个4周泵(alzet,cupertino,ca)。将动物在密闭室中用异氟烷麻醉并移至提供吸入麻醉面罩的手术阶段。在供应与1.5％异氟烷混合的95％/5％的o2/co2的同时，将后颈下部区域的毛发去除并使用乙醇和碘溶液消毒。在该区域做一个小切口，并且皮下插入6周或4周渗透泵。
[0146]
组织采集
[0147]
在hfd饲喂16周后，将动物称重并通过用co2安乐死处死。通过左心室注射肝素(0.1ml)并使其循环一分钟，并且使用14g针头从右心室缓慢采集血液。采集的血液用于分析脂质分布。然后用冰冷的pbs灌注动物以冲洗出体内剩余的血液。取出整个肝叶以记录每只动物的体重。立即从身体切除连接心脏的主动脉，并在手术显微镜下清洁结缔组织。包括主动脉根部的心脏的上部四分之一用于组织学分析，因为与主动脉的其他部分相比，三尖瓣/主动脉根部倾向于最频繁地显示动脉粥样硬化病变。采集主动脉的其余部分，包括升主动脉、主动脉弓、降主动脉和髂动脉分支点，并在正面开口用于油红-o染色。
[0148]
血浆脂质分布测量
[0149]
将从右心室采集的血液置于1.5ml离心管中并以2000rpm离心10分钟。将半透明血浆相替换到新的离心管中并用于每次测定。根据制造商的说明书，基于比色变化测量胆固醇、甘油三酯和hdl-胆固醇的水平。使用bio-tek读板器检测500nm处的吸光度。
[0150]
主动脉解剖正面上的油红-o染色
[0151]
在2-丙醇中制备3％的油红-o溶液并将试剂加热至56℃持续1小时。通过与水混合将油红-o试剂稀释至1.8％，并用0.22μm注射器过滤器过滤。将主动脉开口正面用含pbs(pbst)的0.5％曲通冲洗一次，并且然后在室温下用工作油红-o溶液染色30分钟。在染色后，将主动脉用2-丙醇洗涤1分钟并返回pbst进行另外的洗涤。在nikon e600显微镜下获得主动脉图像，并使用imagej计算染色的病变面积。
[0152]
主动脉根组织学分析
[0153]
将包括主动脉根部区域的心脏上部四分之一切片并收集到4％的多聚甲醛中用于o/n固定。将组织在10％蔗糖中置换至少数小时，然后包埋在石蜡中以5μm切片。在ucla的翻译病理学核心实验室核心设施中使用标准方案进行石蜡切片和h&e染色。切片组织切片也用于使用抗cd107b(mac 3)抗体的巨噬细胞染色。双盲进行所有染色。
[0154]
单核细胞分离
[0155]
从6-8周龄雄性c57bl/6小鼠的骨髓中分离单核细胞。采集股骨和胫骨并清洁，并且使用胰岛素注射器将冰冷的pbs冲洗到骨中。使用histopaque 1083以通过在室温下以400x g离心30分钟来分离单核细胞。小心地更换中间不透明层并用rpmi1640洗涤。
[0156]
单核细胞内皮粘附测定
[0157]
在96孔板上的m199培养基中培养牛主动脉内皮细胞(baec)直至超过80％汇合。在测定当天，将100ng/ml的tnfα添加到baec中，同时从骨髓收获单核细胞。用钙黄绿素am标记1.0x 106个细胞/ml浓度的分离单核细胞。同时，用或不用ptio处理baec 30分钟。在标记30分钟后，将单核细胞用培养基洗涤两次，并用或不用抗unc5b抗体(1μg)处理以阻断unc5b受体与轴突导向因子-1的结合。同时，将轴突导向因子-1(100ng/ml)添加到baec中。将两个细胞再孵育30分钟。在孵育结束时，除去baec的培养基，并用温pbs洗涤一次。然后将100μl pbs中的单核细胞覆盖在baec上并共培养30分钟。将细胞用pbs轻轻洗涤两次以除去未粘附的细胞。通过在bio-tek荧光读板器中在激发/发射：485/528nm下读数来检测钙黄绿素am标记的单核细胞粘附baec的水平。
[0158]
单核细胞中的unc5b检测
[0159]
为了观察unc5b响应于轴突导向因子-1结合的裂解，用或不用轴突导向因子-1处理单核细胞30分钟。在处理后，将细胞沉淀裂解，并按照标准方案使用7.5％sds/page和硝
酸纤维素膜通过蛋白质印迹法检测完整的unc5b和裂解的unc5b蛋白水平。来自abcam的抗体(#ab139643/1:500稀释)用于检测完整形式的unc5b，而来自enzo life sciences的抗体(#alx-804-846-c100/1:500稀释)用于检测裂解的unc5b。计算裂解/完整的unc5b的表达水平的比率。
[0160]
其他实验和实施方案
[0161]
轴突导向因子-1活性的增强
[0162]
为了测定轴突导向因子-1化合物对单核细胞活化的影响及其对unc5b的依赖性；p47phox的抑制是否通过轴突导向因子-1化合物抑制unc5b而增强再狭窄和动脉粥样硬化的消除；以及轴突导向因子-1化合物对血管平滑肌细胞(vsmc)增殖和迁移以及巨噬细胞浸润的作用和潜在的分子机制，可以进行以下实验。
[0163]
单核细胞募集到损伤部位是促进再狭窄和动脉粥样硬化的主要成分。单核细胞趋化蛋白(mcp)-1/ccl2对趋化因子(c-c基序)配体2的过表达诱导巨噬细胞浸润和动脉粥样硬化病变形成，而mcp-1缺乏或抑制与损伤后内膜增生减少有关。mcp-1负责募集单核细胞，其随后在血管壁内变成巨噬细胞。
[0164]
在初步实验中，发现轴突导向因子-1以unc5b依赖性方式减弱单核细胞迁移(图8、图b、图9、图10)。在另外的初步研究中，发现mcp-1表达在股动脉线损伤后上调，但通过轴突导向因子-1输注减弱。unc5b独特地在单核细胞中表达，而在内皮细胞和心肌细胞中不表达。
[0165]
可以在存在或不存在轴突导向因子-1化合物处理和unc5b抗体的情况下测定单核细胞迁移和与内皮细胞的粘附，以阐明轴突导向因子-1对单核细胞活化的作用，以及这些调节对unc5b的依赖性。还可以检查在高脂肪饲喂的apoe无效小鼠和ldl受体(ldlr)缺陷小鼠的受损股动脉和主动脉中的单核细胞活化和mcp-1原位表达，所述小鼠具有和不具有轴突导向因子-1化合物输注并且注射用轴突导向因子-1化合物预处理的内皮祖细胞(epc)。除了炎症，vsmc增殖和迁移在再狭窄和动脉粥样硬化中起重要作用。在最初的内皮损伤后，no的损失导致vsmc增殖和迁移的no依赖性抑制的损失。因此，假设通过产生no，轴突导向因子-1化合物通过抑制vsmc增殖和迁移而减轻再狭窄和动脉粥样硬化。
[0166]
从6-8周龄c57bl6小鼠的骨髓中分离单核细胞。为了分析轴突导向因子-1化合物对单核细胞迁移的调节，在存在或不存在中和unc5b抗体(2μg/ml)的情况下，将细胞接种在无血清培养基中的transwell小室中。将transwell置于装有含5％fbs的rpmi 1640培养基的24孔板上，存在或不存在轴突导向因子-1化合物(100ng/ml)。在孵育4小时后，用含有钙黄绿素am(calbiochem)的解离缓冲液(trevigen)处理作为迁移群体的transwell底表面上的细胞。使用bio-tek荧光板读取器分别在485nm和520nm的激发和发射下测量钙黄绿素am强度的荧光(synergy ht,bio-tek)。
[0167]
在初步实验中，发现单核细胞迁移的轴突导向因子-1抑制被unc5b抗体消除(图9)。可以使用本领域的方法分析单核细胞与内皮细胞的粘附。在存在或不存在unc5b抗体(2μg/ml)的情况下用轴突导向因子-1(100ng/ml，12小时)处理后，用无血清rpmi1640培养基中的vybrant dii或dio溶液(分子探针)标记单核细胞。将标记的单核细胞(2x 105个细胞/孔)添加到培养在24孔板中的牛主动脉内皮细胞的汇合单层中。在37℃孵育后，通过用rpmi洗涤除去未粘附的细胞。在荧光显微镜下计数荧光标记的单核细胞。
[0168]
另外的初步数据表明p47phox对unc5b表达的令人感兴趣的调节作用。p47phox的敲除导致unc5b的显著上调，表明p47phox抑制unc5b表达(图10)。由于unc5b丰度增加，轴突导向因子-1在减弱p47phox敲除小鼠中的单核细胞迁移方面更有效(图10)。轴突导向因子-1增加了裂解的unc5b的水平，这可能使其较少用于引导单核细胞迁移，导致迁移活性降低(图8、图b)。
[0169]
p47phox/apoe dko小鼠可用于通过原位定量单核细胞浸润来检查动脉粥样硬化的任何减少是否源自减少的单核细胞活化，并如下检查体内单核细胞活化中与unc5b和再狭窄相关的反应。
[0170]
可以使用moma-2(单克隆抗小鼠)(mc和标记物)的荧光探针通过单核细胞浸润到伤口部位来评估原位单核细胞的活化，并且在股动脉损伤后第1天和第7天，在输注和不输注轴突导向因子-1化合物(在渗透微型泵中15ng/kg/天)和注射用轴突导向因子-1化合物预处理的epc(500个细胞)的情况下在股动脉损伤小鼠中定量。假设预处理的epc也将抑制单核细胞活化。使用本领域已知的用于新生内膜形成/再狭窄的股动脉线损伤模型。在股动脉损伤后1周和4周通过免疫组织化学评价mcp-1的原位表达(来自cell signaling的抗体，1:50)。所有体内实验含有以下6组：假手术组、假手术/轴突导向因子-1组、假手术/轴突导向因子-1-epc组、损伤组、损伤/轴突导向因子-1组、损伤/轴突导向因子-1-epc组，使用新生内膜/再狭窄模型(股动脉损伤)和动脉粥样硬化模型(高脂肪饮食饲喂的apoe无效和ldlr缺陷小鼠)。其他组可包括p47phox敲除小鼠和p47phox/apoe dko小鼠。
[0171]
vsmc的增殖和迁移是再狭窄和动脉粥样硬化的标志。假设再狭窄的轴突导向因子-1衰减至少部分归因于vsmc增殖和迁移的抑制。在初步实验中，通过轴突导向因子-1处理消除vsmc迁移，这通过清除no、拮抗cgmp和抑制p38 mapk而逆转(图11，ec-vsmc共培养系统)。然而，似乎不涉及erk1/2和jnk。此外，响应于轴突导向因子-1的p38 mapk磷酸化被cgmp拮抗剂抑制。因此，可以描述不同p38 mapk同种型的作用。存在四种不同的p38同种型，包括原型p38α(通常作为p38)、p38β、p38γ和p38δ。p38和p38β普遍表达，而p38γ主要在骨骼肌中表达，并且p38δ在肺、肾、睾丸、胰腺和小肠中发现。因此，可以检测p38/p38β在介导轴突导向因子-1抑制vsmc迁移中的潜在差异作用。
[0172]
为了检查vsmc迁移的轴突导向因子-1调节是否由no的内皮细胞产生特异性地介导，ec-vsmc共培养系统的新系统适用于使用伤口分析检验vsmc迁移。将内皮细胞分别培养在transwell插入物上并暴露于轴突导向因子-1化合物，然后覆盖在生长在6孔板上的vsmc细胞(rasmcs,lonza)的顶部，在基线处产生伤口，并在将轴突导向因子-1刺激的内皮细胞插入物置于顶部后随时间观察反应。将u0126(erk1/2，50μmol/l)、sb202190(p38，10μmol/l)、sp600125(jnk，10μmol/l)、rp-8-br-pet-cgmp(cgmp，10μmol/l)和ptio(no清除剂，60μmol/l)的药理学抑制剂添加到vsmc培养物中，然后将内皮细胞插入物置于顶部。跟踪vsmc单层的迁移/伤口闭合活性，并拍照用于使用image j软件的分析。
[0173]
使用本领域已知的mtt测定法测定vsmc增殖。在vsmc与轴突导向因子-1(100ng/ml)孵育24、48、72或96小时后；将20μl的5mg/ml mtt添加到96孔板中并孵育3小时。在孵育结束时，添加150μl dmso来溶解紫色甲臜晶体，并使用bio-tek荧光板读数器在540nm波长下测定吸光度。为了分析vsmc原位增殖，如pcna再狭窄模型所述进行pcna和ki67染色。通过mac-3染色检测巨噬细胞原位浸润，并且在初步实验中，在高脂肪饮食饲喂的apoe无效小鼠
中巨噬细胞的显著原位浸润通过轴突导向因子-1输注显著减弱(数据未显示)。
[0174]
预期结果和数据解释。轴突导向因子-1化合物预期一致地抑制单核细胞活化，包括迁移和粘附于内皮细胞，受损的股动脉和高脂肪饲喂的apoe无效小鼠/ldlr缺陷小鼠的主动脉中的mcp-1原位表达。由于在用unc5b中和抗体处理的细胞中或在unc5b敲除小鼠的主动脉中抑制效果将丧失，所以预期迁移的变化是由轴突导向因子-1化合物对unc5b的活化所引起。基于来自p47phox缺陷小鼠的数据的unc5b表达的氧化还原敏感性调节机制预期表明通过单核细胞上unc5b的上调发生由轴突导向因子-1化合物对单核细胞活化的抑制。轴突导向因子-1化合物预期通过no/cgmp/pkg/p38 mapk途径持续抑制vsmc迁移。
[0175]
unc5b依赖性单核细胞活化的减弱
[0176]
为了确定施用轴突导向因子-1化合物或用轴突导向因子-1化合物预处理的epc是否在高脂肪饲喂的apoe无效和ldlr缺陷小鼠中减弱血脂异常和动脉粥样硬化，可以检查涉及单核细胞和vsmc活化的减弱以及轴突导向因子-1化合物对血脂异常的减弱的潜在分子机制。
[0177]
epc功能增强和vsmc迁移减弱介导轴突导向因子-1预防股动脉内皮细胞线损伤后的再狭窄。这些作用由依赖dcc受体的epc存活保持和no介导的vsmc迁移抑制介导。p47phox在介导unc5b裂解以调节unc5b依赖性单核细胞应答中的独特作用以及轴突导向因子-1化合物对vsmc迁移及其机制的抑制作用可使用ec-vsmc共培养物检验，其中内皮细胞在被分层(在插入物上)在受伤的vsmc单层上之前暴露于轴突导向因子-1化合物。可以对闭合伤口的vsmc的迁移活性进行成像和定量。no清除剂ptio和其他信号传导途径抑制剂可用于预处理vsmc以揭示与no的内皮产生相关的下游信号传导和机制。基于轴突导向因子-1对调节在动脉粥样硬化和再狭窄中都起主要作用的epc、单核细胞和vsmc的作用，饲喂高脂肪饮食的apoe无效小鼠和ldlr缺陷小鼠可用于如下检查轴突导向因子-1对动脉粥样硬化和血脂异常的作用。
[0178]
为了检查轴突导向因子-1对动脉粥样硬化的作用，将12-14周的野生型和apoe无效或ldlr缺陷小鼠用高脂肪饮食(42％脂肪，harlan labs)饲喂，用或不用渗透微型泵(15ng/天)输注轴突导向因子-1化合物16周。如图1和图2中所示，轴突导向因子-1在apoe无效鼠中完全减弱高胆固醇血症和高甘油三酯血症的脂肪肝、病变形成和血脂异常中具有强烈的保护作用。这些实验和在ldlr缺陷动物中用轴突导向因子-1化合物的类似处理可以如下进行。在收获当天，测量体重和器官重量。测定包括ldl-胆固醇的血浆脂质水平。简言之，新鲜制备血浆并使用胆固醇试剂比色测定试剂盒(pointe scientific,#c7510)测量总胆固醇。对于hdl胆固醇测量，在比色测定之前将血浆与沉淀剂(pointe scientific,#h7511)一起孵育以除去ldl和vldl。使用autoldl胆固醇试剂盒(pointe scientific,#7574)测定ldl胆固醇水平。非ldl脂蛋白颗粒被试剂盒中提供的试剂1分离和消耗。然后使用试剂盒中提供的试剂2测定ldl胆固醇水平。使用甘油三酯试剂盒(pointe scientific,#t7532)通过量热测量甘油三酯水平。在收获后，将全长主动脉新鲜分离并进行油红染色以评价动脉粥样硬化病变。通过mac-3染色和cd36染色定量浸润巨噬细胞和负载脂质的cd36 巨噬细胞/泡沫细胞。
[0179]
为了检查unc5b依赖性单核细胞活化是否被轴突导向因子-1减弱而导致延迟的动脉粥样化形成，可将unc5b敲除小鼠与apoe无效小鼠杂交，并且然后在原位分析单核细胞活
化和分析病变形成之前进行高脂肪饮食饲喂。为了确定vsmc活化的轴突导向因子-1衰减是否涉及减少的动脉粥样化形成，可以检查原位vsmc活化的标记物。可以将pkg抑制剂给予小鼠以检查对vsmc活化的抑制作用的破坏是否会减弱轴突导向因子-1对动脉粥样硬化的保护作用。初步数据表明轴突导向因子-1显著治疗血脂异常。由于轴突导向因子-1主要靶向血管和心脏中的内皮细胞，因此轴突导向因子-1化合物可用于降低受试者中的脂质，从而治疗与血脂异常相关的疾病和病症，例如动脉粥样硬化。
[0180]
为了比较轴突导向因子-1化合物与降低胆固醇的现有途径的作用，可以如下检查轴突导向因子-1化合物是否抑制hmg-coa还原酶和pcsk9活性。对于生物合成途径，使用来自sigma的试剂盒测定肝脏中的hmg-coa还原酶活性。检查酶的磷酸化和其降解以及mrna表达水平，以阐明轴突导向因子-1化合物的详细调节机制。pcsk9是将ldl受体粘附并内化到溶酶体中从而促进其破坏的肝蛋白酶。在apoe无效小鼠中使用来自abcam的试剂盒测定pcsk9活性。还可以在apoe无效小鼠中分析轴突导向因子-1化合物对oxldl和ldlr表达的循环水平的影响。
[0181]
在平行实验中，相同饲喂的apoe无效或ldlr缺陷小鼠注射用轴突导向因子-1化合物预处理的epc，所述预处理的epc预期产生no，从而抑制动脉粥样硬化的各个方面，包括单核细胞和vsmc活化。使用本领域的方法制备epc，并且然后用轴突导向因子-1(500个细胞，100ng/ml轴突导向因子-1化合物)离体预处理，然后在16周的整个研究期间每24小时注射给小鼠。然后检查动物的动脉粥样硬化的证据和标记物。
[0182]
预期结果和数据解释。轴突导向因子-1化合物在apoe无效小鼠中对高脂肪饲喂诱导的动脉粥样硬化和血脂异常表现出强烈的抑制作用，并且在ldlr缺陷小鼠中预期具有相当的结果。轴突导向因子-1化合物预期增强epc功能并减弱单核细胞和vsmc活化。
[0183]
内源性轴突导向因子-1信号传导上调
[0184]
为了确定内源性轴突导向因子-1信号传导是否具有对抗再狭窄和动脉粥样硬化的生理保护性，所述再狭窄和动脉粥样硬化的损失夸大了血管病理学，并且为了确定用外源性施用轴突导向因子-1来放大内源性信号传导对于实现足够的保护是否是必需的，可以进行以下实验。
[0185]
外源施用的轴突导向因子-1化合物具有强的心脏保护和再狭窄保护作用。对抗再狭窄和动脉粥样硬化的保护被假定为由增强的epc功能介导以增加再内皮化、消除vsmc增殖和迁移以及减弱血管壁中的单核细胞活化。在心脏中，由轴突导向因子-1产生的no减弱nadph氧化酶同种型4的活化以减少氧化应激、enos解偶联、线粒体功能障碍和慢性自噬以及心肌梗塞后的心脏重塑。轴突导向因子-1及其受体dcc(介导从ec和epc产生no)也在生理条件下在内皮细胞和心肌细胞中内源性表达。本文的数据表明内源性轴突导向因子-1信号传导对于no依赖性心脏保护的生理保护是重要的，no依赖性心脏保护的丧失导致缺血再灌注损伤后心脏损伤的恶化。可以使用轴突导向因子-1敲除小鼠检测轴突导向因子-1化合物在血管保护中的内源性作用，用于再狭窄/新生内膜模型，并且使用轴突导向因子-1/apoe双敲除小鼠分析动脉粥样硬化。通过轴突导向因子-1化合物的生理学血管保护的分子机制也可以类似地检查，包括no产生、增强的epc归巢和如上所述的减弱的原位单核细胞和vsmc活化。假设用外源补充物放大内源性信号传导是对抗血管病变的充分保护所必需的。
[0186]
为了检测轴突导向因子-1在对抗再狭窄的保护中的内源性作用，将轴突导向因
子-1敲除小鼠暴露于股动脉损伤模型并收获用于分析新生内膜形成。对于这些实验，使8-10周龄的雄性和雌性wt和轴突导向因子-1缺陷小鼠经受股动脉线损伤并在4周后收获，使用股骨的未损伤侧作为对照。对于股动脉损伤方案，在股动脉上方的右大腿区域做一个切口。分离股动脉并清除结缔组织。使用小动脉钳暂时停止血流，并且在股直肌和股内侧肌之间的分支上做切口。将涂覆有肝素的导丝插入动脉并向上移动。然后移除动脉夹并将导丝朝髂动脉向上移动。使导丝停留60秒，并向切口点回拉；该运动重复3次。然后再次夹紧动脉并将导丝从动脉中拉出。然后使用手术丝(5-0vicryl)结扎动脉上的切口部位。闭合并缝合皮肤，并且用手术胶密封。在右腿上进行损伤手术，而左股动脉保持完整以作为对照。
[0187]
对于组织学分析，动物在安乐死后灌注4％多聚甲醛。然后在适当的时间点收获组织并包埋在石蜡(例如，在7天和28天采集的用于血管形态的样品)和oct(例如，在1小时和24小时采集的用于原位分析epc归巢和单核细胞和vmsc活化的免疫荧光染色的样品)中，并以5μm进行切片。通过在损伤后第7天或第28天分析来自h&e染色的内膜和中膜层的面积来评价内膜生长。对于急性反应，使用cd34和同工凝集素gs-ib4抗体在损伤后1小时的组织上检测归巢epc和驻留内皮细胞。此外，使用vectastatin试剂盒(载体实验室)进行pcna染色。使用荧光ab检测ki67，并与同工凝集素对比以区分vsmc对内皮细胞的调节。使用image j软件量化图像。将轴突导向因子-1输注(15ng/天，4周)到受伤小鼠中消除了雄性和雌性小鼠中的新生内膜形成和再狭窄(图12，a-图d)。这些数据建立了对两种性别的动物的严格分析，以及所有实验方案评估新生内膜生长/再狭窄的可行性，包括量化。
[0188]
预期股动脉损伤的轴突导向因子-1敲除小鼠的再狭窄/新生内膜形成恶化。在进一步的实验中，产生轴突导向因子-1/apoe双敲除小鼠并进行高脂肪饲喂以诱导动脉粥样硬化，并且预期通过油红染色定义的恶化的动脉粥样硬化。如上所述，也可以在这些小鼠中检测epc的归巢，以及单核细胞和vsmc的原位活化。评估血浆脂质分布。在一些实验中，轴突导向因子-1/apoe双敲除小鼠输注不同剂量的轴突导向因子-1(5，15ng/天，16周)，以检查这是否足以将病变形成减弱至低剂量的apoe无效小鼠的水平和有效显著减少病变形成的高剂量的对照水平。
[0189]
预期结果和数据解释。预期轴突导向因子-1缺陷与两种性别的股动脉线损伤的轴突导向因子-1敲除小鼠中恶化的再狭窄/新生内膜形成有关。预期该反应与更差的epc功能相关，其特征在于归巢减少，以及单核细胞和vsmc在伤口部位中原位活化。与单独的apoe无效小鼠相比，高脂肪饲喂轴突导向因子-1/apoe双敲除小鼠预期导致更差的病变形成，伴随更差的血脂异常和体重增加/脂肪肝发展。然而，将轴突导向因子-1输注到dko小鼠中预期导致部分或完全减弱病变形成和与apoe无效或对照动物水平相关的表型。总之，这些数据表明通过增加轴突导向因子-1的内源性表达或施用外源性轴突导向因子-1化合物来扩增轴突导向因子-1信号传导对于血管保护是重要的。
[0190]
参考文献
[0191]
以下参考文献以全文引用的方式并入本文中，例外的是，如果术语的范围和含义与本文中明确阐述的定义冲突，则以本文中明确阐述的定义为准：
[0192]
[1]j.jawien，“the role of an experimental model of atherosclerosis：apoe-knockout mice in developing new drugs against atherogenesis，”curr.pharm.biotechnol.，vol.13，no.13，pp.2435-2439，2012.
[0193]
[2]m.f.linton，p，g.yancey，s.s.davies，w.g(jay)jerome，e.f.linton，and k.c.vickers，the role of lipids and lipoproteins in atherosclerosis，vol.111，no.2877.2000.
[0194]
[3]w.insull，“the pathology of atherosclerosis：plaque development and plaque responses to medical treatment，”am.j.med.，vol.122，no.1 suppl.，2009.
[0195]
[4]d.gradinaru，c.borsa，c.ionescu，and g.i.prada，“oxidized ldl and no synthesis-biomarkers of endothclial dysfunction and ageing，”mechanisms of ageing and development，vol.151.pp.101-113，2015.
[0196]
[5]t.heitzer et al，“tetrahydrobiopterin improves endothelium-dependent vasodilation in chronic smokers：evidence for a dysfunctional nitric oxide synthase.，”circ res，vo1.86，no.2，pp.e36-e41，2000.
[0197]
[6]c.muller，r.salvayre，a.n
è
gre-salvayre，and c.vindis，“oxidized ldls trigger endoplasmic reticulum stress and autophagy：prevention by hdls，”autophagy，vol.7，no.5.pp.541-543，2011.
[0198]
[7]a.nguyen and h.cai，“netrin-l induces angiogenesis via a dcc-dependent erk1/2-enosfeed-forward mechanism，”proc.natl.acad.sci.u.s.a.，vol.103，no.17，pp.6530-5，2006.
[0199]
[81n.m.liu，k.l.siu，j.y.youn，and h，cai，“attenuation of neointimal formation with netrin-1and netrin-1 preconditioned endothelial progenitor cells，”j.mol.med，vol.95，no.3，pp.335-348，2017.
[0200]
[9]d.salisburyand u.bronas，“inflammation and immune system contribution to the etiology of atherosclerosis：mechanisms and methods of assessment，”nursing research，vol.63，no.5pp.375-385，2014.
[0201]
[10]d.a.chistiakov，a.v.grechko，v.a.myasoedova，a.a.melnichenko，and a.n.orekhov，“the role of monocytosis and neutrophilia in atherosclerosis，”journal of cellular and molecular medicine，vol.22，no.3pp.1366-1382，2018.
[0202]
[11]n.p.ly et al，”netrin-1inhibits leukocyte migration in vitro and in vivo，”proc natl acad sci u s a，vol.102，no.41，pp.14729-14734，2005.
[0203]
[12]n.a.elshourbagy，h.v.meyers，and s.s.abdel-meguid，“cholesterol：the good，the bad，and the ugly-therapeutic targets for the treatment of dyslipidemia，”medical principles and practice，vol.23，no.2pp.99-111，2014.
[0204]
[13]y.li，t.r.gilbert，a.h.matsumoto，and w.shi，“effect of aging on fatty streak formation in a diet-induced mouse model of atherosclerosis，”j.vasc.res.，vol.45，no.3，pp.205-210，2008.
[0205]
[14]h.arakawa，“p53，apoptosis and axon-guidance molecules，”cell death and differentiation，vol.12，no.8.pp.1057-1065，2005.
[0206]
[15]u.landmesser，b.hornig，and h.drexler，“endothelial dysfunction in hypercholesterolemia：mechanisms，pathophysiological importance，and therapeutic interventions.，”semin.thromb.hemost.，vol.26，no.5，pp.529-37，2000.
[0207]
[16]y.baumer et al.，“hyperlipidemia-induced cholesterol crystal production by endothelial cells promotes atherogenesis，”nat.commun.，vol.8，no.1，2017.
[0208]
[17]s.bandeali and j.farmer，“high-density lipoprotein and atherosclerosis：the role of antiioxidant activity，”curr.atheroscler.rep.，vol.14，no.2，pp.101-107，2012.
[0209]
[18]g.f.lewis and d.j.rader，“new insights into the regulation of hdl metabolism and reverse cholesterol transport，”circulation research，vol.96，no.12.pp.1221-1232，2005.
[0210]
除非另有说明，否则本技术中使用的所有科学和技术术语具有本领域中常用的含义。
[0211]
除非特别指出，否则肽以n端在左侧表示，并且序列从n端到c端书写。类似地，除非特别指出，否则核酸序列以5
′
端在左侧表示并且序列从5
′
到3
′
书写。
[0212]
如本文所用，术语“受试者”、“患者”和“个体”可互换使用以指人类和非人类动物。术语“非人动物”和“动物”是指所有非人脊椎动物，例如非人哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、马、绵羊、狗、牛、猪、鸡和其他兽医受试者和试验动物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。
[0213]
如本文所用，术语“诊断”是指告知(即口头地或通过书写(在例如纸或电子媒体上))另一方(例如患者)诊断的物理和活动步骤。类似地，“提供预后”是指告知(即口头或通过书写(在例如纸或电子媒体上))另一方(例如患者)预后的物理和活动步骤。
[0214]
除非另外确切说明，否则单数的使用可包括复数。如本说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述(the)”可包括复数指示物。
[0215]
如本文所用，“和/或”意指“和”或“或”。例如，“a和/或b”意指“a、b、或a和b两者”并且“a、b、c和/或d”意指“a、b、c、d或它们的组合”并且所述“a、b、c、d或它们的组合”意指a、b、c和d的任何子集，例如，单成员子集(例如，a或b或c或d)、两成员子集(例如，a和b；a和c；等)、或三成员子集(例如，a、b和c；或a、b和d；等)，或所有四个成员(例如，a、b、c和d)。
[0216]
如本文所用，短语“中的一者或多者”，例如“a、b和/或c中的一者或多者”意指“a中的一者或多者”、“b中的一者或多者”、“c中的一者或多者”、“a中的一者或多者和b中的一者或多者”、“b中的一者或多者和c中的一者或多者”、“a中的一者或多者和c中的一者或多者”以及“a中的一者或多者、b中的一者或多者和c中的一者或多者”。
[0217]
短语“包含a，基本上由a组成，或由a组成”用作避免过多页面和翻译费的工具，并且在一些实施方案中意味着所讨论的给定事物：包含a，基本上由a组成，或由a组成。例如，句子“在一些实施方案中，组合物包含a，基本上由a组成，或由a组成”应被解释为写成以下三个单独的句子：“在一些实施方案中，组合物包含a。在一些实施方案中，组合物基本上由a组成。在一些实施方案中，组合物由a组成”。
[0218]
类似地，叙述一串交替的句子被解释为提供一串句子，使得每个给定的交替在句子中单独提供。例如，句子“在一些实施方案中，组合物包含a、b或c”应被解释为写成以下三个单独的句子：“在一些实施方案中，组合物包含a。在一些实施方案中，组合物包含b。在一
些实施方案中，组合物包含c”。作为另一个实例，句子“在一些实施方案中，组合物包含至少a、b或c”应解释为写成以下三个单独的句子：“在一些实施方案中，组合物包含至少a。在一些实施方案中，组合物至少包含b。在一些实施方案中，组合物包含至少c”。
[0219]
如本文所用，术语“蛋白质”、“多肽”、“肽”和“肽片段”可互换使用，是指连接在一起的两个或更多个天然和/或非天然氨基酸，并且在本文的序列和式中使用一个字母的氨基酸名称。如本文所用，“aa”是用于“氨基酸”的缩写。例如，“v1-9aa”的“9aa”表示该肽的长度为9个氨基酸残基。
[0220]
如本文所用，给定百分比的“序列同一性”是指序列之间相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比，当在给定的比较窗口上进行比较和最佳比对以获得最大对应性时，如通过视觉检查或本领域中的序列比较算法(诸如blast算法，其描述于altschul等人.,j.mol.biol.215:403-410(1990)中)所测量。用于进行blast(例如blastp和blastn)分析的软件可通过国家生物技术信息中心(ncbi.nlm.nih.gov)公开获得。比较窗口可以存在于给定部分，例如功能结构域，或任意选择一个或两个序列的给定数目的连续核苷酸或氨基酸残基。另选地，比较窗口可以存在于被比较的序列的全长上。出于本文的目的，当未提供给定的比较窗口(例如，超过给定序列的80％)时，所述序列同一性超过给定序列的100％。另外，对于本文提供的蛋白质的序列同一性百分比，使用blastp 2.8.0 ，评分矩阵blosum62和blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi处可用的默认参数确定百分比。还参见altschul,等人.(1997),nucleic acids res.25:3389-3402；和altschul,等人.(2005)febs j.272:5101-5109。
[0221]
用于比较的序列的最佳比对可以例如通过以下来进行：通过smith&waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源比对算法，通过needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源比对算法，通过pearson&lipman,pnas usa 85:2444(1988)的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化实施(wisconsin genetics software package,genetics computer group,575 science dr.,madison,wi中的gap、bestfit、fasta和tfasta)，或通过目测。
[0222]
在理解或完成本发明的公开内容所必需的程度上，本文提及的所有出版物、专利和专利申请明确地以引用的方式并入本文中，如同每个出版物、专利和专利申请单独地如此并入一般。
[0223]
已经如此描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当注意，所公开的内容仅仅是示例性的，并且在本发明的范围内可以进行各种其他替换、修改和变型。因此，本发明不限于本文所示的特定实施方案，而是仅由所附权利要求限制。