溶藻放线菌活性物质的制备方法及应用与流程

1.本发明涉及环保技术领域，尤其涉及富营养化水体治理技术领域，更加涉及溶藻放线菌活性物质的制备方法及应用。


背景技术：

2.水华(algal blooms)指淡水水体中藻类大量繁殖的一种自然生态现象，是水体富营养化的一种特征。主要由于生活及工农业生产中含有大量氮、磷的废污水进入水体后，蓝藻(又叫蓝细菌，包括微囊藻、鱼腥藻、颤藻、念珠藻、蓝球藻、发菜等)、绿藻、硅藻等大量繁殖后使水体呈现蓝色或绿色的一种现象。
3.目前国内外采用的除藻方法包括物理方法、化学方法和生物方法。物理方法主要有机械清淤、过滤除藻、黏土除藻和气浮除藻等，费用大、成本高，且难以应用较大面积的蓝藻防治，在实际应用中受到限制。化学方法主要是采用化学药剂如硫酸铜、过氧化氢、表面活性剂、次氯酸钠等，化学方法容易产生二次污染，对水体生物产生潜在危害。生物法是利用藻类的天敌如细菌、病毒、捕食藻体的浮游动物、水生植物、大型藻类等，或其所产生的某些抑制藻类生长的物质来控制藻类数目的增加，从而达到抑制的目的。生物法具有操作简单，成本低，无二次污染等优点，成为目前国内外的研究热点。因此，寻找一种高效的生物除藻剂具有非常重要的意义。
4.生物法中利用溶藻细菌在去除水体中有害藻类是目前研究比较多的方向，研究发现较多的溶藻细菌是通过分泌胞外活性物质来进行溶藻的，目前对溶藻细菌的研究更多的是在实验室阶段，在生产培养方面相对较少。


技术实现要素：

5.基于上述问题，本发明的目的在于提供一种溶藻放线菌活性物质的制备方法及应用，此制备方法简单，且能有效的促进分泌溶藻放线菌活性物质，所制得的溶藻放线菌活性物质除藻效果明显且稳定性高。
6.为实现上述目的，本发明一方面提供了溶藻放线菌活性物质的制备方法，包括步骤：
7.(1)将放线菌接种至含有培养基的摇瓶中，所述培养基包括碳水化合物、盐、谷氨酸和蓝藻，再置于培养箱中振荡培养得一级种子液；
8.(2)将所述一级种子液按照体积分数为10～20％的接种量接种到一级种子罐中进行培养得二级种子液；
9.(3)将所述二级种子液按照体积分数为10～20％的接种量接种到发酵罐中培养得放线菌发酵液；
10.(4)将所述放线菌发酵液离心后得上清液并加入稳定剂进行混合。
11.与现有技术相比，本发明采用放线菌进行接种培养，放线菌可产生较多的生物活性物质，具有明显的抑藻效果。培养基中添加谷氨酸和蓝藻，由于放线菌产生的部分生物活
性物质为氨基酸类物质，因而通过添加谷氨酸可促使放线菌在发酵过程中分泌更多的活性物质。添加蓝藻可使放线菌在发酵过程中一直保持对藻的去除能力，以分泌相应的活性物质。发酵后取上清液加入稳定剂，可以有效抑制杂菌的生长，以保持除藻性能的稳定性。
12.在一些实施方案中，所述培养基包括可溶性淀粉10～35g/l、乙酸钠5～10g/l、硝酸钠0.5～2.0g/l、硝酸钾0.2～1.5g/l、k2hpo
4 0.1～1g/l、nah2po
4 0.1～1g/l、mgso4·
7h2o 0.2～0.8g/l、nacl 0.2～0.8g/l、feso4·
7h2o 0.005～0.05g/l、谷氨酸0.2～2g/l和蓝藻5～10g/l。
13.在一些实施方案中，所述蓝藻包括铜绿微囊藻、颤藻和念珠藻中的至少一种。
14.在一些实施方案中，所述放线菌为细黄链霉菌。
15.在一些实施方案中，步骤(1)中所述培养的条件包括在25～35℃的培养箱中震荡培养48～96h，且震荡转速为100～200rpm。
16.在一些实施方案中，步骤(2)中所述培养的条件包括温度25～35℃、转速100～200rpm、罐压0.05～0.1mpa、溶解氧20～60％、ph 6.5～8.5、培养时间48～96h。
17.在一些实施方案中，步骤(3)中所述培养的条件包括温度25～35℃、转速100～200rpm、罐压0.05～0.1mpa、溶解氧20～60％、ph 6.5～8.5、培养48～96h。
18.在一些实施方案中，所述离心的转速为2000～6000rpm。
19.在一些实施方案中，所述稳定剂包括对羟基苯甲酸乙酯钠0.5～2.5g/l、乙酸钠10～50g/l和酸，且所述酸调节ph为5.0～6.5。
20.本发明另一方面提供了溶藻放线菌活性物质于水体中藻类去除的应用。
具体实施方式
21.本发明的溶藻放线菌活性物质于水体中进行藻类去除时，可根据蓝藻爆发时期的不同而设置不同的投加量，从而以提高除藻效果。如于蓝藻出现早期，溶藻放线菌活性物质的投加量为水体体积分数的十万分之一至十万分之五；于蓝藻出现中期，溶藻放线菌活性物质的投加量为水体体积分数的万分之一至万分之五；于蓝藻出现后期，溶藻放线菌活性物质的投加量为水体体积分数的十万分之五至万分之五。
22.本发明的溶藻放线菌活性物质的制备方法包括步骤：
23.(1)将放线菌接种至含有培养基的摇瓶中，培养基包括碳水化合物、盐、谷氨酸和蓝藻，再置于培养箱中振荡培养得一级种子液；
24.(2)将一级种子液按照体积分数为10～20％的接种量接种到一级种子罐中进行培养得二级种子液；
25.(3)将二级种子液按照体积分数为10～20％的接种量接种到发酵罐中培养得放线菌发酵液；
26.(4)将放线菌发酵液离心后得上清液并加入稳定剂进行混合。
27.其中，步骤(1)中，放线菌为细黄链霉菌，对蓝藻有较高的抑制效果。
28.作为示例，培养基包括可溶性淀粉10～35g/l、乙酸钠5～10g/l、硝酸钠0.5～2.0g/l、硝酸钾0.2～1.5g/l、k2hpo
4 0.1～1g/l、nah2po
4 0.1～1g/l、mgso4·
7h2o 0.2～0.8g/l、nacl 0.2～0.8g/l、feso4·
7h2o 0.005～0.05g/l、谷氨酸0.2～2g/l和蓝藻5～10g/l。可溶性淀粉的含量具体可以但不限于为10g/l、13g/l、15g/l、17g/l、20g/l、23g/l、
25g/l、27g/l、30g/l、33g/l、35g/l。乙酸钠的含量具体可以但不限于为5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l。硝酸钠的含量具体可以但不限于为0.5g/l、0.7g/l、0.9g/l、1.1g/l、1.3g/l、1.5g/l、1.7g/l、1.9g/l、2.0g/l。硝酸钾的含量具体可以但不限于为0.2g/l、0.3g/l、0.5g/l、0.7g/l、0.9g/l、1.1g/l、1.3g/l、1.5g/l。k2hpo4的含量具体可以但不限于为0.1g/l、0.2g/l、0.3g/l、0.4g/l、0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、0.8g/l、0.9g/l、1g/l。nah2po4的含量具体可以但不限于为0.1g/l、0.2g/l、0.3g/l、0.4g/l、0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、0.8g/l、0.9g/l、1g/l。mgso4·
7h2o的含量具体可以但不限于为0.2g/l、0.3g/l、0.4g/l、0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、0.8g/l。nacl的含量具体可以但不限于为0.2g/l、0.3g/l、0.4g/l、0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、0.8g/l。feso4·
7h2o的含量具体可以但不限于为0.005g/l、0.01g/l、0.015g/l、0.02g/l、0.025g/l、0.03g/l、0.035g/l、0.04g/l、0.045g/l、0.05g/l。谷氨酸的含量具体可以但不限于为0.2g/l、0.4g/l、0.6g/l、0.8g/l、1.0g/l、1.2g/l、1.4g/l、1.6g/l、1.8g/l、2g/l。蓝藻的含量具体可以但不限于为5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l。
29.作为示例，蓝藻包括铜绿微囊藻、颤藻和念珠藻中的至少一种。
30.步骤(1)中培养的条件包括在25～35℃的培养箱中震荡培养48～96h，且震荡转速为100～200rpm。作为示例，培养温度具体可以但不限于为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃。培养时间具体可以但不限于为48h、50h、53h、57h、60h、64h、68h、72h、75h、78h、80h、82h、84h、86h、88h、90h、92h、94h、96h。转速具体可以但不限于为100rpm、120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm。
31.步骤(2)中培养的条件包括温度25～35℃、转速100～200rpm、罐压0.05～0.1mpa、溶解氧20～60％、ph 6.5～8.5、培养时间48～96h。作为示例，培养温度具体可以但不限于为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃。转速具体可以但不限于为100rpm、120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm。罐压具体可以但不限于为0.05mpa、0.06mpa、0.07mpa、0.08mpa、0.09mpa、0.1mpa。溶解氧具体可以但不限于为20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％。ph具体可以但不限于为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。培养时间具体可以但不限于为48h、50h、53h、57h、60h、64h、68h、72h、75h、78h、80h、82h、84h、86h、88h、90h、92h、94h、96h。
32.步骤(3)中培养的条件包括温度25～35℃、转速100～200rpm、罐压0.05～0.1mpa、溶解氧20～60％、ph 6.5～8.5、培养48～96h。作为示例，培养温度具体可以但不限于为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃。转速具体可以但不限于为100rpm、120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm。罐压具体可以但不限于为0.05mpa、0.06mpa、0.07mpa、0.08mpa、0.09mpa、0.1mpa。溶解氧具体可以但不限于为20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％。ph具体可以但不限于为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。培养时间具体可以但不限于为48h、50h、53h、57h、60h、64h、68h、72h、75h、78h、80h、82h、84h、86h、88h、90h、92h、94h、96h。
33.步骤(4)中，离心的转速为2000～6000rpm，作为示例，离心的转速具体可以但但不限于为2000rpm、2500rpm、3000rpm、3500rpm、4000rpm、4500rpm、5000rpm、5500rpm、6000rpm。
34.稳定剂包括对羟基苯甲酸乙酯钠0.5～2.5g/l、乙酸钠10～50g/l和酸。其中，作为示例，对羟基苯甲酸乙酯钠的含量具体可以但不限于为0.5g/l、0.8g/l、1.0g/l、1.2g/l、
1.5g/l、1.8g/l、2.0g/l、2.3g/l、2.5g/l。乙酸钠的含量具体可以但不限于为10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l、40g/l、45g/l、50g/l。酸为盐酸、硫酸和乙酸至少一种，采用酸调节ph为5.0～6.5。
35.为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例及对比例中所涉及的原料除特殊说明可皆为市售，其中，铜绿微囊藻和念珠藻均可在中国科学院淡水藻种库采购获得。细黄链霉菌在中国工业微生物菌种保藏管理中心采购。
36.实施例1
37.本实施例为溶藻放线菌活性物质的制备方法，包括步骤：
38.(1)将细黄链霉菌接种至含有培养基的摇瓶中，培养基包括可溶性淀粉10g/l、乙酸钠6g/l、硝酸钠1.0g/l、硝酸钾0.2g/l、k2hpo
4 0.5g/l、nah2po
4 0.1g/l、mgso4·
7h2o 0.4g/l、nacl 0.5g/l、feso4·
7h2o 0.01g/l、谷氨酸0.5g/l和铜绿微囊藻10g/l，再置于30℃的培养箱中以150rpm的转速振荡培养48h得一级种子液；
39.(2)将一级种子液按照体积分数为10％的接种量接种到一级种子罐中进行培养得二级种子液，一级种子罐的培养条件为温度30℃、转速150rpm、罐压0.08mpa、溶解氧30％、ph7.0、培养48h；
40.(3)将二级种子液按照体积分数为10％的接种量接种到发酵罐中培养得放线菌发酵液，发酵罐的培养条件为温度30℃、转速150rpm、罐压0.08mpa、溶解氧30％、ph7.0、培养48；
41.(4)将放线菌发酵液以4000rpm的转速离心后得上清液并加入稳定剂进行混合，稳定剂包括对羟基苯甲酸乙酯钠0.5g/l、乙酸钠10g/l和盐酸，盐酸浓度为5％且调节混合后的溶液ph为5.5。
42.实施例2
43.本实施例为溶藻放线菌活性物质的制备方法，包括步骤：
44.(1)将细黄链霉菌接种至含有培养基的摇瓶中，培养基包括可溶性淀粉30g/l、乙酸钠9g/l、硝酸钠1.0g/l、硝酸钾1.0g/l、k2hpo
4 0.8g/l、nah2po
4 0.5g/l、mgso4·
7h2o 0.6g/l、nacl 0.5g/l、feso4·
7h2o 0.03g/l、谷氨酸1.0g/l和铜绿微囊藻5g/l，再置于30℃的培养箱中以200rpm的转速振荡培养48h得一级种子液；
45.(2)将一级种子液按照体积分数为10％的接种量接种到一级种子罐中进行培养得二级种子液，一级种子罐的培养条件为温度25℃、转速150rpm、罐压0.08mpa、溶解氧30％、ph7.0、培养80h；
46.(3)将二级种子液按照体积分数为15％的接种量接种到发酵罐中培养得放线菌发酵液，发酵罐的培养条件为温度35℃、转速150rpm、罐压0.08mpa、溶解氧50％、ph7.0、培养48；
47.(4)将放线菌发酵液以5500rpm的转速离心后得上清液并加入稳定剂进行混合，稳定剂包括对羟基苯甲酸乙酯钠2.0g/l、乙酸钠5g/l和盐酸，盐酸浓度为5％且调节混合后的溶液ph为5.5。
48.实施例3
49.本实施例为溶藻放线菌活性物质的制备方法，包括步骤：
50.(1)将细黄链霉菌接种至含有培养基的摇瓶中，培养基包括可溶性淀粉20g/l、乙酸钠6g/l、硝酸钠2.0g/l、硝酸钾0.2g/l、k2hpo
4 0.5g/l、nah2po
4 0.1g/l、mgso4·
7h2o 0.4g/l、nacl 0.8g/l、feso4·
7h2o 0.01g/l、谷氨酸1.0g/l和念珠藻10g/l，再置于35℃的培养箱中以200rpm的转速振荡培养85h得一级种子液；
51.(2)将一级种子液按照体积分数为15％的接种量接种到一级种子罐中进行培养得二级种子液，一级种子罐的培养条件为温度25℃、转速200rpm、罐压0.1mpa、溶解氧50％、ph8.0、培养48h；
52.(3)将二级种子液按照体积分数为10％的接种量接种到发酵罐中培养得放线菌发酵液，发酵罐的培养条件为温度30℃、转速200rpm、罐压0.1mpa、溶解氧45％、ph8.0、培养60h；
53.(4)将放线菌发酵液以5500rpm的转速离心后得上清液并加入稳定剂进行混合，稳定剂包括对羟基苯甲酸乙酯钠0.5g/l、乙酸钠10g/l和乙酸，乙酸浓度为20％且调节混合后的溶液ph为5.1。
54.对比例1
55.本实施例为溶藻放线菌活性物质的制备方法，包括步骤：
56.(1)将细黄链霉菌接种至含有培养基的摇瓶中，培养基包括可溶性淀粉10g/l、乙酸钠6g/l、硝酸钠1.0g/l、硝酸钾0.2g/l、k2hpo
4 0.5g/l、nah2po
4 0.1g/l、mgso4·
7h2o 0.4g/l、nacl 0.5g/l、feso4·
7h2o 0.01g/l和铜绿微囊藻10g/l，再置于30℃的培养箱中以150rpm的转速振荡培养48h得一级种子液；
57.(2)将一级种子液按照体积分数为10％的接种量接种到一级种子罐中进行培养得二级种子液，一级种子罐的培养条件为温度30℃、转速150rpm、罐压0.08mpa、溶解氧30％、ph7.0、培养48h；
58.(3)将二级种子液按照体积分数为10％的接种量接种到发酵罐中培养得放线菌发酵液，发酵罐的培养条件为温度30℃、转速150rpm、罐压0.08mpa、溶解氧30％、ph7.0、培养48；
59.(4)将放线菌发酵液以4000rpm的转速离心后得上清液并加入稳定剂进行混合，稳定剂包括对羟基苯甲酸乙酯钠0.5g/l、乙酸钠10g/l和盐酸，盐酸浓度为5％且调节混合后的溶液ph为5.5。
60.对比例2
61.本实施例为溶藻放线菌活性物质的制备方法，包括步骤：
62.(1)将细黄链霉菌接种至含有培养基的摇瓶中，培养基包括可溶性淀粉10g/l、乙酸钠6g/l、硝酸钠1.0g/l、硝酸钾0.2g/l、k2hpo
4 0.5g/l、nah2po
4 0.1g/l、mgso4·
7h2o 0.4g/l、nacl 0.5g/l、feso4·
7h2o 0.01g/l和谷氨酸0.5g/l，再置于30℃的培养箱中以150rpm的转速振荡培养48h得一级种子液；
63.(2)将一级种子液按照体积分数为10％的接种量接种到一级种子罐中进行培养得二级种子液，一级种子罐的培养条件为温度30℃、转速150rpm、罐压0.08mpa、溶解氧30％、ph7.0、培养48h；
64.(3)将二级种子液按照体积分数为10％的接种量接种到发酵罐中培养得放线菌发
酵液，发酵罐的培养条件为温度30℃、转速150rpm、罐压0.08mpa、溶解氧30％、ph7.0、培养48；
65.(4)将放线菌发酵液以4000rpm的转速离心后得上清液并加入稳定剂进行混合，稳定剂包括对羟基苯甲酸乙酯钠0.5g/l、乙酸钠10g/l和盐酸，盐酸浓度为5％且调节混合后的溶液ph为5.5。
66.对比例3
67.本实施例为溶藻放线菌活性物质的制备方法，包括步骤：
68.(1)将细黄链霉菌接种至含有培养基的摇瓶中，培养基包括可溶性淀粉10g/l、乙酸钠6g/l、硝酸钠1.0g/l、硝酸钾0.2g/l、k2hpo
4 0.5g/l、nah2po
4 0.1g/l、mgso4·
7h2o 0.4g/l、nacl 0.5g/l和feso4·
7h2o 0.01g/l，再置于30℃的培养箱中以150rpm的转速振荡培养48h得一级种子液；
69.(2)将一级种子液按照体积分数为10％的接种量接种到一级种子罐中进行培养得二级种子液，一级种子罐的培养条件为温度30℃、转速150rpm、罐压0.08mpa、溶解氧30％、ph7.0、培养48h；
70.(3)将二级种子液按照体积分数为10％的接种量接种到发酵罐中培养得放线菌发酵液，发酵罐的培养条件为温度30℃、转速150rpm、罐压0.08mpa、溶解氧30％、ph7.0、培养48；
71.(4)将放线菌发酵液以4000rpm的转速离心后得上清液并加入稳定剂进行混合，稳定剂包括对羟基苯甲酸乙酯钠0.5g/l、乙酸钠10g/l和盐酸，盐酸浓度为5％且调节混合后的溶液ph为5.5。
72.对比例4
73.本实施例为溶藻放线菌活性物质的制备方法，包括步骤：
74.(1)将细黄链霉菌接种至含有培养基的摇瓶中，培养基包括可溶性淀粉10g/l、乙酸钠6g/l、硝酸钠1.0g/l、硝酸钾0.2g/l、k2hpo
4 0.5g/l、nah2po
4 0.1g/l、mgso4·
7h2o 0.4g/l、nacl 0.5g/l、feso4·
7h2o 0.01g/l、谷氨酸0.5g/l和铜绿微囊藻10g/l，再置于30℃的培养箱中以150rpm的转速振荡培养48h得一级种子液；
75.(2)将一级种子液按照体积分数为10％的接种量接种到一级种子罐中进行培养得二级种子液，一级种子罐的培养条件为温度30℃、转速150rpm、罐压0.08mpa、溶解氧30％、ph7.0、培养48h；
76.(3)将二级种子液按照体积分数为10％的接种量接种到发酵罐中培养得放线菌发酵液，发酵罐的培养条件为温度30℃、转速150rpm、罐压0.08mpa、溶解氧30％、ph7.0、培养48；
77.(4)将放线菌发酵液以4000rpm的转速离心后得上清液。
78.将实施例1～3和对比例1～4所制得的溶藻放线菌活性物质，分别投加到爆发蓝藻不同时期的水体中，早期投加量为水体体积分数的0.003％，中期投加量为水体体积分数的0.03％，后期投加量为水体体积分数的0.02％，反应3d后，对蓝藻除藻率如表1所示。测试实施例1～3和对比例1～4所制得的溶藻放线菌活性物质于不同保存时间下的染菌情况和除藻率，其结果如表2所示。
79.表1爆发蓝藻不同时期的水体中的蓝藻除藻率
[0080][0081]
表2于不同保存时间下的染菌情况和除藻率
[0082][0083]
由表1的结果可知，本发明溶藻放线菌活性物质的制备方法所制备的溶藻放线菌活性物质不管是在蓝藻爆发的早期、中期还是后期皆具有较高的除藻率。而缺少谷氨酸和/或蓝藻的对比例1～3的除藻率大受影响。
[0084]
由表2的结果可知，本发明溶藻放线菌活性物质的制备方法中加入稳定剂后所制备的溶藻放线菌活性物质，可以有效抑制杂菌的生长，保存2年(24m)之后杂菌的染菌率不到1％。同时还具有较佳的除藻稳定性，保存2年之后其除藻率仍为95％以上。
[0085]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，但是也并不仅限于实施例中所列，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。