一种复合微生物发酵剂的保藏方法与流程

1.本发明涉及微生物发酵剂技术领域，具体涉及一种复合微生物发酵剂的保藏方法。


背景技术：

2.目前，复合微生物发酵剂的制备大多采用纯培养方法，将各个菌体先纯培养，再将培养得到的菌体按照确定的菌种比例复配在一起得到复合菌剂产品，这种方法制得的复合菌剂的缺点是原料、设备和能源的利用率不高，浪费人力，极大的增加了生产成本，造成资源浪费，是一种急待改进的复合菌剂的制作方法。微生物混合培养又叫混菌培养，是指对两种或多种微生物混在一起进行的培养方式，混合培养利用不同菌株之间的协同作用，提高产率，如传统发酵的食品、调味品的生产过程大多是多种微生物协同作用的结果，能够获得纯培养所无法获得的产物。
3.目前复合微生物发酵剂的保藏技术较多，但是现有保藏方法均存在不同程度的缺陷。比如沙土保藏法虽然可用于保藏菌种，但是其存在保藏效果不佳的缺陷；冷冻干燥保藏法对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，但其操作复杂，且对设备的要求高；液体石蜡保藏法制作简单，不需特殊设备，但是其保存菌种时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供了一种复合微生物发酵剂的保藏方法，包括以下步骤：
5.s1、菌种的活化：将植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和异常汉逊酵母的菌种接种至液体培养基中，并在37℃条件下连续活化3代，得到活化菌种；
6.s2、菌体的扩大培养与浓缩：将步骤s1所述的活化菌种接种至液体培养基中，得到扩大培养菌液，然后将所述扩大培养菌液依次进行离心浓缩，过滤，用pbs缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)冲洗2-3次，收集菌泥；
7.s3、添加配料：在步骤s2所述的菌泥中添加保护剂和填充剂，得到含菌混合物；
8.s4、挤压成型：在步骤s3所述的含菌混合物中加入抗热保护剂，然后置于双螺杆挤出机中挤出造粒，双螺杆挤出机的入口温度控制在120-150℃，进料速度为20-50r/min，螺杆速度为10-50r/min，出口温度为50-60℃，得到粒状含菌物质；
9.s5、干燥处理：将步骤s4所述的粒状含菌物质进行微波干燥，得到中间产物；然后将中间产物送入旋转闪蒸干燥机中进行旋转闪蒸干燥，得到复合微生物发酵剂；
10.s6、保藏：将步骤s5所述的复合微生物发酵剂采用背封式包装，常温储藏即可。
11.优选的，步骤s1和步骤s2中所述液体培养基为mrs液体培养基，所述mrs液体培养基包括但不限于以下成分：牛肉膏1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸氢二铵0.2％，乙酸钠0.5％，葡萄糖2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.019％，吐温80 0.1％，ph6.0～8.0，121℃灭菌20min。
12.优选的，步骤s2中所述离心的转速为4000r/min-6000r/min，离心时间20min-30min。
13.优选的，步骤s3中所述保护剂为麦芽糊精和海藻糖。
14.优选的，步骤s3中所述填充剂为淀粉。
15.优选的，步骤s5中所述微波剂量为0.1～1kw/kg，微波时间为1min-10min，微波结束后中间产物的水分含低于10％。
16.优选的，步骤s5中所述抗热保护剂为甘油和脱脂奶粉。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的复合微生物发酵剂的保藏方法不仅有助于保持微生物的活性，提高发酵剂质量，同时还可以在保证复合微生物发酵剂质量的同时大幅延长发酵剂的贮存时间，并且对设备和贮藏条件要求较低。
具体实施方式
18.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
19.下述实施例中所述试验方法或测试方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述原料和助剂，如无特殊说明，均从常规商业途径获得，或以常规方法制备。
20.植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)：购买自中科嘉亿生物工程有限公司；副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)：购买自西安千叶草生物科技有限；嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)：购买自陕西永威生物科技有限公司；异常汉逊酵母(hanseulaanomala)：购买自上海一研生物科技有限公司。
21.实施例1
22.一种复合微生物发酵剂的保藏方法，具体由以下步骤组成：
23.s1、菌种的活化：将植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和异常汉逊酵母的菌种接种至mrs液体培养基中，并在37℃条件下连续活化3代，得到活化菌种；
24.s2、菌体的扩大培养与浓缩：将步骤s1所述的活化菌种接种至mrs液体培养基中，在37℃下恒温摇床中扩大培养48h后，得到扩大培养菌液，然后将扩大培养菌液4000r/min，离心浓缩20min，过滤，用pbs缓冲液冲洗2-3次，收集菌泥；
25.s3、添加配料：称取步骤s2所述的菌泥500g，在其中添加麦芽糊精10g、海藻糖8g和淀粉25g，制成含水量为20％的含菌混合物；
26.s4、挤压成型：在步骤s3所述的含菌混合物中加入甘油50ml和脱脂奶粉50g，然后置于双螺杆挤出机中挤出造粒，双螺杆挤出机的入口温度控制在120℃，进料速度为20r/min，出口温度为50℃，得到粒状含菌物质；
27.s5、干燥处理：将步骤s4所述的粒状含菌物质进行微波干燥，微波剂量为0.1kw/kg，微波时间为1min，得到中间产物；然后将中间产物送入旋转闪蒸干燥机中进行旋转闪蒸干燥，并设置进风温度为120℃，进料速度为10r/min，出风温度为60℃，得到复合微生物发酵剂；
28.s6、保藏：将步骤s5所述的复合微生物发酵剂采用背封式包装，常温储藏即可。
29.实施例2
30.一种复合微生物发酵剂的保藏方法，具体由以下步骤组成：
31.s1、菌种的活化：将植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和异常汉逊酵母的菌种接种至mrs液体培养基中，并在37℃条件下连续活化3代，得到活化菌种；
32.s2、菌体的扩大培养与浓缩：将步骤s1所述的活化菌种接种至mrs液体培养基中，在37℃下恒温摇床中扩大培养48h后，得到扩大培养菌液，然后将扩大培养菌液5000r/min，离心浓缩25min，过滤，用pbs缓冲液冲洗2-3次，收集菌泥；
33.s3、添加配料：称取步骤s2所述的菌泥450g，在其中添加麦芽糊精15g、海藻糖10g和淀粉30g，制成含水量为18％的含菌混合物；
34.s4、挤压成型：在步骤s3所述的含菌混合物中加入甘油45ml和脱脂奶粉55g，然后置于双螺杆挤出机中挤出造粒，双螺杆挤出机的入口温度控制在130℃，进料速度为30r/min，螺杆速度为3r/min，出口温度为55℃，得到粒状含菌物质；
35.s5、干燥处理：将步骤s4所述的粒状含菌物质进行微波干燥，微波剂量为0.5kw/kg，微波时间为8min，得到中间产物；然后将中间产物送入旋转闪蒸干燥机中进行旋转闪蒸干燥，并设置进风温度为120℃，进料速度为35r/min，出风温度为60℃，得到复合微生物发酵剂；
36.s6、保藏：将步骤s5所述的复合微生物发酵剂采用背封式包装，常温储藏即可。
37.实施例3
38.一种复合微生物发酵剂的保藏方法，具体由以下步骤组成：
39.s1、菌种的活化：将植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和异常汉逊酵母的菌种接种至mrs液体培养基中，并在37℃条件下连续活化3代，得到活化菌种；
40.s2、菌体的扩大培养与浓缩：将步骤s1所述的活化菌种接种至mrs液体培养基中，在37℃下恒温摇床中扩大培养48h后，得到扩大培养菌液，然后将扩大培养菌液6000r/min，离心浓缩30min，过滤，用pbs缓冲液冲洗2-3次，收集菌泥；
41.s3、添加配料：称取步骤s2所述的菌泥480g，在其中添加麦芽糊精15g、海藻糖10g和淀粉30g，制成含水量为15％的含菌混合物；
42.s4、挤压成型：在步骤s3所述的含菌混合物中加入甘油50ml和脱脂奶粉35g，然后置于双螺杆挤出机中挤出造粒，双螺杆挤出机的入口温度控制在150℃，进料速度为50r/min，螺杆速度为50r/min，出口温度为60℃，得到粒状含菌物质；
43.s5、干燥处理：将步骤s4所述的粒状含菌物质进行微波干燥，微波剂量为1kw/kg，微波时间为10min，得到中间产物；然后将中间产物送入旋转闪蒸干燥机中进行旋转闪蒸干燥，并设置进风温度为120℃，进料速度为50r/min，出风温度为60℃，得到复合微生物发酵剂；
44.s6、保藏：将步骤s5所述的复合微生物发酵剂采用背封式包装，常温储藏即可。
45.对比例1
46.与实施例1的区别在于，未采用微波干燥。
47.对比例2：
48.与实施例1的区别在于，未采用旋转闪蒸干燥。
49.对比例3
50.与实施例1的区别在于，未采用背封式包装。
51.下面对实施例1-3以及对比例1-3制备的复合微生物发酵剂分别进行性能检测，结果如下所示：
52.采用平板计数法(mrs固体鉴别计数培养基：mrs固体培养基加20g/l碳酸钙，121℃灭菌20min和yepd固体鉴别计数培养基：yepd-溴甲酚绿固体培养基。121℃灭菌20min)，对实施例1制备的复合微生物发酵剂处理前后植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和异常汉逊酵母的活菌数进行检测计数。
53.结果显示，处理前植物乳杆菌的活菌数为9.1
×
10
10
cfu/g，实施例1处理后植物乳杆菌的活菌数为9
×
10
10
cfu/g；处理前副干酪乳杆菌的活菌数为7.6
×
107cfu/g，处理后副干酪乳杆菌的活菌数为7
×
107cfu/g；处理前嗜酸乳杆菌的活菌数为6.7
×
108cfu/g，处理后嗜酸乳杆菌的活菌数为6
×
108cfu/g；处理前异常汉逊酵母的活菌数为12.8
×
105cfu/g，处理后异常汉逊酵母的活菌数为12
×
105cfu/g。可见，实施例1提供的复合微生物发酵剂的保藏方法有助于保持微生物的活性，提高发酵剂质量。
54.对实施例1-3以及对比例1-3提供的复合微生物发酵剂进行贮藏时间和菌活力关系的检测。结果表明，实施例1制备的复合微生物发酵剂在普通室温环境中放置360天后菌活力可达99％；实施例2制备的复合微生物发酵剂在普通室温环境中放置360天，其菌活力可达99％；实施例3制备的复合微生物发酵剂在普通室温环境中放置360天，其菌活力可达97％；对比例1制备的复合微生物发酵剂在普通室温环境中放置360天，其菌活力仅为78％；对比例2制备的复合微生物发酵剂在普通室温环境中放置360天，其菌活力仅为83％；对比例3制备的复合微生物发酵剂在普通室温环境中放置360天，其菌活力仅为65％。
55.由上述分析可知，采用本发明提供的复合微生物发酵剂的保藏方法不仅有助于保持微生物的活性，提高发酵剂质量，同时还可以在保证复合微生物发酵剂质量的同时大幅延长发酵剂的贮存时间。
56.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。