用于坞内测定的方法、系统和试剂盒
背景技术：
：：1.总体上，本文所公开的实施方案涉及用于对限定在规定区域内的微物体的量化或定性参数进行光学测量的系统、装置和方法。更具体地，需要成像系统和方法，其能够精确地测定由限定在微流体装置内的室(例如，隔离室)中的微物体所产生的被分析物的量。技术实现要素：2.一方面，提供了一种用于测定生物微物体所产生的被分析物的量的系统。该系统可以包括图像获取单元。该图像获取单元可以包括微流体装置支撑物，其能够固定微流体装置，其中微流体装置包括流动区域和与流动区域流体连接的多个室。多个室中的每个室均可以容纳一个或多个生物微物体。图像获取单元可以进一步包括成像元件，其被配置为捕捉微流体装置的多个室和流动区域的一个或多个测定图像。该系统可以进一步包括与图像获取单元通信连接的图像处理单元。图像处理单元可以包括受关注区域确定引擎，其被配置为接收每个捕捉的测定图像并对测定图像中描绘的每个室定义受关注区域。受关注区域可以包括图像区域，其对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，和/或沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。图像处理单元可以进一步包括评分引擎，其被配置为分析每个室的受关注区域内的图像区域的至少一部分，以确定指示每个室中被分析物的量的得分。3.另一方面，提供了一种用于测定由生物微物体所产生的被分析物的量的方法。该方法可以包括接收微流体装置的成像数据的步骤，该微流体装置包括流动区域和与流动区域流体连接的多个室。成像数据可以包括被分析物测定图像以及背景噪声图像和信号参比图像中的一种或两种。该方法可以进一步包括对每个室定义受关注区域。受关注区域可以包括室内的图像区域，该图像区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，和/或沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。该方法甚至可以进一步包括确定得分(例如，提供芯片上各个室的相对评级的得分)，其中该得分通过分析每个室中受关注区域的至少一部分图像区域来指示每个室中被分析物的量。4.另一方面，提供了一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机执行用于测定生物微物体所产生的被分析物的量的图像处理方法。该方法可以包括接收微流体装置的成像数据，该微流体装置包括流动区域和多个与流动区域流体连接的室。成像数据可以包括被分析物测定图像以及背景噪声图像和信号参比图像中的一种或两种。该方法还可以包括对每个室定义受关注区域。受关注区域可以包括室内的图像区域，该图像区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，和/或沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。该方法甚至还可以包括通过分析每个室的受关注区域的图像区域的至少一部分来确定指示每个室中的被分析物的量的得分。5.另一方面，提供了一种评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌被分析物的水平的方法，该方法包括：将生物微物体引入到微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室含有第一流体介质；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群向室内的第一流体介质中分泌被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质含有多个可溶性报道分子，并且其中每个可溶性报道分子包含：结合组分，其被配置为与分泌的被分析物结合；和可检测的标记物；允许多个可溶性报道分子中的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物，其中受关注区域包括室的至少一部分。6.另一方面，提供了一种克隆系发育的方法，该方法包括：将单个生物微物体引入到微流体装置的多个室中的每一个中，其中微流体装置还包括具有流动区域的外壳，并且其中多个室中的每一个与流动区域流体连接且含有第一流体介质；允许每个生物微物体或由其生成的生物微物体的克隆群向相应的室中含有的第一流体介质中分泌被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包括多个可溶性报道分子，其中每个可溶性报道分子包含结合组分，其被配置为与分泌的被分析物结合；和可检测的标记物；允许多个可溶性报道分子中的一部分扩散进入多个室中的每一个中并与其中分泌的被分析物的至少一部分结合，从而在多个室中的每一个中产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；对于多个室中的每一个，检测从相应的受关注区域发出的信号的强度，其中受关注区域包括相应的室的至少一部分，并且其中从受关注区域发出的信号的至少一部分是从位于受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物的可检测的标记物发出的；对于多个室中的每一个，基于所检测的从相应的受关注区域发出的信号强度确定得分；从多个室中选择一组室，其中该组中的每个室具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分；和从微流体装置输出所选择的室的组的每个室内含有的一个或多个生物微物体。在某些实施方案中，该方法进一步包括在相应的反应容器中扩增从所选择的室的组中的每个室中输出的一个或多个生物微物体以形成克隆群；以及测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而对每个克隆群确定分泌水平。7.另一方面，提供了一种用于评价生物微物体或由其生成的生物微物体的群的被分析物分泌水平的试剂盒，包括：微流体装置，其包括具有流动区域的外壳；和室，其中室与流动区域流体连接，并且其中流动区域和室被配置为含有流体介质；和可溶性报道分子，其包含可检测的标记物和被配置为与被分析物结合的结合组分。在某些实施方案中，可溶性报道分子在溶液中提供。在其他实施方案中，可溶性报道分子以干燥(例如，冻干)形式提供。8.在各种实施方案中，提供了一种用于评估生物微物体或由其生成的生物微物体的群的被分析物分泌水平的方法，该方法包括：将生物微物体引入微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室含有第一流体介质；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群将被分析物分泌到室内的第一流体介质中；将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质包含多个可溶性报道分子，并且其中每个可溶性报道分子包含被配置为结合分泌的被分析物的结合组分和可检测的标记物；允许多个可溶性报道分子的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含任何可溶性报道分子；允许至少一部分未结合的报道分子扩散到室外；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物，其中受关注区域位于室的非冲刷区域内。9.在各种实施方案中，提供了一种用于评估生物微物体或由其生成的生物微物体的群的被分析物分泌水平的方法，该方法包括：将第一流体介质引入流动区域，其中第一流体介质包含多个可溶性报道分子，并且其中每个可溶性报道分子包括被配置为结合分泌的被分析物的结合组分和可检测的标记物；测量受关注区域内可检测信号的强度；将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质不包含任何可溶性报道分子；将生物微物体引入微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群将被分析物分泌到室内的第一流体介质中；将第三流体介质引入流动区域，其中第二流体介质包括多个可溶性报道分子，并且其中每个可溶性报道分子包括被配置为结合分泌的被分析物的结合组分和可检测的标记物；允许多个可溶性报道分子的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物。10.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域包括室的至少一部分，其沿着从室内向外扩散到流动区域中的轴排列。11.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域在室的非冲刷区域内。12.在各种实施方案中，进一步提供了一种方法，其包括将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含任何可溶性报道分子；允许至少一部分未结合的可溶性报道分子扩散到室外；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物。13.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中检测位于受关注区域内的可溶性报道分子发生在选定的时间，使得已扩散到室外的未结合的可溶性报道分子的量比已扩散到室外的可溶性rmsa复合物的量大至少2倍。14.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中该方法进一步包括量化被分析物中的分泌水平。15.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少两倍。在各种实施方案中，提供了一种方法，其中分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少四倍。在各种实施方案中，提供了一种方法，其中分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少十倍。16.在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物包括蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。17.在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物是抗体或任选地是糖基化抗体。18.在各种实施方案中，生物微物体是生物细胞。19.在各种实施方案中，可溶性报道分子的结合组分包含至少一个氨基酸和/或至少一个核酸。20.在各种实施方案中，可溶性报道分子的结合组分包含肽或蛋白。21.在各种实施方案中，可溶性报道分子的结合组分包含具有seqidno:1至10中任一个的序列的肽。22.在各种实施方案中，可溶性报道分子的结合组分包含蛋白a、蛋白g或蛋白a或蛋白g的igg结合片段。23.在各种实施方案中，可溶性报道分子的结合组分包含适体。24.在各种实施方案中，可检测的标记物包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。25.在各种实施方案中，可溶性报道分子的可检测的标记物是荧光标记物，并且其中所述检测可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物包括检测来自受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物的荧光标记物的荧光发射。26.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中在第二时间段后进行所述检测荧光发射；所述检测荧光发射在第二时间段内进行两次或更多次；或所述检测荧光发射在第二时间段内基本上连续地进行。27.在各种实施方案中，进一步提供了一种方法，该方法包括在第三时间段内将包含室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发可溶性报道分子的荧光标记物的波长。28.在各种实施方案中，进一步提供了一种方法，该方法包括在第四时间段内暴露微流体装置的一部分，该部分包括室但不包括流动区域，其中第四时间段足以光漂白室中存在的任何可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物的荧光标记物。在各种实施方案中，在所述检测受关注区域内的荧光发射之前进行所述暴露第四时间段。29.在各种实施方案中，所述检测受关注区域内的荧光发射发生在所述暴露第四时间段后(例如，在包含非光漂白荧光标记物的报道分子已扩散到所述室中后)约5秒至约20秒。30.在各种实施方案中，该方法进一步包括用培养基灌注流动区域，其中灌注发生在将生物微物体引入室中之后并且在将第二流体介质引入流动区域中之前。31.在各种实施方案中，培养基包括可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。32.在各种实施方案中，将第二流体介质引入流动区域包括在第一时间段内使第二流体介质流过流动区域。33.在各种实施方案中，第一时间段为约30至约60分钟。34.在各种实施方案中，检测位于受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中可检测信号中的至少一些从位于受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物的可检测的标记物发出。35.在各种实施方案中，检测位于受关注区域内的可溶性报道分子进一步包括通过从可检测信号的测量强度中减去背景信号强度来确定减去背景的信号强度。36.在各种实施方案中，可检测信号的测量强度或减去背景的信号强度针对室中观察到的多个细胞进行归一化。37.在各种实施方案中，该方法进一步包括对室提供分泌得分。38.在各种实施方案中，根据实施方案12至25中任一项所述的方法(即，来自所选实施方案的列举)来确定分泌得分。39.在各种实施方案中，微流体装置包括多个室，其中生物微物体被引入多个室的至少两个室中，并且其中该方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每一个进行的。40.在各种实施方案中，该方法进一步包括比较多个室中至少两个室的室的水平。41.在各种实施方案中，该方法进一步包括比较多个室中多于一个室的分泌得分。42.在各种实施方案中，该方法进一步包括选择至少两个室中的一个或多个；以及从每个选择的室输出一个或多个生物微物体。43.在各种实施方案中，将来自每个选择的室的一个或多个生物微物体进一步从微流体装置中输出。44.在各种实施方案中，单独输出选择的室。45.在各种实施方案中，受关注区域包括图像区域，该图像区域对应于室中对测量被分析物浓度波动最敏感的区域，和/或在测量分析物波动时对室中生物微物体的位置最不敏感的区域。46.在各种实施方案中，受关注区域包括图像区域，该图像区域对应于室内对测量最敏感的区域。在各种实施方案中，受关注区域基本上由图像区域组成。在各种实施方案中，该方法是自动化的。47.在各种实施方案中，提供了一种用于克隆细胞系发育的方法，该方法包括进行上述方法中的任一种，从多个室中选择一组室，其中该组的每个室均具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分；从微流体装置输出包含在选择的一组室中的每个室中的一个或多个生物微物体；在相应的反应容器中扩增从选择的一组室中的每个室中输出的一个或多个生物微物体；以及测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而对每个生物微物体或克隆群确定分泌水平。48.在各种实施方案中，受关注区域包括图像区域，其对应于室中对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中生物微物体的位置最不敏感，和/或沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸的区域。在各种实施方案中，该方法是自动化的。49.在各种实施方案中，提供了一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统执行一种用于确定生物微物体产生的被分析物的量的方法，其中该方法是上述方法中的任一种。50.在各种实施方案中，提供了一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统执行一种用于克隆系发育的方法的至少一部分，其中该方法是上述任一权利要求所述的方法，并且其中系统至少执行步骤直到并且包括从微流体装置输出包含在选择的一组室中的每个室中的一个或多个生物微物体为止。51.根据各种实施方案，提供了一种评估跨多个生物微物体或跨由其生成的生物微物体的群的被分析物分泌相对水平的方法，该方法包括：将多个生物微物体引入到微流体装置的多个室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中多个室中的每个室与流动区域流体连接，并且其中多个室含有第一流体介质；允许多个生物微物体或由其生成的生物微物体的群向多个室内的第一流体介质中分泌可溶性被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包含多个可溶性报道分子，并且其中每个报道分子包含：结合组分，其被配置为与分泌的被分析物结合；和可检测的标记物；允许多个可溶性报道分子中的一部分扩散到多个室中并与其中分泌的可溶性被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物。52.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中多个室中的每个室均包括分离区域，该分离区域与流动区域中第二流体介质的二次流动分离。53.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中多个室中的每个室均包含连接区域，该连接区域与流动区域中第二流体介质的直接流动分离。54.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中多个生物微物体中的单个生物微物体被设置在多个室中的单个室中。55.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中可溶性报道分子的浓度是被分析物的可溶性报道分子的kd的约1-10倍。56.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中流动区域中的第二流体介质以约0.1-10秒的刷新率刷新，并且刷新率是替换流动区域中全部流体体积的时间段。57.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中允许多个报道分子的一部分扩散进入多个室中包括允许多个报道分子跨流动区域和多个室达到平衡状态。58.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中在引入第二流体介质后3小时内达到平衡状态。59.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：对多个室中的每个室获得分泌水平或分泌得分；和基于获得的分泌得分对多个室进行评级。60.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中多个报道分子包含至少两个不同的报道分子，每个报道分子具有不同的标记物。61.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中每个室包括朝向流动区域的单个开口。62.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中流动区域包括微流体通道，并且每个室包括分离区域和将分离区域与微流体通道流体连接的连接区域，其中连接区域具有朝向微流体通道的近端开口和朝向分离区域的远端开口。63.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域至少部分在室的分离区域内。64.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域在室的钩区域内。65.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域靠近多个生物微物体中的生物微物体所在的区域。66.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域沿着在多个室和流动区域之间扩散的轴(例如沿着在多个室的分离区域和微流体通道之间扩散的轴，例如沿着连接区域定义的扩散的轴)。67.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域不沿着在多个室和流动区域之间扩散的轴(例如不沿着在多个室的分离区域和微流体通道之间扩散的轴，例如不沿着连接区域定义的扩散的轴)。68.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域包括对应于多个室中的室内的区域的图像区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，和/或在测量被分析物波动时对室中生物微物体的位置最不敏感。69.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中检测位于微流体装置内受关注区域内的报道分子是在报道分子扩散至多个室中并且报道分子与其中分泌的被分析物的结合处于稳态条件或接近稳态条件之后进行的。70.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含报道分子；和允许至少一部分未结合的可溶性报道分子从多个室中扩散出来。71.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中来自第二流体介质的多个可溶性报道分子是第一批多个可溶性报道分子，并且在将多个生物微物体引入微流体装置的多个室之前，所述方法进一步包括：将第四流体介质引入流动区域，其中第四流体介质包含第二批多个可溶性报道分子；获取微流体装置的图像；和将第五流体介质引入流动区域，其中第五流体介质不包含可溶性报道分子。72.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中图像是在t＝0时获取的第一图像，可溶性报道分子的检测包括在t＝1时获取第二图像，其中在t＝l时，流动区域和多个室之间的未结合的可溶性报道分子的扩散已接近稳态。73.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域包括多个室中每个室的连接区域的至少一部分，所述方法进一步包括：从第二图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以确定受关注区域中可溶性rmsa复合物的相对量，所述受关注区域包括多个室的至少部分室中的每个连接区域的至少一部分。74.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域中可溶性rmsa复合物的相对量用于生成可溶性rmsa复合物量变化的线性近似值，并且线性近似值的斜率用于比较室之间分泌的被分析物的产生。75.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第二图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。76.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域是多个室中每个室的钩区域，所述方法进一步包括：从第二图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室的至少一部分量化钩区域中可溶性rmsa复合物的相对量，其中钩区域中可溶性rmsa复合物的相对量用于比较各个室之间分泌的可溶性被分析物的产生。77.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第二图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。78.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中第一批多个可溶性报道分子和第二批多个可溶性报道分子包含相同的标记物。79.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中第一批多个可溶性报道分子和第二批多个可溶性报道分子包含两种不同的报道分子，每种报道分子具有不同的标记物。80.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中所述图像是在t＝0时获取的第一图像，所述方法进一步包括：在将第三流体介质引入流动区域之前，并且在允许多个可溶性报道分子的部分扩散到多个室中并与其中分泌的可溶性被分析物结合之后，获取微流体装置的第二图像。81.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中报道分子的检测包括获取微流体装置的第三图像。82.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域包括多个室中每个室的连接区域的至少一部分，所述方法进一步包括：从第三图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室的至少一部分量化每个连接区域的多个子区域中每个子区域中的可溶性rmsa复合物的量，其中，多个子区域中部分子区域中的可溶性rmsa复合物的量用于生成线性近似值，并且线性近似值的斜率用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。83.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。84.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像、第二图像和背景图像来获得校正图像。85.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域是多个室中每个室的钩区域，所述方法进一步包括：从第三图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室中的至少一部分量化钩区域中的rmsa复合物的量，其中钩区域中rmsa复合物的量用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。86.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。87.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像、第二图像和背景图像来获得校正图像。88.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中所述第二图像用于确定流动区域和多个室之间未结合的报道分子的扩散是否已达到稳态。89.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少两倍。90.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少四倍。91.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少十倍。92.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中生物微物体分泌的被分析物包括蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸之外的有机分子，囊泡或病毒。93.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中生物微物体分泌的被分析物是抗体，或任选地是糖基化抗体。94.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中报道分子的结合组分与抗体重链h1结构域结合。95.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中报道分子的结合组分与抗体轻链(例如，包含轻链肽的一个或多个氨基酸残基的表位)结合。96.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中报道分子的结合组分与λ轻链(例如，包含λ轻链肽的一个或多个氨基酸残基的表位)结合。97.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中报道分子的结合组分与κ轻链(例如，包含κ轻链肽的一个或多个氨基酸残基的表位)结合。98.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中微流体装置包括多个室，其中生物微物体被引入多个室的至少两个室中的每个室，并且其中所述方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每个室进行的。99.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中进一步包括：100.比较多个室的至少两个室的室分泌水平。101.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中进一步包括：102.比较多个室中多于一个室的分泌得分。103.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中将多个生物微物体引入微流体装置的多个室中包括选择生物微物体和选择性地将所选择的生物微物体移动到多个室内。104.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中选择是正选择。105.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中选择是负选择。106.在各种实施方案中，提供了一种克隆系发育方法，其进一步包括：从多个室中选择一组室，其中该组室的每个室具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分；从微流体装置输出包含在选择的一组室的每个室中的一个或多个生物微物体；在相应的反应容器中扩增从选择的一组室的每个室中输出的一个或多个生物微物体；和任选地，测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而对每个生物微物体或克隆群确定分泌水平。107.本文所附权利要求书中提供了另外的方法。108.附图简要说明109.为了更完整地理解本文所公开的原则及其优势，现在参考以下描述与附图的结合，其中：110.图1a示出了根据本公开的一些实施方案用于与微流体装置和相关的控制装置一起使用的系统的实例。111.图1b和1c示出了根据本公开的一些实施方案的微流体装置。112.图2a和2b示出了根据本公开的一些实施方案的室(例如，分离室)。113.图2c示出了根据本公开的一些实施方案的详细的室。114.图2d-f示出了根据本公开的一些其他实施方案的室。115.图2g示出了根据本公开的一个实施方案的微流体装置。116.图2h示出了根据本公开的一个实施方案的微流体装置的经涂覆的表面。117.图3a示出了根据本公开的一些其他实施方案的详细的室。118.图3b示出了根据本公开的一些实施方案用于与微流体装置和相关的控制装置一起使用的系统的具体实例。119.图3c示出了根据本公开的一些实施方案的成像装置。120.图4a-4c是根据本公开的一些实施方案的测定的图解表示。121.图5a-5c是根据本公开的一些其他实施方案的测定的图示。122.图6是根据本公开的一些实施方案的微流体装置的室内的扩散特征的示意图。123.图7a-7b是根据本公开的一些实施方案的分子的经计算的扩散速率的图解表示。124.图8a-8b是根据本公开的一些实施方案的分子的经计算的和经实验证实的扩散速率的图解表示。125.图9a-9b是根据本公开的一些实施方案的微流体装置的室内的扩散特征的图解表示。126.图10a-10b是根据本公开的一些其他实施方案的微流体装置的室内的扩散特征的图解表示。127.图11a-11b是根据本公开的其他实施方案的微流体装置的室内的扩散特征的图解表示。128.图12a-12c是根据本公开的一些实施方案的微流体装置的室内的扩散特征和用于评估来自生物微物体的产物的分泌水平的受关注区域的图解和照片表示。129.图13a-13b描绘了根据本公开的一些实施方案归一化之前和之后微流体装置的照片图像。130.图14a-14c是根据本公开的一些实施方案的微流体装置内的测定图像及其受关注区域的测定数据的图解和照片表示。131.图15是根据本公开的一些实施方案的微流体装置内的多个室的中值强度值的叠加的图解表示。132.图16a和16b是根据本公开的一些实施方案的由设置于微流体装置内的生物微物体分泌被分析物的图解表示。133.图17示出了根据本公开的一些实施方案实施的对室中存在的生物微物体所分泌的被分析物的量进行量化的步骤。134.图18示出了根据本公开的一些实施方案实施的计算表示由生物微物体分泌的被分析物的量的绝对值或相对值的一系列步骤。135.图19示出了根据本公开的一些实施方案实施的评估表示由细胞的克隆群所分泌的被分析物的量的绝对值或相对值的步骤。136.图20是根据本公开的一些实施方案所生成的滴定曲线的图解表示。137.图21是根据本公开的一些实施方案的包括坞识别和测定得分的微流体装置的一部分的归一化的测定图像的照片表示。138.图22是根据本公开的一些实施方案的培养和测定序列的过程的照片和图解表示。139.图23a-23b是根据本公开的一些实施方案的微流体装置的所有室的测定值的图解表示。140.图24是根据本公开的一些实施方案的微流体装置的所选的室中的克隆群和各自的放大的克隆群的测定值之间的相关性的图解表示。141.图25是示出根据各种实施方案的计算机系统的框图。142.图26是根据各种实施方案的用于评估被分析物的量的系统的示意图。143.图27是根据各种实施方案的用于评估被分析物的量的系统的示意图。144.图28是根据各种实施方案的微流体装置的室的横截面。145.图29和30是描绘根据各种实施方案的用于测定被分析物的量的方法的示例性流程图。146.图31是描绘根据各种实施方案的时间和荧光之间关系的示例图。147.图32示出了根据各种实施方案的光漂白室。148.图33a-33c示出了根据各种实施方案的对小分子被分析物的示例性细胞系发育测定。149.图34是根据各种实施方案的用于评估被分析物的量的系统的示意图。150.图35是根据各种实施方案的微流体装置的室的横截面。151.图36示出了根据本公开的各种实施方案的为量化由室中存在的生物微物体分泌的被分析物的量而进行的步骤。152.图37示出了根据本公开的各种实施方案的为量化由室中存在的生物微物体分泌的被分析物的量而进行的步骤。153.图38示出了根据本公开的各种实施方案的为量化由室中存在的生物微物体分泌的被分析物的量而进行的步骤。154.图39示出了根据本公开的各种实施方案的为量化由多个室中存在的多个生物微物体分泌的被分析物的量而进行的步骤。155.图40a-40g示出了为了评估对测量来自微流体装置钩区域中的rmsa复合物的信号的改进而进行的模拟实验的各个方面。156.图41a-41b示出了比较冲洗测定和平衡测定的示例性数据。157.图42a-42b示出了显示为平衡测定拍摄的平均图像的信号改善的示例性数据。158.应当理解，附图不一定是按比例绘制的，附图中物体也不一定是相对于彼此按比例绘制的。附图的描绘旨在使本文所公开的装置、系统和方法的各种实施方案清楚和容易理解。尽可能地，在整个附图中会使用相同的附图标记来指代相同的或类似的部件。此外，应当理解，附图并不意图以任何方式限制本教导的范围。159.发明详述160.本说明书描述了本公开的示例性实施方案和应用。然而，本公开并不限于这些示例性实施方案和应用，也不限于示例性实施方案和应用在本文中操作或描述的方式。此外，附图可以示出简化或局部视图，并且附图中的要素的尺寸可能被夸大或者不成比例。另外，由于本文使用术语“在......上”、“附接到”、“连接到”、“耦合到”或类似的词，一个要素(例如，材料、层、衬底等)可以“在另一要素上”、“附接到另一要素”、“连接到另一要素”或“耦合到另一要素”，而不论该一个要素是直接在该另一要素上、附接到该另一要素、连接到该另一要素或耦合到该另一要素，还是在该一个要素和该另一元素之间有一个或多个间隔要素。此外，除非上下文另有规定，否则如果提供方向(例如，上方、下方、顶部、底部、侧面、上、下、在……下、在……下、上部、下部、水平、垂直、“x”、“y”、“z”等)的话，它们是相对的并且仅作为示例提供，并且为了便于说明和讨论而不是作为限制。另外，在提及要素列表(例如，要素a、b、c)的情况下，这样的提及旨在包括所列要素本身中的任何一个、少于所有列出的要素的任何组合和/或所有列出的要素的组合。说明书中的章节划分仅为了便于审查，并不限制所讨论要素的任何组合。161.在微流体特征的尺寸被描述为具有宽度或面积的情况下，通常相对于x轴和/或y轴尺寸来描述该尺寸，这两个尺寸都位于与微流体装置的衬底和/或盖平行的平面内。可以相对于z轴方向描述微流体特征的高度，该z轴方向垂直于平行于微流体装置的衬底和/或盖的平面。在一些情况下，微流体特征(例如通道或通路)的横截面积可以参考x轴/z轴、y轴/z轴或x轴/y轴面积。162.如本文所用的“基本上”意指足以用于预期目的。因此，术语“基本上”允许由绝对或完美状态、尺寸、测量、结果等的微小的、无关紧要的变化，例如本领域普通技术人员所预期但不明显影响整体性能的变化。当与数值或者可以表示为数值的参数或特性相关地使用时，“基本上”意味着在百分之十之内。163.术语“多个(ones)”意味着不止一个。164.如本文所用的术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。165.如本文所用的术语“置于”在其含义内包括“位于”。166.如本文所用，“微流体装置”或“微流体设备”是这样的装置：其包括一个或多个分离的微流体管路，所述微流体管路被配置为容纳流体，每个微流体管路包括流体互连的管路元件，包括但不限于区域、流动路径、通道、室和/或坞；以及至少一个开口，所述开口被配置为允许流体(以及任选地悬浮在流体中的微物体)流入和/或流出微流体装置。通常，微流体装置的微流体管路将包括流动区域(该流动区域可以包括微流体通道)和至少一个室，并且将容纳小于约1ml(例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2μl)的流体体积。在某些实施方案中，微流体管路容纳约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300μl。微流体管路可以被配置为具有与微流体装置中的第一开口(例如，入口)流体连接的第一端和与微流体装置中的第二开口(例如，出口)流体连接的第二端。167.如本文所用的“纳米流体装置”或“纳米流体设备”是一种具有微流体管路的微流体装置类型，所述微流体管路含有至少一个管路元件，所述管路元件被配置为容纳小于约1μl的流体体积，例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nl或更少。纳米流体装置可以包括多个管路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多)。在某些实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约100pl至1nl、100pl至2nl、100pl至5nl、250pl至2nl、250pl至5nl、250pl至10nl、500pl至5nl、500pl至10nl、500pl至15nl、750pl至10nl、750pl至15nl、750pl至20nl、1至10nl、1至15nl、1至20nl、1至25nl或1至50nl的流体体积。在其他实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约20nl至200nl、100至200nl、100至300nl、100至400nl、100至500nl、200至300nl、200至400nl、200至500nl、200至600nl、200至700nl、250至400nl、250至500nl、250至600nl或250至750nl的流体体积。168.微流体装置或纳米流体装置在本文中可以指“微流体芯片”或“芯片”；或者“纳米流体芯片”或“芯片”。169.如本文所用的“微流体通道”或“流动通道”是指微流体装置的流动区域，其长度显著长于水平和垂直尺寸。例如，流动通道可以是水平或垂直尺寸的长度的至少5倍，例如，长度的至少10倍、长度的至少25倍、长度的至少100倍、长度的至少200倍、长度的至少500倍、长度的至少1,000倍、长度的至少5,000倍，或更长。在一些实施方案中，流动通道的长度为约100,000微米至约500,000微米，包括其间的任何值。在一些实施方案中，水平尺寸为约100微米至约1000微米(例如，约150至约500微米)，并且垂直尺寸为约25微米至约200微米(例如，约40到约150微米)。应当注意，流动通道可以在微流体装置中具有各种不同的空间配置，因此不限于完美线性的元件。例如，流动通道可以是或包括具有以下配置的一个或多个部分：曲线、弯曲、螺旋、倾斜、下降，叉状(例如，多个不同的流动路径)，及其任何组合。另外，流动通道沿其路径可以具有不同的横截面积，加宽和收缩以在其中提供所需的流体流动。流动通道可以包括阀，并且阀可以是微流体领域中已知的任何类型。包括阀的微流体通道的实例公开在美国专利6,408,878和9,227,200中，其每一篇均通过引用整体并入本文。170.如本文所用的术语“障碍物”通常是指凸起或类似类型的结构，其足够大以便部分地(但不完全地)阻碍目标微物体在微流体装置中的两个不同区域或管路元件之间的移动。两个不同的区域/管路元件可以是例如微流体室的连接区域和分离区域。171.如本文所用的术语“收缩”通常是指微流体装置中的管路元件(或两个管路元件之间的界面)的宽度变窄。收缩可以位于例如本公开的微流体室的分离区域和连接区域之间的界面处。172.如本文所用的术语“透明”是指允许可见光通过而在通过时基本上不改变光的材料。173.如本文所用，“亮视场”照明和/或图像是指从广谱光源对微流体视场的白光照明，其中对比度是通过视场中物体对光的吸收形成的。174.如本文所用的术语“微物体”通常是指可以根据本公开分离和/或处理的任何微观物体。微物体的非限制性实例包括：无生命的微物体，例如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠、luminextm珠等)；磁珠；微米棒；微丝；量子点等；生物微物体，例如细胞；生物细胞器；囊泡或复合物；合成囊泡；脂质体(例如，合成的或衍生自膜制品)；脂质纳米筏(nanoraft)等；或无生命微物体和生物微物体的组合(例如，附接于细胞的微珠、脂质体涂覆的微珠、脂质体涂覆的磁珠等)。珠子可以包括共价或非共价附接的部分/分子，例如荧光标志物、蛋白、碳水化合物、抗原、小分子信号传导部分或能够用于测定的其他化学/生物物质。脂质纳米筏已经被描述在例如ritchieetal.(2009)“reconstitutionofmembraneproteinsinphospholipidbilayernanodiscs,”methodsenzymol.,464:211-231中。175.如本文所用的术语“细胞”可以与术语“生物细胞”互换使用。生物细胞的非限制性实例包括真核细胞；植物细胞；动物细胞，例如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、禽类细胞、鱼细胞等；原核细胞；细菌细胞；真菌细胞；原生动物细胞等；从组织(例如肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝脏、肺、神经组织等)解离的细胞；免疫细胞，例如t细胞、b细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等；胚胎(例如，受精卵)；卵母细胞；卵子；精子细胞；杂交瘤；培养的细胞；来自细胞系的细胞；癌细胞；感染的细胞；转染和/或转化的细胞；报道细胞等。哺乳动物细胞可以是例如人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、灵长类动物等。176.如果集落中能够繁殖的所有活细胞是衍生自单亲细胞的子细胞，则生物细胞的集落是“克隆的”。在某些实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过10次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过14次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均来自单亲细胞不超过17次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过20次分裂。术语“克隆细胞”是指同一克隆集落的细胞。177.如本文所用的生物细胞的“集落”是指2个或更多个细胞(例如约2至约20、约4至约40、约6至约60、约8至约80、约10至约100、约20至约200、约40至约400、约60至约600、约80至约800、约100至约1000或大于1000个细胞)。178.如本文所用的术语“维持(一个或多个)细胞”是指提供包含流体和气体组分以及任选的表面的环境，其提供保持细胞存活和/或扩增所必需的条件。179.如本文所用，术语“扩增”在提及细胞时指的是细胞数目的增加。180.流体介质的“组分”是介质中存在的任何化学或生物化学分子，包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷、核酸、氨基酸、肽、蛋白、糖、碳水化合物、脂质、脂肪酸、胆固醇、代谢物等。181.如本文所用的“捕捉部分”是为微物体提供识别位点的化学或生物物质、功能或基序。所选类型的微物体可以识别原位产生的捕捉部分，并且可以与原位产生的捕捉部分结合或与其具有亲合力。非限制性实例包括抗原、抗体和细胞表面结合基序。182.如本文所用，“可流动聚合物”是可溶于或可分散于流体介质中的聚合物单体或大分子单体(例如，预聚物溶液)。可流动聚合物可以被输入到微流体流动区域中，并与其中的流体介质的其他组分一起流动。183.如本文所用的“光引发聚合物”是指这样的聚合物(或可用于产生聚合物的单体分子)：其在暴露于光时能够共价交联，形成特定的共价键，改变固定化的化学基序周围的区域选择性化学，或者形成导致物理状态变化的离子对，从而形成聚合物网络。在一些情况下，光引发聚合物可以包括这样的聚合物区段：其与一个或多个能够共价交联的化学部分结合，形成特定的共价键，改变固定化的化学基序周围的区域选择性化学，或形成导致物理状态变化的离子对。在一些情况下，光引发聚合物可能需要可光活化的自由基引发剂以引发聚合物网络的形成(例如，通过聚合物的聚合)。184.如本文所用的“抗体”是指免疫球蛋白(ig)，且包括多克隆和单克隆抗体两者；灵长类化的(primatized)(例如，人化的)；鼠类；小鼠-人；小鼠-灵长类；和嵌合的；并且可以是完整分子、其片段(例如scfv、fv、fd、fab、fab'和f(ab)'2片段)或者完整分子和/或片段的多聚体或聚集体；并且可以天然存在或者例如通过免疫、合成或基因工程产生。如本文所用的“抗体片段”是指衍生自抗体或与抗体相关的片段，其与抗原结合并且在一些实施方案中可以被衍生化以表现出通过例如掺入半乳糖残留物而促进清除和摄取的结构特征。这包括例如f(ab)、f(ab)'2、scfv、轻链可变区(vl)、重链可变区(vh)及其组合。185.如本文关于流体介质所用的“扩散(diffuse)”和“扩散(diffusion)”是指流体介质的组分沿着浓度梯度向下的热力学运动。186.短语“介质的流动”意味着流体介质主要是由于除扩散之外的任何机制的整体移动。例如，介质的流动可以包括流体介质由于点之间的压力差而从一个点移动到另一个点。这样的流动可以包括液体的连续、脉冲、周期性、随机、间歇或往复流动，或其任何组合。当一种流体介质流入另一种流体介质时，可能导致湍流和介质的混合。187.短语“基本上没有流动”是指流体介质的流速，其随时间平均小于材料的组分(例如，受关注的被分析物)扩散到流体介质中或在流体介质内扩散的速率。这样的材料的组分的扩散速率可以取决于例如温度、组分的尺寸以及组分和流体介质之间的相互作用的强度。188.如本文所用，术语“直接流动(directflow)”是指微流体装置流动区域内主要流动方向上的流动。在大多数情况下，这种流动将是受控速率的层流(laminarflow)，所述受控速率由溶液通过入口移动进入装置和通过出口移动出装置的速率决定。通常，流动区域将是连接入口和出口的区域，例如通道。189.如本文所用，术语“二次流动”是指与流动区域流体连接的室的区域中的流体流动，其中室中经历二次流动的区域中的流体流速是流动区域中流速的100％到0.1％之间。在某些实施方案中，室中经历二次流动的区域中的流体流速是相邻流动区域中流速的100％到0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％或5％之间。在某些实施方案中，流动区域是通道。在某些实施方案中，二次流动发生在隔离坞的连接区域中。在某些情况下，二次流动包括来自流动区域的流体，该流动区域在流动区域和室中朝向流动区域的开口之间的接合处扩张到室中。在其他情况下，二次流动包括在靠近流动区域的室区域中产生的旋涡，其中流动区域中流过并扩张到室开口处的流体层流负责产生这些旋涡。包含“二次流动”的这些旋涡的存在可以增加相邻流动区域和可在其中设置“二次流动”的室(例如，包含这些旋涡可能形成的连接区域的室)之间的流体和溶质交换速率，交换速率随着流动区域中层流速率的增加而增加。190.如本文所用，术语“分离区域”是指微流体装置的室中的区域，该区域与微流体装置流动区域(例如通道)中流体的直接流动和可存在于室的另一部分的二次流动分离。通常，在分离区域中，溶质通过扩散的移动速率将大于流体流动产生的溶质移动速率，因此扩散成为可溶性组分进入或离开“分离区域”的主要方式。191.如本文关于微流体装置内的不同区域所用的短语“流体连接”是指当不同区域基本上充满流体(例如流体介质)时，每个区域中的流体被连接以形成单一的液体。这并不意味着不同区域中的流体(或流体介质)在组成上必然相同。相反，微流体装置的不同流体连接的区域中的流体可以具有不同的组成(例如，不同浓度的溶质，例如蛋白、碳水化合物、离子或其他分子)，当溶质沿着其各自的浓度梯度向下移动和/或流体流过微流体装置时，这些组成处于变化中。192.如本文所用的“流动路径”是指一个或多个流体连接的管路元件(例如，通道、区域、室等)，其限定介质流动的轨迹并受介质流动的轨迹影响。因此，流动路径是微流体装置的冲刷(swept)区域的示例。其他管路元件(例如，非冲刷(unswept)区域)可以与包括流动路径的管路元件流体连接，而不受流动路径中的介质流动的影响。193.如本文所用，术语“钩区域”是指微流体装置的任何子区域或受关注区域，其不太可能在其中设置细胞，并且其与流动区域中的直接流动和/或二次流动(例如，由流动区域中直接层流产生的涡流产生的流动)分离。194.如本文所用，“分离微物体”将微物体限制在微流体装置内的限定区域。195.如本文所用，术语“刷新率”是流动区域的体积除以流速的比率。该“刷新率”表示替换流动区域中的全部流体体积所需的时间量。196.微流体(或纳米流体)装置可以包括“冲刷”区域和“非冲刷”区域。如本文所用的“冲刷”区域包括微流体管路的一个或多个流体互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件经历介质的流。冲刷区域的管路元件可以包括例如区域、通道以及全部或部分室。如本文所用的“非冲刷”区域包括微流体管路的一个或多个流体互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件基本上不经历流体的流动。非冲刷区域可以流体连接到冲刷区域，条件是流体连接被构造成在冲刷区域和非冲刷区域之间能够实现扩散但基本上没有介质流动。因此，微流体装置可以被构造成基本上将非冲刷区域与冲刷区域中的介质流动分离，同时在冲刷区域和非冲刷区域之间基本上仅能够实现扩散性流体连通。例如，微流体装置的流动通道是冲刷区域的示例，而微流体装置的分离区域(下文进一步详细描述)是非冲刷区域的示例。197.可以在这种微流体装置中测定生物微物体(例如，生物细胞)产生特定生物材料(例如，蛋白，例如抗体)的能力。在测定的一个特定实施方案中，可以将包含待测定用于产生受关注的被分析物的生物微物体(例如，细胞)的样品材料加载到微流体装置的冲刷区域中。可以选择具有特定特征的那些生物微物体(例如，哺乳动物细胞，例如人细胞)并将其置于非冲刷区域中。然后，可以使剩余的样品材料从冲刷区域流出，并使测定材料流入到冲刷区域中。因为所选择的生物微物体处于非冲刷区域中，所以所选择的生物微物体基本上不受剩余样品材料的流出或测定材料的流入的影响。可以允许所选择的生物微物体产生受关注的被分析物，其可以从非冲刷区域扩散到冲刷区域中，受关注的被分析物可以在其中与测定材料反应以产生局部的可检测的反应，每个反应可以与特定的非冲刷区域相关联。可以分析与检测到的反应相关的任何非冲刷区域，以评估非冲刷区域中的哪些生物微物体(如果有的话)是足够的受关注的被分析物的生产者。198.微流体装置和用于操作和观察这种装置的系统。图1a示出了可以用于保留、分离、测定、或培养生物微物体的微流体装置100和系统150的实例。示出了微流体装置100的透视图，其盖110被部分切除以提供微流体装置100中的局部视图。微流体装置100通常包括具有流动路径106的微流体管路120，流体介质180可以任选地携带一个或多个微物体(未示出)经过流动路径106流入和/或流过微流体管路120。虽然在图1a中示出了单个微流体管路120，但合适的微流体装置可以包括多个(例如，2或3个)这样的微流体管路。无论如何，微流体装置100可以被配置为纳米流体装置。如图1a所示，微流体管路120可以包括多个微流体室124、126、128和130，其中每个室可以具有与流动路径106为流体连通的一个或多个开口。在图1a的装置的一些实施方案中，室可以仅具有与流动路径106为流体连通的单个开口。如下文进一步讨论的，微流体室包括已被优化用于即使当介质180流过流动路径106时，仍然将微物体保留在微流体装置(例如微流体装置100)中的各种特征和结构。然而，在描述上述之前，提供了对微流体装置100和系统150的简要说明。199.如图1a中大体示出的，微流体管路120由外壳102来限定。尽管外壳102可以被物理地构造成不同的配置，但是在图1a所示的实例中，外壳102被描绘为包括支撑结构104(例如，基部)、微流体管路结构108和盖110。支撑结构104、微流体管路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体管路结构108可以被布置在支撑结构104的内表面109上，并且盖110可以被布置在微流体管路结构108上方。微流体管路结构108与支撑结构104和盖110一起可以限定微流体管路120的元件。200.如图1a所示，支撑结构104可以位于微流体管路120的底部，盖110可以位于微流体管路120的顶部。或者，支撑结构104和盖110可以以其他取向来配置。例如，支撑结构104可以位于微流体管路120的顶部，盖110可以位于微流体管路120的底部。无论如何，可以存在一个或多个开口107，每个开口107均包括进入或离开外壳102的通路。通路的实例包括阀、门、通孔等。如图所示，开口107是由微流体管路结构108中的间隙产生的通孔。然而，开口107可以位于外壳102的其他组件(例如盖110)中。图1a中仅示出了一个开口107，但微流体管路120可以具有两个或更多个开口107。例如，可以存在第一开口107，其用作流体进入微流体管路120的入口，并且可以存在第二开口107，其用作流体离开微流体管路120的出口。开口107是用作入口还是出口可以取决于流体流过流动路径106的方向。201.支撑结构104可以包括一个或多个电极(未示出)和衬底或多个互连的衬底。例如，支撑结构104可以包括一个或多个半导体衬底，每个半导体衬底电连接到电极(例如，半导体衬底的全部或一部分可以电连接到单个电极)。支撑结构104还可以包括印刷电路板组件(“pcba”)。例如，半导体衬底可以安装在pcba上。202.微流体管路结构108可以限定微流体管路120的管路元件。当微流体管路120填充有流体时，这样的管路元件可以包括可以流体互连的空间或区域，例如流动区域(其可以包括或者是一个或多个流动通道)、室、坞、阱(trap)等。在图1a所示的微流体管路120中，微流体管路结构108包括框架114和微流体管路材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体管路材料116。框架114可以是例如基本上包围微流体管路材料116的相对刚性的结构。例如，框架114可以包括金属材料。203.微流体管路材料116可以用空腔等进行图案化，以限定微流体管路120的管路元件和互连。微流体管路材料116可以包括柔性材料，例如柔性聚合物(例如橡胶、塑料、弹性体、硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(“pdms”)等)，其可以是透气性的。可以构成微流体管路材料116的材料的其他实例包括模制玻璃；可蚀刻材料，例如硅氧烷(例如，可光图案化的硅氧烷或“pps”)、光致抗蚀剂(例如，su8)等。在一些实施方案中，此类材料(以及因此微流体管路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气的。无论如何，微流体管路材料116可以被布置在支撑结构104上和框架114内。204.盖110可以是框架114和/或微流体管路材料116的集成(integral)部件。或者，盖110可以是结构上不同的元件，如图1a所示。盖110可以包括与框架114和/或微流体管路材料116相同或不同的材料。类似地，支撑结构104可以是与框架114或微流体管路材料116分开的结构(如图所示)，或者是框架114或微流体管路材料116的集成部件。同样地，框架114和微流体管路材料116可以是如图1a所示的分离结构或同一结构的集成部件。205.在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似性质的材料。在一些实施方案中，盖110可以包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，例如pdms。在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料和可变形材料两者。例如，盖110的一个或多个部分(例如，位于室124、126、128、130上方的一个或多个部分)可以包括与盖110的刚性材料交界的可变形材料。在一些实施方案中，盖110还可以包括一个或多个电极。该一个或多个电极可以包括导电氧化物，例如氧化铟锡(ito)，其可以涂覆在玻璃或类似的绝缘材料上。或者，该一个或多个电极可以是柔性电极，例如嵌入在可变形材料例如聚合物(例如pdms)中的单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合。已经在例如us2012/0325665(chiou等人)中描述了可以用于微流体装置中的柔性电极，其内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，可以修饰盖110(例如，通过调节向内朝向微流体管路120的表面的全部或一部分)以支持细胞粘附、活力和/或生长。该修饰可以包括合成或天然聚合物的涂层。在一些实施方案中，盖110和/或支撑结构104可以是透光的。盖110还可包括至少一种可透气的材料(例如，pdms或pps)。206.图1a还示出了用于操作和控制微流体装置(例如微流体装置100)的系统150。系统150包括电源192、成像装置194(结合在成像模块164内，其中装置194未在图1a本身中示出)以及倾斜装置190(倾斜模块166的一部分，其中装置190未在图1a中示出)。207.电源192可以向微流体装置100和/或倾斜装置190提供电力，根据需要提供偏置电压或电流。电源192可以例如包括一个或多个交流(ac)和/或直流(dc)电压或电流源。成像装置194(成像模块164的一部分，如下文所讨论的)可以包括用于捕捉微流体管路120内的图像的装置，例如数码相机。在一些情况下，成像装置194还包括具有快速帧速率和/或高灵敏度(例如，用于低光应用)的检测器。成像装置194还可以包括用于将刺激性辐射和/或光束引导到微流体管路120中并收集从微流体管路120(或其中包含的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。所发射的光束可以在可见光谱中，并且可以例如包括荧光发射。所反射的光束可以包括源自led或诸如汞灯(例如高压汞灯)或氙弧灯的宽光谱灯的反射的发射。如针对图3b所讨论的，成像装置194还可以包括显微镜(或光具组)，其可以包括或不包括目镜。208.系统150还包括倾斜装置190(倾斜模块166的一部分，如下文所讨论的)，其被配置为使微流体装置100围绕一个或多个旋转轴旋转。在一些实施方案中，倾斜装置190被配置为围绕至少一个轴来支撑和/或保持包括微流体管路120的外壳102，使得微流体装置100(以及因此微流体管路120)可以保持在水平取向(即，相对于x轴和y轴为0°)、垂直取向(即，相对于x轴和/或y轴为90°)或其间的任何取向。微流体装置100(和微流体管路120)相对于轴的取向在本文中被称为微流体装置100(和微流体管路120)的“倾斜”。例如，倾斜装置190可以使微流体装置100相对于x轴倾斜0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或其间的任何角度。水平取向(以及因此x轴和y轴)被定义为垂直于由重力限定的垂直轴。倾斜装置还可以使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴和/或y轴倾斜任何大于90°的程度，或者使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴或y轴倾斜180°，以完全反转微流体装置100(和微流体管路120)。类似地，在一些实施方案中，倾斜装置190使微流体装置100(和微流体管路120)围绕由流动路径106或微流体管路120的一些其他部分限定的旋转轴倾斜。209.在一些情况下，将微流体装置100倾斜成垂直取向，使得流动路径106位于一个或多个室的上方或下方。如本文所用的术语“上方”表示流动路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上高于一个或多个室(即，在流动路径106上方的室中的物体会具有比流动路径中的物体更高的重力势能)。如本文所用的术语“下方”表示流动路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上低于一个或多个室(即，在流动路径106下方的室中的物体会具有比流动路径中的物体更低的重力势能)。210.在一些情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕平行于流动路径106的轴倾斜。此外，微流体装置100可以被倾斜至小于90°的角度，使得流动路径106位于一个或多个室的上方或下方，而不是位于室的正上方或正下方。在其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕垂直于流动路径106的轴倾斜。在另外其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕既不平行也不垂直于流动路径106的轴倾斜。211.系统150还可以包括介质源178。介质源178(例如，容器、贮液器等)可以包括多个部分或容器，每个部分或容器用于容纳不同的流体介质180。因此，介质源178可以是在微流体装置100外部并与之分离的装置，如图1a所示。或者，介质源178可以整体或部分地位于微流体装置100的外壳102内部。例如，介质源178可以包括作为微流体装置100的一部分的贮液器。212.图1a还示出了描绘构成系统150的一部分并且可以与微流体装置100结合使用的控制和监测设备152的实例的简化框图。如图所示，这种控制和检测设备152的实例包括主控制器154，其包括介质模块160，用于控制介质源178；运动模块162，用于控制微流体管路120中的微物体(未示出)和/或介质(例如，介质液滴)的移动和/或选择；成像模块164，用于控制成像装置194(例如，相机、显微镜、光源或其任何组合)以捕捉图像(例如，数字图像)；以及倾斜模块166，用于控制倾斜装置190。控制设备152还可以包括其他模块168，用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其他功能。如图所示，设备152还可以包括显示装置170和输入/输出装置172。213.主控制器154可以包括控制模块156和数字存储器158。控制模块156可以包括例如数字处理器，该数字处理器被配置为根据被存储为存储器158中的非暂态数据或信号的机器可执行指令(例如，软件、固件、源代码等)进行操作。替代地或另外地，控制模块156可以包括硬连线数字电路和/或模拟电路。可以类似地配置介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168。因此，可以由如上文所讨论地配置的主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168中的任意一个或多个来实施本文所讨论的针对微流体装置100或任何其他微流体装置所执行的功能、过程、动作、行动或过程的步骤。类似地，主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168可以通信地耦接，以发送和接收本文所讨论的任何功能、过程、动作、行动或步骤中使用的数据。214.介质模块160控制介质源178。例如，介质模块160可以控制介质源178以将选择的流体介质180输入到外壳102中(例如，通过入口开口107)。介质模块160还可以控制从外壳102中移除介质(例如，通过出口开口(未示出))。因此，可以将一种或多种介质选择性地输入到微流体管路120中以及从其中移除。介质模块160还可以控制微流体管路120内的流动路径106中的流体介质180的流动。例如，在一些实施方案中，在倾斜模块166使倾斜装置190将微流体装置100倾斜到期望的倾斜角度之前，介质模块160停止介质180在流动路径106中和通过外壳102的流动。215.运动模块162可以被配置为控制微流体管路120中的微物体(未示出)的选择、捕集和移动。如下文参考图1b和1c所讨论的，外壳102可以包括介电电泳(dep)、光电镊子(oet)和/或光电润湿(oew)配置(图1a中未示出)，并且运动模块162可以控制电极和/或晶体管(例如，光电晶体管)的激活，以选择和移动流动路径106和/或室124、126、128、130中的微物体(未示出)和/或介质液滴(未示出)。216.成像模块164可以控制成像装置194。例如，成像模块164可以接收和处理来自成像装置194的图像数据。来自成像装置194的图像数据可以包括由成像装置194捕捉的任何类型的信息(例如，存在或不存在微物体、介质液滴、标记物(例如荧光标记物)的累积等)。使用由成像装置194捕捉的信息，成像模块164还可以计算微流体装置100内物体(例如，微物体、介质液滴)的位置和/或这些物体的运动速率。217.倾斜模块166可以控制倾斜装置190的倾斜运动。替代地或另外地，倾斜模块166可以控制倾斜速率和时机，以优化微物体经由重力向一个或多个室的转移。倾斜模块166与成像模块164通信地耦接，以接收描述微流体管路120中的微物体和/或介质液滴的运动的数据。使用该数据，倾斜模块166可以调节微流体管路120的倾斜，以便调节微物体和/或介质液滴在微流体管路120中移动的速率。倾斜模块166还可以使用该数据来迭代地调节微流体管路120中的微物体和/或介质液滴的位置。218.在图1a所示的实例中，微流体管路120被示为包括微流体通道122和室124、126、128、130。每个室均包括通向通道122的开口，但是其他部分被包围，使得室可以将坞内的微物体与通道122的流动路径106中或其他室中的流体介质180和/或微物体基本上分离。室的壁从底座的内表面109延伸到盖110的内表面，以提供外壳。室到微流体通道122的开口被取向为与流体介质180的流动106成一角度，使得流动106不被引导到室中。流动可以与室的开口的平面相切或垂直。在一些情况下，室124、126、128、130被配置为物理地围住微流体管路120内的一个或多个微物体。根据本公开的室可以包括各种形状、表面和特征，如下文将详细讨论和示出的，其被优化为与dep、oet、oew、流体流动和/或重力一起使用。219.微流体管路120可以包括任何数目的微流体室。尽管示出了五个室，但微流体管路120可以具有更少或更多的室。如图所示，微流体管路120的微流体室124、126、128和130各自包括不同的特征和形状，这些特征和形状可以提供用于保持、分离、测定或培养生物微物体的一个或多个益处。在一些实施方案中，微流体管路120包括多个相同的微流体室。220.在图1a所示的实施方案中，示出了单个通道122和流动路径106。然而，其他实施方案可以含有多个通道122，每个通道均被配置为包括流动路径106。微流体管路120还包括与流动路径106和流体介质180为流体连通的入口阀或开口107，由此流体介质180可以经由入口开口107进入通道122。在一些情况下，流动路径106包括单个路径。在一些情况下，单个路径被布置为z字形图案，由此流动路径106以交替的方向穿过微流体装置100两次或更多次。流动路径106中的流动可以从入口进行至出口，或可以反向从出口进行至入口。221.在一些情况下，微流体管路120包括多个平行的通道122和流动路径106，其中每个流动路径106内的流体介质180沿相同的方向流动。在一些情况下，每个流动路径106内的流体介质沿正向或反向中的至少一个方向流动。在一些情况下，配置多个室(例如，相对于通道122)，使得室可以平行地加载目标微物体。222.在一些实施方案中，微流体管路120还包括一个或多个微物体阱132。阱132通常形成在形成通道122的边界的壁中，并且可以与微流体室124、126、128、130中的一个或多个的开口相对地设置。在一些实施方案中，阱132被配置为成从流动路径106接收或捕捉单个微物体。在一些实施方案中，阱132被配置为从流动路径106接收或捕捉多个微物体。在一些情况下，阱132包括大约等于单个目标微物体的体积的体积。223.阱132还可以包括开口，其被配置为帮助目标微物体流入阱132。在一些情况下，阱132包括开口，该开口的高度和宽度近似地等于单个目标微物体的尺寸，由此防止更大的微物体进入微物体阱。阱132还可以包括被配置为帮助将目标微物体保留在阱132内的其他特征。在一些情况下，阱132相对于微流体室的开口对齐并且位于通道122的相对侧上，使得当微流体装置100围绕平行于微流体通道122的轴倾斜时，被捕集的微物体按照使得微物体落入室的开口中的轨迹离开阱132。在一些情况下，阱132包括小于目标微物体的侧通道134，以便有助于穿过阱132的流动，从而增加在阱132中捕捉微物体的可能性。224.在一些实施方案中，经由一个或多个电极(未示出)将介电电泳(dep)力施加在流体介质180(例如，在流动路径中和/或在室中)上，以操纵、运输、分离和分类位于其中的微物体。例如，在一些实施方案中，将dep力施加到微流体管路120的一个或多个部分，以便将单个微物体从流动路径106转移到期望的微流体室中。在一些实施方案中，使用dep力来防止室(例如，室124、126、128或130)内的微物体从其中被替换。此外，在一些实施方案中，使用dep力来从室中选择性地移除先前根据本公开的实施方案收集的微物体。在一些实施方案中，dep力包括光电镊子(oet)力。225.在其他实施方案中，通过一个或多个电极(未示出)将光电润湿(oew)力施加到微流体装置100的支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置(例如，有助于限定流动路径和/或多个室的位置)，以操纵、运输、分离和分类位于微流体管路120中的液滴。例如，在一些实施方案中，将oew力施加到支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置，以将单个液滴从流动路径106转移到期望的微流体室中。在一些实施方案中，使用oew力来防止室(例如，室124、126、128或130)内的液滴从其中被替换。此外，在一些实施方案中，使用oew力来从室中选择性地去除先前根据本公开的实施方案收集的液滴。226.在一些实施方案中，将dep和/或oew力与其他力(例如流动和/或重力)组合，以便操纵、运输、分离和分类微流体管路120内的微物体和/或液滴。例如，可以将外壳102倾斜(例如，通过倾斜装置190)，以将流动路径106和位于其中的微物体定位在微流体室的上方，并且重力可以将微物体和/或液滴运输到室中。在一些实施方案中，可以在施加其他力之前施加dep和/或oew力。在其他实施方案中，可以在施加其他力之后施加dep和/或oew力。在其他情况下，可以在施加其他力的同时或者以与其他力交替地的方式施加dep和/或oew力。227.图1b、1c和2a-2h示出了可以用于实施本公开的实施方案的微流体装置的各种实施方案。图1b描述了其中微流体装置200被配置为光致动的电动力学装置的实施方案。本领域已知多种光致动的电动力学装置，包括具有光电镊子(oet)配置的装置和具有光电润湿(oew)配置的装置。在以下美国专利文献中示出了合适的oet配置的实例，其均通过引用整体并入本文：美国专利号re44,711(wu等人)(最初以美国专利号7,612,355颁发)；和美国专利号7,956,339(ohta等人)。美国专利号6,958,132(chiou等人)和美国专利申请公开号2012/0024708(chiou等人)中示出了oew配置的实例，上述两者都通过引用整体并入本文。光致动的电动力学装置的另一个实例包括组合的oet/oew配置，在美国专利公开号20150306598号(khandros等人)和20150306599(khandros等人)以及其对应的pct公开wo2015/164846和wo2015/164847中示出其实例，其均通过引用整体并入本文。228.已经在例如us2014/0116881(申请号14/060,117，2013年10月22日提交)、us2015/0151298(申请号14/520,568，2014年10月22日提交)和us2015/0165436(申请号14/521,447，2014年10月22日提交)中描述了具有室的微流体装置的实例，其中可以放置、培养和/或监测生物微物体，这些申请中的每一个都通过引用整体并入本文。美国申请号14/520,568和14/521,447也描述了分析在微流体装置中培养的细胞的分泌的示例性方法。前述申请中的每一个还描述了微流体装置，其被配置为产生介电电泳(dep)力，例如光电镊子(oet)，或被配置为提供光电润湿(oew)。例如，us2014/0116881的图2中所示的光电镊子装置是可以在本公开的实施方案中用于选择和移动单个生物微物体或一组生物微物体的装置的实例。229.微流体装置运动配置。如上文所述，系统的控制和监测设备可以包括运动模块，用于选择和移动微流体装置的微流体管路中的物体，例如微物体或液滴。微流体装置可以具有各种运动配置，这取决于被移动物体的类型和其他考虑因素。例如，可以使用介电电泳(dep)配置来选择和移动微流体管路中的微物体。因此，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括dep配置，其用于在微流体管路120中的流体介质180中的微物体上选择性地诱导dep力，从而选择、捕捉和/或移动单个微物体或微物体组。或者，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括电润湿(ew)配置，其用于在微流体管路120中的流体介质180中的液滴上选择性地诱导ew力，从而选择、捕捉和/或移动单个液滴或液滴组。230.图1b和1c中示出了包含dep配置的微流体装置200的一个实例。虽然为了简化的目的，图1b和1c分别示出了具有区域/室202的微流体装置200的外壳102的一部分的侧截面图和顶截面图，但应当理解，区域/室202可以是具有更详细结构的流体管路元件的一部分，例如生长室、隔离室、流动区域或流动通道。此外，微流体装置200可以包括其他流体管路元件。例如，微流体装置200可以包括多个生长室或室和/或一个或多个流动区域或流动通道，例如本文关于微流体装置100所描述的那些。dep配置可以被结合到微流体装置200的任何这种流体管路元件中，或者其选择的部分中。还应当理解，上文或下文描述的微流体装置组件和系统组件中的任一个可以被结合到微流体装置200中和/或与微流体装置200组合使用。例如，上述包括控制和监测设备152的系统150可以与微流体装置200一起使用，该微流体装置200包括介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和其他模块168中的一个或多个。231.如图1b所示，微流体装置200包括具有底部电极204和覆盖底部电极204的电极活化衬底206的支撑结构104，以及具有顶部电极210的盖110，顶部电极210与底部电极204间隔开。顶部电极210和电极活化衬底206限定区域/室202的相对表面。因此，包含在区域/室202中的介质180在顶部电极210和电极活化衬底206之间提供电阻连接(resistiveconnection)。还示出了电源212，其被配置为连接到底部电极204和顶部电极210并且在这些电极之间产生偏置电压，如在区域/室202中产生dep力所需要的。电源212可以是例如交流(ac)电源。232.在某些实施方案中，图1b和1c中所示的微流体装置200可以具有光致动的dep配置。因此，改变来自光源216的光218的图案(其可以由运动模块162控制)可以选择性地激活和去激活电极活化衬底206的内表面208的区域214处的dep电极的变化图案。(下文中，具有dep配置的微流体装置的区域214被称为“dep电极区域”。)如图1c所示，指向电极活化衬底206的内表面208的光图案218可以以诸如正方形的图案照亮选择的dep电极区域214a(以白色示出)。在下文中将未被照亮的dep电极区域214(交叉阴影线)称为“暗”dep电极区域214。通过dep电极活化衬底206(即，从底部电极204直到与流动区域106中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)的相对电阻抗大于在每个暗dep电极区域214处通过区域/室202中的介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对电阻抗。然而，被照亮的dep电极区域214a表现出通过电极活化衬底206的减小的相对阻抗，其小于在每个被照亮的dep电极区域214a处通过区域/室202中的介质180的相对阻抗。233.在电源212被激活的情况下，前述dep配置在被照亮的dep电极区域214a和相邻的暗dep电极区域214之间的流体介质180中产生电场梯度，这又产生了吸引或排斥流体介质180中附近微物体(未示出)的局部dep力。因此，通过改变从光源216投射到微流体装置200中的光图案218，可以在区域/室202的内表面208处的许多不同的此类dep电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥流体介质180中微物体的dep电极。dep力是吸引还是排斥附近的微物体可以取决于诸如电源212的频率和介质180和/或微物体(未示出)的介电性质之类的参数。234.图1c中所示的被照亮的dep电极区域214a的正方形图案220仅是一个实例。可以通过投射到微流体装置200中的光图案218照亮(并由此激活)dep电极区域214的任何图案，并且可以通过改变或移动光图案218来重复地改变被照亮/激活的dep电极区域214的图案。235.在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料或由其组成。在这样的实施方案中，电极活化衬底206的内表面208可以是无特征的。例如，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅(a-si:h)层或由其组成。a-si:h可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-si:h层可以具有约500nm至约2.0μm的厚度。在这样的实施方案中，根据光图案218，可以在电极活化衬底206的内表面208上的任何地方以任何图案形成dep电极区域214。因此，无需固定dep电极区域214的数目和图案，但是可以将其对应于光图案218。已经在例如美国专利号re44,711(wu等人)(最初颁布为美国专利号7,612,355)中描述了具有包括光电导层(例如上文所述的光电导层)的dep配置的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。236.在其他实施方案中，电极活化衬底206可以包括衬底，该衬底包括多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和形成半导体集成电路的导电层，例如在半导体领域中已知的。例如，电极活化衬底206可以包括多个光电晶体管，包括例如横向双极光电晶体管，每个光电晶体管均对应于dep电极区域214。或者，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)，其中每个这样的电极均对应于dep电极区域214。电极活化衬底206可以包括此类光电晶体管或光电晶体管控制的电极的图案。例如，该图案可以是排列成行和列的基本上为正方形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列，如图2b所示。或者，图案可以是形成六边点格(hexagonallattice)的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列。无论图案如何，电路元件都可以在电极活化衬底206的内表面208处的dep电极区域214与底部电极210之间形成电连接，并且可以由光图案218选择性地激活和去激活那些电连接(即，光电晶体管或电极)。当未被激活时，每个电连接都可以具有高阻抗，使得通过电极活化衬底206(即，从底部电极204到与区域/室202中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)的相对阻抗大于在相应的dep电极区214处通过介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对阻抗。然而，当被光图案218中的光激活时，通过电极活化衬底206的相对阻抗小于在每个被照亮的dep电极区域214处通过介质180的相对阻抗，从而在相应dep电极区域214处激活dep电极，如上文所述。因此，以光图案218所确定的方式，可以在区域/室202中的电极活化衬底206的内表面208处的许多不同的dep电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥介质180中的微物体(未示出)的dep电极。237.已经在例如美国专利号7,956,339(ohta等人)(参见例如图21和22中所示的装置300及其描述)中描述了具有包含光电晶体管的电极活化衬底的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。已经在例如美国专利公开号2014/0124370(short等人)(参见例如整个附图中所示的装置200、400、500、600和900及其描述)中描述了具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。238.在dep配置的微流体装置的一些实施方案中，顶部电极210是外壳102的第一壁(或盖110)的一部分，并且电极活化衬底206和底部电极204是外壳102的第二壁(或支撑结构104)的一部分。区域/室202可以位于第一壁和第二壁之间。在其他实施方案中，电极210是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极活化衬底206和/或电极210中的一个或两个是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源216可以替代地用于从下方照亮外壳102。239.利用具有dep构造的图1b-1c的微流体装置200，通过将光图案218投射到微流体装置200中，以便以围绕并捕捉微物体的图案(例如，正方形图案220)来激活电极活化衬底206的内表面208的dep电极区域214a处的第一组一个或多个dep电极，运动模块162可以选择区域/室202中的介质180中的微物体(未示出)。然后，通过相对于微流体装置200移动光图案218以激活dep电极区域214处的第二组一个或多个dep电极，运动模块162可以移动原位产生的捕捉的微物体。或者，可以相对于光图案218来移动微流体装置200。240.在其他实施方案中，微流体装置200可以具有不依赖于电极活化衬底206的内表面208处的dep电极的光激活的dep配置。例如，电极活化衬底206可以包括位于与包括至少一个电极的表面(例如，盖110)相对的位置的选择性可寻址且可激发的电极。可以选择性地打开和闭合开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)以激活或去激活dep电极区域214处的dep电极，从而在激活的dep电极附近的区域/室202中的微物体(未示出)上产生净dep力。取决于诸如电源212的频率和区域/室202中的介质(未示出)和/或微物体的介电性质的特征，dep力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和去激活一组dep电极(例如，在形成正方形图案220的一组dep电极区域214处)，可以在区域/室202中捕捉和移动区域/室202中的一个或多个微物体。图1a中的运动模块162可以控制这类开关，从而激活和去激活各个dep电极，以选择、捕集和移动区域/室202周围的特定微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址且可激发的电极的de配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经被描述在例如美国专利号6,294,063(becker等人)和6,942,776(medoro)中，其全部内容通过引用并入本文。241.作为又一个实例，微流体装置200可以具有电润湿(ew)配置，其可以代替dep配置，或者可以位于微流体装置200与具有dep配置的部分分离的部分中。ew配置可以是光电润湿配置或电介质上的电润湿(ewod)配置，两者都是本领域已知的。在一些ew配置中，支撑结构104具有夹在介电层(未示出)和底部电极204之间的电极活化衬底206。介电层可以包括疏水材料和/或可涂覆有疏水材料，如下文所述。对于具有ew配置的微流体装置200，支撑结构104的内表面208是介电层或其疏水涂层的内表面。242.介电层(未示出)可以包括一个或多个氧化物层，并且可以具有约50nm至约250nm(例如，约125nm至约175nm)的厚度。在某些实施方案中，介电层可以包括氧化物层，例如金属氧化物(例如，氧化铝或氧化铪)层。在某些实施方案中，介电层可以包括除金属氧化物之外的介电材料，例如硅氧化物或氮化物。无论确切的组成和厚度如何，介电层可以具有约10kohms至约50kohms的阻抗。243.在一些实施方案中，介电层的向内朝向区域/室202的表面涂覆有疏水材料。疏水材料可以包括例如氟化碳分子。氟化碳分子的实例包括全氟聚合物，例如聚四氟乙烯(例如，teflon)或聚(2,3-二氟亚甲基-全氟四氢呋喃)(例如，cytoptm)。构成疏水材料的分子可以共价键合到介电层的表面。例如，疏水材料的分子可以借助于诸如硅氧烷基团、膦酸基团或硫醇基团的连接基团共价结合到介电层的表面。因此，在一些实施方案中，疏水材料可以包含烷基封端的硅氧烷、烷基封端的膦酸或烷基封端的硫醇。烷基可以是长链烃(例如，具有至少10个碳或至少16、18、20、22或更多个碳的链)。或者，可以使用氟化(或全氟化)碳链代替烷基。因此，例如，疏水材料可以包括氟代烷基封端的硅氧烷、氟代烷基封端的膦酸或氟代烷基封端的硫醇。在一些实施方案中，疏水涂层的厚度为约10nm至约50nm。在其他实施方案中，疏水涂层的厚度小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)。244.在一些实施方案中，具有电润湿配置的微流体装置200的盖110也涂覆有疏水材料(未示出)。疏水材料可以是用于涂覆支撑结构104的介电层的相同疏水材料，并且疏水涂层可以具有与支撑结构104的介电层上的疏水涂层的厚度基本相同的厚度。此外，盖110可以包括以支撑结构104的方式夹在介电层和顶部电极210之间的电极活化衬底206。盖110的电极活化衬底206和介电层可以具有与支撑结构104的电极活化衬底206和介电层相同的组成和/或尺寸。因此，微流体装置200可以具有两个电润湿表面。245.在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料，例如上文所述的那些。因此，在某些实施方案中，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅层(a-si:h)或由其组成。a-si:h可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-si:h层可以具有约500nm至约2.0μm的厚度。或者，如上文所述，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)。具有光电润湿配置的微流体装置在本领域中是已知的和/或可以用本领域已知的电极活化衬底来构建。例如，美国专利号6,958,132(chiou等人)(其全部内容通过引用并入本文)公开了具有诸如a-si:h的光电导材料的光电润湿配置，而上文引用的美国专利公开号2014/0124370(short等人)公开了具有由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底。246.因此，微流体装置200可以具有光电润湿配置，并且光图案218可以用于激活电极活化衬底206中的光电导ew区域或光响应ew电极。电极活化衬底206的这类激活的ew区域或ew电极可以在支撑结构104的内表面208(即，覆盖介电层或其疏水涂层的内表面)处产生电润湿力。通过改变入射在电极活化衬底206上的光图案218(或相对于光源216移动微流体装置200)，可以移动与支撑结构104的内表面208接触的液滴(例如，包含水性介质、溶液或溶剂)穿过区域/室202中存在的不混溶流体(例如，油介质)。247.在其他实施方案中，微流体装置200可以具有ewod配置，并且电极活化衬底206可以包括不依赖于光来激活的选择性可寻址且可激发的电极。因此，电极活化衬底206可以包括这类电润湿(ew)电极的图案。例如，图案可以是排列成行和列的基本上正方形的ew电极的阵列，如图2b所示。或者，图案可以是形成六边点格的基本上六边形ew电极的阵列。无论图案如何，都可以通过电开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)选择性地激活(或去激活)ew电极。通过选择性地激活和去激活电极活化衬底206中的ew电极，可以在区域/室202内移动与经覆盖的介电层或其疏水涂层的内表面208接触的液滴(未示出)。图1a中的运动模块162可以控制此类开关，从而激活和去激活各个ew电极，以选择和移动区域/室202周围的特定液滴。具有有选择性可寻址且可激发的电极的ewod配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经描述在例如美国专利号8,685,344(sundarsan等人)中，其全部内容通过引用并入本文。248.无论微流体装置200的配置如何，电源212可以用于提供为微流体装置200的电路供电的电势(例如，ac电压电势)。电源212可以与图1中参引的电源192相同或者是其组件。电源212可以被配置为向顶部电极210和底部电极204提供ac电压和/或电流。对于ac电压，电源212可以提供这样的频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围：其如上文所述，足以产生足够强的净dep力(或电润湿力)以在区域/室202中捕集和移动各个微物体(未示出)，和/或还如上文所述，足以改变区域/室202中支撑结构104的内表面208(即，介电层和/或介电层上的疏水涂层)的润湿性质。这样的频率范围和平均或峰值功率范围在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利号6,958,132(chiou等人)、美国专利号re44,711(wu等人)(最初作为美国专利号7,612,355颁布)和美国专利申请公开号us2014/0124370(short等人)、us2015/0306598(khandros等人)和us2015/0306599(khandros等人)。249.室。在图2a-2c中描绘的微流体装置230内示出了一般室224、226和228的非限制性实例。每个室224、226和228可以包括分离结构232，其限定了分离区域240和将分离区域240流体连接到通道122的连接区236。连接区域236可以包括通向微流体通道122的近端开口234和通向分离区域240的远端开口238。连接区域236可以被配置为使得从微流体通道122流入室224、226、228的流体介质(未示出)的流动的最大穿透深度不延伸到分离区域240中。在一些实施方案中，来自微流体通道中流动的流线(streamline)不进入分离区域。因此，由于连接区域236，布置在室224、226、228的分离区域240中的微物体(未示出)或其他材料(未示出)可以与微流体通道122中的介质180流分离且基本上不受其影响。250.图2a-2c的室224、226和228各自具有单个开口，该开口直接通向微流体通道122。室的开口可以从微流体通道122侧向开放。电极活化衬底206在微流体通道122和室224、226和228二者的下方。室的外壳内的电极活化衬底206的上表面(形成室的底板)被设置在与微流体通道122(或者，如果不存在通道，则为流动区域)内的电极活化衬底206的上表面(形成微流体装置的流动通道(或流动区域)的底板)相同水平面上或基本相同的水平面上。电极活化衬底206可以是无特征的，或者可以具有不规则或图案化的表面，其从其最高凸起到其最低凹陷变化小于约3微米、2.5微米、2微米、1.5微米、1微米、0.9微米、0.5微米、0.4微米、0.2微米、0.1微米或更小。跨越微流体通道122(或流动区域)和室的衬底的上表面中的高度变化可以小于室的壁或微流体装置的壁的高度的约3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％或0.1％。虽然详细描述了微流体装置200，但这也适用于本文所述的微流体装置100、230、250、280、290、300、400、500、900、1000、1100、1200中的任一个。251.因此，微流体通道122可以是冲刷区域的示例，并且室224、226、228的分离区域240可以是非冲刷区域的实例。诸如224、226、228的室可以具有分离区域，其中每个分离区域仅有一个开口，该开口朝向隔离坞的连接区域开放。如此配置的在分离区域内外的流体介质交换基本上仅限于通过扩散进行。应当注意，微流体通道122和室224、226、228可以被配置为包含一种或多种流体介质180。在图2a-2b所示的实例中，开口222被连接到微流体通道122，并允许将流体介质180引入到微流体装置230中或从其中移除。在引入流体介质180之前，微流体装置可以装填有气体，如二氧化碳气体。一旦微流体装置230包含流体介质180，就可以选择性地产生和停止微流体通道122中的流体介质180的流动242。例如，如图所示，开口222可以被布置在微流体通道122的不同位置处(例如，相对端)，并且可以从用作入口的一个开口222到用作出口的另一个开口222形成介质的流动242。252.图2c示出了根据本公开的室224的实例的详细视图。还示出了微物体246的实例。253.已知的是，微流体通道122中的流体介质180经过室224的近端开口234的流动242可以产生介质180进入和/或离开室224的二次流动244。为了将室224的分离区域240中的微物体246与二次流动244分离，室224的连接区域236的长度lcon(即，从近端开口234到远端开口238)应当大于二次流动244进入连接区域236的穿透深度dp。穿透深度dp取决于多种因素，包括微流体通道122的形状，其可以由近端开口234处的连接区域236的宽度wcon定义；近端开口234处的微流体通道122的宽度wch；近端开口234处的通道122的高度hch；和连接区域236的远端开口238的宽度。在这些因素中，近端开口234处的连接区域236的宽度wcon和近端开口234处的通道122的高度hch倾向于是最重要的。此外，穿透深度dp可受到通道122中流体介质180的速率和流体介质180粘度的影响。然而，这些因素(即速率和粘度)可能变化很大，而穿透深度dp不会发生显著变化。例如，对于在近端开口234处的连接区域236的宽度wcon为约50微米、在近端开口122处的通道122的高度hch为约40微米，且在近端开口122处的微流体通道122的宽度wch为约100微米至150微米的微流体芯片230，二次流动244的穿透深度dp的范围从流速为0.1微升/秒时小于1.0倍wcon(即小于50微米)到流速为20微升/秒时约2.0倍wcon(即约100微米)，这代表在流体介质180的速率增加200倍的情况下，dp仅增加约2.5倍。因此，对于每个室224，可以识别通道122中的流体介质180的流动242的最大速度vmax，确保二次流动244的穿透深度dp不超过连接区域236的长度lcon。只要微流体通道122中的流体介质180的流动242的速率不超过最大速度vmax，所得到的二次流动244就可以被完全包含在连接区域236内并且不进入分离区域240。因此，微流体通道122中的介质180的流动242将不会将微物体246拖曳出分离区域240。相反，无论微流体通道122中的流体介质180的流动242如何，位于分离区域240中的微物体246将停留在分离区域240中。254.此外，只要微流体通道122中的介质180的流动242的速率不超过vmax，微流体通道122中的流体介质180的流动242就不会把混杂的颗粒(例如，微粒和/或纳米颗粒)从微流体通道122移动到室224的分离区域240中。因此，使连接区域236的长度lcon大于二次流动244的最大穿透深度dp可以防止一个室224被来自微流体通道122或另一个室(例如，图2d中的室226、228)的混杂的颗粒污染。255.因为微流体通道122和室224、226、228的连接区域236可能受到微流体通道122中的介质180的流动242的影响，所以微流体通道122和连接区域236可以被认为是微流体装置230的冲刷(或流动)区域。另一方面，室224、226、228的分离区域240可以被认为是非冲刷(或非流动)区域。例如，微流体通道122中的第一流体介质180中的组分(未示出)可以基本上仅通过第一介质180的组分从微流体通道122扩散通过连接区域236并进入分离区域240中的第二流体介质248中而与分离区域240中的第二流体介质248混合。类似地，分离区域240中的第二介质248的组分(未示出)可以基本上仅通过第二介质248的组分从分离区域240扩散通过连接区域236并进入微流体通道122中的第一介质180中而与微流体通道122中的第一介质180混合。在一些实施方案中，室的分离区域与流动区域之间通过扩散进行的流体介质交换的程度大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于约99％的流体交换。第一介质180可以是与第二介质248相同的介质或不同的介质。此外，第一介质180和第二介质248可以开始相同，然后变得不同(例如，通过分离区域240中的一个或多个细胞来调节第二介质248，或者通过改变流过微流体通道122的介质180)。256.在一些实施方案中，微流体通道122和室224、226、228的尺寸可以相对于微流体通道122中的流体介质180的流动242的向量如下定向：微流体通道宽度wch(或微流体通道122的横截面积)可以基本上垂直于介质180的流动242；连接区域236在开口234处的宽度wcon(或横截面积)可以基本上平行于微流体通道122中的介质180的流动242；和/或连接区域的长度lcon可以基本上垂直于微流体通道122中的介质180的流动242。前述仅是示例，并且微流体通道122和室224、226、228的相对位置可以相对于彼此为其他取向。257.如图2c所示，连接区域236的宽度wcon从近端开口234到远端开口238可以是均匀的。因此，连接区域236在远端开口238处的宽度wcon可以是本文中为连接区域236在近端开口234处的宽度wcon所标识的任何值。或者，连接区域236在远端开口238处的宽度wcon可以大于连接区域236在近端开口234处的宽度wcon。258.如图2c所示，分离区域240在远端开口238处的宽度可以与连接区域236在近端开口234处的宽度wcon基本上相同。因此，分离区域240在远端开口238处的宽度可以是本文中为连接区域236在近端开口234处的宽度wcon所标识的任何值。或者，分离区域240在远端开口238处的宽度可以大于或小于连接区域236在近端开口234处的宽度wcon。此外，远端开口238可以小于近端开口234，并且连接区域236的宽度wcon可以在近端开口234和远端开口238之间变窄。例如，使用各种不同的几何形状(例如，斜切连接区域、使连接区域成斜面)，连接区域236可以在近端开口和远端开口之间变窄。此外，连接区域236的任何部分或子部分可以变窄(例如，连接区域与近端开口234相邻的一部分)。259.图2d-2f描绘了包含微流体管路262和流动通道264的微流体装置250的另一示例性实施方案，其是图1a的相应微流体装置100、管路132和通道134的变体。微流体装置250还具有多个室266，其是上述室124、126、128、130、224、226或228的另外的变体。特别地，应当理解，图2d-2f中所示的装置250的室266可以代替装置100、200、230、250、280、290、300、400、500、900、1000、1100、1200中的上述室124、126、128、130、224、226或228中任一个。类似地，微流体装置250是微流体装置100的另一变体，并且还可以具有与上述微流体装置100、200、230、250、280、290、300、400、500、900、1000、1100、1200相同或不同的dep配置，以及本文所述的其他微流体系统组件中的任一个。260.图2d-2f的微流体装置250包括支撑结构(在图2d-2f中不可见，但可以与图1a中所描绘的装置100的支撑结构104相同或基本上类似)、微流体管路结构256和盖(在图2d-2f中不可见，但可以与图1a中所描绘的装置100的盖122相同或基本上类似)。微流体管路结构256包括框架252和微流体管路材料260，其可以与图1a中所描绘的装置100的框架114和微流体管路材料116相同或基本上类似。如图2d所示，由微流体管路材料260所定义的微流体管路262可以包括多个通道264(示出了两个，但可以有更多个)，多个室266与其流体连接。261.每个室266可以包括分离结构272、分离结构272内的分离区域270、以及连接区域268。从微流体通道264处的近端开口274到分离结构272处的远端开口276，连接区域268将微流体通道264流体连接至分离区域270。通常，根据上文对图2b和2c的讨论，通道264中的第一流体介质254的流动278可以产生第一介质254从微流体通道264进入和/或离开室266的相应连接区域268的二次流动282。262.如图2e所示，每个室266的连接区域268通常包括在至通道264的近端开口274与至分离结构272的远端开口276之间延伸的区域。连接区域268的长度lcon可以大于二次流动282的最大穿透深度dp，在这种情况下，二次流动282将延伸到连接区域268中而不被再引导向分离区域270(如图2d所示)。或者，如图2f所示，连接区域268可以具有小于最大穿透深度dp的长度lcon，在这种情况下，二次流动282将延伸通过连接区域268并且被再引导向分离区域270。在后一种情况下，连接区域268的长度lc1和lc2的和大于最大穿透深度dp，使得二次流动282不延伸到分离区域270中。无论连接区域268的长度lcon是否大于穿透深度dp，或者连接区域268的长度lc1和lc2的和是否大于穿透深度dp，通道264中的第一介质254的不超过最大速度vmax的流动278会产生具有穿透深度dp的二次流动，并且室266的分离区域270中的微物体(未示出，但可以与图2c中所示的微物体246相同或基本上类似)不会被通道264中的第一介质254的流动278拖曳离开分离区域270。通道264中的流动278也不会将混杂的物质(未示出)从通道264拖曳到室266的分离区域270中。这样，扩散是微流体通道264中的第一介质254中的组分可以从微流体通道264移动到室266的分离区域270中的第二介质258中的唯一机制。类似地，扩散是室266的分离区域270中的第二介质258中的组分可以从分离区域270移动到微流体通道264中的第一介质254中的唯一机制。第一介质254可以是与第二介质258相同的介质，或者第一介质254可以是与第二介质258不同的介质。或者，第一介质254和第二介质258可以在开始时相同，然后变得不同，例如，通过分离区域270中的一个或多个细胞调节第二介质，或者通过改变流过微流体通道264的介质。263.如图2e所示，微流体通道264中的微流体通道264的宽度wch(即，横切流体介质流过微流体通道的方向，如图2d中的箭头278所示)可以基本上垂直于近端开口274的宽度wcon1，并且因此基本上平行于远端开口276的宽度wcon2。然而，近端开口274的宽度wcon1和远端开口276的宽度wcon2不需要基本上彼此垂直。例如，近端开口274的宽度wcon1定向于其上的轴(未示出)与远端开口276的宽度wcon2定向于其上的另一轴之间的角度可以不同于垂直，并因此不是90°。可选择的定向角度的实例包括以下角度：约30°至约90°、约45°至约90°、约60°至约90°等。264.图3a示出了包含微流体管路结构308的微流体装置300的另一示例性实施方案，所述微流体装置包括通道322和室324，其特征和特性与本文所述的微流体装置100、200、230、250、280、290、300、400、500、900、1000、1100、1200和本文所述的任何其他微流体装置的室类似。265.图3a的示例性微流体装置包括微流体通道322，如本文所述，微流体通道322具有宽度wch，并且包含第一流体介质302的流动310和一个或多个室324(图3中仅示出一个)。每个室324均具有长度ls、连接区域336和分离区域340，其中分离区域340包含第二流体介质304。连接区域336具有近端开口334，所述近端开口334具有宽度wcon1并且朝向微流体通道322开放，以及远端开口338，所述远端开口338具有宽度wcon2并且朝向分离区域340开放。如本文所述，宽度wcon1可与wcon2相同或不同。每个室324的壁可以由微流体管路材料316形成，该材料可以进一步形成连接区域壁330。连接区域壁330可以对应于相对于近端开口334侧向放置的结构，并且至少部分延伸到室322的封闭部分内。在一些实施方案中，连接区域336的长度lcon至少部分由连接区域壁330的长度l壁定义。连接区域壁330可以具有长度l壁，其被选择为大于二次流动344的穿透深度dp。因此，二次流动344可以完全包含在连接区域内，而不延伸到分离区域340中。266.连接区域壁330可以定义钩区域352，其是室324的分离区域340的子区域。尽管术语“钩区域”用于指分离区域340的该子区域，但“钩区域”可以更广泛地解释为微流体室的任何区域，该区域与直接和/或二次流动分离，并且其中不太可能具有或不具有细胞。由于连接区域壁330延伸到室的内腔中，因此连接区域壁330可以作为物理屏障以掩蔽钩区域352不受二次流动344的影响，同时选择l壁的长度，从而有助于钩区域的范围。在一些实施方案中，连接区域壁330的长度l壁越长，钩区域352被掩蔽得越多。267.在如图2a-2g和3a所示配置的室中，分离区域可以具有任何类型的形状和大小，并且可以被选择调控营养物质、试剂和/或介质向室中的扩散，以到达室的远壁，例如，与连接区域向流动区域(或微流体通道)的近端开口相对。可进一步选择分离区域的大小和形状以调控生物微物体的废物和/或分泌产物通过室连接区域的近端开口从分离区域向流动区域的扩散。一般来说，分离区域的形状对室将微物体与流动区域中的直接流动分离的能力来说并不重要。268.在室的一些其他实施方案中，分离区域可以具有多于一个开口，这些开口将分离区域与微流体装置的流动区域流体连接。然而，对于具有将分离区域与流动区域(或两个或更多个流动区域)流体连接的多个n个开口的分离区域，可以对n-1个开口设置阀门。当n-1个具有阀门的开口关闭时，分离区域仅有一个有效开口，并且进出分离区域的材料交换仅通过扩散进行。269.微流体管路元件尺寸。如本文所述，可选择隔离坞和隔离坞开放向的微流体通道的各种尺寸和/或特征，以限制污染物或不需要的微物体从流动区域/微流体通道被引入隔离坞的分离区域；将流体介质中的组分从通道或分离区域的交换限制为基本上仅扩散交换；促进将微物体转移进和/或转移出隔离坞；和/或促进生物细胞的生长或扩增。对于本文所述的任何实施方案，微流体通道和隔离坞可以具有任何合适的尺寸组合，可以由技术人员根据本公开的教导进行选择。270.对于本文所述的任何微流体装置，微流体通道可以沿着其长度具有均匀的横截面高度，即基本均匀的横截面高度，也可以是本文所述的任何横截面高度。在沿微流体通道的任何点上，通道的基本均匀的横截面高度(其上表面由盖的内表面定义，且其下表面由底座的内表面定义)可以与沿通道的任何其他点处的横截面高度基本相同，例如，该横截面高度与通道内任何其他位置的横截面高度具有不超过约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更小的差异。271.此外，本文所述的微流体装置的室，例如隔离坞，可以相对于室开口向的微流体通道基本上以共面方向布置。也就是说，室的封闭体积由上表面(由盖的内表面定义)、下表面(由底座的内表面定义)和壁(由微流体管路材料定义)形成。因此，室的下表面可以与微流体通道的下表面共面，例如基本共面。室的上表面可以与微流体通道的上表面共面，例如基本共面。因此，室的横截面高度可以具有本文所述的任何值，即与通道相同，例如基本相同，并且微流体装置内的室和微流体通道在整个微流体装置的流动区域内可以具有基本均匀的横截面高度，并且可以在整个微流体装置中基本共面。272.室的下表面和微流体通道的共面性可以对使用dep或磁力在微流体装置内重新定位微物体提供明显的优势。当室的下表面和室开口向的微流体通道具有共面方向时，可以极大地促进微物体的进坞和出坞，尤其是选择性进坞/选择性出坞。273.隔离坞的连接区域的近端开口的宽度(例如，wcon或wcon1)至少与隔离坞拟用于的微物体(例如生物细胞，其可以是植物细胞，例如植物原生质体)的最大尺寸一样大。在一些实施方案中，近端开口具有约20微米、约40微米、约50微米、约60微米、约75微米、约100微米、约150微米、约200微米或约300微米的宽度(例如，wcon或wcon1)。以上仅为实例，并且近端开口的宽度(例如，wcon或wcon1)可以选择为上述任何值之间的值(例如，约20-200微米、约20-150微米、约20-100微米、约20-75微米、约20-60微米、约50-300微米、约50-200微米、约50-150微米、约50-100微米、约50-75微米、约75-150微米、约75-100微米、约100-300微米、约100-200微米或约200-300微米)。274.在一些实施方案中，隔离坞的连接区域可以具有从近端开口到朝向隔离坞分离区域的远端开口的长度(例如lcon)，该长度为近端开口宽度(例如，wcon或wcon1)的至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3.0倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少4.5倍、至少5.0倍、至少6.0倍、至少7.0倍、至少8.0倍、至少9.0倍或至少10.0倍。因此，例如，隔离坞的连接区域的近端开口的宽度(例如，wcon或wcon1)可以是约20微米至约200微米(例如，约50微米至约150微米)，并且连接区域的长度lcon可以是近端开口宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)。作为另一个实例，隔离坞的连接区域的近端开口的宽度(例如，wcon或wcon1)可以是约20微米至约100微米(例如，约20微米至约60微米)，并且连接区域的长度lcon可以是近端开口宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)。275.隔离坞开口向的微流体装置的微流体通道可以具有指定的大小(例如宽度或高度)。在一些实施方案中，隔离坞连接区域的近端开口处的微流体通道的高度(例如，hch)可以在以下任何范围内：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。上述仅为实例，且微流体通道(例如122)的高度(例如，hch)可以选择在上文列出的任何值之间。此外，微流体通道122的高度(例如，hch)可以选择为微流体通道的区域中的任何高度，而不是隔离坞近端开口处的高度。276.隔离坞连接区域的近端开口处的微流体通道的宽度(例如，wch)可以在以下任何范围内：约20-500微米、20-400微米、20-300微米、20-200微米、20-150微米、20-100微米、20-80微米、20-60微米、30-400微米、30-300微米、30-200微米、30-150微米、30-100微米、30-80微米、30-60微米、40-300微米、40-200微米、40-150微米、40-100微米、40-80微米、40-60微米、50-1000微米，50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-300微米、60-200微米、60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、70-100微米、80-100微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米、100-120微米、200-800微米、200-700微米或200-600微米。上述仅为实例，且微流体通道的宽度(例如，wch)可以选择为介于上述任何值之间的值。此外，微流体通道的宽度(例如，wch)可以选择为微流体通道的区域中的任何这些宽度，而不是隔离坞近端开口处的宽度。在一些实施方案中，隔离坞连接区域的近端开口处的微流体通道的宽度wch(例如，与流经通道的大量流体的流动方向成横向)可以基本垂直于近端开口的宽度(例如，wcon或wcon1)。277.隔离坞连接区域近端开口处的微流体通道的横截面积可以是约500-50,000平方微米、500-40,000平方微米、500-30,000平方微米、500-25,000平方微米、500-20,000平方微米、500-15,000平方微米、500-10,000平方微米、500-7,500平方微米、500-5,000平方微米、1,000-25,000平方微米、1,000-20,000平方微米、1,000-15,000平方微米、1,000-10,000平方微米、1,000-7,500平方微米、1,000-5,000平方微米、2,000-20,000平方微米、2,000-15,000平方微米、2,000-10,000平方微米、2,000-7,500平方微米、2,000-6,000平方微米、3,000-20,000平方微米、3,000-15,000平方微米、3,000-10,000平方微米、3,000-7,500平方微米或3,000至6,000平方微米。上述仅为实例，且近端开口处微流体通道的横截面积可以选择为介于上述任何值之间。在各种实施方案中，微流体通道的非近端开口区域处的微流体通道横截面积也可以选择为介于上述任何值之间。在一些实施方案中，横截面积被选择为在微流体通道的整个长度上基本均匀的值。278.在一些实施方案中，微流体芯片被配置为使得隔离坞连接区域的近端开口(例如234或334)的宽度(例如，wcon或wcon1)可以为约20微米至约200微米(例如，约50微米至约150微米)，连接区域的长度lcon(例如，236或336)可以是近端开口宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)，并且微流体通道在近端开口处的高度(例如，hch)可以是约30微米至约60微米。作为另一个实例，隔离坞连接区域的近端开口(例如234或334)的宽度(例如，wcon或wcon1)可以是约20微米至约100微米(例如，约20微米至约60微米)，连接区域的长度lcon(例如，236或336)可以是近端开口宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)，并且微流体通道在近端开口处的高度(例如，hch)可以是约30微米至约60微米。上述仅为实例，且近端开口(例如234或274)的宽度(例如，wcon或wcon1)、连接区域的长度(例如lcon)和/或微流体通道(例如122或322)的宽度(例如，wch)可以选择为介于上述任何值之间的值。然而，通常情况下，隔离坞连接区域近端开口的宽度(wcon或wcon1)小于微流体通道的宽度(wch)。在一些实施方案中，近端开口的宽度(wcon或wcon1)是微流体通道宽度(wch)的约8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、25％或30％。也就是说，微流体通道的宽度(wch)可以是隔离坞连接区域近端开口的宽度(wcon或wcon1)的至少2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或至少10.0倍。279.在一些实施方案中，通道122、322、618、718的大小wc(例如，横截面宽度wch、直径、面积等)可以是室开口如隔离坞开口234、334等的大小wo(例如，横截面宽度wcon、直径、区域等)的约一又四分之一(1.25)倍、约一又二分之一(1.5)倍、约2倍、约二又二分之一(2.5)倍、约三(3)倍或更多倍。这可以减少材料通过开口234、334从选择的室(例如，图2b中的隔离坞224、226)扩散到通道122、322、618、718并随后重新进入下游或相邻室(例如隔离坞228)的二次流动范围和扩散速率(或扩散通量)。分子(例如，受关注的被分析物，例如抗体)的扩散速率取决于许多因素，包括(但不限于)温度、介质粘度和分子扩散系数d0。例如，在约20℃的水性溶液中，igg抗体的d0为约4.4x10-7cm2/秒，而细胞培养基的动力学粘度为约9x10-4m2/秒。因此，在约20℃的细胞培养基中，抗体的扩散速率为约0.5微米/秒。因此，在一些实施方案中，从位于隔离坞(例如224、226、228、324)内的生物微物体扩散到通道122、322、618、718的时间段可以是约10分钟或更少(例如，约9、8、7、6、5分钟或更少)。扩散的时间段可以通过改变影响扩散速率的参数来操控。例如，介质的温度可以升高(例如，达到生理温度，例如约37℃)或降低(例如，到约15℃、10℃或4℃)，从而分别提高或降低扩散速率。可选地，或另外，如本文所讨论的，可以增加或减少介质中的溶质浓度以将选择的坞与来自其他上游坞的溶质分离开。280.因此，在一些变化中，隔离坞连接区域近端开口处的微流体通道的宽度(例如，wch)可以是约50至500微米、约50至300微米、约50至200微米、约70至500微米、约70至300微米、约70至250微米、约70至200微米，约70至150微米、约70至100微米，约80至500微米、约80至300微米、约80至250微米、约80至200微米、约80至150微米、约90至500微米、约90至300微米、约90至250微米、约90至200微米、约90至150微米、约100至500微米、约100至300微米、约100至250微米、约100至200微米或约100至150微米。在一些实施方案中，隔离坞连接区域近端开口处的微流体通道的宽度wch可以是约70至250微米、约80至200微米或约90至150微米。室(如隔离坞)开口的宽度wcon可以是约20至100微米；约30至90微米；或约20至60微米。在一些实施方案中，wch为约70至250微米，且wcon为约20至100微米；wch为约80至200微米，且wcon为约30至90微米；wch为约90至150微米，且wcon为约20至60微米；或其wch和wcon宽度的任何组合。281.在一些实施方案中，隔离坞连接区域近端开口(例如234或334)的宽度(例如，wcon或wcon1)是近端开口处流动区域/微流体通道高度(例如，hch)的2.0倍或更小(例如2.0倍、1.9倍、1.8倍、1.5倍、1.3倍、1.0倍、0.8倍、0.5倍或0.1倍)，或具有位于上述任意两个值定义的范围内的值。282.在一些实施方案中，隔离坞连接区域近端开口(例如234或334)的宽度wcon1可以与朝向其分离区域的远端开口(例如238或338)的宽度wcon2相同。在一些实施方案中，近端开口的宽度wcon1可以不同于远端开口的宽度wcon2，并且wcon1和/或wcon2可以选自对wcon或wcon1描述的任何值。在一些实施方案中，定义近端开口和远端开口的壁(包括连接区域壁)可以基本上彼此平行。在一些实施方案中，定义近端开口和远端开口的壁可以选择为不彼此平行。283.连接区域的长度(例如lcon)可以是约1-600微米、5-550微米、10-500微米、15-400微米、20-300微米、20-500微米、40-400微米、60-300微米、80-200微米、约100-150微米、约20-300微米、约20-250微米、约20-200微米、约20-150微米、约20-100微米、约30-250微米、约30-200微米、约30-150微米、约30-100微米、约30-80微米、约30-50微米、约45-250微米、约45-200微米、约45-100微米、约45-80微米、约45-60微米、约60-200微米、约60-150微米、约60-100微米或约60-80微米。上述仅为实例，且连接区域的长度(例如lcon)可以选择为介于上述任何值之间的值。284.隔离坞的连接区域壁的长度(例如l壁)可以是隔离坞连接区域近端开口的宽度(例如，wcon或wcon1)的至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3.0倍或至少3.5倍。在一些实施方案中，连接区域壁的长度l壁可以是约20-200微米、约20-150微米、约20-100微米、约20-80微米或约20-50微米。以上仅为实例，且连接区域壁的长度l壁可以选择为介于上述任何值之间。285.隔离坞的长度ls可以是约40-600微米、约40-500微米、约40-400微米、约40-300微米、约40-200微米、约40-100微米或约40-80微米。上述仅为实例，且隔离坞的长度ls可以选择为介于上述任何值之间。286.根据一些实施方案，隔离坞可以具有指定的高度(例如hs)。在一些实施方案中，隔离坞的高度hs为约20微米至200微米(例如，约20微米到约150微米、约20微米至约100微米、约20微米至约60微米、约30微米至约150微米，约30微米至约100微米、约30微米至约60微米、约40微米至约150微米、约40微米至约100微米或约40微米至约60微米)。上述仅为实例，且隔离坞的高度hs可以选择为介于上述任何值之间。287.隔离坞近端开口处的连接区域的高度hcon可以是以下任何高度内的高度：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。以上仅为实例，且连接区域的高度hcon可以选择为介于上述任何值之间。通常，连接区域的高度hcon被选择为与连接区域近端开口处的微流体通道高度hch相同。此外，隔离坞的高度hs通常被选择为与连接区域的高度hcon和/或微流体通道的高度hch相同。在一些实施方案中，hs、hcon和hch可被选择为与上文针对所选微流体装置列出的任何值相同的值。288.分离区域可以被配置为仅含有一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对较少数量的微物体。在其他实施方案中，分离区域可以含有多于10个、多于50个或多于100个的微物体。因此，分离区域的体积可以是例如至少1x104、1x105、5x105、8x105、1x106、2x106、4x106、6x106、1x107、3x107、5x1071x108、5x108或8x108立方微米或更大。以上仅为实例，且分离区域可以被配置为包含被选择为介于上述任何值之间的微物体数量和体积(例如，体积在1x105立方微米和5x105立方微米之间，体积在5x105立方米微米和1x106立方微米之间，体积在1x106立方微米和2x106立方微米之间，或体积在2x106立方微米和1x107立方微米之间)。289.根据一些实施方案，微流体装置的隔离坞可以具有指定的体积。可选择指定体积的隔离坞(或隔离坞的分离区域)，使得单个细胞或少量细胞(例如2-10或2-5)能够快速习惯于培养基，从而获得有利(或最佳)生长条件。在一些实施方案中，隔离坞的体积为约5x105、6x105、8x105、1x106、2x106、4x106、8x106、1x107、3x107、5x107或约8x107立方微米或更大。在一些实施方案中，隔离坞的体积为约1纳升至约50纳升、2纳升至约25纳升、2纳升至约20纳升、约2纳升至约15纳升或约2纳升至约10纳升。上述仅为实例，且隔离坞的体积可以选择为介于上述任何值之间的任何值。290.根据一些实施方案，微流体通道(例如122或322)内的流体介质流动可具有指定的最大速度(例如，vmax)。在一些实施方案中，最大速度(例如，vmax)可设置为约0.2、0.5、0.7、1.0、1.3、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.7、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24或25微升/秒。上述仅为实例，且微流体通道内的流体介质流动的最大速度(例如，vmax)可以选择为介于上述任何值之间的值。微流体通道内的流体介质流动通常可以以低于vmax的速率流动。尽管vmax可能因通道和向其开口的隔离坞的具体大小和数量而异，但流体介质可以以以下速率流动：约0.1微升/秒至约20微升/秒；约0.1微升/秒至约15微升/秒；约0.1微升/秒至约12微升/秒、约0.1微升/秒至约10微升/秒；约0.1微升/秒至约7微升/秒钟，但不超过vmax。在典型工作流程的某些部分中，流体介质的流速可以是约0.1微升/秒；约0.5微升/秒；约1.0微升/秒；约2.0微升/秒；约3.0微升/秒；约4.0微升/秒；约5.0微升/秒；约6.0微升/秒；约7.0微升/秒；约8.0微升/秒；约9.0微升/秒；约10.0微升/秒；约11.0微升/秒；或由上述值的其中两个值定义的任何范围，例如1-5微升/秒或5-10微升/秒。微流体通道中流体介质的流速可以等于或小于约12微升/秒；约10微升/秒；约8微升/秒，或约6微升/秒。291.在各种实施方案中，微流体装置具有隔离坞，其配置如本文所讨论的任何实施方案中所述，其中微流体装置具有约5至约10个隔离坞、约10至约50个隔离坞、约25至约200个隔离坞和约100至约500个隔离坞、约200至约1000个隔离坞、约500至约1500个隔离坞、约1000至约2500个隔离坞、约2000至约5000个隔离坞、约3500至约7000个隔离坞、约5000至约10000个隔离坞、约7500至约15000个隔离坞、约12500至约20000个隔离坞、约15000至约25000个隔离坞、约20000至约30000个隔离坞、约25000至约35000个隔离坞、约30000至约40000个隔离坞、约35000至约45000个隔离坞或约40000至约50000个隔离坞。隔离坞不必都是相同的大小，并且可以包括多种配置(例如，不同的宽度、隔离坞内的不同特征)。292.图2g示出了根据一个实施方案的微流体装置280。图2g中所示的微流体装置280是微流体装置100的程式化示意图。在实施中，微流体装置280及其组成管路元件(例如，通道122和室128)会具有本文所讨论的尺寸。图2g中所示的微流体管路120具有两个开口107、四个不同的通道122和四个不同的流动路径106。微流体装置280还包括向每个通道122开口的多个室。在图2g所示的微流体装置中，室具有与图2c中所示的室类似的几何形状，因此具有连接区域和分离区域这两者。因此，微流体管路120包括冲刷区域(例如，通道122和连接区域236的在二次流动244的最大穿透深度dp内的部分)和非冲刷区域(例如，分离区域240和连接区域236的不在二次流动244的最大穿透深度dp内的部分)这两者。293.图3b至3c示出了可用于操作和观察根据本公开的微流体装置(例如，100、200、230、250、280、290、300、400、500、900、1000、1100、1200)的系统150的各种实施方案。如图3b所示，系统150可以包括结构(“巢”)305，其被配置为保持微流体装置320，或本文所述的任何其他微流体装置。巢305可以包括插座(socket)301，其能够与微流体装置320(例如，光致动的电动力学装置100)交界并提供从电源192到微流体装置320的电连接。巢305还可以包括集成的电信号生成子系统304。电信号生成子系统303可以被配置为向插座301提供偏置电压，使得当插座301承载微流体装置320时，在微流体装置320中的一对电极两端施加偏置电压。因此，电信号生成子系统303可以是电源192的一部分。向微流体装置320施加偏置电压的能力并不意味着当插座301承载微流体装置320时会一直施加偏置电压。相反，在大多数情况下，将间歇地施加偏压电压，例如，仅在需要时施加，以促进在微流体装置320中生成电动力，例如介电电泳或电润湿。294.如图3b所示，巢305可以包括印刷电路板组件(pcba)322。电信号生成子系统303可以被安装在pcba322上并被电集成到其中。示例性支撑件包括也安装在pcba322上的插座301。295.通常，电信号生成子系统303将包括波形发生器(未示出)。电信号生成子系统303还可以包括示波器(未示出)和/或被配置为放大从波形发生器接收到的波形的波形放大电路(未示出)。示波器(如果有的话)可以被配置为测量供给至由插座301承载的微流体装置320的波形。在某些实施方案中，示波器在微流体装置320附近(并且远离波形发生器)的位置处测量波形，从而确保更精确地测量实际施加到装置的波形。从示波器测量所获得的数据可以被例如作为反馈提供给波形发生器，并且波形发生器可以被配置为基于这样的反馈而调整其输出。合适的组合式波形发生器和示波器的示例是redpitayatm。296.在某些实施方案中，巢305还包括控制器307，例如用于检测和/或控制电信号生成子系统303的微处理器。合适的微处理器的实例包括arduinotm微处理器，例如arduinonanotm。控制器307可以用于执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154(图1a中所示)进行通信以执行功能和分析。在图3a所示的实施方案中，控制器307通过界面309(例如，插头或连接器)与主控制器154通信。297.在一些实施方案中，巢305可以包括电信号生成子系统303，其包括redpitayatm波形发生器/示波器单元(“redpitaya单元”)和波形放大电路，该波形放大电路将redpitaya单元所产生的波形放大并且将放大的电压传送给微流体装置320。在一些实施方案中，redpitaya单元被配置为测量微流体装置320处的放大的电压，然后根据需要调节其自身的输出电压，使得在微流体装置320处测量到的电压是期望值。在一些实施方案中，波形放大电路可以具有由安装在pcba322上的一对dc-dc转换器产生的 6.5v至-6.5v的电源，从而在微流体装置320处产生高达13vpp的信号。298.如图3b所示，支撑结构305(例如，巢)还可以包括热控制子系统306。热控制子系统306可以被配置为调节由支撑结构305保持的微流体装置320的温度。例如，热控制子系统306可以包括peltier热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。peltier热电装置可以具有被配置为与微流体装置320的至少一个表面相交界的第一表面。冷却单元可以是例如冷却块(未示出)，例如液体冷却铝块。peltier热电装置的第二表面(例如，与第一表面相对的表面)可以被配置为与这种冷却块的表面交界。冷却块可以被连接到流体路径314，流体路径314被配置为使冷却的流体循环通过冷却块。在图3a所示的实施方案中，支撑结构300包括入口315和出口318，以从外部贮液器(未示出)接收冷却的流体，将冷却的流体引入到流体路径314中并通过冷却块，然后将冷却的流体返回到外部贮液器。在一些实施方案中，peltier热电装置、冷却单元和/或流体路径314可以被安装在支撑结构305的壳体312上。在一些实施方案中，热控制子系统306被配置为调节peltier热电装置的温度，以实现微流体装置320的目标温度。peltier热电装置的温度调节可以例如通过热电电源实现，例如通过pololutm热电电源(pololuroboticsandelectronicscorp.)实现。热控制子系统306可以包括反馈电路，例如由模拟电路提供的温度值。或者，反馈电路可以由数字电路提供。299.在一些实施方案中，巢305可以包括具有反馈电路的热控制子系统306，该反馈电路是包括电阻器(例如，具有1kohm /-0.1％的阻抗， /-0.02ppm/c0的温度系数)和ntc热敏电阻(例如，具有1kohm /-0.01％的标称阻抗)的模拟分压器电路(未示出)。在一些情况下，热控制子系统306测量来自反馈电路的电压，然后使用计算出的温度值作为机载pid控制环路算法的输入。来自pid控制环路算法的输出可以驱动例如pololutm马达驱动器(未示出)上的定向和脉冲宽度调制的信号引脚，以致动热电电源，从而控制peltier热电装置。300.巢305可以包括串行端口324，其允许控制器308的微处理器经由界面310(未示出)与外部主控制器154进行通信。另外，控制器307的微处理器可以与电信号生成子系统303和热控制子系统306进行通信(例如，经由plink工具(未示出))。因此，经由控制器307、界面309和串行端口324的组合，电信号生成子系统303和热控制子系统306可以与外部主控制器154进行通信。以这种方式，除了其他方面之外，主控制器154还可以通过执行用于输出电压调节的定标(scaling)计算来辅助电信号生成子系统304。经由耦接到外部主控制器154的显示装置170提供的图形用户界面(gui)(未示出)可以被配置为绘制分别从热控制子系统306和电信号生成子系统303获得的温度和波形数据。替代地或另外地，gui可以允许更新控制器307、热控制子系统306和电信号生成子系统303。301.如上文所讨论的，系统150可以包括成像装置194。在一些实施方案中，成像装置194包括光调制子系统350(参见图3c)。光调制子系统335可以包括数字镜像装置(dmd)或微快门阵列系统(msa)，其中任一个都可以被配置为接收来自光源332的光并将接收到的光的一部分发送到显微镜350的光具组中。或者，光调制子系统335可以包括产生其自身光的装置(因此无需光源332)，例如有机发光二极管显示器(oled)、硅基液晶(lcos)装置、铁电硅基液晶装置(flcos)或透射式液晶显示器(lcd)。光调制子系统335可以是例如投影仪。因此，光调制子系统350能够发射结构光和非结构光。在某些实施方案中，系统150的成像模块164和/或运动模块162可以控制光调制子系统330。302.在某些实施方案中，成像装置194还包括显微镜350。在这样的实施方案中，巢305和光调制子系统335可以被单独地配置为安装在显微镜350上。显微镜350可以是例如标准研究级别的光学显微镜或荧光显微镜。因此，巢305可以被配置为安装在显微镜350的载物台344上和/或光调制子系统335可以被配置为安装在显微镜350的端口上。在其他实施方案中，本文所述的巢305和光调制子系统335可以是显微镜350的集成部件。303.在某些实施方案中，显微镜350还可以包括一个或多个检测器348。在一些实施方案中，检测器348由成像模块164控制。检测器348可以包括目镜、电荷耦合器件(ccd)、相机(例如，数码相机)或其任何组合。如果存在至少两个检测器348，则一个检测器可以是例如快速帧率相机，而另一个检测器可以是高灵敏度相机。此外，显微镜350可以包括光具组，其被配置为接收从微流体装置320反射和/或发射的光，并将反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到一个或多个检测器348上。显微镜的光具组还可以包括用于不同检测器的不同镜筒透镜(未示出)，使得每个检测器上的最终放大率可以是不同的。304.在某些实施方案中，成像装置194被配置为使用至少两个光源。例如，可以使用第一光源332来产生结构光(例如，经由光调制子系统335)，并且可以使用第二光源334来提供非结构光。第一光源332可以产生用于光驱动的电运动和/或荧光激发的结构光，且第二光源333可以用于提供亮视场照明。在这些实施方案中，运动模块164可以用于控制第一光源332，并且成像模块164可以用于控制第二光源333。显微镜350的光具组可以被配置为(1)接收来自光调制子系统335的结构光，并且当该装置被巢305保持时，将结构光聚焦在微流体装置(例如，光致动的电动力学装置)中的至少第一区域上，以及(2)接收从微流体装置反射和/或发射的光，并将这种反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到检测器348上。光具组还可以被配置为接收来自第二光源的非结构光，并且当该装置被巢305保持时，将非结构光聚焦在微流体装置的至少第二区域上。在某些实施方案中，微流体装置的第一和第二区域可以是重叠的区域。例如，第一区域可以是第二区域的子集。在其他实施方案中，第二光源333可以另外地或替代地包括激光，其可以具有任何合适的光波长。图3c中所示的光学系统的表示仅是示意性表示，并且光学系统可以包括另外的滤光器、陷波滤波器、透镜等。当第二光源333包括用于亮视场和/或荧光激发的一个或多个光源以及激光照明时，光源的物理布置可以与图3c中所示的不同，并且可以在光学系统内的任何合适的物理位置引入激光照明。光源333和光源332/光调制子系统335的示意性位置也可以互换。305.在图3c中，第一光源332被显示为将光提供给光调制子系统335，其将结构光提供给系统355的显微镜350的光具组(未示出)。第二光源333被显示为经由分束器335将非结构光提供给光具组。来自光调制子系统335的结构光和来自第二光源333的非结构光一起从分束器337通过光具组行进到达第二分束器(或二向色滤光器339，取决于光调制子系统335提供的光)，光在此通过物镜340向下反射到样品平面342。然后，从样品平面342反射和/或发射的光向上返回通过物镜340、通过分束器和/或二向色滤光器339，并返回到二向色滤光器346。到达二向色滤光器346的光的仅仅一部分穿过并到达检测器348。306.在一些实施方案中，第二光源333发射蓝光。利用适当的二向色滤光器346，从样品平面342反射的蓝光能够穿过二向色滤光器346并到达检测器348。相反，来自光调制子系统335的结构光从样品平面342反射，但不穿过二向色滤光器346。在该实例中，二向色滤光器346滤除波长长于495nm的可见光。只有从光调制子系统发射的光不包括短于495nm的任何波长时，对来自光调制子系统335的光的这种滤除才算完成(如图所示)。在实施中，如果来自光调制子系统335的光包括短于495nm的波长(例如，蓝色波长)，则来自光调制子系统的一些光会穿过滤光器346到达检测器348。在这样的实施方案中，滤光器346作用于改变从第一光源332和第二光源333到达检测器348的光量之间的平衡。如果第一光源332显著强于第二光源333，则这可能是有益的。在其他实施方案中，第二光源333可以发射红光，并且二向色滤光器346可以滤除除了红光之外的可见光(例如，波长短于650nm的可见光)。307.涂覆溶液和涂覆剂。不希望受理论的限制，当微流体装置的至少一个或多个内表面已经被调节或涂覆以便呈现有机和/或亲水分子层(其提供微流体装置和保持在其中的生物微物体之间的主要界面)时，可以促进微流体装置(例如，dep配置的和/或ew配置的微流体装置)内的生物微物体(例如，生物细胞)的维持(即，生物微物体在微流体装置内表现出增加的活力、更大的扩增和/或更大的可携带性)。在一些实施方案中，微流体装置的一个或多个内表面(例如，dep配置的微流体装置的电极活化衬底的内表面、微流体装置的盖和/或管路材料的表面)可以用涂覆溶液和/或涂覆剂处理或改性，以产生所需的有机和/或亲水分子层。308.涂层可以在引入生物微物体之前或之后施加，或者可以与生物微物体同时引入。在一些实施方案中，生物微物体可以在包含一种或多种涂覆剂的流体介质中输入到微流体装置中。在其他实施方案中，在将生物微物体引入到微流体装置中之前，将微流体装置(例如，dep配置的微流体装置)的内表面用包含涂覆剂的涂覆溶液处理或“装填”。309.在一些实施方案中，微流体装置的至少一个表面包括涂层材料，其提供适合于维持和/或扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层(例如提供如下文所述的经调节的表面)。在一些实施方案中，微流体装置的基本上所有内表面都包括涂层材料。经涂覆的内表面可以包括流动区域(例如，通道)、室或室的表面，或其组合。在一些实施方案中，多个室中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在其他实施方案中，多个流动区域或通道中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在一些实施方案中，多个室中的每一个和多个通道中的每一个的至少一个内表面都涂覆有涂层材料。310.涂覆剂/溶液。可以使用任何方便的涂覆剂/涂覆溶液，包括但不限于：血清或血清因子、牛血清白蛋白(bsa)、聚合物、洗涤剂、酶及其任何组合。311.基于聚合物的涂层材料。至少一个内表面可以包括包含聚合物的涂层材料。聚合物可以与至少一个表面共价或非共价地结合(或可以非特异性地粘附)。聚合物可以具有多种结构基序，例如嵌段聚合物(和共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)和接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)中所发现的，所有这些都可以适用于本文公开的方法。312.聚合物可以包括含有亚烷基醚部分的聚合物。大量的含亚烷基醚的聚合物可以适用于本文所述的微流体装置。一类非限制性示例性的含亚烷基醚的聚合物是两性非离子嵌段共聚物，其包括在聚合物链内具有不同比例和位置的聚氧乙烯(peo)和聚氧丙烯(ppo)子单元的嵌段。pluronic聚合物(basf)是这类嵌段共聚物，并且在本领域中已知适合于在与活细胞接触时使用。聚合物的平均分子量mw可以为约2000da至约20kda。在一些实施方案中，peo-ppo嵌段共聚物可以具有大于约10(例如，12-18)的亲水-亲油平衡(hlb)。可用于产生经涂覆的表面的特定pluronic聚合物包括pluronicl44、l64、p85和f127(包括f127nf)。另一类含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(pegmw《100,000da)或可替代地，聚氧乙烯(peo，mw》100,000)。在一些实施方案中，peg可以具有约1000da、5000da、10,000da或20,000da的mw。313.在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有羧酸部分的聚合物。羧酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚乳酸(pla)。在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磷酸酯部分的聚合物，该磷酸酯部分在聚合物主链的末端处或者从聚合物的主链悬垂。在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磺酸部分的聚合物。磺酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚苯乙烯磺酸(pssa)或聚茴香脑磺酸。在进一步的实施方案中，涂层材料可以包括含有胺部分的聚合物。聚氨基聚合物可以包括天然多胺聚合物或合成的多胺聚合物。天然多胺的实例包括精胺、亚精胺和腐胺。314.在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有糖部分的聚合物。在一个非限制性实例中，诸如黄原胶或葡聚糖的多糖可以适合于形成可以在微流体装置中减少或防止细胞粘附的材料。例如，大小为约3kda的葡聚糖聚合物可以用于为微流体装置内的表面提供涂层材料。315.在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有核苷酸部分的聚合物，即核酸，其可以具有核糖核苷酸部分或脱氧核糖核苷酸部分，从而提供聚电解质表面。核酸可以仅含有天然核苷酸部分或者可以含有非天然核苷酸部分，其包含核碱基、核糖或磷酸酯部分类似物，例如7-脱氮腺嘌呤、戊糖、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯部分，但不限于此。316.在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有氨基酸部分的聚合物。含有氨基酸部分的聚合物可以包括含有天然氨基酸的聚合物或含有非天然氨基酸的聚合物，其均可以包括肽、多肽或蛋白。在一个非限制性实例中，蛋白可以是牛血清白蛋白(bsa)和/或包含白蛋白的血清(或多种不同血清的组合)和/或一种或多种作为涂覆剂的其他类似蛋白。血清可以来自任何方便的来源，包括但不限于胎牛血清、绵羊血清、山羊血清、马血清等。在某些实施方案中，bsa在涂覆溶液中存在的浓度为约1mg/ml至约100mg/ml，包括5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml，或更高或介于其间的任何值。在某些实施方案中，血清在涂覆溶液中存在的浓度可以为约20％(v/v)至约50％v/v，包括25％、30％、35％、40％、45％，或更高或介于其间的任何值。在一些实施方案中，bsa可以作为涂覆剂以5mg/ml存在于涂覆溶液中，而在其他实施方案中，bsa可以作为涂覆剂以70mg/ml存在于涂覆溶液中。在某些实施方案中，血清作为涂覆剂以30％存在于涂覆溶液中。在一些实施方案中，可以在涂层材料内提供细胞外基质(ecm)蛋白，用于获得优化的细胞粘附以促进细胞生长。可以包含在涂层材料中的细胞基质蛋白可以包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、含rgd的肽(例如纤连蛋白)或层粘连蛋白。在其他实施方案中，可以在微流体装置的涂层材料内提供生长因子、细胞因子、激素或其他细胞信号传导物质。317.在一些实施方案中，涂层材料可以包括含有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分或氨基酸部分中超过一种的聚合物。在其他实施方案中，经聚合物调节的表面可以包括超过一种聚合物的混合物，每种聚合物具有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分和/或氨基酸部分，其可以独立地或同时地并入到涂层材料中。318.共价连接的涂层材料。在一些实施方案中，至少一个内表面包括共价连接的分子，其提供适于在微流体装置内维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层，为这些细胞提供调节的表面。319.共价连接的分子包括连接基团，其中连接基团与微流体装置的一个或多个表面共价连接，如下文所述。连接基团还与被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分共价连接。320.在一些实施方案中，被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括烷基或氟代烷基(包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子表面)；磺酸盐阴离子；羧基甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。321.在各种实施方案中，被配置为在微流体装置中提供适合于维持/扩增的生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括非聚合部分，例如烷基部分、取代的烷基部分(例如，氟代烷基部分(包括但不限于全氟代烷基部分))、氨基酸部分、醇部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸部分、氨基磺酸部分或糖部分。或者，共价连接的部分可以包括聚合部分，其可以是上文所述的任何部分。322.在一些实施方案中，共价连接的烷基部分可以包含形成直链(例如，至少10个碳或至少14、16、18、20、22或更多个碳的直链)的碳原子并且可以是无支链的烷基部分。在一些实施方案中，烷基可以包括取代的烷基(例如，烷基中的一些碳可被氟化或全氟化)。在一些实施方案中，烷基可以包括第一区段(其可以包括全氟代烷基)，其连接至第二区段(其可以包括未取代的烷基)，其中第一和第二区段可以直接或间接(例如，通过醚链接)连接在一起。烷基的第一区段可以位于连接基团的远端，并且烷基的第二区段可以位于连接基团的近端。323.在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一个氨基酸，其可以包括超过一种类型的氨基酸。因此，共价连接的部分可以包括肽或蛋白。在一些实施方案中，共价连接的部分可以包括氨基酸，其可以提供两性离子表面以支持细胞生长、活力、可携带性(portability)或其任何组合。324.在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一个亚烷基氧化物部分，并且可以包括如上文所述的任何亚烷基氧化物聚合物。一类有用的含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(pegmw《100,000da)或者聚氧乙烯(peo，mw》100,000)。在一些实施方案中，peg可以具有约1000da、5000da、10,000da或20,000da的mw。325.共价连接的部分可以包括一种或多种糖。共价连接的糖可以是单糖、二糖或多糖。可以修饰共价连接的糖，以引入反应性配对部分，其允许偶联或加工用于表面的附接。示例性的反应性配对部分可以包括醛、炔烃或卤素部分。可以以随机方式修饰多糖，其中可以修饰每种糖单体或仅修饰多糖内的一部分糖单体，以提供可以直接或间接偶联至表面的反应性配对部分。一个实例可以包括葡聚糖多糖，其可以经过非支链的连接部分间接地偶联到表面。326.共价连接的部分可以包括一个或多个氨基。氨基可以是取代的胺部分、胍部分、含氮杂环部分或杂芳基部分。含氨基的部分可以具有允许对微流体装置内以及任选地对室和/或流动区域(例如，通道)内的环境进行ph修饰的结构。327.提供经调节的表面的涂层材料可以仅包含一类共价连接的部分，或者可以包括超过一种不同类型的共价连接的部分。例如，经氟代烷基调节的表面(包括全氟代烷基)可以具有多个共价连接的部分，它们全部相同，例如具有相同的连接基团和与表面的共价连接、相同的总长度和相同数目的氟代亚甲基单元，包括氟代烷基部分。或者，涂层材料可以具有超过一种类型的与表面附接的共价连接部分。例如，涂层材料可以包括具有共价连接的具有指定数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基部分的分子，并且还可以包括另一组分子，其具有共价连接到具有更大数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基链的带电荷部分，其可以提供在经涂覆的表面上呈现较大部分的能力。在这种情况下，具有不同的、空间要求更低的末端和更少的主链原子的第一组分子能够有助于使整个衬底表面功能化，从而防止与构成衬底本身的硅/氧化硅、氧化铪或氧化铝的不期望的粘附或接触。在另一个实例中，共价连接的部分可以提供两性离子表面，其在表面上以随机的方式呈现交替的电荷。328.经调节的表面性质。除了经调节的表面的组成之外，其他因素(例如疏水材料的物理厚度)可能影响dep力。各种因素可能改变经调节的表面的物理厚度，例如在衬底上形成经调节的表面的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂、溢流和静电涂覆)。在一些实施方案中，经调节的表面的厚度为约1nm至约10nm；约1nm至约7nm；约1nm至约5nm；或其间的任何单个值。在其他实施方案中，由共价连接的部分形成的经调节的表面可以具有约10nm至约50nm的厚度。在各种实施方案中，如本文所述制备的经调节的表面具有小于10nm的厚度。在一些实施方案中，当共价连接至微流体装置的表面(例如，dep配置的衬底表面)时，经调节的表面的共价连接的部分可以形成单层，并且可以具有小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)的厚度。这些值与通过例如旋涂制备的表面的值(其厚度通常为约30nm)形成对比。在一些实施方案中，经调节的表面不需要完美形成的单层以适当地作用于在dep配置的微流体装置内操作。329.在各种实施方案中，提供微流体装置的经调节表面的涂层材料可以提供所需的电性质。不希望受理论的限制，影响涂覆有特定涂层材料的表面的稳健性的一个因素是固有电荷捕捉。不同的涂层材料可能捕捉电子，这可能导致涂层材料的破坏。涂层材料中的缺陷可能增加电荷捕捉并导致涂层材料的进一步破坏。类似地，不同的涂层材料具有不同的介电强度(即导致介电击穿的最小施加电场)，这可能影响电荷捕捉。在某些实施方案中，涂层材料可以具有降低或限制电荷捕捉量的整体结构(例如，紧密堆积的单层结构)。330.除了其电性质之外，经调节的表面还可以具有有益于与生物分子一起使用的性质。例如，相对于烷基封端的链，含有氟代(或全氟代)碳链的经调节的表面可以在减少表面结垢量方面提供益处。如本文所用的表面结垢是指沉积在微流体装置的表面上的任意物质的量，其可以包括生物材料(例如，蛋白及其降解产物、核酸和各自的降解产物，等等)的永久性或半永久性沉积。331.单一或多部分调节的表面。如下文所述的，共价连接的涂层材料可以通过已经含有被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分的分子的反应形成。或者，共价连接的涂层材料可以在两步顺序中通过将被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分偶联至表面修饰配体(它本身已经与表面共价连接)而形成。332.制备共价连接的涂层材料的方法。在一些实施方案中，共价连接至微流体装置的表面(例如，包括室和/或流动区域的至少一个表面)的涂层材料具有式1或式2的结构。当将涂层材料一步引入到表面中时，它具有式1的结构，而当将涂层材料以多步法引入时，它具有式2的结构。[0333][0334]涂层材料可以共价连接到dep配置或ew配置的衬底的表面的氧化物上。dep或ew配置的衬底可以包括硅、氧化硅、氧化铝或氧化铪。氧化物可以作为衬底的初始化学结构的一部分存在，或者可以被如下所讨论地引入。[0335]涂层材料可以经由连接基团(“lg”)与氧化物连接，该连接基团可以是由硅氧烷或膦酸基团与氧化物反应而形成的甲硅烷氧基或膦酸酯基团。被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分可以是本文所述的任何部分。连接基团lg可以直接或间接连接到被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。当连接基团lg直接连接至该部分时，不存在任选的连接部分(“l”)，且n为0。当连接基团lg间接连接至该部分时，存在连接部分l，且n为1。连接部分l可以具有线性部分，其中线性部分的主链可以包括1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和/或磷原子的任何组合的非氢原子，其受本领域中已知的化学键合的限制。它可以被可以选自醚、氨基、羰基、酰氨基和/或膦酸酯基、亚芳基、亚杂芳基或杂环基的一个或多个部分的任何组合所中断。在一些实施方案中，连接部分l的主链可以包括10至20个原子。在其他实施方案中，连接部分l的主链可以包括约5个原子至约200个原子；约10个原子至约80个原子；约10个原子至约50个原子；或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，主链原子均为碳原子。[0336]在一些实施方案中，可以在多步法中向衬底的表面添加被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分，并且该部分具有上文所示的式2的结构。该部分可以是上文所述的任何部分。[0337]在一些实施方案中，偶联基团cg表示由反应性部分rx和反应性配对部分rpx(即，被配置为与反应性部分rx反应的部分)的反应所得到的基团。例如，一种典型的偶联基团cg可以包括羧酰氨基基团，其是氨基与羧酸衍生物(例如，活化的酯、酰氯等)反应的结果。其他cg可以包括亚三唑基、羧酰氨基、硫代酰氨基、肟、巯基、二硫化物、醚或烯基，或者可以在反应性部分与其相应的反应性配对部分反应时形成的任何其他合适的基团。偶联基团cg可以位于连接基团l的第二末端(即，邻近被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分的末端)，连接基团l可以包括如上文所述的元素的任何组合。在一些其他实施方案中，偶联基团cg可以中断连接基团l的主链。当偶联基团cg是亚三唑基时，它可以是由click偶联反应产生的产物并且可以进一步被取代(例如，二苯并环辛烯基稠合的亚三唑基)。[0338]在一些实施方案中，使用化学气相沉积将涂层材料(或表面修饰的配体)沉积在微流体装置的内表面上。可以任选地改进气相沉积工艺，例如，通过暴露于溶剂浴、超声处理或其组合而预清洁盖110、微流体管路材料116和/或衬底(例如，dep配置的衬底的电极活化衬底206的内表面208，或ew配置的衬底的支撑结构104的介电层)。替代地或另外地，这种预清洁可以包括在氧等离子体清洁剂中处理盖110、微流体管路材料116和/或衬底，其可以去除各种杂质，同时引入经氧化的表面(例如，表面上的氧化物，其可以如本文所述进行共价修饰)。或者，可以使用液相处理，例如盐酸和过氧化氢的混合物或硫酸和过氧化氢的混合物(例如，食人鱼溶液，其可以具有约3:1至约7:1的硫酸与过氧化氢的比率)代替氧等离子体清洁剂。[0339]在一些实施方案中，在微流体装置200已经被组装以形成限定微流体管路120的外壳102之后，使用气相沉积来涂覆微流体装置200的内表面。不希望受理论的限制，将这样的涂层材料沉积在完全组装的微流体管路120上可能有益于防止由微流体管路材料116和电极活化衬底206介电层和/或盖110之间变弱的结合所引起的分层。在采用两步法的实施方案中，可以通过如上文所述的气相沉积引入表面修饰配体，随后引入被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。该随后的反应可以通过在溶液中将表面修饰的微流体装置暴露于合适的偶联剂来进行。[0340]图2h描绘了微流体装置290的横截面视图，该微流体装置290具有提供经调节的表面的示例性共价连接的涂层材料。如所示，涂层材料298(示意性地示出)可以包括与底座286(其可以是dep衬底)的内表面294和微流体装置290的盖288的内表面292两者共价结合的紧密堆积的分子单层。涂层材料298可以被设置在邻近且向内朝向微流体装置290的外壳284的基本上所有内表面294、292上，在一些实施方案中并且如上文所讨论的，包括用于定义微流体装置290内的管路元件和/或结构的微流体管路材料的表面(未示出)。在可选的实施方案中，涂层材料298可以仅被设置在微流体装置290的一个或一些内表面上。[0341]在图2h所示的实施方案中，涂层材料298可以包括单层有机硅氧烷分子，每个分子经由甲硅烷氧基连接部分296共价键合到微流体装置290的内表面292、294。可以使用任何上文所讨论的涂层材料298(例如，烷基封端的、氟代烷基封端的部分、peg封端的部分、葡聚糖封端的部分或含有用于有机硅氧基部分的正电荷或负电荷的末端部分)，其中末端部分被设置在其朝向外壳的末端(即，涂层材料298的单层的未与内表面292、294结合并且邻近外壳284的部分)。[0342]在其他实施方案中，用于涂覆微流体装置290的内表面292、294的涂层材料298可以包括阴离子、阳离子或两性离子部分，或其任何组合。不希望受理论的限制，通过在微流体管路120的外壳284的内表面上提供阳离子部分、阴离子部分和/或两性离子部分，涂层材料298可以与水分子形成强的氢键，使得所产生的水合水充当将生物微物体与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。另外，在涂层材料298与涂覆剂结合使用的实施方案中，涂层材料298的阴离子、阳离子和/或两性离子可以与存在于外壳284中的介质180(例如，涂覆溶液)中的非共价涂覆剂(例如，溶液中的蛋白)的带电荷部分形成离子键。[0343]在其他实施方案中，涂层材料可以包含或经化学修饰以在其朝向外壳的末端提供亲水涂覆剂。在一些实施方案中，涂层材料可以包括含亚烷基醚的聚合物，例如peg。在一些实施方案中，涂层材料可以包括多糖，例如葡聚糖。与上文所讨论的带电荷部分(例如，阴离子、阳离子和两性离子部分)一样，亲水涂覆剂可以与水分子形成强的氢键，使得所得的水合水充当将生物微物体与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。[0344]适当的涂层处理和修饰的进一步细节可以在2016年4月22日提交的美国专利申请系列号15/135,707中找到，其通过引用整体并入。[0345]用于在微流体装置的室内维持细胞活力的另外的系统组件。为了促进细胞群的生长和/或扩增，可以通过系统的另外的组件提供有利于维持功能细胞的环境条件。例如，此类另外的组件可以提供营养物、细胞生长信号传导物质、ph调节、气体交换、温度控制和从细胞中除去废产物。[0346]测定由生物微物体分泌的被分析物。在一些实施方案中，本公开提供了用于对室中存在的生物分子进行量化的方法、系统和装置。在一些实施方案中，生物分子是由生物细胞或任何其他能够产生分泌的被分析物的生物微生物分泌的被分析物。[0347]在生物生产工业中，在采用目前可得的仪器和工作流程时，一个严重的问题是识别具有期望水平的生产水平和生长习性的克隆群的费用、时间和困难。例如，开发新的抗体生产线可能需要数月的工作并且在人员、设备和材料上花费数百万美元。如本文所述，在扩增群中非常早期(例如在接种个体创建细胞(foundingcell)后3、4、5、6或7天)筛选和识别微流体装置内有希望的克隆的能力可以提供显著的时间和成本优势。申请人已经发现，如本文所述的纳米流体环境，特别是基于室的纳米流体环境，提供了示例性的克隆群彼此分离，提供从每个单独的克隆群获得测定结果而没有来自位于微流体装置内的其他克隆群的污染的能力。还已经发现，使用本文所述的方法确定分泌的被分析物的相对或绝对量的测定，即使在克隆扩增的早期阶段进行，也可以在更典型的宏观级的扩增(例如，摇瓶等)时与期望的分泌的被分析物的生产相关联。此外，在这样的早期阶段筛选单个克隆的能力还可以允许识别满足特定的生长速率和/或更强大生产的要求的期望克隆(例如，高度生产性克隆，其对培养环境中的物质(例如代谢废物或耗尽的营养物)的水平更具抵抗力)。[0348]申请人发现的另一个优点是，可以在不使用过多资源的情况下更充分地探索多个细胞作为克隆群的潜在创建细胞，因为本文描述的纳米流体室(例如，室)允许同时以极小的体积同时生长/测定多达数千个个体的创建细胞。[0349]另外，本文描述的纳米流体环境允许通过来自重复测定的反馈来检查特定条件对细胞的影响。例如，与细胞分泌产物(本文的方法中的被分析物)的大规模生产更密切相关的条件和材料(例如培养基)可以用于发现和表征最合适的克隆用于进一步检查。在另一个实例中，可以以更可重复的方式检查用于b细胞抗体刺激的不同刺激方案，并且可以对其进行测定以便更一致地评估一种方案相对于另一种方案的益处。[0350]使用扩散谱进行检测和量化。如本文所述，可以使用与分泌的被分析物结合的报道分子来量化生物微物体的分泌的被分析物的量。报道分子包括与待量化的分泌的被分析物结合的结合组分和用于检测报道分子的量的信号组分。报道分子在其未结合状态(例如，未与分泌的被分析物结合)的扩散速率高于其结合状态(例如，与分泌的被分析物的一个或多个分子结合)。在一些实施方案中，未结合的和结合的报道分子之间的扩散速率的差异将是报道分子所结合的分泌的被分析物分子的大小的函数。在一些实施方案中，报道分子可以以使扩散速率减慢的构象与分泌的被分析物结合。例如，报道分子可以以这样的构象与分泌的被分析物的多个拷贝结合：其中分泌的被分析物聚集并且部分地由于其构象而缓慢扩散。本文描述的方法利用报道分子(未结合的)与结合的报道分子:被分析物复合物(rmsa)之间的扩散速率的差异来量化分泌的被分析物的量。[0351]在微流体通道中的流动条件下的扩散测定。图4a-4c示出了根据本公开的一些实施方案的测定。在图4a中，通过使在流242内使含有一定浓度的报道分子412的流体流入到微流体装置400的通道122中，将报道分子412(每个具有可检测的标记物)引入到微流体通道122中。室424、426、428各自与包含不同数目的分泌生物被分析物410的细胞402、404、406的微流体通道122流体连接。室424、426、428中的每一个包括连接区域436和分离区域440(仅为了清楚起见，室424是如此标记的唯一的坞)。连接区域436和分离区域440具有如上文所述的特性，并且限制被引入到通道122中的物质的接触(例如，在分离区域440内，在通道122内流动的物质可以仅通过扩散进入分离区域，而不是直接流入分离区域中)。在图4a所示的时间点，分泌的被分析物410的分子在细胞附近。[0352]图4b示出了在稍后的时间点与图4a中的微流体装置相同的区域。报道分子412可以在通道122和室424、426、428内快速扩散，使得报道分子412的浓度在通道122和室424、426、428的内部之间平衡。如图4b中所示，报道分子412已达到稳态浓度，以在室424、426、428内基本均匀。含有报道分子412的介质的流动242被不含报道分子412的介质的流动242代替，并且通道122不含有显著量的报道分子。[0353]当每个室424、426、428内的报道分子412接触分泌的被分析物410的分子时，报道分子412可以与被分析物410结合，形成报道分子:被分析物复合物414，并提供局部可检测信号，该信号与分泌的被分析物410的量有关。随着流动242的继续，报道分子扩散出室，进入通道122并从微流体装置输出。然而，如图4b所示，报道分子:被分析物复合物410的扩散比未结合的报道分子412的扩散慢，因为它具有更大的分子量(和有效尺寸)并且有差异地不会那么快速地从室424、426、428中扩散出来。[0354]图4c示出了在更后的时间点与图4a和4b中的微流体装置相同的区域，在该时间点分泌的被分析物410和报道分子:被分析物复合物414从分泌的被分析物410的来源(例如，细胞402、404、406)扩散到通道122。流动242在通道122内继续，从而允许报道分子412比报道分子:被分析物复合物410更快地扩散出每个室424、426、428。[0355]报道分子:被分析物复合物扩散得更慢，因为分泌的被分析物分子410可以具有比报道分子412更大的分子量(和相关的在溶液中的有效尺寸)。在分泌的被分析物是抗体并且报道分子是肽或适体的实施方案中，分子量的差异是显著的。在任何情况下，结合的报道分子:被分析物复合物414的重量(并且相应的，大小)大于未结合的报道分子412的重量，因此报道分子:被分析物复合物414可以比未结合的报道分子412更慢地扩散，相对于未结合的报道分子412所提供的均匀信号，其提供不同的扩散谱和相关的可检测信号。另外，生物微物体502、504、506继续分泌被分析物410，提供更多的靶标以与仍然位于室524、526、528内的报道分子412结合。可以选择一个时间点，其中未结合的报道分子正在或已经从室中扩散出来的百分比超过阈值，允许对基本上或主要仅来自每个室424、426、428内的报道分子:被分析物复合物414的可检测信号成像。在一些实施方案中，当已从室中扩散出来的未结合的报道分子412的量为约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或由前述值中的两个所限定的任何范围时，获取测定图像。替代地或另外地，在一些实施方案中，当已从室中扩散出来的未结合的报道分子412的量比已从室中扩散出来的结合的报道分子:被分析物复合物414的量高约1.25x、1.5x、2.0x、2.5x、3.0x、3.5x、4.0x、4.5x、5.0x、7.5x、10x、25x、50x或100x时，获取测定图像。[0356]在测定图像中获得的可检测信号可以与室中生物微物体的数目成比例。室424被示出为含有6个生物微物体，室426被示出为含有4个生物微物体，并且室428被示出为含有2个生物微物体，并且在一些实施方案中，来自各个室的测定信号可以与那些细胞数目成比例。在一些实施方案中，被分析物的分泌可以取决于测定信号获取时间的细胞周期状态，并且来自多个室中的每一个的信号可能与每个室内的细胞数目基本上不成比例。另外，如图4c所示，虽然所有细胞402、404、406均分泌被分析物410，但不同细胞群(例如，不同克隆)可以以不同的速率分泌生物被分析物410。因此，即使当针对每个室中存在的细胞402、404、406的数目进行归一化时，产生的被分析物410的量(以及从报道分子:被分析物复合物414检测到的扩散谱信号的所得强度)也可能在室与室之间不相同。可以在该时间段内获得一个或多个测定图像，其可以用于表征成像的室424、426、428内的分泌的被分析物410的量。下文描述了为了得到所产生的分泌的被分析物410的量的相对或绝对量化而进行的分析。[0357]如上所述，报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物扩散得更慢，因为分泌的被分析物分子可能比报道分子具有更大的分子量(以及溶液中的相关有效大小)。在分泌的被分析物为抗体且报道分子为肽或适体的实施方案中，分子量的差异显著。在任何情况下，结合的rsma复合物的重量(以及相应的大小)大于未结合的报道分子的重量，因此，rsma复合物可以扩散得比未结合的报道分子慢，相对于未结合的报道分子提供的均匀信号，它提供了独特的扩散谱和相关的可检测信号。[0358]未结合的报道分子和rmsa复合物之间在分子量差异的加入(keyingin)可能会影响本文讨论的用于涉及小分子量分子(分泌的小分子量被分析物)的产生的工作流程的一些测定方法的兼容性。由于扩散速率必然与所讨论组分的重量/大小有关，并且不同的扩散谱允许收集有价值的可检测信号，因此当结合由细胞分泌的小分子量分子时，如何减缓测定试剂的扩散似乎并不明显。因此，这可能导致结合的荧光物质和游离的荧光物质之间的扩散速率没有明显差异，因此似乎没有明确的途径来获得必要的扩散谱来收集必要的可检测信号。通过克服这个问题，本文所公开的各种实施方案可以涉及例如小代谢物、生物燃料或其他受关注的小分子的分泌来实现。[0359]测量小分子的产生可以例如通过根据各种实施方案反转细胞系发育测定来完成，其中较亮的荧光室将指示不是最高产生的细胞系，而是较弱的产生系。在一个实例中，已知与小分子靶结合的分子(例如，大分子量蛋白或蛋白复合物，称为“锚”)将首先与感兴趣靶的荧光版本在芯片外结合。这种荧光复合物(锚 荧光靶)将在整个芯片中，包括在含有可能分泌靶的非荧光版本的细胞的室中平衡。在这些未标记靶的存在下，结合动力学将驱动标记靶与室内浓度远远更高的未标记靶的交换。在冲洗干净通道一段时间后，不被锚结合的荧光靶将迅速从室扩散。因此，当读取该冲洗后的荧光水平时，较暗的观察室将等同于那些分泌更多小分子量靶的室。[0360]图33a-c示出了根据各种实施方案的该方法的实例。在图33a中，将具有结合的荧光分子3720的高分子量锚蛋白3710(例如，抗体)(标记靶)引入含有细胞3760和分泌的未标记靶3730的室3750。在图33b中，结合动力学驱动标记靶3720与未标记靶3730的交换。例如，假设目的是寻找产生最高量的fciii肽的细胞。为了实现这一点，鉴于上述情况，可以添加预结合在芯片外的锚(anchoroffchip)上的标记的fciii。在将这种标记靶引入室后，随着时间的推移，将在室中发生细胞分泌的未标记fciii和在锚上预平衡的标记的fciii之间的交换。最后，在图33c中，交换完成，并且可以冲洗通道以允许未结合的荧光靶扩散到坞外。由此，可以使用标准图像捕捉和分析(如本文所述)来观察荧光水平。然而，与寻找指示高分泌水平的更明亮的室相反，由于未结合的荧光靶被移除，较暗的室分泌更多的小分子靶。[0361]在微流体通道中的非流动条件下的扩散测定。图5a至5c示出了根据本公开的一个实施方案的测定。在图5a中，通过使含有一定浓度的报道分子412的流体流入通道122，将各自具有可检测的标记物的报道分子412引入到微流体装置500的微流体通道122中。图5a还示出了与含有各种数目的分泌生物被分析物410的细胞502、504、506的微流体通道122流体连接的室524、526、528。室524、526、528中的每一个包括连接区域536和分离区域540(为了清楚起见，室524是唯一标记的坞)。连接区域536和分离区域540具有如上文所述的特性，并且限制引入到通道122中的物质的接触(例如，在分离区域540内，在通道122内流动的物质可以仅通过扩散而不是通过直接流入分离区域而进入分离区域)。在图5a所示的时间点，分泌的被分析物410的分子在细胞附件。[0362]图5b示出了在稍后的时间点与图5a中的微流体装置相同的区域。报道分子412可以在通道122和室524、526、528内快速扩散，使得报道分子412的浓度在通道122和室524、526、528的内部之间平衡。如图5b中所示，报道分子412已经达到稳态浓度平衡，使得未结合的报道分子412的浓度在室524、526、528和通道122中可以是基本上均匀的。当报道分子412的浓度平衡到室524、526、528中时，停止通道中的流动。当报道分子412接触分泌的被分析物410的分子时，报道分子412可以与被分析物410结合，形成报道分子:被分析物复合物414，并提供与分泌的被分析物410的量相关的局部可检测信号。[0363]图5c示出了在更后的时间点与图5a和5b中的微流体装置相同的区域，在该时间点分泌的被分析物410和报道分子:被分析物复合物414从分泌的被分析物410的来源(例如，细胞502、504、506)扩散到通道122。在该时间点，通道122中没有流动。[0364]如上文所述，分泌的被分析物分子410可以具有比报道分子412更大的分子量(和相关的在溶液中的有效尺寸)。因此，报道分子:被分析物复合物414可以比未结合的报道分子412更慢地扩散，相对于未结合的报道分子412所提供的均匀信号，其提供不同的扩散谱和相关的可检测信号。另外，生物微物体502、504、506继续分泌被分析物410，提供更多的靶标以与仍然被位于室524、526、528内的报道分子412结合。[0365]扩散谱和/或相关的信号可以与室中的生物微物体的数目成比例。室524被示出为含有6个生物微物体，室526被示出为含有4个生物微物体，且室528被示出为含有2个生物微物体。然而，在一些其他实施方案中，各个室524、526、528中的细胞502、504、506可以以大约相同的速率分泌被分析物410，并且从报道分子:被分析物复合物414检测到的信号的所得强度可以与每个室中存在的细胞502、504、506的数目成比例。然而，被分析物的分泌可以取决于测定信号获取时间的细胞周期状态。此外，如图5c所示，虽然所有细胞502、504、506均分泌被分析物，但不同细胞群(例如，不同克隆)可以以不同的速率分泌生物被分析物410。因此，即使当针对每个室中存在的细胞502、504、506的数目进行归一化时，产生的被分析物410的量(以及从报道分子:被分析物复合物414检测到的扩散谱信号的所得强度)也可能在室与室之间不相同。可以在该时间段内获得一个或多个测定图像，其可以用于表征成像的室524、526、528内的分泌的被分析物410的量。下文描述了为了得到所产生的分泌的被分析物410的量的相对或绝对量化而进行的分析。[0366]分泌的被分析物。由生物微物体分泌的被分析物可以是蛋白、糖、核酸、分子量小于3kd的有机分子、囊泡、病毒及其任何组合。分泌的被分析物可以是天然表达的被分析物(例如，野生表达的)或可以是生物工程被分析物(例如，由基因插入、缺失、修饰等产生的产物)。作为核酸的分泌的被分析物可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸，可以包括天然或非天然核苷酸。作为病毒的分泌的被分析物可以是病毒颗粒、载体或噬菌体。作为糖的分泌的被分析物可以是单糖、二糖或多糖。糖的非限制性实例可以包括葡萄糖、海藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖、核糖、黄原胶或壳聚糖。分泌的小有机分子可以包括但不限于生物燃料、油、聚合物或药物，例如大环内酯类抗生素。作为蛋白的分泌的被分析物可以是抗体或抗体片段。作为蛋白的分泌的被分析物可以是血液蛋白，例如白蛋白、球蛋白(例如，α2-巨球蛋白、丙种球蛋白、β-2微球蛋白、结合珠蛋白)、补体蛋白(例如，组分3或4)、转铁蛋白、凝血酶原、α1抗胰蛋白酶等；激素，如胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、生长激素、生长因子(如fgf、hgf、ngf、egf、pdgf、tgf、促红细胞生成素、igf、tnf)、卵泡刺激素、黄体生成素、瘦素等；纤维蛋白，例如丝或细胞外基质蛋白(例如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白、多能蛋白聚糖、骨唾液蛋白)；酶，例如金属蛋白酶(例如，基质金属蛋白酶(mmp))或其他类型的蛋白酶(例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬酰胺肽裂解酶)、淀粉酶、纤维素酶、过氧化氢酶、果胶酶等；细菌、酵母或原生动物蛋白；植物蛋白；或病毒蛋白，如衣壳蛋白或包膜蛋白。作为蛋白的分泌的被分析物可以是抗体、抗体片段、酶(包括但不限于蛋白水解酶)、工程化(通常为细胞内蛋白)蛋白，例如白蛋白，和/或结构蛋白，包括但不限于蚕丝或蜘蛛丝)。该列举不是限制性的，并且可以通过该方法评估任何可以被工程化以被分泌的蛋白。分泌的被分析物可以是抗体-药物缀合物。可以具有蛋白、糖、核酸、分子量小于3kd的有机分子和/或病毒的组合的分泌的被分析物的非限制性实例可以包括蛋白聚糖或糖蛋白。[0367]报道分子及其特性。报道分子可以包括被设计用于与分泌的被分析物结合的结合组分，并且还可以包括可检测的标记物。结合组分可以是被配置成与分泌的被分析物结合的任何合适的结合配偶体。结合组分可以是蛋白、肽、核酸或分子量小于3kd的小有机分子。例如，结合组分可以是与另一个核酸序列特异性结合的核酸序列或与蛋白特异性结合的肽(例如识别特定抗体的表位)。在一些实施方案中，结合组分可以与生物微物体的分泌的被分析物家族非特异性结合。例如，结合组分可以是与igg结构域特异性结合的肽或与核酸序列家族中存在的结构域结合的核酸。在一些实施方案中，报道分子可以是多价的，其包含多于一个的结合组分以与分泌的被分析物的多于一个的拷贝结合或与分泌的被分析物的家族的多于一个成员结合。为了便于讨论，如本文所用的术语分泌的被分析物可以指特定的分泌的被分析物分子或分泌的被分析物家族。因此，rmsa复合物的化学计量可以变化。例如，与分泌的被分析物的一个拷贝结合的报道分子可以具有1:1化学计量的rmsa复合物。或者，rmsa复合物可以具有2:1、3:1、4:1、2:2、4:2或其他化学计量的报道分子:分泌的被分析物。报道分子可以具有任何合适的分子量，条件是由报道分子:被分析物复合物的扩散特征所定义的表观“大小”(其取决于分子量)比报道分子本身足够“大”，以观察未结合的报道分子和rmsa复合物之间的差异性扩散。报道分子的分子量可以是分泌的被分析物的分子量的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或相同。在一些实施方案中，报道分子的分子量小于分泌的被分析物的分子量的约50％、40％、30％、20％、10％。rmsa复合物的分子量可以比报道分子的分子量高至少2x、4x、10x、20x、30x、40x、50x或其间的任何数。rmsa复合物的分子量可以比未结合的报道分子的分子量高2倍、4倍或50倍。[0368]用于一类分泌的被分析物:抗体的报道分子。适于与抗体结合的报道分子包括被配置成与igg的区域结合的蛋白、肽和适体。表1中示出了适于在报道分子内使用以检测抗体的结合组分的非限制性列表。[0369]表1：化合物作为用于检测抗体的报道分子的结合组分。[0370]id.no:10)的结构。[0375]cpd7具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-xaa7-xaa8-xaa9-xaa10-xaa11-leu-val-trp-cys-xaa16-xaa17-xaa18-xaa19-xaa20的结构，(seqid.no:1)，其中：xaa1是任何氨基酸或不存在；xaa2是任何氨基酸或不存在；xaa3是任何氨基酸或不存在；xaa4是任何氨基酸或不存在；xaa5是cys或ser；xaa6是任何氨基酸；xaa7是任何氨基酸；xaa8是任何氨基酸；xaa9是任何氨基酸；xaa10是任何氨基酸；xaa11是任何氨基酸；xaa16是任何氨基酸或不存在；xaa17是任何氨基酸或不存在；xaa18是任何氨基酸或不存在；xaa19是任何氨基酸或不存在；且xaa20是任何氨基酸或不存在。[0376]cpd8具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-xaa7-xaa8-xaa9-gly-glu-leu-val-trp-cys-xaa16-xaa17-xaa18-xaa19-xaa20的结构，(seqid.no:2)，其中：xaa1是任何氨基酸或不存在；xaa2是任何氨基酸或不存在；xaa3是任何氨基酸或不存在；xaa4是任何氨基酸或不存在；xaa5是cys或ser；xaa6是任何氨基酸；xaa7是任何氨基酸；xaa8是任何氨基酸；xaa9是任何氨基酸；xaa16是任何氨基酸或不存在；xaa17是任何氨基酸或不存在；xaa18是任何氨基酸或不存在；xaa19是任何氨基酸或不存在；且xaa20是任何氨基酸或不存在。[0377]cpd9具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-xaa7-xaa8-xaa9-gly-glu-leu-val-trp-cys-xaa16-xaa17-xaa18-xaa19-xaa20的结构，(seqid.no:3)，其中：xaa1是任何氨基酸或不存在；xaa2是任何氨基酸或不存在；xaa3是任何氨基酸或不存在；xaa4是任何氨基酸或不存在；xaa5是cys或ser；xaa6是ala、ser或thr；xaa7是trp或tyr；xaa8是his或trp；xaa9是leu或met；xaa16是任何氨基酸或不存在；xaa17是任何氨基酸或不存在；xaa18是任何氨基酸或不存在；xaa19是任何氨基酸或不存在；且xaa20是任何氨基酸或不存在。[0378]cpd10具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-xaa7-xaa8-xaa9-gly-glu-leu-val-trp-cys-xaa16-xaa17-xaa18-xaa19-xaa20的结构，(seqid.no:4)，其中：xaa1是任何氨基酸或不存在；xaa2是任何氨基酸或不存在；xaa3是任何氨基酸或不存在；xaa4是ser、arg或asp；xaa5是cys或ser；xaa6是ala、ser或thr；xaa7是trp或tyr；xaa8是his或trp；xaa9是leu或met；xaa16是glu、ser、thr或val；xaa17是任何氨基酸或不存在；xaa18是任何氨基酸或不存在；xaa19是任何氨基酸或不存在；且xaa20是任何氨基酸或不存在。[0379]cpd11具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-xaa7-xaa8-leu-val-trp-cys-xaa13的结构，(seqid.no:5)，其中：xaa1是任何氨基酸或不存在；xaa2是cys或ser；xaa3是任何氨基酸；xaa4是任何氨基酸；xaa5是任何氨基酸；xaa6是任何氨基酸；xaa7是任何氨基酸；xaa8是任何氨基酸；且xaa13是任何氨基酸或不存在。[0380]cpd12具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-gly-glu-leu-val-trp-cys-xaa13的结构，(seqid.no:6)，其中：xaa1是任何氨基酸或不存在；xaa2是cys或ser；xaa3是任何氨基酸；xaa4是任何氨基酸；xaa5是任何氨基酸；xaa6是任何氨基酸；且xaa13是任何氨基酸或不存在。[0381]cpd13具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-gly-glu-leu-val-trp-cys-xaa13的结构，(seqid.no:7)，其中：xaa1是任何氨基酸或不存在；xaa2是cys或ser；xaa3是ala、ser或thr；xaa4是trp或tyr；xaa5是his或trp；xaa6是leu或met；且xaa13是任何氨基酸或不存在。[0382]cpd14具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-gly-glu-leu-val-trp-cys-xaa13的结构，(seqid.no:8)，其中：xaa1是ser、arg或asp；xaa2是cys或ser；xaa3是ala、ser或thr；xaa4是trp或tyr；xaa5是his或trp；xaa6是leu或met；且xaa13是glu、ser、thr或val。[0383]结合组分不限于对igg具有高亲合力的物质(例如，对于表1的cpd1和cpd2已知的纳摩尔浓度)。在一些实施方案中，具有大于约100毫摩尔浓度或1微摩尔浓度的亲合力的结合组分可以成功地用于该基于扩散的测定中以检测抗体。[0384]对于其他类型的分泌的被分析物，可以使用不同类型的报道分子的结合组分。例如，可以使用不可逆蛋白酶抑制剂来检测蛋白水解酶，例如用于丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶的氟甲基酮抑制剂。可以使用工程化的被分析物的适体，如糖类或大环内酯类抗生素。可以使用抗体或其片段来检测白蛋白、结构蛋白或大环内酯类抗生素。如本领域已知的，可以使用与分泌的被分析物的任何合适的结合组分。[0385]报道分子:纯化标签。目前的细胞系发育测定可依赖于抗体中普遍存在的fc区。然而，许多治疗性蛋白和为合成生物学应用而产生的蛋白缺乏该部分，因此可能与某些细胞系发育测定不兼容。这些非抗体蛋白中的许多已经包含或可以被设计为包含遗传编码的残基，这些残基引入用于纯化的短氨基酸“标签”。[0386]根据各种实施方案，可以将当前的芯片上(on-chip)滴度测定改进为使用对纯化标签(即用于纯化的短氨基酸“标签”)特异的荧光标记的小分子。这种改进允许解决目前许多细胞系发育测定无法触及的许多蛋白类型。[0387]在一个实例中，将六组氨酸(his6)标签编码到感兴趣蛋白的n端或c端；该标签随后用于通过使用ni-nta(nα,nα-双(羧甲基)-l-赖氨酸，镍(ii)复合物)柱纯化his6标记的蛋白，该柱以高亲和力特异性结合六组氨酸。这种化学相互作用可用于用荧光标记的物质(例如，来自例如sigma的ni-ntaatto缀合物)标记his6标签。业内公知，ni-ntaatto缀合物可以提供对his标记的融合蛋白的特异性和高灵敏度检测。与atto染料缀合的ni-ntaatto复合物对多聚组氨酸标签具有特异性，并且可以以最小的交叉反应进行。具体地，每个ni-nta部分与一对组氨酸侧链结合，并且每个ni-nta可以用荧光团标记。此外，两个或三个ni-nta基团可以交联在一起以增加结合亲和力。[0388]低分子量分泌的报道复合物。如上所述，测量小分子的产生(低分子量分泌)可以例如通过根据各种实施方案反转细胞系发育测定来完成，其中较亮的荧光室将指示不是最高产生的细胞系，而是较弱的产生系。为了提供这个，已知与小分子靶结合的分子(例如，大分子量蛋白或蛋白复合物，称为“锚”)可以首先与感兴趣靶的荧光版本在芯片外结合。这种荧光报道分子复合物(锚 荧光靶)将在整个芯片中，包括在含有可能分泌靶的非荧光版本的细胞的室中平衡。在这些未标记靶的存在下，结合动力学将驱动标记靶与室内浓度远远更高的未标记靶的交换。在冲洗干净通道一段时间后，不被锚结合的荧光靶将迅速从室扩散。因此，当读取该冲洗后的荧光水平时，较暗的观察室将等同于那些分泌更多小分子量靶的室。[0389]可检测的标记物。报道分子还可包括可见的、发光的、磷光的或荧光的可检测的标记物。在一些实施方案中，可检测的标记物可以是荧光标记物。可以使用任何合适的荧光标记物，包括但不限于荧光素、罗丹明、花青、菲或任何其他类别的荧光染料标记物。有用的荧光染料标记物的一些实例包括荧光素(可用作用于标记报道分子的结合组分的硫代异氰酸酯活性物质)、alexafluor594((af594，thermofisherscientific，目录号a20004(nhs酯))mw819.8，ex/em590/617nm)或hilytefluortm555(anaspecinc.，目录号as-81250)mw869，ex/em550/566nm(cy3滤光器)。在一些实施方案中，报道分子，例如适体或捕捉寡核苷酸，可以包括fret标记的寡核苷酸，其可以包括但不限于分子信标、双杂交探针、scorpion或eclipse探针。fret标记的寡核苷酸探针或探针对可以包括荧光标记物，其在发生杂交事件之前不发荧光。在一些实施方案中，可检测的标记物直接或间接地共价连接至报道分子的结合组分。在一些其他实施方案中，捕捉寡核苷酸可以是报道分子的结合组分，并且内源或外源荧光染料可以是可检测的标记物，使得报道分子的可检测的标记物可能是不可检测的，直到捕捉寡核苷酸与被分析物(例如，嵌入染料)结合。在一些实施方案中，报道分子的可检测的标记物直到rmsa复合物形成后才可检测到，因为可检测的信号转移到结合前不存在的新波长。在一些实施方案中，例如共价连接到报道分子的结合组分的嵌入染料。在其他实施方案中，可检测的标记物可以是同位素。[0390]在其他实施方案中，可检测的标记物和结合组分是单个部分，例如提供可检测信号的蛋白或核酸(例如自身可检测的蛋白，例如绿色荧光蛋白(gfp)，或核糖核酸适体，例如“spinach”，它是与gfp等同的rna)。spinach含有3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮(dfhbi)作为荧光可检测的标记物。[0391]扩散模拟。本文描述的方法利用与分泌的被分析物从室的分离区域到流动区域(例如，微流体通道)的差异扩散相关的模型和观察。许多软件程序可以用于模拟生物微物体的分泌的被分析物的行为，包括但不限于comsol、matlab和/或各种数字模拟和计算机辅助设计工具。[0392]图6示出了一种类型的室的模型，其具有一个生物细胞(602)，该细胞被置于室624的底部，在分离区域640内，在远离室624向通道122的开口的点处。扩散线610示出了细胞602的分泌的被分析物从分离区域640通过连接区域636扩散到通道122的轨迹。可以看出，当扩散物质通过连接区域时，扩散线集中并线性地流动到通道122。扩散速率由分泌的被分析物的扩散系数来定义，并可以被模拟如下。[0393]特定的分泌的被分析物的扩散系数d被定义为：[0394]d＝(1/f)ktꢀꢀ(公式1)[0395]其中f是摩擦系数，k是玻尔兹曼常数，t是绝对温度。摩擦系数f取决于分泌的被分析物在其中扩散的溶剂的粘度(η)以及分泌的被分析物的大小和形状。具有球形球的分泌的被分析物具有最小化的摩擦系数，但是非对称的形状，例如具有确定的结构约束的抗体或其他蛋白，将导致更大的f。另外，如果分泌的被分析物具有与溶剂的相互作用，例如氢键或者与分泌的被分析物缔合的水合水，则摩擦系数也会增加。一些通用的扩散系数如表2所示。[0396]表2：示例性扩散系数。[0397]通用物质ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ扩散系数[0398]水中的小分子(《1kda)ꢀꢀꢀꢀ1-1.5x10-5cm2s-1[0399]小蛋白(《20kda)ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ10-6cm2s-1[0400]分泌的被分析物的扩散可以用以下公式表示：[0401]《x2》＝qidt(公式2)[0402]其中《x2》是均方位移，x是在时间t内从所选择的行程起始点的平均距离。qi的值取决于扩散是否是在1、2或3维下评估的。[0403]利用这些公式，可以模拟报道分子扩散进出具有确定构型的室的时间和rmsa复合物的时间，并且对于分子量为约150kda范围的抗体分泌的被分析物，在图7a和7b中显示了这些时间。在图7b中，曲线712模拟了像分子量为约2.5kda的cpd3这样的小肽的行为，其中小肽被计算为能够在25-30分钟内从通道扩散进入室并在其内平衡，所述室的配置类似于室424、524、624等(分别参见图4a-c、5和6)。相反，曲线714模拟了大得多的分子量为约45kda的cpd1的行为。该较大的分子提供了更多与溶剂相互作用的机会，并且在45-50分钟之间达不到完全平衡。[0404]在图7b中，示出了四种不同物质在从被配置为类似于424、624的室中扩散出来方面的行为。在该图中，曲线716示出了针对小肽cpd3计算的从被配置为类似于室424、524、624等的室中扩散出来的速率。将小肽cpd3基本上从室中消除约25分钟。相反，当cpd3与分泌的被分析物igg(ms150kda)结合时，曲线722(三角形)显示了计算的含有cpd3的rmsa复合物的扩散行为，其中在60分钟后保留少量rmsa复合物。曲线718(菱形)显示了计算的cpd1(蛋白a，45kda的蛋白)的扩散行为，其因此需要超过50分钟才能基本上完全扩散。当该蛋白与分泌的抗体(mw150kda)复合时，曲线724(虚线片段)显示出与cpd3:igg复合物相似的缓慢扩散速率，并且在60分钟后仍显示复合物保留。[0405]图8a显示了对于报道分子的两种不同的结合组分中的每一种计算的报道分子和rmsa复合物之间的差异。曲线826显示了针对cpd3:cpd3/igg对在室内的最大浓度差异的测定时间优化，以观察由rmsa复合物产生的最大信号和由未结合的报道分子引起的最小信号，这似乎是在微流体通道中恢复的介质流动约15分钟，其将任何扩散的物质从微流体装置中输出。曲线828显示了cpd1的差异曲线，显示了在室内未结合的cdp-1和含有cpd1的rmsa复合物之间的浓度差异，并且显示了最大化的差异在稍后的时间点(在25分钟或更长时间后的某个时间)出现。图8b显示了未结合的cpd1的扩散入(上图)和扩散出(下图)的实验时间，显示了与计算值的合理相关性。这些组模拟和执行实验表明，有可能找到优化的时间点，用于观察基本上来自报道分子:分泌的被分析物复合物的可检测信号，以评估特定室内被分析物的分泌水平。[0406]沿扩散轴的区域的选择。图9a-b和10a-b显示了用于确定一个区域的模拟实验，从该区域中，从测定图像中提取量化测量值(相对或绝对)。在图9a-b中，对扩散流动和来自rmsa复合物的所得荧光信号强度进行模拟，以考虑生物细胞902、904、906在微流体装置900的室924(其类似于室424、524、624)内的位置的影响。对于细胞902，使用距离室的底部(0微米)约25微米的位置对该效果进行模拟，该位置远离室924到通道122的开口；在与室924的底部约100微米的距离处对细胞904进行模拟；且在与室924的底部约180微米的距离处对细胞906进行模拟(参见图9a和图9b的水平轴)。为了模拟的简化，每个细胞被模拟为位于沿着线952所示的朝向室的开口的扩散轨迹的中心轴。这些位置中的每一个位于室的分离区域940内，并且远离室的连接区域936，因此确保从分离区域940内的细胞902、904、906检测到的信号强度不受来自通道122中的流动242的流动效应的影响。图9a的y轴表示报道分子(或等效的rmsa复合物，因为该实验仅依赖于检测到的荧光强度)的归一化浓度。如图9a所示，荧光信号的强度(模拟包括以下约束：902、904、906均以相同的速率产生分泌的被分析物)对于细胞902是最高的，因为荧光标记的复合物比904、906以更单向的方式扩散，这是由于其位置接近室924的底部。细胞904、906具有更大的使标记的rmsa复合物在所有方向上扩散的能力。该模型确定的是可以识别一个区域，其中信号强度对由于被标记物质的浓度(例如，rmsa复合物)的变化而引起的荧光信号强度的变化最敏感，并且对细胞902、904、906位于沿着室924和通道122之间的扩散轴的确切位置(即区域944)最不敏感，如图9a和9b所示。细胞位置不敏感区域944是用于评估室924内的生物微物体的分泌的被分析物的相对或绝对量的受关注区域(aoi)的至少一部分。在一些实施方案中，aoi可以包括室924和/或通道122的附加部分。[0407]针对大细胞群对室进行优化。图10a和10b示出了用于不同配置的室1024的如图9a和9b所示的类似构造的模拟实验。显示了生物细胞1002、1004、1006在微流体装置1000的室1024(类似于室224、226、228)内的位置的影响。对于细胞1002，使用距室底部(0微米)约25微米的位置对该效果进行模拟，该位置远离室1024到通道122的开口；在距室1024的底部约100微米的距离处对细胞1004进行模拟；且在距室1024的底部约180微米的距离处对细胞1006进行模拟(参见图10a和图10b的水平轴)。为了模拟的简化，每个细胞被模拟为位于沿着线1052所示的朝向室的开口的扩散轨迹的中心轴。这些位置中的每一个位于室的分离区域1040内，并且远离室的连接区域1036，因此确保从分离区域1040内的细胞1002、1004、1006检测到的信号强度不受来自通道122中的流动242的流动效应的影响。图10a的y轴表示报道分子(或等效的rmsa复合物，因为该实验仅依赖于检测到的荧光强度)的归一化浓度，并且所示浓度的讨论如上文针对图9a所述。该模型确定的是可以识别一个区域，其中信号强度对由于被标记物质的浓度(例如，rmsa复合物)的变化而引起的荧光信号强度的变化最敏感，并且对细胞1002、1004、1006位于沿着室1024和通道122之间的扩散轴的确切位置(即区域1044)最不敏感，如图10a和10b所示。细胞位置不敏感区域1044是用于评估室1024内的生物微物体的分泌的被分析物的相对或绝对量的aoi的至少一部分。在一些实施方案中，aoi可以包括室1024和/或通道122的附加部分，其位于沿着室1024和通道之间的扩散轴。[0408]在一些实施方案中，可以改变室的几何形状以提供分泌的被分析物的最佳扩散谱。图11a示出了微流体装置1100的一部分，其包括通道122和室1124、1126，所述室1124、1126被设计成提供优化的扩散谱。具体地，室1124、1126具有可以容纳大量生物微物体1102的分离区域，这可以用于提供更大的信号强度以用于评估细胞1102的分泌的被分析物的量(相对或绝对)。[0409]在一些实施方案中，室1124的分离区域1140可以容纳从0.1到100nl的体积。在特定实施方案中，如图11b所示，分离区域1140可以容纳6nl的体积。室1124、1126可以容纳多达100、200、300、400或500个微物体。在一些实施方案中，室可以容纳最多300-400个微物体。[0410]室1124、1126各自具有连接区域1136，连接区域1136被配置为将分离区域1140中的生物微物体1102与连接区域1136分离，从而产生足够的距离以使分泌的被分析物扩散远离其来源(例如，分泌被分析物的生物微物体1102之一)。该分离减少了来自rmsa复合物的局部信号的干扰或重叠，所述rmsa复合体仍然在生物微物体1102处或其上缔合(例如，不自由地扩散)，其扩散轨迹沿着预期的扩散轨迹1130的线。通过消除这种重叠，从aoi的至少一部分或整个aoi产生的浓度值将表示来自结合的报道分子在其扩散时的信号。在一些实施方案中，通过连接区域1136相对于分离区域1140的收缩而将连接区域1136与分离区域1140分离。在一些实施方案中，连接区域1136的宽度为10-30微米，长度为40-200微米。在特定实施方案中，连接区域1136的宽度为20微米，长度为100至200微米。[0411]图11b描绘了生物微物体1102的分泌的被分析物从室1124内通过连接区域1136并且向外至通道122的通量线1120和浓度梯度线110。连接区域1136的部分可以被选择为aoi的至少一部分，并且可以是对细胞位置不敏感并且对在测定图像中观察到的强度变化敏感的区域的一部分。[0412]评估受关注区域(aoi)。图12a显示了aoi的示意图，从中提取数据用于确定来自生物微物体的分泌的被分析物的相对或绝对量。选择aoi1250以包括：分离区域1240中的区域、(微流体装置1200中的室1224的)连接区域1236中的区域；和通道122的一部分，所有这些都沿着从室1224到通道122的扩散轴对齐。在该实施方案中，在微流体通道122中存在流动242，从而减少了包含在aoi内的通道部分内的任何可检测信号。选择aoi在室内终止的点，以防止与生物物体1202重叠，该生物物体1202分泌被分析物并从其发出可检测信号。如图12a所示，扩散线1210指向连接区域1236，并在进入连接区域1236时与扩散轴对齐。还示出了浓度梯度线1220。[0413]图12b是显示对室1224的测定图像的照片，其具有“327”的标识号1260，这指示其在微流体装置1200内的位置。识别号有助于关联亮视场和荧光图像位置，还有助于用户从选择的室中选择、操作和导出细胞。图12b的室1224具有存在于分离区域(未标出)内的一个生物微物体1202。测定图像清楚地显示了室内大量的荧光信号，其从生物微物体1202发射。显示了aoi1250，其被照相地施加，并沿着扩散轴对齐并沿着扩散轨迹1252居中。aoi是20像素宽，其根据连接区域126的宽度(在图12b中未标出)来选择，并且被分成20个子区域。aoi可以具有到每个子区域的其他像素大小，并且子区域的数目可以从大约1到大约50变化。aoi的子区域1254是aoi的所有子区域中位于距离通道122最远的子区域，但是被选择为不与生物微物体1202重叠。aoi的第二端处的子区域是子区域1258，其位于通道122内。重要的是，子区域1256的组是图9a-b和10a-b的细胞位置不敏感区域944、1044，从中检测到的荧光用于评估室内的生物微物体的分泌的被分析物的相对或绝对量。[0414]图12c示出了在aoi中检测到的荧光的图解表示，其中水平轴上的值表示子区域1(对应于图12b的子区域1254)，其是位于aoi至生物微物体1202的最近端的子区域；且子区域20对应于图12b的子区域1258，其在aoi在通道122中的最近端。在aoi中检测到的荧光的量与分泌的被分析物的量成比例。可以使用各种数学运算来提取关于分泌的被分析物的相对或绝对量的信息，并在下面的部分中详细讨论。[0415]测定图像的归一化。在可以处理测定图像以评估分泌的被分析物的相对或绝对量之前，可以对原始测定图像进行归一化。图13a示出了原始测定图像，其显示诸如光源、光调制子系统(例如dmd)、图像捕捉装置(例如相机)的系统组件的方差(variance)和非线性之类的误差。[0416]用于在流动条件下进行的测定的方法a。在一个实施方案中，可以如下面的公式通过从原始测定图像中的每个像素中减去暗参比图像和信号参比图像校正来对原始测定图像进行归一化：[0417][0418]可以通过在使任何介质流动到装置中之前对微流体装置进行成像来获得暗参比图像。可以通过在每个像素处减去暗参比值来校正自发荧光误差和其他系统误差。信号参比图像可以校正衰减(rolloff)、光漂白误差或相机误差，并且通过使报道分子或仅报道分子流过整个微流体装置以达到报道分子或荧光标记物的平衡浓度而获得。在提取荧光数据用于量化目的之前，可以以这种方式校正原始测定图像中的每个像素。归一化的测定图像显示在图13b中。[0419]用于在非流动条件下进行的测定的一些实施方案的方法b。作为归一化的第一步，如上文所述，从存在结合和未结合的报道分子的微流体装置的图像中减去暗参比图像，以产生“减去暗参比的图像”。[0420]作为第二步，从减去自发荧光的图像中移除或“掩蔽”图13a的原始测定图像中不存在结合和未结合的报道分子的部分(即，限定微流体装置中的室和通道的壁)，以产生“掩蔽的减去暗参比的图像”。如本领域技术人员所理解的，该步骤也可以在减去自发荧光之前进行。[0421]作为产生图13a的归一化的图像的第三步，将掩蔽的减去自发荧光的图像中的每个像素的强度值除以基于掩蔽的减去自发荧光的图像中的所有像素计算的全局平均强度。通过将每个像素的强度值除以全局平均强度，对每个像素生成包含增益校正因子的图像或类似数据结构(例如，矩阵)(“增益校正图像”)。产生增益校正图像的其他方法是本领域技术人员公知的。[0422]作为产生图13a中描绘的归一化的图像的第四步，对增益校正图像进行平滑算法以减少随机噪声。在该方法的一些实施方案中可以不采用该步骤。具体地，对增益校正图像进行盒滤波器平滑算法，该算法使用9像素乘9像素盒滤波器，其在为每个像素生成局部平均值时说明图像的掩蔽部分。如本领域技术人员可以理解的，可以使用其他平滑算法，例如均值滤波、高斯滤波、梯度加权滤波、序列统计滤波、鲁棒平滑滤波、crimmins噪声消除滤波、边缘保持滤波和自适应中值滤波。[0423]作为产生图13b中描绘的归一化的图像的第五步骤，可以将平滑后的增益校正图像乘以减去自发荧光的图像以产生归一化的图像。[0424]这些方法可以以相同或不同的顺序组合任何前述步骤和方法。[0425]用于在非流动条件下进行的测定的一些实施方案的方法c。可以使用另一种使图像归一化的方法，这依赖于通道内未结合的报道分子的基本均匀的浓度，因为其比结合的rmsa复合物的扩散速率更高。可以使用通道的亮度来归一化图像以校正上述误差。[0426]因此，在另一实施方案中，可以使用靠近室的通道中的亮度来获得图13b的归一化图像，以校正微流体装置的区域视图上的亮度量的任何变化。这种归一化方法依赖于以下事实：预期通道中不具有任何存在的被分析物(或任何rmsa复合物)，因此可以使用不具有存在的被分析物的微流体装置的任何区域来执行该方法。[0427]为了基于通道强度进行归一化，作为第一步，针对每个室识别通道r中预期不具有任何存在的被分析物的区域。在一些实施方案中，该区域r可以是对应于室上方的通道区域的预定义的区域r。在其他实施方案中，可以基于其他信息识别每个室的区域r或者基于图像计算每个室的区域r。[0428]对于通道r的每个区域，基于该区域内的像素计算亮度值br。在计算亮度值之前，可以如上所述减去、掩蔽或以其他方式处理用于计算亮度值的图像。在一些实施方案中，br是区域r内的像素的平均亮度值。[0429]在计算每个区域r的平均亮度值br之后，可以将坞和通道的图像划分为一系列区域a，其中每个区域a包含相应的区域r。可以计算该区域，使得区域r位于区域a的中心。在特定的实施方案中，可以通过生成每个区域r的矩心的voronoi图或delauney三角测量来计算区域a。在其他实施方案中，每个区域r不需要在其相应的区域a中居中，并且可以基于分割微流体装置的预定义的区域来计算。对于每个区域a，针对与区域a相关联的区域r，基于针对最亮区域计算的最大亮度值brmax除以亮度值br来计算增益校正因子。增益校正因子可以用于生成增益校正图像，该增益校正图像可以与另一个图像(例如减去自发荧光的图像)相乘以产生归一化的图像。在用于归一化之前，还可以如上文所述地使增益校正因子图像平滑。[0430]测定信号的量化。在一些实施方案中，rmsa的扩散谱可以用于量化室内存在的rmsa复合物的量。扩散谱提供了一系列值(“浓度值”)，其表示rmsa复合物从其源向通道扩散时的浓度。[0431]在识别aoi之后，可以应用其他变换。例如，可以通过丢弃离群值和/或异常像素、其他形式的全局/局部归一化、空间转换以及变换像素的空间(例如，从多维空间到二维空间，或相反)来处理每行中的像素。[0432]根据实施方案，可以以不同的方式使用强度值来计算浓度值。在一些实施方案中，可以在固定点处对aoi进行采样以生成与固定点处的强度值相对应的一组浓度值。在一些实施方案中，可以将aoi分段成一系列区段，并且可以计算每个区段的中值或平均强度。基于实施方案和所需的分辨率，计算的浓度值的数目可以低至1并且高至表示扩散轨迹的线中的像素的数目。[0433]取决于实施方案，浓度值可以以不同方式组合，以量化来自存在的结合的报道分子的信号的量(以及因此分泌的被分析物的量)。在一些实施方案中，可以将浓度值绘图以评估浓度值是否表现出与扩散谱一致的特征。取决于实施方案，可以使用多种算法来将线拟合到浓度值并计算线的特性，例如与线相关的斜率和误差。合适的线拟合算法包括：最小二乘法、多项式拟合、曲线拟合和erfc拟合。其他算法是本领域技术人员已知的。下面更全面地描述转化荧光强度值以获得浓度值的方法。[0434]图14a是标识号为“1107”的一个室1424的测定图像(照片)，并且其中示出了预期的扩散轨迹线1452。将aoi1450投影到测定图像上，并且在该实例中，具有约12个像素的宽度，并且沿着由线限定的轴将其分段成20个相等的区段(区段未示出)。计算20个相等区段中的每一个的中值强度，然后将其绘制为图14b的图中的浓度值。在图的横轴上，区段号1-20根据它们与源(即分泌分泌的被分析物的细胞)的距离编号，其中具有低数字的区段号表示最接近于最远离通道的室区域中的细胞的aoi的区段。[0435]图14b描绘了表示一组室的浓度值的一系列曲线，其是根据前一段中讨论的方法和下面的其他部分产生的。为了产生图14b中所示的一系列曲线，不基于室中的细胞数目对每个室生成的浓度值进行归一化。然而，在另一实施方案中，可以基于每个室中的细胞数目对浓度值和所得曲线进行归一化。如图14b所示，每个室的曲线(浓度值)的斜率可以用于评估每个室中存在的分泌的被分析物的相对量。换句话说，斜率可以用作得分，使得室可以相对于彼此分级和排序，并且在本文的一些实施方案中，“斜率”和“得分”可以互换使用。在一些情况下，得分可以被称为分泌得分。更具体地，在室中存在的生物微物体(例如细胞)产生分泌的被分析物的情况下，斜率可以用于评估每个室中的细胞产生分泌的被分析物的相对能力(例如，细胞分泌抗体的相对能力)。如下文所讨论的，可以使用不同的方法来计算分泌的被分析物的相对或绝对量，包括对aoi的子区域中的所有点进行求和，所述子区域对室中细胞的位置不敏感并且对观察到的荧光强度的变化最敏感(例如，图12b的区域1256、图10a-b的区域1044和图9a-b的区域944)。[0436]另外，可以评估曲线的形状以评估每个室的浓度值是否与预期的参数一致或指示系统误差。例如，图14b中标记为“坞1497”的曲线的形状不对应于针对其他室观察到的曲线的形状，而标记为“坞1107”的曲线的形状确实对应于预期的扩散谱。如图14a所示，坞1107具有从其室到通道的报道分子的可见梯度，这导致其曲线对应于预期的扩散谱。如图14c所示，具有标识号坞1497的室1426具有预期的扩散轨迹线1452和aoi1450。然而，室1426靠近含有气泡的通道，其中气泡的弯月面1401在图像中显示为白色椭圆。气泡的存在导致图14b中描绘的坞1497的异常曲线。在各种实施方案中，可以应用线性回归的分段的aoi的区域可以被选择为区段(子区域)9-13，如上文所讨论的，其包含连接区域的部分并且已经被识别为对荧光强度变化最敏感并且对室内的生物微物体的位置最不敏感。[0437]图15显示了从微流体装置内的多个室获得的多条曲线的叠加，这些曲线表示通过本文所述的任何方法得到的强度值(以及因此的浓度值)。相对于图的垂直轴绘制的每条曲线中的每个点的强度值已经被归一化以便于重叠。沿水平轴的值以“y”的值等于零开始，表示每个aoi的y维度中的第一个像素(并且类似于图9a-b、10a-b、12a-b以及14a和c中所示的aoi，其在物理上位于微流体装置的通道内并且位于室的外部)。沿着水平轴被标记为“200”的点对应于多个室的每个aoi中的最后一个像素，其是最接近于分泌被分析物的细胞的aoi的边界，因此是从rmsa复合物发出可检测信号的来源。如图所示，从对室内的细胞位置最不敏感并且对荧光强度的变化最敏感的aoi的部分1544获得的浓度值被显示在与约90到约130之间的y值相关的曲线部分中。可以看出，在该区域中施加线性形状并提取其斜率的数学运算紧密地表示数据的状态。[0438]在包含数千个克隆群(每个克隆群衍生自放置在单独的室中的单个细胞)的纳米流体装置上进行测定，可以提供每个克隆群的量化。如图16a和b所示，增强了发现稀有高产克隆的能力。如果假设通过泊松统计很好地描述了来自细胞的随机分泌池的滴度分布，那么滴度分布应当符合伽玛分布。在图16a中，叠加在滴度的条形图分布上的曲线(其从得分获得并针对多个室中的每一个中存在的细胞数目进行归一化，并以任意单位(a.u.)表示)显示出良好的一致性。绝大多数克隆群以小于50到小于100a.u.表达被分析物，并且非常少的单个滴度超出了250a.u.及以上的高范围。现在将相对比生产率相对于生长速率(沿水平轴)绘图，显示相同的数据。叠加在图上的曲线显示恒定滴度的线，其再次显示大多数克隆(不论其是快速或缓慢生长的克隆)以低于100a.u.表达被分析物，并且不是寻求用于细胞系发育的期望的高产克隆。仅在1670、1680和1690区域内发现的少数克隆是稀有的高产者。然而，这些克隆不是由最初接种的单个细胞产生的最快生产的克隆。如果将这些细胞与其他细胞混合作为较大生长环境(例如孔板或摇瓶)的一部分，则这些稀有的高产克隆很可能会被较快生长的生产力较低的克隆的生长所超过。如果试图选择随机单细胞组进行扩增，则试图识别这些克隆会需要大量的采样工作，需要大量的资源输入来增加到有可能看到这些细胞所需的细胞数目。在此处提供的系统中，可以获得所有克隆群的滴度(或得分)，并且知晓生产性克隆的物理位置(参见下文的图21)。此外，可以仅选择所选择的克隆并将其物理移动，以进一步扩增/亚克隆；可以单独地进行选择和移动以防止被其他细胞群污染。筛选由最初接种的细胞产生的所有克隆的机会提供了极大改进的用于筛选和选择分泌期望的被分析物的细胞的方法。[0439]根据各种实施方案，光漂白后荧光恢复(frap)可以是进行所分泌分子的芯片上浓度测量(即分泌速率)的另一种技术。特别地，细胞分泌的未标记分子的浓度和/或结合亲和力应可以通过监测光漂白后的荧光恢复来检测。该技术可在本文讨论的各种细胞系发育测定(cld测定)中的不同点实施，例如，在平衡步骤期间，通常进行该平衡步骤以在芯片上产生均匀的试剂浓度。frap可在该步骤中进行，其中每个室中有游离试剂群、分泌分子群和与感兴趣的分泌分子结合的试剂的群。通过光漂白室的区域，例如50-100μm的盒，或甚至颈部本身，可以观察到游离试剂和结合的群重新扩散到该区域中。游离试剂由于扩散速率快而通常恢复快，而结合的复合物由于扩散速率较慢而恢复慢。然后，快速恢复过程幅度(图31中的h1)与缓慢恢复过程幅度(图31的h2)的比率可以形成浓度(分泌速率)的量度，其中恢复时间常数分别由试剂和结合的复合物的分子量确定。图31的a部分代表低分泌分子，而图31的b部分代表高分泌分子。此外，下文更详细讨论的光电定位(optoelectropositioning，oep)技术可用于获得更多的光功率以减少漂白时间，允许使用较不稳定的染料，并允许在监控步骤中以较低的投影仪功率成像。[0440]因此，根据各种实施方案，提供了一种评估生物微物体或由其生成的生物微物体的群的被分析物分泌水平的方法。所述方法可以包括将生物微物体引入微流体装置的室，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室包含第一流体介质。所述方法还可以包括允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群将被分析物分泌到室内的第一流体介质中，并在第一时间段内将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质包含多个报道分子。该方法还可以包括允许多个报道分子的一部分扩散到室中，并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物，并检测位于微流体装置内受关注区域内的报道分子，其中受关注区域包括室的至少一部分。报道分子(或每个报道分子)可以包含配置为与分泌的被分析物结合的结合组分和可检测的标记物。[0441]根据各种实施方案，提供了一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统进行一种使用frap技术确定由生物微物体或由其生成的生物微物体的群产生的被分析物的量的方法。对此，图25的框图提供了一种实例计算机系统，该框图示出了计算机系统3100，在此计算机系统上可以实现本教导的实施方案。下文将提供计算机系统3100的详细信息。[0442]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，可检测的标记物可以包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。报道分子的可检测的标记物可以是荧光标记物，其中所述检测报道分子包括检测来自受关注区域内的报道分子的荧光标记物的荧光发射。[0443]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括在第二时间段内将包含室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发报道分子的荧光标记物的波长。该方法还可以包括在第二时间段后对受关注区域内的荧光发射进行检测，在第三时间段内对受关注区域内的荧光发射进行两次或更多次检测，和/或在第三时间段内基本上连续地对受关注区域内的荧光发射进行检测。[0444]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括在第四时间段内将包含室的至少一部分的微流体装置的一部分但不是流动区域暴露于电磁辐射，其中第四时间段足以对室的部分中存在的任何报道分子的荧光标记物进行光漂白，和检测室的光漂白部分内的荧光发射。可在第四时间段后对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测，可在第五时间段内对室的光漂白部分内的荧光发射进行两次或更多次检测；和/或可在第五时间段内基本上连续地对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测。此外，对室的光漂白部分内的荧光发射的检测可以在所述第四时间段内暴露后约5秒至约20秒之间发生。此外，在第四时间段内暴露和检测室的光漂白部分中的荧光发射的步骤可以重复一次或多次。[0445]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，室的光漂白部分由受关注区域包含。[0446]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，室具有分离区域和将分离区域与流动区域流体连接的连接区域，其中分离区域和连接区域被配置为使得分离区域中流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域中流体介质的组分交换。[0447]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，生物微物体是生物细胞，并且其中所述方法还包括将室内的生物细胞扩增为生物细胞的克隆群。[0448]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括用培养基灌注流动区域，其中灌注可以在将生物微物体引入室之后以及在将第二流体介质引入流动区域之前进行。[0449]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，第一时间段为约30分钟至约60分钟。[0450]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含任何报道分子，并且允许至少一部分未结合的报道分子扩散出室，其中对位于受关注区域内的报道分子的检测发生在选定的时间，使得已扩散出室的未结合的报道分子的量比已扩散出室的rmsa复合物的量至少多2倍。[0451]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，其中受关注区域可以包括沿从室内向外扩散到流动区域的轴排列的室的至少一部分。检测位于受关注区域内的报道分子的步骤可以包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中可检测信号中的至少一些从位于受关注区域内的报道细胞的可检测的标记物发出。[0452]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，检测位于受关注区域内的报道分子的步骤还可以包括通过从可检测信号的测量强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。该方法还可以包括在将生物微物体引入室之前的时间测量受关注区域内背景信号的强度。可检测信号的测量强度或减去背景的信号强度可针对室中观察到的多个细胞进行归一化。[0453]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括量化被分析物的分泌水平。该方法还可以包括提供室的分泌得分。分泌得分可以根据实施方案12至25中任一项所述的方法(即，来自下文所选实施方案的列举)来确定。[0454]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，报道分子的结合组分可以包含肽或蛋白。报道分子的结合组分可以包含具有seqidno:1至10中任一项的序列的肽。报道分子的结合组分可以包括蛋白a、蛋白g或蛋白a或蛋白g的igg结合片段。[0455]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，由生物微物体分泌的被分析物可以是抗体。由生物微物体分泌的被分析物可以是除抗体以外的蛋白。[0456]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，微流体装置可以包括多个室，其中生物微物体被引入多个室中的至少两个室中，并且其中该方法的剩余部分针对所述至少两个室中的每一个进行。该方法还可以包括比较多个室中的至少两个室的室的分泌水平。[0457]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，受关注区域可以包括图像区域，其对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，并沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。[0458]现在参考图32，根据各种实施方案，提供了frap的方法。在图32的a部分中，允许试剂在室中平衡。在图32的b部分中，使用例如结构光来诱导局部光漂白。如该图所示，局部区域为框3540。在图32的c部分中，当未漂白的游离试剂进入局部区域3550时，观察到部分恢复。如上所述，游离试剂由于扩散速率快，通常恢复快。在图32的d部分中，当未漂白的结合复合物进入局部区域时，观察到完全恢复(未绘示为已达到平衡，因此消除了任何可观察到的局部区域)。如上所述，由于扩散速率慢且通常分子量较高，结合复合物的恢复速率通常慢(比游离试剂慢)。[0459]frap具有许多潜在优势。例如，frap可以允许重复测定或在任何时候试剂达到平衡。frap可以比典型的扩散梯度技术更快地进行。frap用户可以获得重复的时间序列分泌测量，以辨析随时间的生物尖峰噪声，从而有可能导致以更少细胞和更短培养时间改善生物噪声统计。浓度测量在视场内和视场之间都是独立的，因为该技术测量的是室内快速和缓慢恢复过程的相对幅度。这不应受到室成像顺序，或室位于视场的哪个部分的影响。此外，例如，frap可用于测量结合亲和力，因为上述比率也会受到亲和力的强烈影响。[0460]因此，根据各种实施方案，提供了一种用于评估生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的方法。该方法可以包括将生物微物体引入微流体装置的室，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室包含第一流体介质。该方法还可以包括允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群将被分析物分泌到室内的第一流体介质中，并在第一时间段内将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质包含多个报道分子。该方法还可以包括允许多个报道分子的一部分扩散到室中，并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物，并检测位于微流体装置内受关注区域内的报道分子，其中受关注区域包括室的至少一部分。报道分子(或每个报道分子)可以包括被配置为与分泌的被分析物结合的结合组分和可检测的标记物。[0461]根据各种实施方案，提供了一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统进行一种使用frap技术确定由生物微物体或由其生成的生物微物体的群产生的被分析物的量的方法。对此，图25的框图提供了一种实例计算机系统，该框图示出了计算机系统3100，在此计算机系统上可以实现本教导的实施方案。下文将提供计算机系统3100的详细信息。[0462]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，可检测的标记物可以包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。报道分子的可检测的标记物可以是荧光标记物，其中所述检测报道分子包括检测来自受关注区域内的报道分子的荧光标记物的荧光发射。[0463]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括在第二时间段内将包含室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发报道分子的荧光标记物的波长。该方法还可以包括在第二时间段后对受关注区域内的荧光发射进行检测，在第三时间段内对受关注区域内的荧光发射进行两次或更多次检测，和/或在第三时间段内基本上连续地对受关注区域内的荧光发射进行检测。[0464]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括在第四时间段内将包含室的至少一部分的微流体装置的一部分但不是流动区域暴露于电磁辐射，其中第四时间段足以对室的部分中存在的任何报道分子的荧光标记物进行光漂白，和检测室的光漂白部分内的荧光发射。可在第四时间段后对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测，可在第五时间段内对室的光漂白部分内的荧光发射进行两次或更多次检测；和/或可在第五时间段内基本上连续地对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测。此外，对室的光漂白部分内的荧光发射的检测可以在所述第四时间段内暴露后约5秒至约20秒之间发生。此外，在第四时间段内暴露和检测室的光漂白部分中的荧光发射的步骤可以重复一次或多次。[0465]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，室的光漂白部分由受关注区域包含。[0466]方法。提供了一种用于评估生物微物体或由其生成的生物微物体的群的被分析物的分泌水平的方法，该方法包括：将生物微物体引入到微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室含有第一流体介质；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群向室内的第一流体介质中分泌被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质含有多个报道分子，并且其中每个报道分子包括被配置为与分泌的被分析物结合的结合组分和可检测的标记物；允许多个报道分子的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的报道分子，其中受关注区域包括室的至少一部分。[0467]在一些实施方案中，流动区域还可以含有第一流体介质。在其他实施方案中，流动区域可以含有与第一流体介质不同的流体介质。[0468]在一些实施方案中，报道分子可以与分泌的被分析物结合，从而形成rmsa复合物，其中rmsa复合物的报道分子:分泌的被分析物的化学计量可以是1:1、2:1、3:1、4:1、2:2、4:2等。[0469]在用于评估被分析物分泌水平的方法的各种实施方案中，检测报道分子可以包括检测未结合的报道分子以及检测作为rmsa复合物的一部分的报道分子。[0470]在各种实施方案中，室可以具有分离区域和将分离区域流体连接到流动区域的连接区域，其中分离区域和连接区域被配置为使得分离区域中的流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域中的流体介质的组分进行交换。[0471]在用于评估被分析物的分泌水平的方法的各种实施方案中，该方法还包括将室内的生物微物体扩增成生物微物体的克隆群。[0472]在各种实施方案中，该方法还可以包括用培养基灌注流动区域，其中灌注发生在将生物微物体引入到室中之后并且在将第二流体介质引入到流动区域中之前。在一些实施方案中，培养基可以与第一介质相同。[0473]在各种实施方案中，培养基可以包括可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。在一些实施方案中，可以通过包括饲养细胞的上清液培养基的一部分来改善在微流体装置内培养的细胞的活力，所述饲养细胞的上清液培养基的一部分提供刺激或以其他方式支持在微流体装置内培养的细胞的辅助生物分子。饲养细胞本身可以不存在于微流体装置内，但可以在标准反应容器中培养。可以收集由饲养细胞的存在而调节的培养基的部分并将其递送到微流体装置。在其他实施方案中，可以根据需要测量和改变溶解氧的量，与在培养孔板、摇瓶等中的这种调节相比，在本文所述的微流体环境中，这可能是个简便的过程。在一些其他实施方案中，可以监测和改变微流体环境内的培养基的ph，这也是比在标准使用的塑料器皿中更简便的过程。[0474]在其他实施方案中，可以将耗尽的生长培养基添加到微流体环境中，其可以充当选择机制以分析微流体环境中的哪些克隆仍然可以更容易地产生分泌的被分析物，或者可以用于接近各种类型的反应容器(其可以包括孔板、摇瓶和生物反应器)的放大环境。在其他实施方案中，可以添加可溶性刺激性组分例如抗体(包括但不限于cd28)、细胞因子、生长因子等，其可以刺激微流体环境内的细胞比引入刺激性组分之前更快速地产生被分析物或产生不同的被分析物。在其他实施方案中，可以将一种或多种被配置为防止细胞彼此粘附和粘附到坞的化合物和/或试剂添加到培养基中。[0475]在一些实施方案中，向培养基中这些添加中的一种或多种可以对室内的一个或多个细胞赋予选择压力。[0476]在各种实施方案中，将第二流体介质引入到流动区域中包括使第二流体介质流过流动区域经历第一时间段。在一些实施方案中，第一时间段可以基于未结合的报道分子的扩散谱的模拟。在一些实施方案中，第一时间段可以是约30至约60分钟。[0477]该方法还可以包括将第三流体介质引入到流动区域中，其中第三流体介质不包括报道分子；以及允许至少一部分未结合的报道分子从室中扩散出来，其中检测位于受关注区域内的报道分子在选择的时间发生，使得已经从室中扩散出来的未结合的报道分子的量比已经从室中扩散出来的rmsa复合物的量至少大2倍。检测可以包括检测未结合的报道分子和检测作为rmsa复合物一部分的报道分子。在各种实施方案中，将第三流体介质引入到流动区域中可以包括使第三流体介质流过流动区域经历第二时间段。在一些实施方案中，可以基于未结合的报道分子和rmsa复合物的扩散谱的模拟来选择第二时间段。[0478]在各种实施方案中，受关注区域可以包括沿着从室内扩散出来进入流动区域中的轴对齐的室的至少一部分。在各种实施方案中，检测位于受关注区域内的报道分子可以包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中至少一些可检测信号是由位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出的。在一些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多的可检测信号是由位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出的。在一些实施方案中，检测位于受关注区域内的报道分子还可以包括通过从测量的可检测信号的强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。可能不必在每次检测报道分子时测量背景信号。在一些实施方案中，可以基于已知/标准条件(例如，芯片类型、芯片中室的位置、可检测的标记物的类型、第一流体介质的组分)预先确定背景信号。[0479]该方法还可以包括在将生物微物体引入到室之前的时间测量受关注区域内的背景信号的强度。在各种实施方案中，可以针对在室内观察到的多个细胞对测量的可检测信号的强度或减去背景的信号强度进行归一化。[0480]在各种实施方案中，该方法还可以包括对被分析物的分泌水平进行量化。对产物的分泌水平进行量化可以基于多个测量中的任何一个，例如可检测信号的测量强度或减去背景的信号强度，其中任一个都可以针对视野中的暗角进行归一化。该方法还可以包括为室提供分泌得分。可以根据以下部分中的任何方法确定分泌得分，其中描述了处理检测的和/或归一化的荧光信号的方法。[0481]在各种实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以是报道分子的分子量的至少两倍。在一些实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少四倍。在其他实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少十倍。[0482]在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。在一些实施方案中，报道分子的结合组分可以包含肽或蛋白。在一些实施方案中，报道分子的结合组分可以包含具有seqidno：1至10中任一个序列的肽。在一些其他实施方案中，报道分子的结合组分包含蛋白a、蛋白g或者蛋白a或蛋白g的igg结合片段。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含适体。[0483]在各种实施方案中，可检测的标记物可以包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。在一些实施方案中，可检测的标记物可以是荧光标记物。[0484]在各种实施方案中，由生物微物体分泌的被分析物可以包含蛋白、糖、核酸；蛋白、糖或核酸以外的有机分子；囊泡或病毒。在一些实施方案中，由生物微物体分泌的被分析物可以是抗体。在其他实施方案中，由生物微物体分泌的被分析物可以是除抗体之外的蛋白。[0485]在各种实施方案中，微流体装置可以包括多个室，其中布置步骤可以包括将生物微物体布置在多个室的至少一部分内。在各种实施方案中，该方法还可以包括比较多个室的室子组中每个室的分泌水平的步骤。该方法还可以包括比较多个室中多于一个室的得分的步骤。在一些实施方案中，该方法还可以包括对分泌水平进行量化的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括选择多个室中的一个或多个以及从所选的一个或多个室中输出生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。在各种实施方案中，该方法允许进行亚克隆和通过进一步扩增和测定所得亚克隆群而对亚克隆进行比较分析。这可以通过将所选的克隆群移动到微流体装置内的另一组室并且针对所选的群的每个单独细胞再次扩增来实现。在其他实施方案中，该方法还可以包括从微流体装置中输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。在各种实施方案中，可以在每个所选的室上单独地执行从室输出到通道或从室和/或通道输出离开微流体装置的步骤(例如，可以在一系列输出步骤中输出来自一组所选的室的细胞，每次一个室)。在一些实施方案中，布置在室内的细胞可以来自先前测定的室，允许进行亚克隆和对亚克隆进行比较分析。例如，特定抗体的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量特异性抗体的细胞。类似地，蛋白家族(例如具有igg结构域的抗体)的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量抗体的细胞。在一些实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的室的所有细胞将被选择并在相同的室或芯片的其他包含区域中扩增。在其他实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的相同室的一个或多个细胞将被选择并在不同的室中扩增。在一些实施方案中，可以对扩增的细胞重复(1x、2x、3x、4x或更多次)执行上文所讨论的用于生成相对或绝对值的步骤。[0486]在另一个实施方案中，该方法的应用可以允许通过重复测定的反馈来检查特定条件对细胞的影响。例如，可以使用与分泌的被分析物的大规模生产更密切相关的条件和材料，以便找到并表征最合适的克隆用于进一步检查。在另一个实例中，可以以更可重复的方式检查用于b细胞抗体刺激的不同刺激方案，并且可以对其进行测定以便更一致地评估一种方案相对于另一种方案的益处。[0487]根据各种实施方案，提供了一种评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的方法。该方法可以包括将生物微物体引入微流体装置的室，其中微流体装置可以包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室包含第一流体介质。该方法还可以包括允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群将包含外源标签的被分析物分泌到室内的第一流体介质中，和将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质包含多个报道分子。该方法还可以包括允许多个报道分子的一部分扩散到室中，并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物，和检测位于微流体装置内的受关注区域内的报道分子，其中受关注区域包括室的至少一部分。报道分子(或每个报道分子)可以包含被配置成与分泌的被分析物的外源标签结合的结合组分和可检测的标记物。[0488]根据各种实施方案，提供了一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统进行一种使用外源标签确定由生物微物体或由其生成的生物微物体的群产生的被分析物的量的方法。对此，图25的框图提供了一种实例计算机系统，该框图示出了计算机系统3100，在此计算机系统上可以实现本教导的实施方案。下文将提供计算机系统3100的详细信息。[0489]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，室可以具有分离区域和将分离区域与流动区域流体连接的连接区域，其中分离区域和连接区域被配置为使得分离区域中的流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域中的流体介质的组分进行交换。[0490]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，生物微物体是生物细胞，其中所述方法还包括将室内的生物细胞扩增成生物细胞的克隆群。[0491]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括用培养基灌注流动区域，其中灌注可以在将生物微物体引入室之后和将第二流体介质引入流动区域之前进行。[0492]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，将第二流体介质引入流动区域可以包括在第一时间段内使第二流体介质流经流动区域。第一时间段为约30分钟至约60分钟。[0493]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，可检测的标记物可以包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。报道分子的可检测的标记物可以是荧光标记物，并且其中所述检测报道分子包括检测来自受关注区域内的报道分子的荧光标记物的荧光发射。[0494]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括在第二时间段内将包含室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发报道分子的荧光标记物的波长。另外，可以在第二时间段后对受关注区域内的荧光发射进行检测，在第三时间段内对受关注区域内的荧光发射进行两次或更多次检测，和/或在第三时间段内基本上连续地对受关注区域内的荧光发射进行检测。[0495]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括在第四时间段内将包含室的至少一部分的微流体装置的一部分但不是流动区域暴露于电磁辐射，其中第四时间段足以对室的部分中存在的任何报道分子的荧光标记物进行光漂白，和检测室的光漂白部分内的荧光发射。另外，可以在第四时间段后对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测，在第五时间段内对室的光漂白部分内的荧光发射进行两次或更多次检测；和/或可在第五时间段内基本上连续地对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测。更进一步地，所述暴露第四时间段和检测室的光漂白部分内的荧光发射的步骤可以重复一次或多次。下文更详细地讨论了对室的区域(区域、受关注区域或受关注区)进行光漂白后荧光恢复(frap)以对分泌的分子进行芯片上浓度测量(即分泌速率)的过程。[0496]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括将第三流体介质引入到流动区域中，其中第三流体介质不包括任何报道分子；以及允许至少一部分未结合的报道分子从室中扩散出来，其中检测位于受关注区域内的报道分子在选择的时间发生，使得已经从室中扩散出来的未结合的报道分子的量比已经从室中扩散出来的rmsa复合物的量至少大2倍。[0497]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法可进一步包括量化被分析物的分泌水平。该方法还可以包括对室提供分泌得分。[0498]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，分泌的被分析物的外源标签可以包含肽序列。肽序列可以包括flag表位、多聚组氨酸序列、血凝素(ha)表位或myc表位。肽序列可以包含氨基酸序列(从n端到c端)dykddddk(seqidno:11)。肽序列可以包含氨基酸序列(从n端到c端)hhhhhh(seqidno:12)。[0499]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，报道分子的结合组分是抗体。报道分子的结合组分可以包含螯合剂。[0500]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，由生物微物体分泌的被分析物可以包括蛋白。由生物微物体分泌的被分析物可以是抗体。[0501]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，微流体装置可以包括多个室，其中生物微物体被引入多个室中的至少两个室中，并且其中所述方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每一个进行的。该方法还可以包括比较多个室中至少两个室的室的分泌水平。该方法还可以包括选择至少两个室中的一个或多个，和将每个所选室中的一个或多个生物微物体输出到微流体装置外。[0502]现在转向图17，图17中展示了工作流程1700，以示出根据本公开的一些实施方案执行的用于对室中存在的分泌的被分析物的量进行量化的功能。[0503]在框1702中，使产生分泌的被分析物的生物微物体保持在微流体装置中的一个或多个室中。例如，生物微物体可以在室内培养或者使用包括重力和/或介电电泳力的各种手段加载到室中，所述重力和/或介电电泳力可以是光致动的。每个室可以包含单个生物微物体或多个生物微物体。多个生物微物体可以是由单个生物微物体产生的生物微物体的克隆群(例如，细胞的克隆群体)，或者可以是生物微物体的异质群。[0504]在框1704中，向通道和室提供具有信号组分和与分泌的被分析物结合的结合组分的报道分子。例如，可以使报道分子流入通道并且允许其扩散到向通道开口的室中。可以使用向通道提供报道分子的其他手段。[0505]在框1706中，允许报道分子在微流体装置内(例如在通道和室内)扩散，直到其在其未结合状态下达到稳态浓度平衡。取决于报道分子的分子量，达到稳态浓度平衡所需的时间量可以变化。[0506]在框1708中，报道分子与存在于室中的分泌的被分析物结合。在一些实施方案中，在通道内恢复流动，并且未结合的报道分子从室中扩散出来。[0507]在框1710中，生成包含未结合的报道分子和rmsa复合物的室和通道的图像。取决于报道分子的信号组分，可能有必要使微流体装置经受特定的光(例如使荧光团经受特定频率的光)或引入另外的试剂以使信号组分可视化。[0508]在框1712中，分析室和通道的图像以计算室中存在的分泌的被分析物的量。[0509]根据本文讨论的各种实施方案，微流体装置可以包括多个室，其中生物微物体被引入多个室中的至少两个室中，并且其中所述方法的剩余部分是针对至少两个室中的每一个进行的。此外，提供了克隆系发育的示例方法，该方法还包括比较多个室中至少两个室的室的分泌水平。此外，该方法可以包括从多个室中选择一组室，其中该组室中的每个室具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分，从微流体装置输出所选择的室的组中的每个室内含有的一个或多个生物微物体；在相应的反应容器中扩增从所选择的室的组中的每个室中输出的一个或多个生物微物体，以及测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而对每个生物微物体或克隆群确定分泌水平。[0510]根据各种实施方案，提供了一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统执行用于克隆系发育的方法的至少一部分。该系统至少执行步骤直到并且包括从微流体装置输出包含在选择的一组室中的每个室中的一个或多个生物微物体为止。对此，图25的框图提供了一种实例计算机系统，该框图示出了计算机系统3100，在此计算机系统上可以实现本教导的实施方案。下文将提供计算机系统3100的详细信息。[0511]现在转到图18，图18中展示了工作流程1800，以示出根据本公开的一些实施方案执行的用于计算表示分泌的被分析物的量的绝对或相对值的功能。[0512]在框1802中，对包括通道和室的微流体装置的图像进行归一化以校正系统误差。如上文所讨论的，可以使用多种不同的归一化算法来校正系统误差。在一些实施方案中，使用增益校正因子对图像进行归一化。在一些实施方案中，使用在与室相邻的通道中存在的荧光信号的量来对图像进行归一化。在一些实施方案中，在归一化期间从微流体装置的图像中减去自发荧光图像。[0513]在框1804中，识别表示从室内的分泌的被分析物的源(例如室内的细胞)到室近侧的通道的预期扩散轨迹的轴的线。识别沿着预期扩散轨迹的轴对齐，并且从室内延伸到通道中的aoi。aoi的至少一部分包括对信号强度具有最大敏感度同时还对室内的细胞位置不敏感的区域。如上文所讨论的，可以通过对多个不同参数(包括但不限于：室的几何形状、室内分泌的被分析物的源的位置、分泌的被分析物的分子量以及通道内存在(或不存在)流动)进行计算模拟来确定aoi和对信号具有最大敏感度/对细胞位置不敏感的相应区域。[0514]在框1806中，基于在aoi处生成一个或多个浓度值，该aoi包含对细胞位置不敏感且对信号变化最敏感的aoi的至少一部分。根据该实施方案，可以基于在aoi内采样像素或者将aoi分区成像素组来计算浓度值。[0515]在框1808中，使用一个或多个浓度值来计算表示每个室中存在的分泌的被分析物的量的相对或绝对值。如上文所讨论的，可以基于每个室中存在的生物微物体(例如，细胞)的数目对针对给定的室计算的一个或多个浓度值进行归一化。在一些实施方案中，一个或多个浓度值可以用于产生表示从分泌的被分析物的源到通道的扩散谱的曲线或其他复合值。在这些实施方案中，拟合至浓度值(或其他复合值)的曲线的线的斜率可以评估与室相关的分泌得分，并且可以用于评估每个室相对于其他室中存在的分泌的被分析物的量(即分泌的被分析物的相对值)。[0516]另一方面，提供了一种克隆系发育的方法，该方法包括：将单个生物微物体引入到微流体装置的多个室中的每一个中，其中微流体装置还包括具有流动区域的外壳，且其中多个室中的每一个与流动区域流体连接且含有第一流体介质；允许每个生物微物体或由其生成的生物微物体的克隆群向相应的室中含有的第一流体介质中分泌被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包括多个报道分子，其中每个报道分子包括结合组分，其被配置为与分泌的被分析物结合；和可检测的标记物；允许多个报道分子中的一部分扩散进入多个室中的每一个并与其中分泌的被分析物的至少一部分结合，从而在多个室中的每一个中产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；对于多个室中的每一个，检测从相应的受关注区域发出的信号的强度，其中受关注区域包括相应的室的至少一部分，且其中从受关注区域发出的信号的至少一部分是从位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出的；对于多个室中的每一个，基于所检测的从相应的受关注区域发出的信号强度确定得分；从多个室中选择一组室，其中该组中的每个室具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分；从微流体装置输出所选的室的组的每个室内含有的一个或多个生物微物体；在相应的反应容器中扩增从所选的室的组的每个室中输出的一个或多个生物微物体；以及测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而测定每个生物微物体或克隆群的分泌水平。最高被分析物生产者可以是生产者中前50％的生产者之一。在一些实施方案中，最高被分析物生产者以前55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％生产克隆或更高的速率产生被分析物。或者，最高生产者可以以大于阈值量生产被分析物。[0517]在各种实施方案中，得分可以是从相应的受关注区域发出的信号的强度，或者可以基于从相应的受关注区域发出的信号的强度来计算。[0518]多个室中的每一个可以具有分离区域和将分离区域流体连接到流动区域的连接区域，并且分离区域和连接区域可以被配置为使得分离区域中的流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域中的流体介质的组分交换。[0519]在各种实施方案中，该方法还包括将多个室中的一些或所有室内的单个生物微物体扩增成生物微物体的克隆群。在各种实施方案中，该方法还包括用培养基灌注流动区域，其中在将单个生物微物体引入到多个室之后并且在将第二流体介质引入到流动区域中之前进行灌注。培养基可以与第一介质相同。灌注可以连续或间歇进行。[0520]在一些实施方案中，培养基可以包括可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。在一些实施方案中，可以通过包括饲养细胞的上清液培养基的一部分来改善在微流体装置内培养的细胞的活力，所述饲养细胞的上清液培养基的一部分提供刺激或以其他方式支持在微流体装置内培养的细胞的辅助生物分子。饲养细胞本身可以不存在于微流体装置内，但可以在标准反应容器中培养。可以收集由饲养细胞的存在而调节的培养基的部分并将其递送到微流体装置。在其他实施方案中，可以根据需要测量和改变溶解氧的量，与在培养孔板、摇瓶等中的这种调节相比，在本文所述的微流体环境中，这是简易的过程。在一些其他实施方案中，可以监测和改变微流体环境内的培养基的ph，这也是比标准使用的塑料器皿中更简易的过程。[0521]在其他实施方案中，可以将耗尽的生长培养基添加到微流体环境中，其可以充当选择机制以分析微流体环境中的哪些克隆仍然可以更容易地产生分泌的被分析物，或者可以用于接近各种类型的反应容器(其可以包括孔板、摇瓶和生物反应器)的放大环境。在其他实施方案中，可以添加可溶性刺激性组分例如抗体(包括但不限于cd28)、细胞因子、生长因子等，其可以刺激微流体环境内的细胞比引入刺激性组分之前更快速地产生被分析物或产生不同的被分析物。在其他实施方案中，可以将一种或多种被配置为防止细胞彼此粘附以及粘附到室的化合物和/或试剂添加到培养基中。[0522]在该方法的各种实施方案中，将第二流体介质引入到流动区域中可以包括使第二流体介质流过流动区域经历第一时间段。可以基于未结合的报道分子的扩散谱的模拟来选择第一时间段。在一些实施方案中，第一时间段可以是约30至约60分钟。[0523]在各种实施方案中，该方法还包括：将第三流体介质引入到流动区域中，其中第三流体介质不包含报道分子；以及允许至少一部分未结合的报道分子从室中扩散出来，其中检测从多个室中每一个室的相应的受关注区域发出的信号的强度在选择的时间发生，使得已经从室中扩散出来的未结合的报道分子的量比已经从室中扩散出来的rmsa复合物的量至少大2倍。在一些实施方案中，将第三流体介质引入到流动区域中可以包括使第三流体介质流过流动区域经历第二时间段。在一些实施方案中，可以基于未结合的报道分子和rmsa复合物的扩散谱的模拟来选择第二时间段。在一些实施方案中，第二时间段可以是约20至约50分钟。[0524]在该方法的各种实施方案中，受关注区域可以包括沿着从室内扩散出来进入流动区域的轴对齐的室的至少一部分。[0525]在该方法的各种实施方案中，检测从多个室中的每一个的相应的受关注区域发出的信号的强度可以包括从测量的可检测信号的强度中减去背景信号的强度以确定减去背景的信号强度。可能不必在每次检测报道分子时测量背景信号。在一些实施方案中，可以基于已知/标准条件(例如，芯片类型、芯片中室的位置、可检测标记物的类型、第一流体介质的组件)预先确定背景信号。[0526]在各种实施方案中，该方法还可以包括在将生物微物体引入到室中之前的时间测量多个室中每一个的相应的受关注区域内的背景信号的强度。在一些实施方案中，可以针对在相应的室内观察到的多个细胞对测量的可检测信号的强度或减去背景的信号强度进行归一化。[0527]在各种实施方案中，可以根据以下部分中的任何方法确定多个室的得分，其中描述了处理检测的和/或归一化的荧光信号的方法。[0528]在各种实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以是报道分子的分子量的至少两倍。在一些实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少四倍。在其他实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少十倍。[0529]在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包括至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。在一些实施方案中，报道分子的结合组分可以包括肽或蛋白。在一些实施方案中，报道分子的结合组分可以包括具有seqidno：1至10中任一个序列的肽。在一些其他实施方案中，报道分子的结合组分包含蛋白a、蛋白g或蛋白a或蛋白g的igg结合片段。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包括适体。[0530]在各种实施方案中，可检测的标记物可以包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。在一些实施方案中，可检测的标记物可以是荧光标记物。[0531]在各种实施方案中，由生物微物体分泌的被分析物可以包括蛋白、糖、核酸；蛋白、糖或核酸以外的有机分子；囊泡或病毒。在一些实施方案中，由生物微物体分泌的被分析物可以是抗体。在其他实施方案中，由生物微物体分泌的被分析物可以是除抗体之外的蛋白。[0532]在各种实施方案中，反应容器可以是孔板、摇瓶或生物反应器中的孔。反应容器的体积可以大于约20微升、约100微升、约1毫升、约10毫升、约100ml、约1l或更高。生物反应器可以具有以下一个或多个特征：具有o2和co2独立控制的ph和溶解氧(do)的闭环控制；用于反应器设置、进料、碱添加和取样的自动液体处理，其可以更密切地靠近用于大量生产分泌的被分析物的反应器的环境，其可以具有20l、50l、50加仑、200加仑或更大的体积。生物反应器可具有相对小的体积，例如10ml或15ml(例如，ambr15tm(tapbiosystems)生物反应器)。生物反应器可具有整合的活力分析能力。[0533]图19中展示了工作流程1900，以示出根据本公开的一些实施方案执行的用于评估表示细胞的克隆群中分泌的被分析物的量的绝对或相对值的功能。[0534]在框1902中，选择单个细胞用于扩增。如上文所讨论的，可以基于测定结果选择细胞，或者可以基于其他特征(例如表型和/或形态)选择细胞。[0535]在框1904中，将单个细胞扩增成细胞的克隆群。在一些实施方案中，可以在细胞增殖时分析细胞的克隆群的方面。例如，可以分析增殖速率、细胞的形态和细胞粘附，以评估细胞的总体健康和/或活力。[0536]在框1906中，评估由细胞的克隆群产生的分泌的被分析物的绝对或相对值。在一些实施方案中，可以如上文关于图12a-c和15所述地评估绝对或相对值。在一些实施方案中，可以使用其他方法评估绝对或相对值，例如美国专利申请号14/964,025中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。[0537]在框1908中，可以基于细胞的克隆群产生的分泌的被分析物的绝对或相对值从细胞的克隆群中选择一个或多个细胞。在一些实施方案中，可以基于如上文所讨论的在细胞增殖期间观察到的细胞的克隆群的方面来选择一个或多个细胞。在一些实施方案中，可以输出所选的细胞用于分析或进一步扩增(例如作为细胞系扩增以产生分泌的被分析物)。如上文所讨论的，在一些实施方案中，可以重复扩增单个细胞和分析克隆群以产生分泌的被分析物的过程，以评估第二分泌的被分析物的绝对或相对量或者评估单个细胞是否稳定地产生在框1906中量化的分泌的被分析物。[0538]分泌的被分析物浓度的绝对值：滴定曲线。在一些实施方案中，可以使用扩散的理论模型，基于一个或多个浓度值和/或生物微物体在一个室中分泌的被分析物的已知量来产生绝对值。根据该实施方案，可以使用不同的扩散理论模型，基于一个或多个浓度值来计算被分析物的绝对值。根据该实施方案，理论模型可以模拟各种现象或评价不同的假设。[0539]在一些实施方案中，可以使用滴定曲线来产生生物微物体分泌的被分析物的绝对值。在这些情况下，可以将各种已知量的被分析物引入到微流体装置中并用于产生表示被分析物的已知量的绝对值。表示被分析物的已知量的绝对值可以用于产生滴定曲线，其部分地证明绝对值与被分析物的各种已知量之间的线性关系。在一些实施方案中，可以产生对应于被分析物的已知量的多个绝对值，使得滴定曲线包含“动态范围”，其显示给定各种系统参数时被分析物的精确量化的上限和下限(即产生具有线性关系的绝对值的被分析物的最高和最低量)。[0540]取决于该实施方案，可以使用各种复制期望的扩散谱的方法，以允许以与在室中的源处产生(例如由室中的细胞产生)的被分析物相同的方式产生已知浓度的被分析物的浓度值。在一些实施方案中，将变化的已知浓度的受关注的被分析物与报道分子一起孵育。在大多数实施方案中，报道分子的浓度将超过与被分析物的所有拷贝结合所必需的报道分子的量。在一些实施方案中，报道分子的浓度将是与被分析物的所有拷贝结合所需的量的大约5-200倍。然而，该范围可以基于报道分子对被分析物的结合亲合力而变化。例如，在报道分子对被分析物具有强结合亲合力的实施方案中，报道分子的浓度可以是与被分析物的所有拷贝结合所需的量的2-200倍。在使用fitc标记的cpd4(表1)与igg结合的具体实施方案中，fitc标记的cpd4的浓度可以是与igg的所有拷贝结合所需的量的5-100倍。该方法不限于使用cpd4，而是可以使用任何适用于扩散测定本身的报道分子。例如，可以使用荧光标记的cpd1、cpd2、cpd3、cpd5、cpd6(表1)来产生滴定曲线，并且荧光团可以是任何适当选择的荧光团，例如alexafluor594或hilytefluortm555。[0541]在一些实施方案中，通过将未结合的报道分子提供给包含分泌的被分析物的室，可以生成预期的扩散谱。在未结合的报道分子和结合的报道分子:被分析物复合物达到平衡的足够时间段(例如，平衡期)之后，随着时间，报道分子和报道分子:被分析物复合物在微流体装置的室和通道中达到平衡状态。在某些情况下，在接近平衡状态和/或处于平衡状态时拍摄图像。示例性的时间段或平衡期为1-3小时。然而，平衡期可以大于10分钟、大于30分钟、大于1小时、大于1.5小时、大于2小时、大于2.5小时、大于3小时、大于3.5小时、大于4小时或大于4.5小时。可选地或另外，在rmsa复合物和未结合的报道分子达到平衡状态之后，或者在平衡期结束后，可以为通道提供另一种介质流，该介质流通过用不包含报道分子的流体介质替换流动区域中的流体介质来消除报道分子(即冲洗)。在这样的情况下。因此，来自通道和室的冲刷区域的rmsa复合物和未结合的报道分子被冲洗出流动区域。此外，布置在室中的rmsa复合物和未结合的报道分子从室扩散至通道。然而，如上所述，未结合的报道分子的扩散速率高于rmsa复合物。因此，未结合的报道分子从微流体装置中扩散出来比rmsa复合物快得多，rmsa复合体具有更大的质量，因此半径也更大。由于半径较大的分子扩散得较慢(参见下面的stokes-einstein方程)，半径较小的分子扩散得更快，因此游离试剂(半径较小)将比包含分泌的被分析物和结合的报道分子的rmsa复合物更快地从坞中扩散出来。[0542][0543]该差异允许基于aoi(受关注区域)的子区域的中值强度值来量化浓度值，如上文关于图12a-c和15所述，并且如下文针对特定数据操纵所讨论的。[0544]图20描绘了根据一个具体实施方案产生的滴定曲线。具体地，图20描绘了一系列绝对值(在y轴上标记为“芯片上测定滴度得分”)，其对应于igg的已知量(在x轴上以微克/ml表示)。具体地，用于产生图20中所示的滴定曲线的igg的已知量为0.001526、0.003052、0.006104、0.012207、0.024414、0.048828、0.097656、0.195313、0.390625、0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5微克/ml。[0545]为了产生表示图20中所示的igg的已知量的绝对值(标记为测定得分)，将已知量的igg在含有fitc标记的cpd4的溶液中孵育。为了确保igg的所有拷贝的结合和检测，在溶液中包括与igg的所有拷贝结合所需的fitc标记的cpd4的量的6倍。然后，用溶液灌注微流体装置45分钟，接着用细胞系培养基(thermofishercdcho培养基)以10微升/秒的速度冲洗通道。冲洗通道后，使fitc标记的cpd4和igg从室扩散到通道10分钟。然后对微流体装置进行成像并用于为微流体装置中的每个室产生测定得分，如下文所述。该过程最初使用最高量的igg(即，12.5微克/毫升)进行，并且每次使用较低量的igg连续重复。[0546]在对微流体装置成像后，通过取对微流体装置中每个室所产生的各个绝对值的平均值来计算每个已知量的igg的测定得分。如上文针对图12-15所述，通过取对室所产生的浓度值的斜率来生成每个单独的绝对值。具体地，基于所选的aoi产生浓度值，并基于该浓度值计算每个室的斜率。在产生浓度值之前，将图像归一化并经受如上文针对图13a-b所述的增益校正因子。在计算每个室的斜率之后，将微流体装置中所有室的所有斜率的平均值用作测定得分。[0547]一旦产生，滴定曲线(例如图20中所示的滴定曲线)就可以用于产生未知量的分泌的被分析物的绝对值。如图20所示，滴定曲线中的测定得分可以用任何线拟合算法拟合，以产生定义绝对值(即，测定得分)和分析物(即，igg抗体)的已知量之间关系的斜率方程。然后，基于在实验条件下观察到的测定得分，斜率方程可以用于产生表示在实验条件(即产生未知量的被分析物的细胞)下存在的被分析物的量的绝对值。为了产生图20中所示的滴定曲线，使用tableau软件生成基于测定得分的标准偏差使用95％置信区间的对数拟合模型。[0548]如图20所示，已知量的igg的测定得分证明了从大约1微克/ml开始的线性关系。也就是说，测定得分证明了响应于igg增加量的成比例增加。在低于1毫克/ml的浓度下，未观察到线性关系。因此，图20中所示的滴定曲线显示了动态范围，其具有大约1微克/ml的精确量化的下限。图20中所示的滴定曲线未显示上限，因为对应于igg的最高量的测定得分在表现出与igg的已知量的线性关系的测定得分的范围内。[0549]如图20中所描绘的曲线所示，通常在实验条件(即在室内分泌igg的细胞)下观察到的测定得分在滴定曲线上以灰色标注并标记为“典型的测定滴度范围”。由于在实验条件下观察到的测定得分在证明与igg的已知量的线性关系的测定得分的范围内，因此图20产生的斜率可以用于计算通常在实验条件下产生的igg的量。[0550]试剂盒。可以提供试剂盒用于评估生物微物体或由其生成的生物微物体的群的被分析物的分泌水平，包括微流体装置，其包括具有流动区域的外壳；和室，其中室与流动区域流体连接，并且其中流动区域和室被配置为含有流体介质；和报道分子，其包含可检测的标记物和被配置为与被分析物结合的结合组分。[0551]在试剂盒的各种实施方案中，微流体装置的室可以具有分离区域和将分离区域流体连接到流动区域的连接区域，其中分离区域和连接区域被配置为使得流体介质的组分基本上仅通过扩散在流动区域和室的分离区域之间进行交换。在各种实施方案中，微流体装置的外壳可以包括基部，流动区域和室设置在该基部上。在一些实施方案中，外壳的基部可以包括具有介电电泳配置的基底。介电电泳配置可以是光致动的。在各种实施方案中，流动区域可以是通道。在一些实施方案中，微流体装置可以包括多个室，其可以与如本文所述的任何室类似地配置。在一些实施方案中，微流体装置的至少一个内表面包括共价修饰的表面。在各种实施方案中，试剂盒的微流体装置可以与本文所述的任何微流体装置类似地配置，并且可以以任何组合具有任何组件、尺寸和/或微流体管路元件的多样性。[0552]在试剂盒的各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包括至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。在一些实施方案中，报道分子的结合组分可以包括肽或蛋白。在各种实施方案中，肽或蛋白结合组分可以是与人或鼠igg结合的肽或蛋白。在一些实施方案中，报道分子的结合组分可以是cpd1、cpd2、cpd3、cpd4、cpd7、cpd8、cpd9、cpd10、cpd11、cpd12、cpd13或cpd14中的任一种(参见表1)。在一些实施方案中，报道分子的结合组分可以是cpd1、cpd2、cpd3或cpd4(参见表1)。在一些实施方案中，与人或鼠igg结合的蛋白结合组分可以是cpd1或cpd2(参见表1)。在其他实施方案中，报道分子的结合组分包括适体。在各种实施方案中，适体可以是cpd5或cpd6(表1)。在一些实施方案中，报道分子的适体结合组分与igg的fc结合。[0553]在试剂盒的各种实施方案中，报道分子的可检测的标记物可以包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。在一些实施方案中，可检测的标记物是荧光标记物。荧光标记物可以是罗丹明、荧光素或花青荧光染料。[0554]在试剂盒的各种实施方案中，试剂盒还可以包含流体介质。流体介质可以被配置为维持、扩增生物微物体或由其生成的生物微物体的群或对其提供选择压力。[0555]在试剂盒的各种实施方案中，试剂盒还可以包含被配置为使微流体装置的一个或多个表面调节的试剂。在一些实施方案中，试剂可以被配置为共价修饰微流体装置的一个或多个表面。[0556]根据各种实施方案，提供一种试剂盒，用于评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平。所述试剂盒可以包括微流体装置和报道复合物。微流体装置可以包括具有流动区域的外壳和多个室，其中每个室与流动区域流体连接，并且其中流动区域和室被配置为包含流体介质。报道复合物可以包括被配置为与分泌的被分析物结合的第一复合物组分，以及与第一复合物组分结合并包含可检测的标记物的第二复合物组分，其中分泌的被分析物与第一复合物组分的结合抑制或阻止第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[0557]计算机实施的系统[0558]计算机实施的系统。图25是示出计算机系统3100的框图，可以根据它实施各种实施方案。根据各种实施方案，计算机系统3100可以包括总线3102或用于传递信息的其他通信机制，以及与总线3102耦接用于处理信息的处理器3104。在各种实施方案中，计算机系统3100还可以包括存储器3106，其可以是所示的随机存取存储器(ram)或其他动态存储设备，耦接到总线3102，用于确定将由处理器3104执行的指令。存储器3106还可以用于在执行要由处理器3104执行的指令期间存储临时变量或其他中间信息。在各种实施方案中，计算机系统3100还可以包括另一存储器3108，例如只读存储器(rom)3108或耦接到总线3102的用于存储用于处理器3104的静态信息和指令的其他静态存储设备。可以提供诸如磁盘或光盘的存储设备3110并将其耦接到总线3102用于存储信息和指令。[0559]在各种实施方案中，计算机系统3100可以通过总线3102耦接到显示器3112，例如阴极射线管(crt)或液晶显示器(lcd)，用于向计算机用户显示信息。包括字母数字键和其他键的输入设备3114可以耦接到总线3102，用于将信息和命令选择传送到处理器3104。另一种类型的用户输入设备是光标控制3116，例如鼠标、轨迹球或光标方向键，用于将方向信息和命令选择传送到处理器3104并用于控制显示器3112上的光标移动。该输入设备3114通常在两个轴(第一轴(即，x)和第二轴(即，y))上具有两个自由度，其允许设备指定平面中的位置。然而，应当理解的是，本文还考虑了允许3维(x、y和z)光标移动的输入设备3114。[0560]与本文所述的各种实施方案一致，响应于处理器3104执行包含在存储器3106中的一个或多个指令的一个或多个序列，计算机系统3100可以提供结果。这些指令可以从另一计算机可读介质或计算机可读存储介质(例如存储设备3110)读入存储器3106。包含在存储器3106中的指令序列的执行可以使处理器3104执行本文描述的方法。或者，可以使用硬连线电路代替软件指令或与软件指令组合以实现本教导。因此，本教导的执行不限于硬件电路和软件的任何特定组合。[0561]本文使用的术语“计算机可读介质”(例如，数据存储、数据存储器等)或“计算机可读存储介质”是指参与向处理器3104提供指令以供执行的任何介质。这种介质可以采取多种形式，包括但不限于非易失性介质、易失性介质和传输介质。非易失性介质的实例可以包括但不限于光盘、固态硬盘、磁盘，例如存储设备3110。易失性介质的实例可以包括但不限于动态存储器，例如存储器3106。传输介质的实例可以包括但不限于同轴电缆、铜线和光纤，包括包含总线3102的导线。[0562]计算机可读介质的常见形式包括，例如，软盘、软磁盘、硬盘、磁带或任何其他磁介质、cd-rom、任何其他光学介质、穿孔卡、纸带、任何其他具有孔图案的物理介质、ram、prom和eprom、flash-eprom、任何其他存储器芯片或盒式磁带或计算机可以读取的任何其他有形介质。[0563]除了计算机可读介质之外，还可以提供指令或数据作为在通信装置或系统中包括的传输介质上的信号，以向计算机系统3100的处理器3104提供一个或多个指令的序列以供执行。例如，通信设备可以包括具有指示指令和数据的信号的收发器。指令和数据被配置为使一个或多个处理器执行本文公开中概述的功能。数据通信传输连接的代表性实例可以包括但不限于电话调制解调器连接、广域网(wan)、局域网(lan)、红外数据连接、nfc连接等。[0564]应当理解，本文描述的方法、流程图、示意图和所附的公开内容可以使用计算机系统3100作为独立设备或者在诸如云计算网络的共享计算机处理资源的分布式网络上来执行。[0565]被分析物量化器系统[0566]被分析物量化器系统。根据各种实施方案，公开了用于确定由微物体产生的被分析物的量的系统和方法。被分析物可以包括例如来自微物体的分泌物，其中微物体可以是生物微物体。被分析物可以包括例如蛋白、糖、核酸、抗体、抗原；蛋白、糖、核酸以外的有机分子；囊泡或病毒。如下文所讨论的，被分析物的量可以是相对量。[0567]图26是根据各种实施方案的用于确定由微物体产生的被分析物的量的系统的示意图。如本文所描绘的，系统3200可以包括图像获取单元3202、图像处理单元3204和显示器3212，其用于输出数据和经由相关联的输入设备(未示出)接收用户输入。[0568]图像获取单元3202(例如，但不限于，上文的图1中所描绘的成像模块164)可以包括微流体装置支撑物3214(例如但不限于上文的图1和3b中所描绘的支撑结构104和300)和成像元件3216(例如但不限于上文提到的成像装置194)。[0569]微流体装置支撑物3214可以被定位并设计成固定微流体装置。微流体装置可包括本文所述的各种实例(例如但不限于上文的图1b-1c、2a-2b、2d、2g-2h、3a、4a-4c、5a-5c、9b、10b、11a-11b和12a-12b中所描绘的微流体装置200、230、250、280、290、320、400、500、900、1000、1100和1200)中的任一种。或者，支撑物3214可以与微流体装置集成。微流体装置可以包括流动区域和可以流体连接到流动区域的一个或多个室，其中每个室可以容纳一个或多个微物体。如前文所述，该室可以是例如室。应当理解的是，该室可以具有如它们所用的特定应用所要求的任何形状、尺寸或取向。如前文所述，流动区域可以是单个微流体通道，或多个微流体流动通道(例如但不限于如上文的图1a和2a-2c中所描绘的通道122，以及如上文的图2d-2f中所描绘的流动通道264)，其提供单个流动路径或多个流动路径(例如但不限于上文的图1a和2b中所描绘的流动路径106，以及上文的图2c-2d、4a-4c、5a、9b、10b、12a中所描绘的介质242和278的流动)。流动区域可以与单个或多个室流体连通。或者，流动区域可以通过可逆闭合件(例如，阀)与单个室或多个室流体连通。流动区域可以被配置为通过如前文所述的入口接收材料流。材料流可包括例如微物体、结合剂或试剂的流，或者包括该材料的介质的流。微流体装置可以进一步被配置为通过流动路径接收结合剂(例如，报道分子)的流动并进入室。结合剂可以在与被分析物结合时发射电磁辐射，例如由结合剂的可检测的标记物发射的光(例如，荧光，uv等)。被分析物可以包括例如来自微物体的分泌物，其中微物体可以是生物微物体。被分析物可包括例如蛋白、糖、核酸、抗体、抗原；蛋白、糖或核酸以外的有机分子；囊泡或病毒。[0570]成像元件216可以被配置为捕捉微流体装置的多个室和流动区域一个或多个测定图像3222(参见图27)。成像元件3216可以被进一步配置为捕捉一个或多个相应的背景图像3218(参见图27)和/或一个或多个相应的信号参比图像3220(参见图3)，以如下文所详细讨论地与一个或多个测定图像3222相关联地进行分析和执行。[0571]在将任何外来物质(例如，微物体、结合剂或其他试剂)引入到微流体装置中之前，可以由成像元件3216获取背景图像3218(参见，例如，图27)。在这样做时，背景图像3218捕捉设备中特别是受关注区域中的任何背景噪声，这在下文中进一步讨论。背景噪声可能是由于例如伪影或仪器设置和成像参数-例如，来自激发源的光、相机噪声和环境光。背景噪声还可以归因于例如由样品、容器、成像介质的自发荧光或由未与特定靶标结合的荧光团产生的荧光所赋予的背景荧光。背景图像中包含什么样的图像区域取决于如何在进行中的系统中执行成像。例如，如下文将详细描述的，根据所使用的校准方法，可能期望不同的背景图像区域。[0572]在将结合剂引入到室中至一定水平使得结合剂浓度在受关注区域(“aoi”)中平衡之后，成像元件3216可以获取信号参比图像3220(参见，例如，图27)。在这样做时，信号参比图像3220捕捉设备中的图像获取畸变。这种畸变可以源于例如微流体或成像元件设计。图像畸变类型可以包括例如图像边缘效应、透视畸变、桶形畸变、枕形畸变、胡须畸变和色差。信号参比图像区域可包括aoi、靠近室的流动区域和相关联的aoi的图像，或两者。信号参比图像中包含什么样的图像区域取决于如何在进行中的系统中执行成像。例如，如下文进一步详细提供的，取决于系统执行的校准方法，可以使用不同的信号参比图像区域。[0573]图26的系统3200的图像处理单元3204可以通信地连接到图像获取单元3202。在各种实施方案中，图像处理单元3204可以包括受关注区域确定引擎3206(aoi引擎3206)和评分引擎3210。应当理解，被描绘为图像处理单元3204的一部分(并且在此描述)的每个组件(例如，引擎、模块等)可以作为硬件、固件、软件或其任何组合来实现。[0574]在各种实施方案中，图像处理单元3204可以作为具有图像获取单元3202的集成的仪器系统组合件来实现。也就是说，图像处理单元3204和图像获取单元3202可以被容纳在相同的壳体组合件中，并通过传统的设备/组件连接装置(例如，串行总线、光缆、电缆等)进行通信。[0575]在各种实施方案中，图像处理单元3204可以作为独立的计算设备(如上文在图26中所示)来实现，其经由光学、串行端口、网络或调制解调器连接通信地连接到图像获取单元3202。例如，图像处理单元可以经由lan或wan连接来连接，该lan或wan连接允许将由图像获取单元3202获取的成像数据传输到分析用图像处理单元3204。[0576]在各种实施方案中，图像处理单元3204的功能可以在共享计算机处理资源(诸如云计算网络)的分布式网络上实现，该分布式网络经由wan(或等效的)连接通信地连接到图像获取单元3202。例如，图像处理单元3204的功能可以被划分为在诸如amazonwebservicestm的云处理服务上的一个或多个计算节点中实现。[0577]受关注区域确定引擎3206(aoi引擎3206)可以被设计和配置为从成像元件3216接收捕捉的测定图像，并为测定图像中描绘的每个室限定aoi。受关注区域确定引擎3206可以被编程为通过在aoi内包括对测量被分析物浓度波动最敏感的室内的图像区域来定义适当的aoi。例如，这可以是室内这样的区域：其中可以由成像元件3216测量电磁辐射(例如光发射(例如，荧光、uv等))的最小波动。甚至更进一步地，图像区域可以包括当测量被分析物波动时对室中的微物体的位置最不敏感的图像区域。例如，这将是室内这样的区域：其中电磁辐射(例如光发射(例如，荧光、uv等))的测量的灵敏度受室中微物体的存在的影响最小。aoi甚至可以被进一步限定为沿着扩散轴3302(参见图28)在相应的室和与相应的室流体连通的流动区域之间延伸。如下文将更详细地讨论的，该aoi也可以是在例如图32中示出的室的非冲刷区域。[0578]在图28中描绘的示例性实施方案中，可以使用关于微流体装置及其相应室的空间信息来确定扩散轴3302。该空间信息可以源自包含在系统3200中的cad模型、相关的软件或单独的软件包，以产生定义的未对齐的aoi3224。然后，用于成像元件和微流体装置的校准算法可以将图像数据映射到该cad模型，以获得适当的扩散轴3302。基于该映射应用空间校正变换3226，受关注区域确定引擎3206可以产生一组对齐的aoi3228。aoi可以从受关注区域确定引擎3206自动确定，或者可以通过用户输入到显示器3212中手动确定。[0579]图26的系统3200的评分引擎3210可以被设计和配置为分析每个室的受关注区域内的图像区域的至少一部分，以确定指示每个室中的被分析物的量的得分。此外，由于得分可以是无量纲的值，其可以通过评分引擎3210与其他得分进行比较，以指示被分析物的相对量或浓度，所确定的得分可以转换为用户的浓度单位。[0580]为了确定得分，评分引擎3210可以使用各种模型。如下文所讨论的，一些模型可以是利用例如荧光数据的模型，所述荧光数据量化与每个室、流动区域或二者中的被分析物结合的结合剂(例如，报道分子)的量。被分析物可以包括例如来自室内的微物体的分泌物，其中微物体可以是生物微物体。评分引擎3210可以使用结合的报道分子数据(例如，荧光值)，特别是跨aoi的结合的报道分子数据，以确定相应室的得分，其指示该室中被分析物的量。评分模型的非限制性实例包括将线性回归分析应用于每个室的aoi的图像区域的一部分上的发光数据(例如，荧光值或一些其他类型的可检测的信号)、将s形模型应用于aoi、使用对产生受关注的被分析物的生物微物体的位置不变的aoi的平均强度或者对每个室的aoi的图像区域的一部分上的发光数据(例如，荧光值或一些其他类型的可检测的信号)进行积分。[0581]例如，s形模拟通过s形或逻辑曲线、方程和细节来靠近aoi中的扩散梯度。使用参数(例如生长速率、渐近线之间的差异和拐点位置)组合的量化模型，可以产生必要的准确度和/或精度。可以通过例如非线性回归或曲线回归来估计模型的参数，这取决于所使用的s形曲线的确切形式。常见的模型参数估计技术包括例如levenberg-marquardt、单形和模拟退火。可以使用启发式技术来初始化参数，以进一步帮助确保在诸如非线性回归的迭代拟合技术期间的收敛。例如，可以通过aoi极值处的子区域的平均值粗略估计上下渐近线。[0582]或者，如图27的实施方案中所示，在将上述评分模型应用于aoi之前，评分引擎3210可以将对齐的aoi3228沿着扩散轴3302分隔成单独的区段3230(参见图28)。图28描绘了微流体装置的一部分的实例，包括流动区域3308、室3306、扩散轴3302、多个区段3304和微物体3310。区段3304的数目可以根据需要变化，以执行必要的评分模型。区段3304的数目可以是例如20。对于区段3304，评分引擎3210可以计算中值3232，其中该值可以是例如电磁辐射值，例如荧光值，其指示与每个室3306、流动区域3308或二者内的被分析物结合的结合剂(例如，报道分子)的量。被分析物可以包括例如来自微物体3310的分泌物，其中微物体可以是生物微物体。然后，评分引擎3210可以基于一组参数经由子部分量化过程3234确定区段3304(或区间(bins))的子集。[0583]评分引擎3210可以使用编码到或者远程提供给(例如，无线地、远程软件程序、用户输入)评分引擎3210的一组指令，经由子部分量化过程3234确定区段(或区间)3304的子集。该组指令可以基于例如使用例如微物体类型、室中的微物体计数、区段计数(或区间计数)、子部分计数和子部分位置的不同组合进行的先前数值模拟。使用该数据，可以编码指令，其将受关注的微物体与各种数值模拟相关联，以确定用于分析受关注的生物微物体的适当的区段子集。[0584]区段3304的子集可以包括确定所述室3306的得分所需的总区段计数内的任何区段的组。例如，基于所提供的一组参数或指令，评分引擎3210可以将箱9-13识别为用于确定特定室的得分的箱的子集。应用评分模型，例如先前描述的那些，评分引擎3210然后可以确定所述室的得分，例如分泌得分3236。[0585]或者，根据各种实施方案，图像处理单元3204还可以包括在例如图26和图27中示出的校准引擎3208。校准引擎3208可以被设计和配置成针对由来自微流体装置并在测定图像捕捉期间的背景噪声引起的图像畸变，应用每个室的aoi归一化过程3238。然后可以通过评分引擎3210对得到的校准图像aoi进行评分。如上文所述，背景噪声可能是由于例如伪影或仪器设置和成像参数-例如，来自激发源的光、相机噪声和环境光。背景噪声还可以归因于例如由样品、容器、成像介质的自发荧光或由未与特定靶标结合的荧光团产生的荧光所赋予的背景荧光。测定图像捕捉期间的图像畸变可以源自例如微流体装置设计或成像装置设计。图像畸变类型可以包括例如图像边缘效应、投影仪不均匀性、相机晕光、透视畸变、桶形畸变、枕形畸变、胡须畸变和色差。[0586]校准引擎3208可以被设计和配置成针对在测定图像捕捉之前和/或在测定图像捕捉期间引入的来自微流体装置的图像畸变，对每个室的aoi或至少每个室的aoi的图像区域进行归一化。校准引擎3208可以通过从测定图像和/或信号参比图像中减去背景图像并且考虑在信号参比图像中捕捉的图像获取畸变来实现这一点。然后可以通过评分引擎3210对得到的归一化图像aoi进行评分。[0587]针对特征提取和异常检测，存在用于对图像进行归一化的各种模型。[0588]在一个实施方案中，通过统计推断的数据排除可以在对aoi进行归一化之前去除异常。可以利用诸如计算所有aoi数据的分布内的给定数据点的z得分的基本统计变换来检测可能具有非常低或非常高强度的异常，例如异物。[0589]根据各种实施方案，通过统计推断的数据排除可以在对aoi进行归一化之前去除异常。因为理想的扩散谱通常沿着与扩散轴正交的任何线具有恒定值，所以可以统计地推断aoi中是否存在诸如异物的异常并且从模拟中排除那些数据点。可以将aoi中的每个数据点转换为z得分，其表示由于随机变化而发生的概率。例如，给定aoi，其中i是给定点处的强度值，μ是平均强度值，σ是标准偏差，y表示扩散方向，x与其正交，给定点的z得分可以通过方程(1)计算：[0590](1)[0591]由该方程产生的z得分可以用于排除z得分幅度大于给定阈值的数据。可以重复该过程以迭代地去除不同尺寸和强度的异常。[0592]根据各种实施方案，分段模拟可以在对aoi进行归一化之前去除异常。基于扩散谱沿着与扩散轴正交的任何方向理想地恒定的原理，可以在aoi的n列上独立地拟合分析模型。在理想的系统中，这些模型都会产生相同的参数估计。在实践中，它们将是正态分布的。然而，在异常的情况下，例如未对齐或存在异物，在参数估计的分布中将存在另外的模式。通过将诸如模型与aoi列数据的相关性的信息与所有参数估计的分布中给定参数的大小的普遍性相结合，可以确定哪些模型反映了异常结果，因此应当从进一步分析中排除。这可以与上述z得分技术结合使用，以适当地对受关注的数据进行归一化。[0593]根据各种实施方案，根据方程(2)，可以使用捕捉的背景图像“a”和信号参比图像“c”数据产生在点x,y处的测定图像的归一化值(i校正)：[0594](2)[0595]根据各种实施方案，产生g得分以对aoi中的所有数据点进行归一化。在捕捉背景图像“a”和信号参比图像“c”之后，可以根据方程(3)计算校正因子“g”：[0596](3)[0597]然后可以如下应用校正因子g，以根据方程(4)确定用于对aoi进行评分的测定图像的归一化的值(i校正)：[0598](4)i校正(x,y)＝g(x,y)(i原始(x,y)-a(x,y))[0599]使用测定图像的归一化的值，可以将评分引擎3210进一步设计和配置为分析每个室的归一化的受关注区域的一部分，以确定指示每个室中被分析物的量的得分。如上文所详细讨论的，评分模型的实例包括将线性回归分析应用于每个室的归一化的受关注区域的一部分，或者对每个室的归一化的受关注区域的一部分上的荧光值(或一些其他类型的可检测的信号)进行积分。[0600]或者，根据各种实施方案，不是使用aoi的信号参比图像和背景图像，使用靠近室和相关联的aoi的流动区域以及微流体装置的其他不含生物微物体的区域的信号参比图像和/或背景图像，校准引擎3208可以应用上述用于校准的实施方案于。这些“非aoi”图像可以与测定图像数据结合使用，以对测定图像数据进行归一化，如上文所详细讨论的。[0601]根据各种实施方案，图像获取单元3202和图像处理单元3204可以集成到单个物理单元中。或者，图像获取单元3202和图像处理单元3204可以可分离地定位，以独立单元提供，使得各单元仍然通信地连接以交换信息。[0602]上述图像处理单元3204的每个组件可以是硬件，或者可以部分或全部是软件模块。[0603]图29是示出用于确定由微物体产生的被分析物的量的方法的示例性流程图。如本文所描绘的，步骤3410详细描述了可由图26的系统3200的图像获取单元3202的受关注区域引擎3206使用的示例性工作流程。在步骤3410中，受关注区域引擎3206接收微流体装置的成像数据，该微流体装置包括流动区域和与流动区域流体连接的多个室，其中成像数据可以包括背景噪声图像、信号参比图像和被分析物测定图像的其中之一或组合。在将任何外来物质(例如，微物体、结合剂或其他试剂)引入到微流体装置中之前，可以通过成像元件3216获取背景图像。在这样做时，背景图像捕捉与系统3200相关联的任何背景噪声和设备上的区域的图像捕捉。先前描述了背景噪声的实例。在将结合剂引入到室中至一定水平使得结合剂浓度在装置中平衡之后，成像元件3216可以获取信号参比图像。在这样做时，信号参比图像捕捉与系统3200相关联的图像获取畸变以及设备上的区域的相关联的图像捕捉。[0604]所接收的成像数据可包括例如由与一个或多个室、流动区域或二者中的被分析物结合的结合剂(例如，报道分子)发射的荧光确定的荧光发射数据。被分析物可以包括例如来自微物体的分泌物，其中微物体可以是生物微物体。来自生物微物体的分泌物可以包括例如蛋白、糖、核酸、分子量小于3kd的有机分子或病毒。如前所述，室可以是例如室。[0605]如本文所描绘的，步骤3420和3430详细描述了可以由图26的系统3200的图像处理单元3204的评分引擎3210使用的示例性工作流程。在步骤3420中，图像处理单元3204可以为每个室定义受关注区域(“aoi”)。aoi可以包括室内对测量被分析物浓度波动最敏感的图像区域。aoi还可以包括当测量被分析物波动时对室中的微物体的位置最不敏感的图像区域，并且甚至进一步地，图像区域可以沿着室和流动区域之间的扩散轴延伸。[0606]在步骤3430中，评分引擎3210可以通过分析每个室的aoi的一部分来确定指示每个室中的被分析物的量的得分。为了确定每个室的得分，评分引擎3210可以使用如上文所讨论的各种模型。一些模型可以是利用例如荧光数据的模型，所述荧光数据量化与被分析物结合的结合剂(例如，报道分子)的量。被分析物可以包括例如来自室内的微物体的分泌物，其中微物体可以是生物微物体。评分引擎3210可以使用结合的报道分子数据(或荧光值)，特别是跨aoi的结合的报道分子数据，以确定相应室的得分，其指示该室中被分析物的量。评分模型的非限制性实例包括将线性回归分析应用于每个室的归一化的受关注区域的一部分，或者对每个室的归一化的受关注区域的一部分上的荧光值(或一些其他类型的可检测的信号)进行积分。[0607]图30示出了可以应用于成像数据以获得被分析物测定图像中的每个室的归一化的aoi的校准方法。如本文所描绘的，步骤3510至3530详细描述了可由图26的图像处理单元3204的校准引擎3208使用的校准方法的示例性工作流程。[0608]在步骤3510中，校准引擎3208可以从图像获取单元3202接收成像数据，其可以包括如前文所讨论的背景图像、信号参比图像和被分析物测定图像的成像数据的其中之一或组合。如前文所讨论的，成像数据可以是来自微流体装置上每个室的受关注区域的荧光值的形式。成像的荧光可以是源自背景噪声(对于背景图像)、填充受关注区域的结合剂(对于信号参比图像)或来自与被分析物结合的结合剂(例如报道分子，对于被分析物测定图像)的发射的荧光，其中被分析物可以包括例如来自存在于室中的生物微物体的分泌物。[0609]在步骤3520中，校准引擎3208可以从信号参比图像和被分析物测定图像值中减去背景图像值。在这样做时，将系统中已经存在的任何背景噪声从信号参比图像和被分析物测定图像值中去除，以获得不再受噪声影响的两个图像的背景校正值。[0610]在步骤3530中，校准引擎3208可以通过比较信号参比图像和被分析物测定图像值的背景校正值来进一步校正被分析物测定图像值，以解决先前描述的将通过信号参比图像识别的图像获取畸变。该比较将产生归一化的被分析物测定图像值，特别是在aoi内。上文提供了确定归一化的值的相关公式和计算的实例。[0611]使用归一化的数据，评分引擎3210可以通过分析每个室的现在归一化的aoi的一部分来确定指示每个室中的被分析物的量的得分。[0612]本文描述的方法可以根据应用通过各种手段来实现。例如，这些方法可以用硬件、固件、软件或其任何组合来实现。对于硬件实现，处理单元可以在一个或多个专用集成电路(asic)、数字信号处理器(dsp)、数字信号处理装置(dspd)、可编程逻辑装置(pld)、现场可编程门阵列(fpga)、处理器、控制器、微控制器、微处理器、电子设备、被设计用于执行本文所述功能的其他电子单元或其组合中实现。[0613]在各种实施方案中，本教导的方法可以以固件和/或软件程序以及用诸如c、c 等传统编程语言编写的应用程序实现。如果以固件和/或软件实现，则本文描述的实施方案可以在非暂态计算机可读介质上实现，其中存储有程序用于使计算机执行上述方法。应当理解，本文描述的各种引擎可以在计算机系统(例如图25的计算机系统3100)上提供，从而处理器3104将根据由存储器组件3106/3108/3110和通过输入设备3114提供的用户输入中的任何一个或其组合提供的指令来执行由这些引擎提供的分析和确定。[0614]钩区域模拟[0615]对由室和流动区域组成的几何形状内的层流和扩散传输进行模拟，以确定室内对rmsa复合物(例如，结合的rmsa复合物、结合的复合物等)信号敏感的位置。使用单室几何形状对模型进行参数化。模拟中使用的边界条件如图40a所示。在含有可溶性报道分子的液体介质先前已流入流动区域后，当不含可溶性报道分子(例如，报道分子、报道物等)的液体介质通过流动区域流入微流体时，流体流场在时间上是恒定的，输入流速为4.8mm/s，以匹配测定的冲洗步骤中在实验上使用的1.7μl/s体积流速。每种物质(例如，可溶性报道分子、rmsa复合物等)均独立考虑，并且在整个几何形状中，游离可溶性报道分子的初始浓度设置为1mol/m3。浓度是扩散方程中的常数项，因此该值可以归一化为标准曲线的每个条件的实际值。t＝0时，在进行测定之前，将入口处的浓度设置为零，以匹配冲洗。通道的出口是一个自由边界，允许流体和分子运输出几何形状。[0616]扩散系数使用stokes-einstein方程(d＝kt/(6πηr))估算，其中k是boltzmann常数，t是绝对温度，η是液体动力粘度，r是分子半径。游离报道分子的半径可以估算为rmin＝0.066m1/3，其中m是分子的分子量(单位为道尔顿)，rmin单位为纳米。这提供了报道分子的最小估算尺寸，因为它假设报道分子是一个填充球体。[0617]除了一些代表性分子量的扩散系数外，表3还列出了示例性的感兴趣的可溶性报道分子以及分子量和估算的扩散系数。[0618]表3.分子量和估算的扩散系数[0619][0620][0621]使用示例性报道分子spotlighthu3进行标准曲线实验，以基于最小化cv(方差系数)和最大化检测下限来确定何时应进行荧光测量。在标准曲线中，可溶性报道分子和分泌的被分析物分子的混合物在96孔板中温育，然后被导入芯片。平衡后，以0.17μl/s的速率从通道中冲洗混合物。在该冲洗期间，在芯片上进行荧光成像，以观察报道分子和rmsa复合物向室外的扩散。表4总结了所使用的条件。在所有条件下，报道分子的摩尔超出分泌的被分析物至少8倍。[0622]表4：igg1-spotlighthu3的标准曲线条件[0623]报道物μg/ml4444444μm1.71.71.71.71.71.71.7被分析物μg/ml012481632nm06.713.326.753.3106.7213.3[0624]将使用以下假设在数值模拟中重新创建这些条件。首先，基于所有目标分子都被报道分子结合并且解离速率慢于测量时间段的假设，忽略结合动力学。因此，报道分子和rmsa复合物的扩散可以用初始浓度独立处理：[rmsa复合物]＝[分泌的被分析物]，且[报道分子]＝[报道分子]o-[分泌的被分析物]。另一个假设是，忽略可溶性报道分子平衡和测定冲洗之间的冲洗步骤。此外，还忽略室之间的扩散相互作用。[0625]为了对标准曲线进行模拟(model)，对报道分子和结合的rmsa复合物以如表3所示的扩散系数进行了两个独立的模拟。除了报道分子(分子量较小，扩散性较强)和结合的rmsa复合物(分子量较大，扩散性较弱)的扩散系数不同外，每个模拟的条件几乎相同。使用图40b所示的边界条件，以10秒的分辨率持续一小时(3600秒)，对报道分子和结合的rmsa复合物向坞外的扩散进行了时间依赖性模拟。在每个时间点，计算空间中每个点的浓度。这如图40c所示，其示出了测定的原理。虽然报道分子和结合的rmsa复合物以相同的浓度起始，但扩散性较强的报道分子在坞中的浓度下降速度比结合的rmsa复合物更快。因此，与没有生物微物体分泌分泌的被分析物的室相比，具有生物微物体分泌分泌的被分析物的室将显示更大的荧光强度。[0626]通过在固定空间点对模拟中的浓度进行采样，可以分析从坞的扩散。图40d显示了结合的rmsa复合物在室内三个不同位置的时间过程。当分子被二次流动冲刷，然后随时间呈指数衰减时，室连接区域中的十字(图40d中的a和b)在前两分钟内经历超指数衰减。然而，室的钩区域(图40d中的c)在整个时间过程中呈指数衰减。通过在图40d中a和b之间的室连接区域底部的荧光信号的斜率对测定进行评分。当仪器在多个视场中以及在单个视场中的空间变化上对微流体芯片进行成像时，采用归一化以校正一次测量中的时间变化。如何对测定进行评分中的复杂性可能更高，但测定区域内浓度的线性斜率与得分成正比。[0627]结合游离的报道分子和结合的复合物(rmsa复合物)模拟以建立扩散梯度测定的模型。可使用报道分子和rmsa复合物(例如，结合的rmsa复合物)浓度模拟结果的线性组合生成标准曲线条件下的总荧光信号和测定得分。在标准曲线测量中，假设所有目标分泌的被分析物均与报道分子结合，因此[rmsa复合物]＝[分泌的被分析物]，并被从报道分子浓度中完全减去，给出[报道物]＝[报道物]o-[分泌的被分析物]。这些值可以乘以模拟值(以1的初始浓度开始)以得出总信号(以浓度单位表示)：[0628][0629]测定得分是信号经过如图40d所示的室连接区域中的两个位置的斜率，但由于空间距离对所有条件都是相同的，我们可以将得分简化为[0630]得分(t)＝信号(0,-125,20,t){红x}-信号(0,-75,20,t){蓝x}[0631]其中x大小以微米为单位，原点是室连接区域开口的中心，且流动区域深度为40微米。这种情况下的得分单位为δ浓度。[0632]利用信号和得分的关系，可以从报道分子和rmsa复合物的模拟创建标准曲线的条件。图40e显示了32μg/ml(213nm)分泌的被分析物和4μg/ml(1.7μm)报道物的测定区域中平均信号和测定得分，其中标绘了单个组分的贡献。由于初始的报道分子摩尔浓度要高得多，所以总信号和测定得分在早期由报道分子的贡献主导。报道分子的贡献比rmsa复合物减少得更快，因为它具有更高的扩散性。报道分子和目标对测定得分的贡献在830秒左右达到相等，之后测定得分由rmsa复合物的贡献主导。图6显示了标准曲线中使用的各种抗体浓度的测定得分。图6的插图中显示了580秒的单一标准曲线。观察到与图40f相同的趋势，其中随着时间的增加，观察到分泌的被分析物和报道物(例如可溶性报道分子)之间的相对分离更大，但总信号也显著降低。[0633]进行测量的合理时间是对目标浓度变化最敏感的时间，这由标准曲线的斜率表示。标准曲线的斜率(δnm信号/nm目标)随时间的变化如图40g所示。基于根据信号参比图像(例如荧光参比图像)设置测定暴露时间的假设，斜率已归一化为报道分子的浓度。如果在分泌测定期间使用相同的暴露时间，则这将设置测量动态范围的上边界。该图表明，开始冲洗后8-10分钟进行的测定将具有最高灵敏度，其中在540秒时最大。这种方法突出了报道分子和rmsa复合物的差异扩散与从坞的总扩散之间的竞争。在早期，信号主要来自报道分子，而在后期，总信号减少。该测定的最终目的是区分不同室之间的分泌。这种方法表明，最佳测量时间是当标准曲线的斜率最大化时。[0634]该预测接近经验确定的12分钟时间，表明该方法可能有利于应用于其他分子量组合。微流体芯片在冲洗过程中见到不含报道分子的介质之前的实际时间可能接近11分钟，因为在用于测定的计时器启动后会进行泵操作。此外，正如对扩散系数的讨论中所述，这两种物质的扩散性将被高估，因此这也可能是为什么预测建议在更早的时间点进行测量的原因之一。[0635]一个不同的感兴趣的分子量组合的实例是使用二抗来结合目标抗体。在这种情况下，报道分子的分子量为150kd，rmsa复合物为300kd。通过使用表3中提供的扩散系数，使用64μg/ml的报道分子浓度进行类似的分析，并且得到的相对于标准cld测定的灵敏度如图8所示。这是比标准cld测定中使用的spotlighthu3浓度低约4倍的摩尔浓度，因此，其灵敏度比如果使用与spotlighthu3-igg1条件相同的摩尔比时所见的灵敏度高4倍。然而，我们还必须假设kd足够低，以确保所有目标均与报道分子结合。无论如何，这种方法建议冲洗20-22分钟，以将针对这种分子量组合的测定灵敏度最大化。可以推断，在报道分子和目标分子具有相似分子量的情况下，可能能够进行扩散梯度测定。[0636]总之，已生成扩散梯度测定的数值模型，以预测最佳冲洗时间，从而将测定的灵敏度最大化。通过结合灌注期间报道分子和rmsa复合物从坞的扩散的独立模型，可以生成随时间的标准曲线，以确定哪个时间对坞中抗体浓度的变化最敏感。该方法预测，最佳测量时间为用介质冲洗通道后的8-10分钟，而实验确定的时间为12分钟。该预测与实验上使用的12分钟时间非常接近，表明该方法可能有助于应用于其他分子量组合。最后，然后考虑较低摩尔浓度的抗体大小的报道分子，并确定了在冲洗20-22分钟后，测定灵敏度最大化，尽管绝对灵敏度低于使用低分子量报道分子。[0637]此外，已经产生了一种估算测定何时最敏感的方法，并且该方法还可用于确定室内的哪个位置对目标分子浓度的变化最敏感。一个候选位置位于室的钩内。该位置离坞中的冲刷区域更远，所以此处的信号衰减完全是扩散性的，除非坞过度生长，否则颈部不应该有细胞。如图s2所示，使用平均信号代替斜率，并遵循正文中概述的相同方法，在560秒时产生了0.02718％动态范围/nm抗体的最大灵敏度，其与当前方法的最佳窗口大致相同(8-10分钟)。在与当前测定相同的条件下，测量钩中的平均信号比颈部信号的斜率，可使测定灵敏度增加2.8倍。这一发现必须经过实验验证，但该方法可用于为最佳测量位置提供量化估算。[0638]被分析物量化系统[0639]被分析物量化系统。根据各种实施方案，如上所述，讨论了用于测定微物体产生的被分析物的量的系统和方法。例如，被分析物可以包括来自微物体的分泌，其中微物体可以是生物微物体。被分析物可包括例如蛋白，糖，核酸，抗体，抗原，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。被分析物的量可以是相对量，如下所述。[0640]如上所述，根据各种实施方案，图26是用于确定微物体产生的被分析物的量的系统的示意图。如本文所示，系统3200可以包括图像获取单元3202、图像处理单元3204和显示器3212，其用于输出数据和经由相关联的输入设备(未示出)接收用户输入。[0641]如上所述，图像获取单元3202(例如但不限于，如上图1中所示的成像模块164)可以包括微流体装置支撑物3214(例如但不限于，如上图1和3b中所示的支撑结构104和300)和成像元件3216(例如但不限于，上文所述的成像装置194)。[0642]如上所述，微流体装置支撑物3214可以定向并设计为固定微流体装置。微流体装置可以包括本文所述的各种实例中的任何一个(例如但不限于，如上图1b-1c、2a-2b、2d、2g-2h、3a、4a-4c、5a-5c、9b、10b、11a-11b和12a-12b所示的微流体装置200、230、250、280、290、320、400、500、900、1000、1100和1200)。或者，支撑物3214可以与微流体装置集成。微流体装置可以包括流动区域和一个室，或者多个室，其可以与流动区域流体连接，其中每个室均可以容纳一个或多个微物体。如前所述，室可以是例如室。应该认识到，室可以根据其所用的特定应用的要求具有任何形状、大小或方向。如前所述，流动区域可以是单个微流体通道，或是多个微流体流动通道(例如但不限于，如上图1a和2a-2c所示的通道122，以及如上图2d-2f所示的流动通道264)，它们提供了单个流动通道或多个流动通道(例如但不限于，如上图1a和2b所示的流动通道106，和如上图2c-2d、4a-4c、5a、9b、10b、12a所示的介质242和278的流动通道)。流动区域可以与单个室或多个室流体连通。或者，流动区域可以通过可逆闭合装置(例如，阀门)与单个室或多个室流体连通。如前所述，流动区域可配置为通过入口接收材料流。材料流可以包括例如微物体、结合剂或试剂的流，或者包括材料的介质的流。微流体装置还可以被配置为通过流动通道接收结合剂(例如，报道分子)并流入室中。结合剂与被分析物结合后，可发射电磁辐射，例如由结合剂的可检测标记物发出的光(例如荧光、uv等)。被分析物可以包括，例如来自微物体的分泌物，其中微物体可以是生物微物体。被分析物可包括例如蛋白，糖，核酸，抗体，抗原，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。[0643]现在参考图34，该图示出了用于评估被分析物的量的示意图的实例，根据各种实施方案，成像元件216可以配置为捕捉微流体装置的多个室和流动区域的一个或多个测定图像3822。成像元件3216还可以被配置为捕捉一个或多个对应的背景图像3818和/或一个或多个对应的信号参比图像3820，这些图像将如下文详细讨论地与一个或更多测定图像3822一起分析和实现。[0644]在将任何外来物质(例如，微物体、结合剂或其他试剂)引入微流体装置之前，可以通过成像元件3216拍摄背景图像3818(参见图26)。如此，背景图像3818可以捕捉装置中的任何背景噪声，尤其是下文进一步讨论的受关注区域。背景噪声可能来源于，例如和如先前讨论的，伪影(artifacts)或仪器设置和成像参数-例如来自激发源的光、相机噪声和环境光。背景噪声也可能来源于，例如和如先前讨论的，样品、容器、成像介质的自荧光或不与特定目标结合的荧光团产生的荧光所导致的背景荧光。背景图像中包含什么图像区域取决于该图像在前进的系统中如何实现。例如，如上文所述，取决于使用的校准方法，可能需要不同的背景图像区域。[0645]在将结合剂引入室至结合剂(例如，报道物)浓度在受关注区域(“aoi”)中平衡的水平后，可以通过成像元件3216拍摄信号参比图像3820(参见图26)。如此，信号参比图像3820可以捕捉装置中的图像获取畸变。此类畸变可以源于例如微流体或成像元件设计。图像畸变类型可以包括例如图像边缘效果、透视畸变、桶形畸变(barreldistortion)、枕形畸变(pincushiondistortion)、胡子型畸变(mustachedistortion)和色差。信号参比图像区域可以包括aoi、靠近室的流动区域和相关aoi或两者的图像。信号参比图像中包含的图像区域取决于前进的系统如何实现该图像。例如，如下文更详细描述地，取决于系统实施的校准方法，可以使用不同的信号参比图像区域。在某些情况下，可以在引入不含结合剂(例如，报道物)的流体介质后拍摄信号参比图像，其中，在将含有结合剂的流体介质引入微流体装置后，灌注不含结合剂的流体介质；在此类情况下，信号参比图像可以称为“扩散参比图像”。[0646]如前文所讨论，图26的系统3200的图像处理单元3204可以与图像获取单元3202通信连接。类似地，图34的图像处理单元3804可以与图像获取单元3202通信连接。在各种实施方案中，图像处理单元3804可以包括受关注区域确定引擎3806(aoi引擎)和评分引擎3810。应该认识到，作为图像处理单元384的一部分示出(并在本文中描述)的每个组件(例如，引擎、模块等)可以作为硬件、固件、软件或其任意组合来实现。[0647]在各种实施方案中，图像处理单元3804可以作为具有图像获取单元3202的集成的仪器系统组合件来实现(参见图26)。也就是说，图像处理单元3804和图像获取单元3202可以被容纳在相同的壳体组合件中，并通过传统的设备/组件连接手段(例如，串行总线、光缆、电缆等)进行通信[0648]在各种实施方案中，图像处理单元3804可以作为独立的计算设备(如上文在图31中所示)来实现，其经由光学、串行端口、网络或调制解调器连接与图像获取单元3202通信连接。例如，图像处理单元可以经由lan或wan连接来连接，该lan或wan连接允许将由图像获取单元3202获取的成像数据传输到分析用图像处理单元3204。[0649]在各种实施方案中，图像处理单元3804的功能可以在共享计算机处理资源(诸如云计算网络)的分布式网络上实现，该分布式网络经由wan(或等效的)连接与图像获取单元3202通信连接。例如，图像处理单元3204的功能可以被划分为在诸如amazonwebservicestm的云处理服务上的一个或多个计算节点中实现。[0650]受关注区域确定引擎3806(aoi引擎)可以被设计和配置为从成像元件3216接收捕捉的测定图像(参见图26)，并对测定图像中示出的每个室定义aoi。可对受关注区域确定引擎3806进行编程，以通过在aoi内包括室中对测量被分析物浓度波动最敏感的图像区域来定义适当的aoi。例如，这将是室内的区域，其中可以通过成像元件3216测量电磁辐射如光发射(例如荧光、uv等)的最小波动(参见图26)。更进一步地，当测量被分析物波动时，图像区域可以包括对室中微物体位置最不敏感的图像区域。例如，这可以是室内的区域，其中电磁辐射如光发射(例如荧光、uv等)测量的灵敏度受室中存在的微物体的影响最小。aoi甚至可以进一步定义为位于室3702的非冲刷区域内(参见图35)。[0651]通过参考图35所示微流体装置的室3706的示例横截面，可以使用关于微流体装置及其相应室的空间信息来确定扩散轴3702。该空间信息可以源自系统3200中包含的cad模型、相关软件或单独的软件包，以生成定义的未对齐的aoi3824(参见图34)。然后，针对成像元件和微流体装置的校准算法可以将图像数据定位到该cad模型，以获得受关注区域3702。下文将更详细地讨论图35所示示例装置的组件和特征。[0652]回到图34，基于该定位应用空间校正变换3826，受关注区域确定引擎3806可以产生一组对齐的aoi3828。aoi可以从受关注区域确定引擎3806自动确定，或者可以通过用户输入到显示器3212中手动确定(参见图26)。[0653]如上所述，图26(和图27)的系统3200的评分引擎3210可以被设计和配置为分析每个室的受关注区域内的图像区域的至少一部分，以确定指示每个室中的被分析物的量的得分。此外，由于得分可以是无量纲的值，其可以通过评分引擎3210与其他得分进行比较，以指示被分析物的相对量或浓度，所确定的得分可以转换为用户的浓度单位。图34的评分引擎可以以基本上相同的方式操作。[0654]为了确定得分，根据各种实施方案，评分引擎3810可以使用各种模型，如上文参考图26和27所讨论的那些模型。此外，与上文关于图像处理单元3204所公开的内容相似，图像处理单元3804还可以包括校准引擎3808。校准引擎3808可以被设计和配置成针对由来自微流体装置并在测定图像捕捉期间的背景噪声引起的图像畸变，应用每个室的aoi归一化过程3838。然后可以通过评分引擎3810对得到的校准图像aoi进行评分。如上文所述，背景噪声可能是由于例如伪影或仪器设置和成像参数-例如，来自激发源的光、相机噪声和环境光。背景噪声还可以归因于例如由样品、容器、成像介质的自发荧光或由未与特定靶标结合的荧光团产生的荧光所赋予的背景荧光。测定图像捕捉期间的图像畸变可以源自例如微流体装置设计或成像装置设计。图像畸变类型可以包括例如图像边缘效应、投影仪不均匀性、相机晕光、透视畸变、桶形畸变、枕形畸变、胡须畸变和色差。[0655]校准引擎3808可以被设计和配置成针对在测定图像捕捉之前和/或在测定图像捕捉期间引入的来自微流体装置的图像畸变，对每个室的aoi或至少每个室的aoi的图像区域进行归一化。校准引擎3808可以通过从测定图像和/或信号参比图像中减去背景图像并且考虑在信号参比图像中捕捉的图像获取畸变来实现这一点。然后可以通过评分引擎3810对得到的归一化图像aoi进行评分。评分引擎3810可以被设计和配置为应用aoi量化过程3834来确定分泌得分3836。[0656]如上所述，存在各种模型用于将图像归一化以进行特征提取和异常检测。这里将不再赘述，在上文已详细讨论。[0657]根据各种实施方案，图像获取单元3802和图像处理单元3604可以集成到单个物理单元中。或者，图像获取单元3202(参见图26)和图像处理单元3804可以单独定向，在独立单元中提供，使得单元仍然通信连接以交换信息。[0658]上述图像处理单元3804的每个组件可以是硬件，或者可以部分或全部是软件模块。[0659]本文描述的方法可以根据应用通过各种手段来实现。例如，这些方法可以用硬件、固件、软件或其任何组合来实现。对于硬件实现，处理单元可以在一个或多个专用集成电路(asic)、数字信号处理器(dsp)、数字信号处理装置(dspd)、可编程逻辑装置(pld)、现场可编程门阵列(fpga)、处理器、控制器、微控制器、微处理器、电子设备、被设计用于执行本文所述功能的其他电子单元或其组合中实现。[0660]在各种实施方案中，本教导的方法可以以固件和/或软件程序以及用诸如c、c 等传统编程语言编写的应用程序实现。如果以固件和/或软件实现，则本文描述的实施方案可以在非暂态计算机可读介质上实现，其中存储有程序用于使计算机执行上述方法。应当理解，本文描述的各种引擎可以在计算机系统(例如图1的计算机系统3100)上提供，从而处理器3104将根据由存储器组件3106/3108/3110和通过输入设备3114提供的用户输入中的任何一个或其组合提供的指令来执行由这些引擎提供的分析和确定。[0661]如上文所详细讨论的，图17示出了根据各种实施方案，为了量化室中存在的分泌的被分析物的量所执行的功能。如上文所详细讨论的，图18示出了根据各种实施方案，为了计算代表分泌的被分析物的量的绝对值或相对值所执行的功能。如上文所详细讨论的，图19示出了根据各种实施方案，为了评估代表细胞克隆群中分泌的被分析物的量的绝对值或相对值所执行的功能。下文详细讨论了用于量化分泌的被分析物的量、用于计算代表分泌的被分析物的量的绝对值或相对值或用于评估代表细胞克隆群中分泌的被分析物的量的绝对值或相对值的方法的各种进一步的实施方案。[0662]方法1[0663]根据各种实施方案，提供了一种用于由评估生物微物体或生物微物体的群分泌的被分析物水平的方法。所述方法的实例在例如图36中所示。参考图36，在步骤3910将生物微物体3710(参见图35)引入室或微流体装置的室。参考图35，微流体装置可以包括具有流动区域3708的外壳，其中室3706(或室3706)与流动区域3708流体连接，并且其中室包含基本流体介质。允许生物微物体3710或由其生成的生物微物体的群将被分析物分泌到室内的基本流体介质中。[0664]回到图36，在步骤3920，将含有多个报道分子的第一流体介质引入流动区域和室。每个报道分子可以包括配置为与分泌的被分析物结合的结合区域和可检测的标记物。[0665]扩散到室中的多个报道分子的一部分可以与其中分泌的被分析物结合，从而在步骤3930产生多个报道基因:分泌的被分析物(rmsa)复合物。[0666]在步骤3940将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质不包含任何报道分子。然后，未结合的报道分子可以在步骤3950中扩散出室。然后，通过对相关一个或多个室和一个或多个流动区域拍摄的图像，在微流体装置3960内的受关注区域内检测报道分子。然后在步骤3970分析图像以计算室中的分泌产物水平。[0667]在各种实施方案中，受关注区域位于室的非冲刷区域内，例如如图35的3702所示。在各种实施方案中，受关注区域位于室内对室内细胞位置最不敏感的区域内。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室内的生物物体(例如细胞)至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。受关注区域也可以位于室内对由室边缘产生的人工背景信号最不敏感的区域中。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室边缘或壁至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。[0668]在一些实施方案中，报道分子可结合分泌的被分析物，从而形成rmsa复合物，其具有1:1、2:1、3:1、4:1、2:2、4:2等的rmsa复合物的报道分子:分泌的被分析物的化学计量比。[0669]在各种实施方案中，检测报道分子的步骤可以包括检测未结合的报道分子以及检测作为rmsa复合物一部分的报道分子。[0670]回到图35，例如，根据各种实施方案，室可以具有分离区域3705和将分离区域3705与流动区域3708流体连接的连接区域3704，其中分离区域3705和连接区域3704被配置为使得分离区域3705中任何实施的流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域3708中任何实施的流体介质的组分进行交换。[0671]根据用于评估或确定被分析物的分泌水平的各种实施方案，所述方法还包括将室内的生物微物体扩增为生物微物体的克隆群。[0672]根据用于评估或确定被分析物的分泌水平的各种实施方案，所述方法还可以包括用培养基对流动区域进行灌注，其中灌注可以在将生物微物体引入室之后以及在将第一流体介质引入流动区域之前进行。在一些实施方案中，当引入生物微物体时，培养基可以与室中的基本流体介质相同。培养基可以包括例如可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。在各种实施方案中，可以通过包括饲养细胞的上清液培养基的一部分来改善在微流体装置内培养的细胞的活力，所述饲养细胞的上清液培养基的一部分提供刺激或以其他方式支持在微流体装置内培养的细胞的辅助生物分子。饲养细胞本身可以不存在于微流体装置内，但可以在标准反应容器中培养。[0673]可以收集由于饲养细胞的存在而调节的培养基的部分并将其递送到微流体装置。在各种实施方案中，可以根据需要测量和改变溶解氧的量，与在培养孔板、摇瓶等中的这种调节相比，在本文所述的微流体环境中，这可能是个简便的过程。在各种实施方案中，可以监测和改变微流体环境内的培养基的ph，这也是比在标准使用的塑料器皿中更简便的过程。[0674]在各种实施方案中，可以将耗尽的生长培养基添加到微流体环境中，其可以充当选择机制以分析微流体环境中的哪些克隆仍然可以更容易地产生分泌的被分析物，或者可以用于接近各种类型的反应容器(其可以包括孔板、摇瓶和生物反应器)的放大环境。在各种实施方案中，可以向微流体环境内添加可溶性刺激性组分例如抗体(包括但不限于cd28)、细胞因子、生长因子等，以刺激微流体环境内的细胞比引入刺激性组分之前更快速地产生被分析物或产生不同的被分析物。在各种实施方案中，可以将一种或多种被配置为防止细胞彼此粘附以及粘附到室的化合物和/或试剂添加到培养基中。[0675]在各种实施方案中，向培养基中进行上述一种或多种添加可以对室内的一个或多个细胞赋予选择压力。[0676]在各种实施方案中，将第一流体介质引入流动区域包括在第一时间段内使第一流体介质流经流动区域。在一些实施方案中，第一时间段可基于未结合的报道分子的扩散谱的模拟。在各种实施方案中，第一时间段可以是约30至约60分钟。[0677]如上所述，根据各种实施方案，该方法还可以包括将第二流体介质引入到一个或多个流动区域和坞中，其中第二流体介质不包括报道分子；以及允许至少一部分未结合的报道分子从室中扩散出来，其中检测位于受关注区域内的报道分子在选择的时间发生，使得已经从室中扩散出来的未结合的报道分子的量比已经从室中扩散出来的rmsa复合物的量大至少2倍。检测可以包括检测未结合的报道分子和检测作为rmsa复合物一部分的报道分子。在各种实施方案中，将第二流体介质引入到流动区域中可以包括使第二流体介质在第二时间段流经流动区域。在一些实施方案中，可以基于未结合的报道分子和rmsa复合物的扩散谱的模拟来选择第二时间段。[0678]在各种实施方案中，受关注区域可以包括沿着从室内扩散出来进入流动区域中的轴对齐的室的至少一部分。在各种实施方案中，检测位于受关注区域内的报道分子可以包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中至少一些可检测信号是由位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出的。在一些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多的可检测信号是由位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出的。在各种实施方案中，检测位于受关注区域内的报道分子还可以包括通过从测量的可检测信号的强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。可能不用在每次检测报道分子时都测量背景信号。在各种实施方案中，可以基于已知/标准条件(例如，芯片类型、芯片中室的位置、可检测的标记物的类型、基本流体介质的组分)预先确定背景信号。[0679]根据各种实施方案，可以在将生物微物体引入室之前的时间测量受关注区域内的背景信号强度。在各种实施方案中，可检测信号的测量强度或减去背景的信号强度可针对室中观察到的多个生物物体(例如细胞)进行归一化。[0680]在各种实施方案中，可以量化被分析物的分泌水平，其中量化可以基于许多测量中的任何一项，例如可检测信号的测量强度或减去背景的信号强度，其任何一项都可以通过视场中的渐晕(相对于图像中心，图像的亮度或饱和度朝向边缘而降低)进行归一化。[0681]在各种实施方案中，可以提供或确定室的分泌得分。下文将详细讨论分泌评分。[0682]在各种实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以是报道分子的分子量的至少两倍。在一些实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少四倍。在其他实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少十倍。[0683]在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含肽或蛋白。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含具有seqidno：1至10中任一项的序列的肽。在各种实施方案中，报道分子的结合组分包含蛋白a、蛋白g或者蛋白a或蛋白g的igg结合片段。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含适体。[0684]在各种实施方案中，可检测的标记物可以包括例如可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。在各种实施方案中，可检测的标记物可以是荧光标记物。[0685]在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物可以包括蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物可以是抗体。在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物可以是除抗体以外的蛋白。[0686]在各种实施方案中，微流体装置可以包括多个室，其中布置步骤可以包括将生物微物体布置在多个室的至少一部分内。在各种实施方案中，如图36所示例的方法还可以包括比较多个室的室子组中每个室的分泌水平的步骤。该方法还可以包括比较多个室中多于一个室的得分的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括对分泌水平进行量化的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括选择多个室中的一个或多个以及从所选的一个或多个室中输出生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。[0687]根据本文中各种实施方案的方法可以允许进行亚克隆和通过进一步扩增和测定所得亚克隆群而对亚克隆进行比较分析。这可以例如通过将所选的克隆群移动到微流体装置内的另一组室并且针对所选的群的每个单独细胞再次扩增来实现。在各种实施方案中，如图36所示例的方法还可以包括输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群到流动区域(或通道)，或从微流体装置中输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。在各种实施方案中，可以在每个所选的室上单独地执行从室输出到通道或从室和/或通道输出离开微流体装置的步骤(例如，可以在一系列输出步骤中输出来自一组所选的室的细胞，每次一个室)。在各种实施方案中，布置在室内的细胞可以来自先前测定的室，允许进行亚克隆和对亚克隆进行比较分析。例如，特定抗体的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量特异性抗体的细胞。类似地，蛋白家族(例如具有igg结构域的抗体)的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量抗体的细胞。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的室的所有细胞将被选择并在相同的室或芯片的其他包含区域中扩增。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的相同室的一个或多个细胞将被选择并在不同的室中扩增。在各种实施方案中，可以对扩增的细胞重复(1x、2x、3x、4x或更多次)执行生成分泌的被分析物的相对或绝对值。[0688]根据各种实施方案，本文讨论的各种方法的应用可以允许通过重复测定的反馈来检查特定条件对细胞的影响。例如，可以使用与分泌的被分析物的大规模生产更密切相关的条件和材料，以便找到并表征最合适的克隆用于进一步检查。在另一个实例中，可以以更可重复的方式检查用于b细胞抗体刺激的不同刺激方案，并且可以对其进行测定以便更一致地评估一种方案相对于另一种方案的益处。[0689]方法2[0690]根据各种实施方案，提供了一种用于评估生物微物体或生物微物体的群的被分析物分泌水平的方法。例如，图37中示出了所述方法的一个实例。参考图37，在步骤4010中，向一个或多个流动区域(通道)和室提供包含多个报道分子的第一流体介质。在各种实施方案中，这些报道分子包含被配置成结合分泌的被分析物的结合组分；和可检测的标记物。[0691]在步骤4020，拍摄室和流动区域的图像，以测量受关注区域内可检测信号的强度。然后在步骤4030，将不包含任何报道分子的第二流体介质引入流动区域。然后在4040，将生物微物体引入室。允许生物微物体将被分析物分泌到室内的介质中。然后在步骤4050，将包含多个报道分子的第三流体介质引入流动区域。在步骤4060，扩散到室中的多个报道分子的一部分可以与其中分泌的被分析物结合，产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物。然后，通过对一个或多个相关室和流动区域拍摄的图像，检测微流体装置4070内受关注区域内的报道分子。然后在步骤4080分析图像以计算一个或多个室中的分泌产物的水平。[0692]在各种实施方案中，受关注区域包括室的至少一部分，其沿着从室内向外扩散到流动区域中的轴排列。图28中提供了一个实例。如图27和28所示，受关注区域可以被划分为多个区段3230。可以对每个区段3232计算平均信号，并可以将其针对区间3234的子部分进行量化。这可以用于确定分泌得分3236。[0693][方法3]或者，根据各种实施方案，受关注区域位于室的非冲刷区域内，例如如图35的3702所示。在各种实施方案中，受关注区域位于室中对室内细胞位置最不敏感的区域内。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室内的生物物体(例如细胞)至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。受关注区域也可以位于室中对室边缘产生的人工背景信号最不敏感的区域。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室边缘或壁至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。[0694]在各种实施方案中，报道分子可结合分泌的被分析物，从而形成rmsa复合物，其具有1:1、2:1、3:1、4:1、2:2、4:2等的rmsa复合物的报道分子:分泌的被分析物的化学计量比。[0695]在各种实施方案中，检测报道分子的步骤可以包括检测未结合的报道分子以及检测作为rmsa复合物一部分的报道分子。[0696]根据用于评估或确定被分析物分泌水平的各种实施方案，该方法还包括将室内的生物微物体扩增为生物微物体的克隆群。[0697]根据用于评估或确定被分析物的分泌水平的各种实施方案，所述方法还可以包括用培养基对流动区域进行灌注，其中灌注可以在将生物微物体引入室之后以及在将第一流体介质引入流动区域之前进行。在一些实施方案中，当引入生物微物体时，培养基可以与室中的第二介质相同。培养基可以包括例如可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。在各种实施方案中，可以通过包括饲养细胞的上清液培养基的一部分来改善在微流体装置内培养的细胞的活力，所述饲养细胞的上清液培养基的一部分提供刺激或以其他方式支持在微流体装置内培养的细胞的辅助生物分子。饲养细胞本身可以不存在于微流体装置内，而是可以在标准反应容器中培养。[0698]可以收集由饲养细胞的存在而调节的培养基的部分并将其递送到微流体装置。在各种实施方案中，可以根据需要测量和改变溶解氧的量，与在培养孔板、摇瓶等中的这种调节相比，在本文所述的微流体环境中，这可能是更简便的过程。在各种实施方案中，可以监测和改变微流体环境内的培养基的ph，这也是比在标准使用的塑料器皿中更简便的过程。[0699]在各种实施方案中，可以将耗尽的生长培养基添加到微流体环境中，其可以充当选择机制以分析微流体环境中的哪些克隆仍然可以更容易地产生分泌的被分析物，或者可以用于接近各种类型的反应容器(其可以包括孔板、摇瓶和生物反应器)的放大环境。在各种实施方案中，可以添加可溶性刺激性组分例如抗体(包括但不限于cd28)、细胞因子、生长因子等，其可以刺激微流体环境内的细胞比引入刺激性组分之前更快速地产生被分析物或产生不同的被分析物。在各种实施方案中，可以将一种或多种被配置为防止细胞彼此粘附以及粘附到室的化合物和/或试剂添加到培养基中。[0700]在各种实施方案中，向培养基中进行上述一种或多种添加可以对室内的一个或多个细胞赋予选择压力。[0701]在各种实施方案中，受关注区域可以包括沿着从室内扩散出来进入流动区域中的轴对齐的室的至少一部分。在各种实施方案中，检测位于受关注区域内的报道分子可以包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中至少一些可检测信号是由位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出的。在一些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多的可检测信号是由位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出的。在一些实施方案中，检测位于受关注区域内的报道分子还可以包括通过从测量的可检测信号的强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。可能不必在每次检测报道分子时测量背景信号。在各种实施方案中，可以基于已知/标准条件(例如，芯片类型、芯片中室的位置、可检测的标记物的类型、流体介质的组分)预先确定背景信号。[0702]根据各种实施方案，可以在将生物微物体引入室之前的时间测量受关注区域内的背景信号强度。在各种实施方案中，可检测信号的测量强度或减去背景的信号强度可针对室中观察到的多个生物物体(例如细胞)进行归一化。[0703]在各种实施方案中，该方法可进一步包括定量被分析物的分泌水平。对产物分泌水平的量化可基于多种测量，如前文讨论的那些中的任一种。[0704]在各种实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以是报道分子的分子量的至少两倍。在一些实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少四倍。在其他实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少十倍。[0705]在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含肽或蛋白。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含具有seqidno：1至10中任一项的序列的肽。在各种实施方案中，报道分子的结合组分包含蛋白a、蛋白g或者蛋白a或蛋白g的igg结合片段。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含适体。[0706]在各种实施方案中，可检测的标记物可以包括例如可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。在各种实施方案中，可检测的标记物可以是荧光标记物。[0707]在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物可以包括蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物可以是抗体。在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物可以是除抗体以外的蛋白。[0708]在各种实施方案中，微流体装置可以包括多个室，其中布置步骤可以包括将生物微物体布置在多个室的至少一部分内。在各种实施方案中，如图37所示例的方法还可以包括比较多个室的室子组中每个室的分泌水平的步骤。该方法还可以包括比较多个室中多于一个室的得分的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括对分泌水平进行量化的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括选择多个室中的一个或多个以及从所选的一个或多个室中输出生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。[0709]如上文详细描述的，根据本文中各种实施方案的方法可以允许进行亚克隆和通过进一步扩增和测定所得亚克隆群而对亚克隆进行比较分析。这可以通过将所选的克隆群移动到微流体装置内的另一组室并且针对所选的群的每个单独细胞再次扩增来实现。在各种实施方案中，如图37所示例的方法还可以包括输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群到流动区域(或通道)，或从微流体装置中输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。在各种实施方案中，可以在每个所选的室上单独地执行从室输出到通道或从室和/或通道输出离开微流体装置的步骤(例如，可以在一系列输出步骤中输出来自一组所选的室的细胞，每次一个室)。在各种实施方案中，布置在室内的细胞可以来自先前测定的室，允许进行亚克隆和对亚克隆进行比较分析。例如，特定抗体的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量特异性抗体的细胞。类似地，蛋白家族(例如具有igg结构域的抗体)的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量抗体的细胞。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的室的所有细胞将被选择并在相同的室或芯片的其他包含区域中扩增。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的相同室的一个或多个细胞将被选择并在不同的室中扩增。在各种实施方案中，可以对扩增的细胞重复(1x、2x、3x、4x或更多次)执行生成分泌的被分析物的相对或绝对值。[0710]如上所述，本文讨论的各种实施方案的应用可以允许通过重复测定的反馈来检查特定条件对细胞的影响。例如，可以使用与分泌的被分析物的大规模生产更密切相关的条件和材料，以便找到并表征最合适的克隆用于进一步检查。在另一个实例中，可以以更可重复的方式检查用于b细胞抗体刺激的不同刺激方案，并且可以对其进行测定以便更一致地评估一种方案相对于另一种方案的益处。[0711]方法3(参见方法2部分，该部分讨论了方法2的交替钩区域到颈部区域的实施方案)[0712]方法4[0713]根据各种实施方案，提供了一种用于评估生物微物体或微物体的群的被分析物分泌水平的方法。图38示出了描述该方法的示例过程的工作流程。在步骤4110，向一个或多个流动区域(通道)和室提供包含多个报道分子的第一流体介质。在各种实施方案中，这些报道分子包含被配置成结合分泌的被分析物的结合组分；和可检测的标记物。[0714]回到图38，在步骤4120，拍摄一个或多个室和流动区域的图像，以测量受关注区域内可检测信号的强度。然后在步骤4130，将不包含任何报道分子的第二流体介质引入流动区域。然后在步骤4140，将生物微物体引入室。允许生物微物体将被分析物分泌到室内的介质中。[0715]然后在步骤4150，将包含多个报道分子的第三流体介质引入流动区域。此外，随后允许多个报道分子的一部分扩散到室中。在步骤4160，报道分子与其中分泌的被分析物结合以产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物。[0716]在步骤4170中，拍摄一个或多个室和流动区域的图像，以检测微流体装置内的受关注区域内的报道分子。在步骤4180，将不包含任何报道分子的第四流体介质提供到一个或多个室和流动区域，以促进报道分子扩散出室。然后，通过对相关一个或多个室和流动区域拍摄的图像，在微流体装置4190内的受关注区域内检测报道分子。然后在步骤4195，分析图像以计算室中的分泌产物水平。[0717]在各种实施方案中，受关注区域包括室的至少一部分，其沿着从室内向外扩散到流动区域中的轴排列。图28中提供了一个实例。如图27和28所示，受关注区域可以被划分为多个区段3230。可以对每个区段3232计算平均信号，并可以将其针对区间3234的子部分进行量化。这可以用于确定分泌得分3236。[0718][方法5]或者，根据各种实施方案，受关注区域位于室的非冲刷区域内，例如如图35的3702所示。在各种实施方案中，受关注区域位于室中对室内细胞位置最不敏感的区域内。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室内的生物物体(例如细胞)至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。受关注区域也可以位于室中对室边缘产生的人工背景信号最不敏感的区域。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室边缘或壁至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。[0719]关于形成的rmsa复合物的化学计量以及其检测，请参考上文的详细讨论。[0720]根据各种实施方案，关于室和流动区域的特征，请参考上文的详细讨论。[0721]关于有关微物体的克隆群、用培养基灌注流动区域、培养基组成、耗尽的生长培养基、可溶性刺激组分、受关注区域、减去背景的信号、信号归一化、分泌得分、分泌的被分析物分子量、报道分子组成(例如，氨基酸、核酸)、可检测的标记物的特征和性质以及分泌的被分析物的组成的讨论，请参考上文的详细讨论。[0722]在各种实施方案中，微流体装置可以包括多个室，其中布置或提供生物微物体的步骤可以包括将生物微物体布置或提供在多个室的至少一部分内。在各种实施方案中，所述方法还可以包括比较多个室的室子组中每个室的分泌水平的步骤。该方法还可以包括比较多个室中多于一个室的得分的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括对分泌水平进行量化的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括选择多个室中的一个或多个以及从所选的一个或多个室中输出生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。[0723]根据本文中各种实施方案的方法可以允许进行亚克隆和通过进一步扩增和测定所得亚克隆群而对亚克隆进行比较分析。这可以例如通过将所选的克隆群移动到微流体装置内的另一组室并且针对所选的群的每个单独细胞再次扩增来实现。在各种实施方案中，所述方法还可以包括输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群到流动区域(或通道)，或从微流体装置中输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。在各种实施方案中，可以在每个所选的室上单独地执行从室输出到通道或从室和/或通道输出离开微流体装置的步骤(例如，可以在一系列输出步骤中输出来自一组所选的室的细胞，每次一个室)。在各种实施方案中，布置在室内的细胞可以来自先前测定的室，允许进行亚克隆和对亚克隆进行比较分析。例如，特定抗体的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量特异性抗体的细胞。类似地，蛋白家族(例如具有igg结构域的抗体)的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量抗体的细胞。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的室的所有细胞将被选择并在相同的室或芯片的其他包含区域中扩增。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的相同室的一个或多个细胞将被选择并在不同的室中扩增。在各种实施方案中，可以对扩增的细胞重复(1x、2x、3x、4x或更多次)执行生成分泌的被分析物的相对或绝对值。[0724]在另一个实施方案中，该方法的应用可以允许通过重复测定的反馈来检查特定条件对细胞的影响。例如，可以使用与分泌的被分析物的大规模生产更密切相关的条件和材料，以便找到并表征最合适的克隆用于进一步检查。在另一个实例中，可以以更可重复的方式检查用于b细胞抗体刺激的不同刺激方案，并且可以对其进行测定以便更一致地评估一种方案相对于另一种方案的益处。[0725]方法5[见上文段落][0726]方法6[0727]根据各种实施方案，提供了一种用于评估被分析物在多个生物微物体或生物微物体的群间的相对分泌水平的方法。图39示出了描述该方法示例过程的工作流程。如图39所示，所述方法包括可选步骤4210、4220、4230、4270和4280，根据各种实施方案，这些步骤可以选择性地执行以增强测量，例如，在实验期间增加信噪比、消除背景噪声或纠正系统错误。下文进一步描述了可选步骤4210、4220、4230、4270和4280中的每一步。[0728]参考图39，步骤4240的方法包括将包含多个生物微物体的第一流体介质引入微流体装置的多个室。在各种实施方案中，微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中多个室中的每个室均与流动区域流体连接。在微流体装置内，允许多个生物微物体或生物微物体的群将可溶性被分析物分泌到多个室内的第一流体介质中。[0729]根据各种实施方案，在步骤4250，所述方法包括将第二流体介质引入流动区域。第二流体介质包含多个可溶性报道分子，其中每个可溶性报道分子均包含被配置为结合分泌的被分析物的结合组分和可检测的标记物。另外，随后允许多个可溶性报道分子的一部分扩散到室中。[0730]在步骤4260，可溶性报道分子与其中分泌的被分析物结合，以产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物。然后，在步骤4290，通过将位于微流体装置内的受关注区域内的可溶性报道分子成像并在步骤4295中分析图像以计算微流体装置的室中的分泌或分泌产物的相对水平来检测这些复合物。[0731]在各种实施方案中，多个室中的每个室均包括分离区域，该分离区域与流动区域中第二流体介质的二次流动分离。在各种实施方案中，多个室中的每个室均包括与流动区域中第二流体介质的直接流动分离的连接区域。[0732]在各种实施方案中，多个生物微物体的单个生物微物体被布置到多个室中的单个室中。在各种实施方案中，可溶性报道分子的浓度为被分析物的可溶性报道分子的kd的约1-10倍。[0733]在各种实施方案中，以约0.1-10秒的刷新率刷新流动区域中的第二流体介质，并且刷新率是替换流动区域中全部流体体积的时间段。[0734]在各种实施方案中，允许多个报道分子的一部分扩散进入多个室中包括允许多个报道分子跨流动区域和多个室达到平衡状态。在各种实施方案中，在引入第二流体介质后3小时内达到平衡状态。[0735]在各种实施方案中，所述方法进一步包括获得多个室中每个室的分泌水平或分泌得分和基于获得的分泌得分对多个室进行评级。[0736]在各种实施方案中，可溶性报道分子包含至少两个不同的报道分子，每个报道分子均具有不同的标记物。在各种实施方案中，每个室均包括朝向流动区域的单个开口。在各种实施方案中，流动区域包括微流体通道，并且每个室均包括分离区域和将分离区域与微流体通道流体连接的连接区域。连接区域具有朝向微流体通道的近端开口和朝向分离区域的远端开口。[0737]在各种实施方案中，受关注区域包括室的至少一部分，其沿着从室内向外扩散到流动区域中的轴排列。图28中提供了一个实例。如图27和28所示，受关注区域可以被划分为多个区段3230。可以对每个区段3232计算平均信号，并可以将其针对区间3234的子部分进行量化。这可以用于确定分泌得分3236。或者，根据各种实施方案，受关注区域位于室的非冲刷区域内，例如如图35的3702所示。在各种实施方案中，受关注区域位于室中对室内细胞位置最不敏感的区域内。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室内的生物物体(例如细胞)至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。受关注区域也可以位于室中对室边缘产生的人工背景信号最不敏感的区域。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室边缘或壁至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。[0738]在各种实施方案中，受关注区域至少部分位于室的分离区域内。在各种实施方案中，受关注区域位于室的钩区域内。在各种实施方案中，受关注区域靠近多个生物微物体中的生物微物体所在的区域。[0739]在各种实施方案中，受关注区域沿着在多个室和流动区域之间扩散的轴(例如沿着在多个室的分离区域和微流体通道之间扩散的轴，例如沿着连接区域定义的扩散的轴)。在各种实施方案中，受关注区域不沿着在多个室和流动区域之间扩散的轴(例如不沿着在多个室的分离区域和微流体通道之间扩散的轴，例如不沿着连接区域定义的扩散的轴)。[0740]在各种实施方案中，受关注区域包括对应于多个室中的室内的区域的图像区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，并且在测量被分析物波动时对室中生物微物体的位置最不敏感。[0741]在各种实施方案中，检测位于微流体装置内受关注区域内的报道分子是在报道分子扩散至多个室中并且报道分子与其中分泌的被分析物的结合处于稳态条件或接近稳态条件之后进行的。[0742]如图39所示，所述方法包括可选步骤4280，将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含任何报道分子，以促进或允许至少一部分未结合的可溶性报道分子扩散出多个室。[0743]在各种实施方案中，来自第二流体介质的多个可溶性报道分子是第一批多个可溶性报道分子，并且在将多个生物微物体引入微流体装置的多个室之前。在各种实施方案中，所述方法任选地包括在可选步骤4210将第四流体介质引入流动区域，其中第四流体介质包含第二批多个可溶性报道分子。[0744]所述方法还包括在可选步骤4220获取包含多个室和流动区域的微流体装置的图像，随后在可选步骤4230将第五流体介质引入流动区域，其中第五流体介质不包含可溶性报道分子。[0745]在各种实施方案中，图像是在t＝0时获取的第一图像，可溶性报道分子的检测包括在可选步骤4270在t＝1时获取第二图像。在t＝l时，流动区域和多个室之间的未结合的可溶性报道分子的扩散已接近稳态。在各种实施方案中，第二图像用于确定流动区域和多个室之间的未结合的报道分子的扩散是否已达到稳态。[0746]在各种实施方案中，受关注区域包括多个室中每个室的连接区域的至少一部分，所述方法进一步包括：从第二图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室的至少一部分确定包含每个连接区域的至少一部分的受关注区域内的可溶性rmsa复合物的相对量。在各种实施方案中，受关注区域中的可溶性rmsa复合物的相对量用于生成可溶性rmsa复合物量的变化的线性近似值，并且线性近似值的斜率用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。[0747]在各种实施方案中，所述方法进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第二图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[0748]在各种实施方案中，受关注区域是多个室中每个室的钩区域，所述方法进一步包括：从第二图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室的至少一部分量化钩区域中可溶性rmsa复合物的相对量，其中钩区域中可溶性rmsa复合物的相对量用于比较各个室之间分泌的可溶性被分析物的产生。[0749]在各种实施方案中，所述方法进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第二图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[0750]在各种实施方案中，第一批多个可溶性报道分子和第二批多个可溶性报道分子包含相同的标记物。在各种实施方案中，第一批多个可溶性报道分子和第二批多个可溶性报道分子包含两种不同的报道分子，每种报道分子均具有不同的标记物。[0751]在各种实施方案中，所述图像是在t＝0时获取的第一图像，所述方法进一步包括：在将第三流体介质引入流动区域之前，并且在允许多个可溶性报道分子的部分扩散到多个室中并与其中分泌的可溶性被分析物结合之后，获取微流体装置的第二图像。[0752]在各种实施方案中，报道分子的检测包括获取微流体装置的第三图像。[0753]在各种实施方案中，受关注区域包括多个室中每个室的连接区域的至少一部分，所述方法进一步包括：从第三图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室的至少一部分量化每个连接区域的多个子区域中每个子区域中的可溶性rmsa复合物的量，其中多个子区域中部分子区域中的可溶性rmsa复合物的量用于生成线性近似值，并且线性近似值的斜率用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。[0754]在各种实施方案中，所述方法进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[0755]在各种实施方案中，所述方法进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像、第二图像和背景图像来获得校正图像。[0756]在各种实施方案中，受关注区域是多个室中每个室的钩区域，所述方法进一步包括：从第三图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室中的至少一部分量化钩区域中的rmsa复合物的量，其中钩区域中rmsa复合物的量用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。[0757]在各种实施方案中，所述方法进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[0758]在各种实施方案中，所述方法进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像、第二图像和背景图像来获得校正图像。[0759]在各种实施方案中，分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少两倍。在各种实施方案中，分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少四倍。在各种实施方案中，分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少十倍。在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物包括蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸之外的有机分子，囊泡或病毒。在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物是抗体，或任选地是糖基化抗体。[0760]在各种实施方案中，报道分子的结合组分与抗体重链h1结构域结合。在各种实施方案中，报道分子的结合组分与抗体轻链(例如，包含轻链肽的一个或多个氨基酸残基的表位)结合。在各种实施方案中，报道分子的结合组分与λ轻链(例如，包含λ轻链肽的一个或多个氨基酸残基的表位)结合。在各种实施方案中，报道分子的结合组分与κ轻链(例如，包含κ轻链肽的一个或多个氨基酸残基的表位)结合。[0761]在各种实施方案中，生物微物体被引入多个室的至少两个室中的每个室，并且其中所述方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每个室进行的。[0762]在各种实施方案中，所述方法进一步包括：比较多个室的至少两个室的室分泌水平。在各种实施方案中，所述方法进一步包括：比较多个室中多于一个室的分泌得分。[0763]在各种实施方案中，将多个生物微物体引入微流体装置的多个室中包括选择生物微物体和选择性地将所选择的生物微物体移动到多个室内。在各种实施方案中，所述选择是正选择(例如，对生物微物体进行指示健康细胞或表达构建体在细胞基因组中成功/靶向整合的标志物的染色，并且选择阳性染色的生物微物体)。在各种实施方案中，提供了一种方法，其中所述选择是负选择(例如，对生物微物体进行指示不健康细胞或表达构建体在细胞基因组中未成功整合的标志物的染色，并且选择未被染色的生物微物体)。可用于正选择或负选择的标志物的非限制性实例包括但不限于：可评估细胞活力的试剂(例如，膜联蛋白v、碘化丙啶等)、可评估代谢状态的试剂(例如，线粒体膜电位试剂“mitoid染色”)、可评估igg表达的试剂(例如，蛋白-afitc、多克隆ab、抗fc荧光团等)、靶向一种或多种细胞表面标志物的抗原特异性染色剂和/或葡萄糖摄取试剂(例如，2-nbdg)。[0764]在各种实施方案中，提供了一种克隆系发育方法，其进一步包括：从多个室中选择一组室，其中该组室的每个室均具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分；从微流体装置输出包含在选择的一组室的每个室中的一个或多个生物微物体；在相应的反应容器中扩增从选择的一组室的每个室中输出的一个或多个生物微物体；以及测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而对每个生物微物体或克隆群确定分泌水平。[0765]关于形成的rmsa复合物的化学计量以及其检测，请参考上文的详细讨论。[0766]根据各种实施方案，关于室和流动区域的特征，请参考上文的详细讨论。[0767]关于有关微物体的克隆群、用培养基灌注流动区域、培养基组成、耗尽的生长培养基、可溶性刺激组分、受关注区域、减去背景的信号、信号归一化、分泌得分、分泌的被分析物分子量、报道分子组成(例如，氨基酸、核酸)、可检测的标记物的特征和性质以及分泌的被分析物的组成的讨论，请参考上文的详细讨论。[0768]在各种实施方案中，微流体装置可以包括多个室，其中布置或提供生物微物体的步骤可以包括将生物微物体布置或提供在多个室的至少一部分内。在各种实施方案中，所述方法还可以包括比较多个室的室子组中每个室的分泌水平的步骤。该方法还可以包括比较多个室中多于一个室的得分的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括对分泌水平进行量化的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括选择多个室中的一个或多个以及从所选的一个或多个室中输出生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。[0769]根据本文中各种实施方案的方法可以允许进行亚克隆和通过进一步扩增和测定所得亚克隆群而对亚克隆进行比较分析。这可以例如通过将所选的克隆群移动到微流体装置内的另一组室并且针对所选的群的每个单独细胞再次扩增来实现。在各种实施方案中，所述方法还可以包括输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群到流动区域(或通道)，或从微流体装置中输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。在各种实施方案中，可以在每个所选的室上单独地执行从室输出到通道或从室和/或通道输出离开微流体装置的步骤(例如，可以在一系列输出步骤中输出来自一组所选的室的细胞，每次一个室)。在各种实施方案中，布置在室内的细胞可以来自先前测定的室，允许进行亚克隆和对亚克隆进行比较分析。例如，特定抗体的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量特异性抗体的细胞。类似地，蛋白家族(例如具有igg结构域的抗体)的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量抗体的细胞。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的室的所有细胞将被选择并在相同的室或芯片的其他包含区域中扩增。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的相同室的一个或多个细胞将被选择并在不同的室中扩增。在各种实施方案中，可以对扩增的细胞重复(1x、2x、3x、4x或更多次)执行生成分泌的被分析物的相对或绝对值。[0770]在另一个实施方案中，该方法的应用可以允许通过重复测定的反馈来检查特定条件对细胞的影响。例如，可以使用与分泌的被分析物的大规模生产更密切相关的条件和材料，以便找到并表征最合适的克隆用于进一步检查。在另一个实例中，可以以更可重复的方式检查用于b细胞抗体刺激的不同刺激方案，并且可以对其进行测定以便更一致地评估一种方案相对于另一种方案的益处。[0771]问题解决方案[0772]如上文所述，微流体组件通常包括一系列室或样品位置。其中许多组件通常包括一个或多个入口和出口，用于将样品、试剂、探针等移入或移出室或样品位置，以促进微流体组件内的反应和检测。通常情况下，室或样品位置相对于入口和出口串联放置，因此某些室位于更靠近入口的位置，而其他室则位于更靠近出口的位置。因此，产生了一个技术问题，因为这些配置可能会由于室靠近入口和/或出口而在样品、试剂或微物体的浓度中产生固有梯度，这可能会在比较室之间的平衡值时无意中导致测量中的系统偏差。[0773]为了说明这一技术问题，请考虑如果报道分子通过所讨论的入口递送，靠近入口的室通常将比靠近出口的室接收更多的报道分子。因此，可能需要不同的时间段来让每个室内的荧光检测达到平衡状态，该时间段取决于室相对于入口和/或出口的位置。在微流体装置中的多个室间获得了与时间相关的现象的相对测量的情况下，技术问题通过在芯片上达到平衡状态所需时间的差异体现出来。这种差异可能导致相对测量(得分、数值等)较不准确地表示芯片上每个室的测量现象，和/或限制可测定的测量组分的动态范围。[0774]例如，该技术问题扩展到了组件包括冲洗程序以清除之前递送至组件的物质(例如，在该情况下是报道分子)的情况。在本实例情况中，技术问题再次体现出来，因为报道分子的冲洗也会在各个室间具有不均匀的性能。与上述实例一样，在这些类型的冲洗情况下，虽然靠近入口的室将具有更多的报道分子，但由于它们靠近入口，它们将比靠近出口的室更能成功地冲洗出更多的报道分子。因此，与微流体组件中的其他室相比，每个室可能还是缺乏相对均匀的报道分子分布，因为样品、试剂或微物体扩散出室并进入通道，形成在靠近入口处前室(upfrontchamber)的通道区域和靠近出口近端处的后室(latterchamber)的通道区域之间的跨通道的浓度梯度。由于测量组分(例如，样品、试剂或微物体等)在通道和室中之间的浓度差异与扩散速率常数成正比，因此与测量组分扩散相关的任何相对测量或得分都将具有系统偏差。[0775]因此，对于包括一系列室或样品位置、入口和出口的微流体组件，需要解决的一个技术问题是：当任何递送的组分(例如，样品、试剂或探针)分布不均时，可能导致与每个室相关的相对指标如室中可溶性分泌的被分析物的相对浓度发生误差。[0776]本文提供的各种实施方案，例如图37和38所示的那些示例性实施方案，解决了所述技术问题，原因至少如下提供。[0777]申请人意外地发现，微流体组件(例如，微流体芯片)的一系列室或样品位置间的系统误差的技术问题可以通过优化的刷新率(例如，流体交换率、交换率)，例如约0.1-10秒来减少。刷新率可以是通道体积与流速的比率，也就是说，通道的全部体积被新试剂替换的速率。因此，优化刷新率使流体通道成为更好的试剂源(例如，跨微流体装置的试剂浓度更一致)。这一点很重要，因为随着流动区域(例如通道)成为跨微流体芯片的更一致的“源”，在邻近分泌的被分析物或室中的“槽(sink)”的区域，条件(例如，游离报道物穿过通道并进入室的梯度)变得更一致，从而提高扩散到室外的rmsa复合物产生的信号的信噪比。[0778]微流体组件(例如，微流体芯片)的一系列室或样本位置间的系统误差的技术问题也可以通过校正获取的图像来解决，以克服芯片上的噪声影响(例如，平场校正)。如所述，可以使用背景参比和信号参比(例如，荧光参比和扩散参比)来完成校正。此外，获取多个图像可以进一步帮助平均噪声。[0779]通过减少整个微流体组件(例如芯片)的系统误差(例如，入口处室环境和出口处室环境中的误差)，提高了对整个系统的室的相对评分的准确性。当报道物流入通道时(冲洗步骤之前)，通过例如使用平衡(即稳态)测定进行成像，可以改善整个系统的相对评级/评分。这样做还导致操作参数的意外发现。例如，发现被引入通道的可溶性报道物的最佳浓度在约1-10倍kd(解离常数，以浓度表示)的范围内。此外，例如，跨通道和室的试剂平衡时间可配置为在约1-3小时内发生。这些以及其他优化参数实例增加了测量的信噪比，从而改善了对芯片上室的评级/评分。[0780]除了解决技术问题外，这些参数共同进一步使得可以使用不同分子量的试剂以及在不同分子量的分泌的被分析物上进行测定。在各种实施方案中，相同的方案与不同分子量的试剂的各种组合一起使用，并用于不同分子量的分泌的被分析物。在各种实施方案中，相同的方案与单试剂一起使用，以检测不同重量的分泌的被分析物。在各种实施方案中，相同的方案与不同分子量的试剂一起使用并用于不同分子量的分泌的被分析物。[0781]此外，由于使用平衡(例如，稳态)测定的成像与时间无关，因此可以获取多个图像并用于平均噪声。平衡测定更灵敏、更准确，并支持多种该测定中可进行的新的目标分泌分子和新的检测试剂。[0782]优化扩散测定性能的一个重要考虑因素是了解通道和室(例如，坞)之间的扩散，以及该扩散在微流体组件(例如，芯片)中在不同步骤中如何变化。在平衡期间，检测试剂可以从通道导入并扩散到室(例如，坞)中，这降低了通道中检测试剂的浓度。在这种情况下，通道充当“源”(高浓度区域)，且室(例如，坞)充当“槽”(低浓度区域)。目标蛋白使室(例如，坞)中的检测试剂与分泌细胞结合，从而有效地增加室(例如，坞)的容量以充当更大的槽。为了保持恒定的浓度(恒定的源)，检测试剂需要通过持续灌注检测试剂而在通道中不断补充。因此，优化的刷新率为约0.1-10秒。[0783]由于在流体通过针头被吸入微流体芯片的情况下，存在从入口(最靠近泵的芯片端口)到出口(最靠近针头的芯片端口)或相反的定向流动，因此分子的浓度随着其在芯片上扩散到室(例如，坞)中而耗尽。结果是，通道中出口处的室(例如，坞)的检测试剂浓度较低，从而在芯片上产生梯度，直到系统完全平衡。“源”和“槽”的这种相互影响也在含有分泌分子的细胞的室(例如，坞)中发挥作用。在这种情况下，室(例如，坞)作为源起作用，而通道则是分泌分子的槽。扩散到通道中的分泌分子沿流体通道的路径长度而积累。这种作用在分泌分子增加的流动方向(入口到出口)上形成梯度。[0784]在这两种情况下，均可以使用更快的流速来缓解这种影响，以帮助通道充当更均匀的“源”或“槽”。虽然室(例如，坞)中的流体主要由扩散控制，但通道中的层流在室(例如，坞)中产生小漩涡。这些漩涡的存在可以增加通道和室(例如，坞)之间的交换速率，并且交换速率可以随着层流速率的增加而增加。[0785]稳态或平衡测定解决了进一步的技术问题。例如，如图41a和图41b所示(平均得分相比于通道部分(channelfraction))，冲洗测定中的系统偏差被测量为通道部分的函数。对于图41a和图41b中示出的实例，通过将单个克隆细胞系加载到芯片上并使用por冲洗测定和原型bkm平衡测定对芯片进行测定，以生成数据。[0786]虽然每个坞的得分会不同，但理论上每个通道部分的平均得分应该是相似的(以蓝色显示)。然而，冲洗测定中的显著斜率(从入口到出口的平均得分变化为37％)表明存在显著偏差，而平衡(例如，稳态)测定(或在游离试剂平衡期间拍摄的图像，而不是在冲洗期间拍摄的图像)作为通道部分的函数，表明几乎没有偏差或没有偏差。冲洗测定中系统误差的根本原因可能是芯片上不完全平衡的结果，或者是平衡期间灌注速率较慢的结果。例如，较慢的灌注速率不会移除流动区域中的分泌蛋白并用新鲜培养基替换通道，同时分泌蛋白从跨通道的梯度上游的室(例如，最靠近入口)扩散出来并进入流动区域(例如，通道)，并随后进入下游室(例如，最靠近出口)。从流入流动区域的上游流动区域中的分泌蛋白到下游室附近的流动区域的该梯度转而改变了下游坞中的稳态平衡，从而增加了下游坞附近的流动区域中的rmsa浓度，从而引入下游坞的得分的误差。[0787]来自代理测定(proxyassay)标准曲线的进一步数据显示了作为坞中浓度的函数的偏差，以及作为视场(fov)的函数的成像顺序(数据未显示)。在当前测定中，扩散参比可以是一个校正图像或一组图像，用于校正由于游离试剂随时间扩散而导致的信号变化。这种校正并不校正由扩散出室的结合的复合物的更高浓度梯度驱动的信号的时间依赖性，这在高分泌室中最为明显。(如菲克定律所述，扩散速率取决于梯度的大小。梯度越大，浓度随时间的变化就越大。)由于在稳态平衡下，信号没有时间依赖性，平衡将消除这种误差和对扩散参比校正的需要。[0788]总之，平衡测定通过消除通道部分和fov/时间系统误差，提高了测量精度。它可以允许使用适用于大范围分子量的单一平衡时间。例如，使用2至2.5小时的平衡时间可使所有小于150kda的试剂达到99％的平衡。此外，虽然小分子迅速扩散出室且因此不会在室中积聚太多，但使用大的检测试剂会导致减缓扩散出室的更大的结合复合物。当系统在检测试剂的存在下平衡至稳态时，室中目标蛋白的量将增加，从而产生更高的信号和提高的灵敏度。[0789]如上文所述，获取多幅图像可以进一步帮助平均噪声，从而提高信噪比。平均n幅图像可将噪声降低n的平方根。例如，平均共四幅图像可使噪声降低2级，而平均九幅图像可使噪声降低3级。例如，为了证明克隆的评级排序一致性的提高，从而证明测量的准确性，在系统完全平衡后，每隔10分钟拍摄一张图像，共拍摄一组11张连续图像。通过参照图42a和图42b，对最高的分泌克隆的子集(最高的65个克隆中的63个，不包括2个高离群值)的相关性进行分析。图42a示出了单个图像之间的相关性，而图42b示出了来自前5个图像的得分的平均值与最后6个图像的平均值的比较。当前，使用评分区域中的区域9-13来计算得分。将区域扩展到5-15以计算得分(即，梯度的斜率)进一步降低了噪声。单个图像之间的平均相关性提高到r2＝0.75 /-0.1，并且比较5和6个图像的平均值将相关性提高到r2＝0.90。进一步地，通过比较单个图像的选择，平均相关性(r2)为0.33 /-0.25(095％ci)，其中最小值为0.15，最大值为0.62。将前5个图像的平均得分与后6个图像的平均值进行比较，r2提高至0.71。[0790]分泌的被分析物[0791]分泌的被分析物。生物微物体分泌的被分析物可以是蛋白、糖、核酸、分子量小于3kd的有机分子、囊泡、病毒及其任何组合。分泌的被分析物可以是自然表达的被分析物(例如，天然表达的)或可以是生物工程化的被分析物(例如，基因插入、缺失、修饰等产生的产物)。作为核酸的分泌的被分析物可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸，可以包括天然或非天然核苷酸。作为病毒的分泌的被分析物可以是病毒颗粒、载体或噬菌体。作为糖的分泌的被分析物可以是单糖、双糖或多糖。糖的非限制性实例可包括葡萄糖、海藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖、核糖、黄原胶或壳聚糖。分泌的小有机分子可包括但不限于生物燃料、油、聚合物或药物，如大环内酯抗生素。作为蛋白的分泌的被分析物可以是抗体或抗体片段。作为蛋白的分泌的被分析物可以是血液蛋白，例如白蛋白、球蛋白(例如，α2巨球蛋白、丙种球蛋白、β2微球蛋白、结合球蛋白(haptoglobulin))、补体蛋白(例如，组分3或4)、转铁蛋白、凝血酶原、α1抗胰蛋白酶等；激素，例如胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、生长激素、生长因子(例如，fgf、hgf、ngf、egf、pdgf、tgf、促红细胞生成素、igf、tnf)、卵泡刺激素、黄体生成素、瘦素等；纤维蛋白，例如丝或细胞外基质蛋白(例如，纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白(vitronectin)、生腱蛋白(tenascin)、多能蛋白聚糖、骨唾液蛋白)；酶，例如金属蛋白酶(例如，基质金属蛋白酶(mmp))或其他类型的蛋白酶(例如，丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬酰胺肽裂解酶)、淀粉酶、纤维素酶、过氧化氢酶、果胶酶等；细菌、酵母或原生动物蛋白；植物蛋白；或病毒蛋白，例如衣壳或包膜蛋白。作为蛋白的分泌的被分析物可以是抗体、抗体片段、酶(包括但不限于蛋白水解酶)、工程化(通常是细胞内蛋白)蛋白，例如白蛋白和/或结构蛋白，包括但不限于蚕丝或蜘蛛丝)。该列表不是限制性的，并且可以通过该方法评估任何可被工程化以被分泌的蛋白。分泌的被分析物可以是抗体-药物缀合物。可具有蛋白、糖、核酸、分子量小于3kd的有机分子和/或病毒的组合的分泌的被分析物的非限制性实例可包括蛋白聚糖或糖蛋白。[0792]报道分子及其特征[0793]报道分子及其特征。[0794]报道分子可以包括被设计用于与分泌的被分析物结合的结合组分，并且还可以包括可检测的标记物。结合组分可以是被配置成与分泌的被分析物结合的任何合适的结合配偶体。结合组分可以是蛋白、肽、核酸或分子量小于3kd的小有机分子。例如，结合组分可以是与另一个核酸序列特异性结合的核酸序列或与蛋白特异性结合的肽(例如识别特定抗体的表位)。在一些实施方案中，结合组分可以与生物微物体的分泌的被分析物家族非特异性结合。例如，结合组分可以是与igg结构域特异性结合的肽或与核酸序列家族中存在的结构域结合的核酸。在一些实施方案中，报道分子可以是多价的，其包含多于一个的结合组分以与分泌的被分析物的多于一个的拷贝结合或与分泌的被分析物的家族的多于一个成员结合。为了便于讨论，如本文所用的术语分泌的被分析物可以指特定的分泌的被分析物分子或分泌的被分析物家族。因此，rmsa复合物的化学计量可以变化。例如，与分泌的被分析物的一个拷贝结合的报道分子可以具有1:1化学计量的rmsa复合物。或者，rmsa复合物可以具有2:1、3:1、4:1、2:2、4:2或其他化学计量的报道分子:分泌的被分析物。报道分子可以具有任何合适的分子量，条件是由报道分子:被分析物复合物的扩散特征所定义的表观“大小”(其取决于分子量)比报道分子本身足够“大”，以观察未结合的报道分子和rmsa复合物之间的差异性扩散。报道分子的分子量可以是分泌的被分析物的分子量的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或相同。在一些实施方案中，报道分子的分子量小于分泌的被分析物的分子量的约50％、40％、30％、20％、10％。rmsa复合物的分子量可以比报道分子的分子量高至少2x、4x、10x、20x、30x、40x、50x或其间的任何数。rmsa复合物的分子量可以比未结合的报道分子的分子量高2倍、4倍或50倍。[0795]实验[0796]系统和装置：采用optoselecttm装置，其是一种纳米流体装置，由berkeleylights,inc.制造并被也由berkeleylights,inc.制造的光学仪器控制。该仪器包括：用于芯片的安装台，其耦接到温度控制器；泵和流体介质调节组件；以及包括相机和适于激活芯片内的光电晶体管的结构光源的光具组。optoselect装置包括采用提供光电晶体管激活的oet力的optoelectropositioning(oeptm)技术配置的基底。芯片还包括多个微流体通道，每个微流体通道具有与其流体连接的多个nanopentm室(或室)。每个室的体积为约1×106立方微米。[0797]生物细胞。使用经工程改造以表达人抗体的cho细胞。计数细胞数目和活力，并将细胞密度调节至5×105/ml，以将细胞加载到optoselect装置上。[0798]设备启动。将250微升100％二氧化碳以12微升/秒的速度流入到optoselect装置中，接着是250微升含有0.1％pluronicf27的pbs(lifetechnologies目录号p6866)以12微升/秒流入，最后是250微升pbs以12微升/秒流入。随后引入培养基。[0799]培养基：使用cdcho培养基(thermofisherscientific目录号10743029)，其是市售的无蛋白且无血清的培养基、化学成分确定的培养基。[0800]培养期间的培养基灌注。根据以下两种方法之一，将培养基灌注通过optoselect装置：[0801]1.以0.01微升/秒的速度灌注2小时；以2微升/秒的速度灌注64秒；并重复。[0802]2.以0.02微升/秒的速度灌注100秒；停止流动500秒；以2微升/秒的速度灌注64秒；并重复。[0803]实施例1：使用肽报道分子评估抗体的相对产量。[0804]报道分子。一种igg结合肽，其分子量为2.4kd，用hilytefluortm555nhs酯(anaspecinc.，目录号as-81251，869da(游离酸的mw)，ex/em550/566nm(cy3滤光器))进行n-末端标记。[0805]暗参比图像采集：在引入细胞之前，首先对不存在培养基或报道分子的optoselect装置成像，获得在本文所述的方法中使用的暗参比图像，其去除背景并对每个nanopen室的图像进行归一化。[0806]信号参比图像采集：使含有浓度为1微克/ml的n末端标记的hilytefluortm555igg结合肽(报道分子)的培养基以0.005微升/秒流入optoselect装置45分钟，直至荧光化合物在nanopen室和微流体通道之间扩散并达到平衡分布。此时获取信号参比图像。然后用不含报道分子的培养基以0.03微升/秒冲洗optoselect装置25分钟。这段冲洗确保报道分子基本上完全从nanopen室扩散出来，在nanopen室内没有留下报道分子或留下微量的报道分子。或者，可以通过使荧光染料本身以相同的摩尔浓度流动来获得信号参比图像，而不需要使用荧光标记的报道分子。[0807]将分泌细胞引入到微流体装置中。将cho细胞引入到optoselect装置中，并使用装置的oep技术的介电电泳力选择性地将其置于nanopen室中。将细胞以每个nanopen室一个细胞放置。如上所述地灌注培养基，持续6天。每天拍摄亮视场图像，以记录每个nanopen室内的细胞扩增。在第一次测定之前选择6天的培养期可以根据生物细胞和分泌的被分析物的特定要求而变化。可能期望在延长的培养期的每一天进行测定(其可以包括亮视场图像)，或者可以在培养期间的选定日期进行一个或多个测定。[0808]测定信号采集。作为测定的初始步骤，获得亮视场图像以关联每个nanopen室内的细胞数目和位置。在采集亮视场图像之后，使浓度为1微克/ml的荧光报道分子以0.05微升/秒流入微流体通道45分钟，为报道分子充分扩散到每个nanopen室中提供足够的时间。在将报道分子引入到nanopen室中之后，基于如上测定的扩散速率，以0.03微升/秒重新开始不含荧光报道分子的培养基的流动25分钟。获得荧光图像。如果需要，可以在被确定为适合于特定细胞和/或由其分泌的被分析物的另外的培养/扩增期间重复该测定。[0809]被分析物相对产量的测定。在每个nanopen室内确定沿着从nanopen室内扩散的轴的受关注区域(aoi)，其包括约20像素宽和200像素长的区域，其中选择aoi的下(第一)端在分离区域内的距离nanopen室的底部(其远离向微流体通道的开口)的选定距离处，其中没有放置细胞。选择aoi长度的第二端(上端)在微流体通道本身内，这确保了位于aoi内和通道内的像素基本上没有信号。aoi的宽度沿着从nanopen室的分离区域到optoselect装置的通道的预期扩散的轨迹居中。如本文所述，aoi被细分为20个子区域(箱)，每个子区域具有20个像素的宽度和沿着10个像素的预期扩散轨迹的长度。[0810]如本文所述使用暗参比和信号参比图像对荧光测定图像进行归一化/校准，以减少系统误差，并且由于视场的不完美照射而使信号图像衰减(rolloff)。aoi中的每个像素都被处理为：[0811][0812]通过将子区域中的每个像素的信号强度相加来确定20个子区域中的每一个的中值强度。图12b中示出了由绘制每个子区域的归一化的中值强度值得到的曲线的表示，其中x轴列出了子区域1至20。子区域1是最远离通道的aoi的子区域，且子区域20是进入通道最远的aoi的子区域。对绘制子区域9-13(图12b中的区域1156)的归一化的中值强度值的曲线部分进行线性回归。如上文所述，确定这些子区域在观察到的信号强度对nanopen室的分离区域的下部(最远离通道)部分内的生物细胞的位置不敏感的区域内。将从该操作获得的斜率值用作以任意单位(a.u.)表示的得分。较大的斜率(得分)表明该nanopen室内的细胞分泌的被分析物更多。[0813]如图21所示，对于每个可见的nanopen室指示标识号和得分(顶部数字是该nanopen室的标识号，并且底部数字是该nanopen室的得分)，这明显与观察到的信号的强度相关。分别具有10.01和8.67的低得分的nanopen室563和941具有至少一个产生被分析物的细胞，但具有少量的报道分子:抗体复合物扩散出这些nanopen室中的每一个。得分分别为13.15和17.26的nanopen室563和949显示出中等得分。最后，得分分别为25.26、29.99和27.95的nanopen室560、566和942产生更大量的抗体被分析物。此处显示的得分未针对存在的细胞数目进行校正。但是，可以对此处显示的得分进行计算。原始得分或细胞计数校正的得分可以用于更容易地对nanopen室进行评级，以帮助确定在开发高产细胞系的过程中将进一步检查哪些nanopen室。也可以采用计算从nanopen室内到通道的浓度变化率的其他方法，例如曲线下面积或本文所述的其他方法，以量化每个nanopen室内分泌的被分析物的生产水平。[0814]测量相对生产率。可以针对每个nanopen室的细胞数目对得分进行校正，如图22a-b所示。在该实验中，细胞类型、培养基、报道分子、培养前图像获取、培养条件和测定条件与上述相同。图22示出了单个nanopen室的图像，在第0天和第3、4、5、6天对其获取亮视场图像，如图21的顶行中的图像所示。另外，在第3、4、5、6天中的每一天进行如上所述的测定，并且对于相同的单个nanopen室，在第3、4、5和6天的每一天的荧光图像显示为在那天相应的亮视场图像下对齐。亮视场图像用于计数存在的细胞数目，其可以在自动化过程中进行，对于所选的nanopen室，随着克隆群被扩增，显示：第0天(1个细胞)；第3天(8个细胞)；第4天(25个细胞)；第5天(65个细胞)；第6天(123个细胞)。如上文所述获得的测定得分(表示负斜率)也稳定地增加，第3天(195a.u.)；第4天(566a.u.)；第5天(1431a.u.)；第6天(2842)。因此，在第3天，nanopen室中的八个细胞得分为195(a.u.)。在第4天，相同的nanopen室现在具有25个细胞，得分为566(a.u.)。在第5天，相同的nanopen室具有65个细胞，得分为1431(a.u.)。最后，在第6天，相同的nanopen室具有123个细胞，得分为2843(a.u.)。图22的图显示了自nanopen室内细胞培养开始以来相对于以天表示的测定时间点(x轴)绘制的测定得分(y-轴)。将绝对得分除以在该时间点存在的细胞数目，以提供针对室中的细胞数目归一化的得分。这产生了所选择的nanopen室中细胞的归一化的生产率测量值(rqp)，其保持在每个细胞22.6至24.1a.u.的范围内。[0815]实施例2.抗体生产的原位评分与宏观生产和细胞系发育的相关性。[0816]系统和装置：如上文所述。[0817]细胞：如实验1中的cho细胞。[0818]培养基：与实验1中所述。[0819]报道分子：如实验1中所述。[0820]培养进行6天，并且如实验1中那样使用分子量为2.4kd的hilytefluortm555标记的igg结合肽进行基于扩散的测定。进行分析，以基于在本文所定义的aoi内观察到的信号的强度来分配得分。对optoselect装置内的每个nanopen室评估得分。在图22a和22b中，绘制了optoselect装置的每个nanopen室，其中水平轴是在芯片上获得的滴度(“得分”，或者在这种情况下，沿着细胞位置不敏感子区域(整个aoi的子区域1-20中的9-13)的中值强度值的斜率))。将每个nanopen室绘制在图的y轴上(图23a)，y轴表示在测定时在相应的nanopen室中计数的细胞数目(从亮视场图像获得)。通过选择三组nanopen室进行第一次选择，所述nanopen室具有：被分析物分泌的低(截止值小于800a.u.)得分；被分析物分泌的中等水平得评分(从刚好小于800a.u.到约1400a.u.)和被分析物分泌的高得分(从约1400到约2400a.u.)。在这些所选的组中的每一组中，存在具有大、中和低细胞数目的nanopen室。[0821]如图23b所示，包括进一步的选择，以选择具有快速生长的nanopen室；显示中等细胞倍增率的室，并且选择第三组以具有仅缓慢扩增的细胞数目。在这些组中的每一组中，存在高、中和低水平的被分析物生产的表示(得分范围在图23b的整个水平轴上)。在所有九种亚型的生长/分泌谱中的一种内选择单个nanopen室，并将所选择的室(每个室保持单独的克隆群)单独输出，首先进入孔板。通过对igg的elisa测定获得滴度。将含有克隆群的低、中和高分泌孔的进一步选择引入到125ml摇瓶中并进一步放大。[0822]通过对igg的elisa测定法测定放大的125ml摇瓶中的克隆群。所选择的克隆显示在图24中，其中每个125ml摇瓶的滴度在y轴上表示，并且相应的nanopen室(细胞来源于其中)的芯片上滴度(在上述测定中获得的以a.u.表示的得分)显示在x轴上。第一组2405源自具有低芯片上滴度(得分)的nanopen室内的细胞。一旦放大到125ml摇瓶，组2405不包括任何高产克隆。第二组2415来源于具有中等范围的芯片上滴度(得分)的nanopen室内的细胞，并且表明来自125摇瓶的中等范围的elisa滴度值。最后一组2425具有高滴度值，均高于139.1微克/ml的池平均值，并且与来自具有也很高的芯片上滴度(以a.u.表示的得分)的nanopen室的细胞相关联。因此证明，对于具有中等至高的芯片上滴度(得分，或在一个特定实施方案中，斜率)的nanopen室中的细胞，与宏观尺度群中获得的滴度水平有良好的相关性。因此，在如本文所述的optoselect装置内进行的测定产生了一种有意义的方法，以更快速地识别更大数目的高产克隆用于细胞系开发。另外，如上文关于图16b所讨论的，单独筛选每个克隆群的能力提供了识别可能不像其他非生产性克隆群那样快速生长的生产性克隆的能力。这些生长较慢、更高产的克隆在大量扩增的条件下被识别的可能性很小。[0823]实施例3.使用适体评估抗体的相对产量。[0824]系统和装置：如上文所述。[0825]细胞：如实验1中的cho细胞。[0826]培养基：与实验1中所述。[0827]报道分子：人免疫球蛋白g的适体，(apta-indextm，apt8，id#44，23-mer，mw.7.4kd，对fc结构域具有亲合力，aptagenl.l.c.序列：5’‑rgp-rgp-rap-rgp-rgp-fup-fcp-fcp-rgp-rap-rap-rap-rgp-rgp-rap-fcp-fup-fcp-fcp-3’。在序列记号中，r-前缀表示核糖核苷酸；f-前缀表示2-氟核苷酸；-p后缀表示磷酸盐；g、a、c、u是标准核苷酸缩写。它被alexafluor594(af594，thermofisherscientific，目录号a20004(nhs酯))mw819.8，ex/em590/617nm)所标记。[0828]使含有浓度为2微克/ml的alexafluor594或alexafluor594标记的适体的培养基流入optoselect装置45分钟，直到荧光化合物在nanopen室和微流体通道之间扩散并达到平衡分布。获取信号参比图像。然后用不含报道分子的培养基以0.03微升/秒冲洗optoselect装置30分钟。这段冲洗确保报道分子基本上完全扩散出nanopen室。[0829]将cho细胞引入到optoselect装置中，并使用装置的oep技术的介电电泳力选择性地将其置于nanopen室中。将细胞以每个nanopen室一个细胞放置。如上文所述灌注培养基，持续6天。每天获取亮视场图像以记录每个nanopen室内的细胞扩增。在实验的第3、4、5和6天的每一天进行测定，以检测抗体产生。[0830]测定信号采集。获得亮视场图像以关联每个nanopen室内的细胞数目和位置。在采集亮视场图像之后，使浓度为2微克/ml的荧光报道分子适体-alexafluor594流入微流体通道50分钟，为报道分子充分扩散到每个nanopen室中提供足够的时间。在将报道分子引入到nanopen室中之后，基于大约7kd的分子的扩散速率，以0.03微升/秒重新开始不含报道分子的培养基的流动30分钟。获得荧光图像。[0831]在每个nanopen室内识别沿着从nanopen室内扩散的轴的受关注区域(aoi)，其包括约20像素宽和200像素长的区域，其位置如上文实验1中所述。aoi的宽度沿着从nanopen室的分离区域到optoselect装置的通道的预期扩散的轨迹居中。aoi被细分为20个子区域(箱或区段)，每个子区域具有20个像素的宽度和沿着预期扩散轨迹的10个像素的长度。如本文所述使用暗参比和信号参比图像对荧光测定图像进行归一化/校准，以减少系统误差，并且由于视场的不完美照射而使信号图像衰减。[0832]通过将子区域中的每个像素的信号强度相加来确定20个子区域中的每一个的中值强度。生成每个子区域的归一化的中值强度值的曲线，并且对绘制子区域9-13的归一化的中值强度值的曲线部分进行线性回归。将从该操作获得的斜率值用作以任意单位(a.u.)表示的得分。预计optoselect装置的总共3500个nanopen室中的选定数目的单个nanopen室具有大于200-250a.u.的得分，并被选择为输出用于扩增和进一步开发。[0833]虽然结合各种实施方案描述了本教导，但是并不意味着本教导限于这些实施方案。相反，如本领域技术人员将理解的，本教导包含各种替代、修改和等同技术方案。[0834]此外，在描述各种实施方案时，说明书可能已经将方法和/或过程呈现为特定的步骤顺序。然而，在方法或过程不依赖于本文所述的特定步骤顺序的程度上，方法或过程不应限于所描述的特定步骤顺序。如本领域普通技术人员将理解的，其他步骤顺序也是可能的。因此，说明书中提供的特定步骤顺序不应被解释为对权利要求的限制。此外，针对方法和/或过程的权利要求不应限于以写出的顺序执行其步骤，并且本领域技术人员可以容易地理解，顺序可以变化并且仍然保持在各种实施方案的精神和范围内。[0835]本文描述的实施方案可以用其他计算机系统配置来实施，包括手持设备、微处理器系统、基于微处理器或可编程的消费性电子产品、小型计算机、大型计算机等。实施方案还可以在分布式计算环境中实施，其中任务由通过网络链接的远程处理设备执行。[0836]还应当理解，本文描述的实施方案可以采用涉及存储在计算机系统中的数据的各种计算机执行的操作。这些操作是需要物理操纵物理量的操作。通常(尽管不是必须的)，这些量采取能够被存储、传输、组合、比较和以其他方式操纵的电信号或磁信号的形式。此外，所执行的操作通常用术语来表示，例如产生、识别、确定或比较。[0837]形成本文所述的实施方案的一部分的任何操作都是有用的机器操作。本文描述的实施方案还涉及用于执行这些操作的设备或装置。本文描述的系统和方法可以为所需目的而专门构造，或者它可以是由存储在计算机中的计算机程序选择性地激活或配置的通用计算机。特别地，各种通用机器可以与根据本文的教导编写的计算机程序一起使用，或者构造更专用的装置来执行所需的操作可以是更方便的。[0838]某些实施方案还可以体现为计算机可读介质上的计算机可读代码。计算机可读介质是任何可以存储数据的数据存储设备，其后该数据可以由计算机系统读取。计算机可读介质的实例包括硬盘驱动器、网络附加存储器(nas)、只读存储器、随机存取存储器、cd-rom、cd-r、cd-rw、磁带和其他光学、flash存储器和非光学数据存储设备。计算机可读介质还可以分布在网络耦接的计算机系统上，使得计算机可读代码以分布式方式存储和执行。[0839]所选实施方案的列举[0840]实施方案1.一种用于测定生物微物体所产生的被分析物的量的系统，包括：图像获取单元，包括：能够固定微流体装置的微流体装置支撑物，其中所述微流体装置包括流动区域和多个与流动区域流体连接的室，其中多个室中的每一个可以容纳一个或多个生物微物体，和成像元件，其被配置为捕捉微流体装置的多个室和流动区域的一个或多个测定图像；和与图像获取单元通信连接的图像处理单元，包括：受关注区域确定引擎，其被配置为接收每个捕捉的测定图像并对测定图像中描绘的每个室定义受关注区域，其中受关注区域包括图像区域，该图像区域对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中生物微物体的位置最不敏感，并且沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸，和评分引擎，其被配置为分析每个室的受关注区域内的图像区域的至少一部分，以确定指示每个室中的被分析物的量的得分。[0841]实施方案2.根据实施方案1所述的系统，还包括：校准引擎，其被配置为至少针对由背景噪声引起的和/或在测定图像捕捉期间引入的图像失真来对每个室的受关注区域的图像区域进行归一化。[0842]实施方案3.根据实施方案1或2所述的系统，其中成像元件被进一步配置为捕捉一个或多个相应的背景图像和一个或多个相应的信号参比图像。[0843]实施方案4.根据实施方案3所述的系统，其中校准引擎被配置为通过从测定图像中减去相应的背景图像来至少对每个室的受关注区域的图像区域进行归一化以用于图像失真；和/或其中校准引擎被配置为通过考虑在相应的信号参比图像中捕捉的图像获取失真，从而至少针对图像失真来对每个室的受关注区域的图像区域进行归一化。[0844]实施方案5.根据实施方案2至4中任一项所述的系统，其中评分引擎被配置为分析每个室的受关注区域的归一化的图像区域的至少一部分，以确定指示每个室中的被分析物的量的得分。[0845]实施方案6.根据实施方案5所述的系统，其中评分引擎被配置为对每个室的受关注区域的归一化的图像区域的一部分上的光强度值应用线性回归分析，以确定指示每个室中的被分析物的量的得分。[0846]实施方案7.根据实施方案5所述的系统，其中评分引擎被配置为对每个室的归一化的受关注区域的一部分上的光强度值进行积分，以确定指示每个室中的被分析物的量的得分。[0847]实施方案8.根据实施方案1至7中任一项所述的系统，其中图像获取单元和图像处理单元是分别定位的。[0848]实施方案9.根据实施方案1至7中任一项所述的系统，其中图像获取单元和图像处理单元被集成在单个单元中。[0849]实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的系统，其中受关注区域由图像处理单元自动地定义。[0850]实施方案11.根据实施方案1至10中任一项所述的系统，其中微流体装置被配置为接收结合剂的流，所述结合剂与由生物微物体所产生的被分析物结合并且包含可检测的标记物，并且其中评分引擎被配置为基于由测定图像所确定的结合剂的可检测的标记物所发射的光量来确定每个室中的被分析物量。[0851]实施方案12.一种用于测定由生物微物体所产生的被分析物的量的方法，包括：接收微流体装置的成像数据，该微流体装置包括流动区域和多个与流动区域流体连接的室，其中成像数据包括被分析物测定图像以及背景噪声图像和信号参比图像中的一种或两种；对每个室定义受关注区域，其中受关注区域包括室内的图像区域，该图像区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对在室中生物微物体的位置最不敏感，并且沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸，以及通过分析每个室的受关注区域的图像区域的至少一部分来确定指示每个室中的被分析物的量的得分。[0852]实施方案13.根据实施方案12所述的方法，其中成像数据包括从由报道分子发射的光确定的发光数据，所述报道分子与由生物微物体所产生的被分析物结合。[0853]实施方案14.根据实施方案12或13所述的方法，还包括：通过减去在背景噪声图像中捕捉的背景噪声，至少对被分析物测定图像中的每个室的受关注区域的图像区域进行归一化；和/或通过考虑在信号参比图像中捕捉的图像获取失真，至少对被分析物测定图像中的每个室的受关注区域的图像区域进行归一化。[0854]实施方案15.根据实施方案14所述的方法，其中确定指示每个室中的被分析物的量的得分还包括分析每个室的受关注区域的归一化的图像区域的至少一部分。[0855]实施方案16.根据实施方案14所述的方法，其中确定指示每个室中的被分析物的量的得分还包括对每个室的受关注区域的归一化的图像区域的至少一部分上的发光数据应用线性回归分析。[0856]实施方案17.根据实施方案14所述的方法，其中确定指示每个室中的被分析物的量的得分还包括对每个室的受关注区域的归一化的图像区域的至少一部分上的发光数据进行积分。[0857]实施方案18.根据实施方案12至17中任一项所述的方法，其中被分析物包含蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。[0858]实施方案19.一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机执行用于测定由生物微物体所产生的被分析物的量的图像处理方法，该方法包括：接收微流体装置的成像数据，该微流体装置包括流动区域和多个与流动区域流体连接的室，其中成像数据包括被分析物测定图像以及背景噪声图像和信号参比图像中的一种或两种；对每个室定义受关注区域，其中受关注区域包括室内的图像区域，该图像区域对测量分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中生物微物体的位置最不敏感，并且沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸，以及通过分析每个室的受关注区域的图像区域的至少一部分来确定指示每个室中的被分析物的量的得分。[0859]实施方案20.根据实施方案19所述的方法，其中成像数据包括从由报道分子发射的光确定的发光数据，该报道分子与由生物微物体所产生的被分析物结合。[0860]实施方案21.根据实施方案19或20所述的方法，还包括：通过减去在背景噪声图像中捕捉的背景噪声，至少对被分析物测定图像中的每个室的受关注区域的图像区域进行归一化；和/或通过考虑在信号参比图像中捕捉的图像获取失真，至少对被分析物测定图像中的每个室的受关注区域的图像区域进行归一化。[0861]实施方案22.根据实施方案21所述的方法，其中确定指示每个室中的被分析物的量的得分还包括分析每个室的受关注区域的归一化的图像区域的至少一部分。[0862]实施方案23.根据实施方案21所述的方法，其中确定指示每个室中的被分析物的量的得分还包括对来自每个室的受关注区域的归一化的图像区域的至少一部分的发光数据应用线性回归分析。[0863]实施方案24.根据实施方案21所述的方法，其中确定指示每个室中的被分析物的量的得分还包括对每个室的受关注区域的归一化的图像区域的至少一部分上的发光数据进行积分。[0864]实施方案25.根据实施方案19至24中任一项所述的方法，其中被分析物包含蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。[0865]实施方案26.一种评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的方法，该方法包括：将生物微物体引入到微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室含有第一流体介质；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群向室内的第一流体介质中分泌被分析物；在第一时间段将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包含多个报道分子，并且其中每个报道分子包含被配置为与分泌的被分析物结合的结合组分和可检测的标记物；允许多个报道分子中的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的报道分子，其中受关注区域包括室的至少一部分。[0866]实施方案27.根据实施方案26所述的方法，其中可检测的标记物包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。[0867]实施方案28.根据实施方案27所述的方法，其中报道分子的可检测的标记物是荧光标记物，并且其中所述检测报道分子包括检测来自受关注区域内报道分子的荧光标记物的荧光发射。[0868]实施方案29.根据实施方案26或27所述的方法，其进一步包括：在第二时间段将包括室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发报道分子的荧光标记物的波长。[0869]实施方案30.根据实施方案29所述的方法，其中：在第二时间段后对受关注区域内的荧光发射进行检测；在第三时间段内对受关注区域内的荧光发射进行两次或更多次检测；和/或在第三时间段内基本上连续地对受关注区域内的荧光发射进行检测。[0870]实施方案31.根据实施方案30所述的方法，其进一步包括：在第四时间段将包含室的至少一部分的微流体装置的一部分但不是流动区域暴露于电磁辐射，其中第四时间段足以对室的部分中存在的任何报道分子的荧光标记物进行光漂白；和检测室的光漂白部分内的荧光发射。[0871]实施方案32.根据实施方案31所述的方法，其中：在第四时间段后对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测；在第五时间段内对室的光漂白部分内的荧光发射进行两次或更多次检测；和/或在第五时间段内基本上连续地对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测。[0872]实施方案33.根据实施方案31所述的方法，其中检测室的光漂白部分内的荧光发射发生在所述暴露第四时间段后(例如，在包含非光漂白荧光标记物的报道分子已扩散到所述室中后)约5秒至约20秒。[0873]实施方案34.根据实施方案31至33中任一项所述的方法，其中室的光漂白部分由受关注区域包含。[0874]实施方案35.根据实施方案31至34中任一项所述的方法，其中所述暴露第四时间段和检测室的光漂白部分中的荧光发射的步骤重复一次或多次(例如，1、2、3、4、5次或更多次)。[0875]实施方案36.根据实施方案27至35中任一项所述的方法，其中室具有分离区域和将分离区域流体连接到流动区域的连接区域，并且其中分离区域和连接区域被配置为使得分离区域中流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域中流体介质的组分进行交换。[0876]实施方案37.根据实施方案27至36中任一项所述的方法，其中生物微物体是生物细胞，并且其中所述方法还包括将室内的生物细胞扩增为生物细胞的克隆群。[0877]实施方案38.根据实施方案27至37中任一项所述的方法，其进一步包括用培养基灌注流动区域，其中灌注发生在将生物微物体引入室中之后并且在将第二流体介质引入流动区域中之前。[0878]实施方案39.根据实施方案38所述的方法，其中培养基包括可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。[0879]实施方案40.根据实施方案27至39中任一项所述的方法，其中第一时间段为约30分钟至约60分钟。[0880]实施方案41.根据实施方案27至40中任一项所述的方法，进一步包括：将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含任何报道分子，并且允许至少一部分未结合的报道分子扩散出室，其中对位于受关注区域内的报道分子的检测发生在选定的时间，使得已扩散出室的未结合的报道分子的量比已扩散出室的rmsa复合物的量至少多2倍。[0881]实施方案42.根据实施方案41所述的方法，其中将第三流体介质引入流动区域包括使第三流体介质流经流动区域一个额外时间段。[0882]实施方案43.根据实施方案42所述的方法，其中额外时间段基于对未结合的报道分子和rmsa复合物的扩散谱的模拟来选择。[0883]实施方案44.根据实施方案42所述的方法，其中额外时间段为约20分钟至约50分钟。[0884]实施方案45.根据实施方案27至44中任一项所述的方法，其中受关注区域包括室的至少一部分，所述室的至少一部分沿从室内向外进入流动区域的扩散的轴对齐。[0885]实施方案46.根据实施方案27至45中任一项所述的方法，其中检测位于受关注区域内的报道分子包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中至少一些可检测信号从位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出。[0886]实施方案47.根据实施方案46所述的方法，其中检测位于受关注区域内的报道分子进一步包括通过从可检测信号的测量强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。[0887]实施方案48.根据实施方案46或47所述的方法，其进一步包括在将生物微物体引入室之前测量受关注区域内的背景信号的强度。[0888]实施方案49.根据实施方案46至48中任一项所述的方法，其中针对在室内观察到的多个细胞对测量的可检测信号强度或减去背景的信号强度进行归一化。[0889]实施方案50.根据实施方案27至49中任一项所述的方法，其进一步包括量化被分析物的分泌水平。[0890]实施方案51.根据实施方案27至50中任一项所述的方法，其进一步包括对室提供分泌得分。[0891]实施方案52.根据实施方案51所述的方法，其中根据实施方案12至25中任一项所述的方法确定分泌得分。[0892]实施方案53.根据实施方案27至52中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量是报道分子的分子量的至少两倍。[0893]实施方案54.根据实施方案27至52中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量比报道分子的分子量大至少四倍。[0894]实施方案55.根据实施方案27至52中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量比报道分子的分子量大至少十倍。[0895]实施方案56.根据实施方案27至55中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包含至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。[0896]实施方案57.根据实施方案27至55中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包括肽或蛋白。[0897]实施方案58.根据实施方案57所述的方法，其中报道分子的结合组分包含具有seqidno:1至10中任一项的序列的肽。[0898]实施方案59.根据实施方案57所述的方法，其中报道分子的结合组分包括蛋白a、蛋白g或蛋白a或蛋白g的igg结合片段。[0899]实施方案60.根据实施方案27至55中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包括适体。[0900]实施方案61.根据实施方案27至60中任一项所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物包括蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。[0901]实施方案62.根据实施方案27至61中任一项所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物是抗体，或任选地是糖基化抗体。[0902]实施方案63.根据实施方案27至61中任一项所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物是除抗体以外的蛋白，所述蛋白任选地是糖基化蛋白。[0903]实施方案64.根据实施方案27至63中任一项所述的方法，其中所述微流体装置包括多个室，其中生物微物体被引入多个室中的至少两个室中，并且其中所述方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每一个室进行的。[0904]实施方案65.根据实施方案64所述的方法，其进一步包括比较多个室中至少两个室的室的分泌水平。[0905]实施方案66.根据实施方案64所述的方法，其进一步包括比较多个室中多于一个室的分泌得分。[0906]实施方案67.根据实施方案64至66中任一项所述的方法，其进一步包括：选择至少两个室中的一个或多个室；以及从每个选择的室输出一个或多个生物微物体。[0907]实施方案68.根据实施方案67所述的方法，其中来自每个选择的室的一个或多个生物微物体进一步从微流体装置中输出。[0908]实施方案69.根据实施方案68所述的方法，其中单独输出选择的室。[0909]实施方案70.根据实施方案27至69中任一项所述的方法，其中受关注区域包括图像区域，其对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，并沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。[0910]实施方案71.根据实施方案70所述的方法，其中受关注区域基本上由图像区域组成。[0911]实施方案72.根据实施方案28至71中任一项所述的方法，其中所述方法是自动化的。[0912]实施方案73.一种评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物的水平的方法，该方法包括：将生物微物体引入到微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室含有第一流体介质；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群向室内的第一流体介质中分泌包含外源标签的被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包含多个报道分子，并且其中每个报道分子包含被配置为结合分泌的被分析物的外源标签的结合组分和可检测的标记物；允许多个报道分子中的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的报道分子，其中受关注区域包括室的至少一部分。[0913]实施方案74.根据实施方案73所述的方法，其中室具有分离区域和将分离区域流体连接到流动区域的连接区域，并且其中分离区域和连接区域被配置为使得分离区域中流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域中流体介质的组分进行交换。[0914]实施方案75.根据实施方案73或74所述的方法，其中生物微物体是生物细胞，并且其中所述方法还包括将室内的生物细胞扩增为生物细胞的克隆群。[0915]实施方案76.根据实施方案73至75中任一项所述的方法，其进一步包括用培养基灌注流动区域，其中灌注发生在将生物微物体引入室中之后并且在将第二流体介质引入流动区域中之前。[0916]实施方案77.根据实施方案76所述的方法，其中培养基包括可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。[0917]实施方案78.根据实施方案73至77中任一项所述的方法，其中将第二流体介质引入流动区域包括在第一时间段使第二流体介质流经流动区域。[0918]实施方案79.根据实施方案78所述的方法，其中第一时间段为约30分钟至约60分钟。[0919]实施方案80.根据实施方案73至79中任一项所述的方法，其中可检测的标记物包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。[0920]实施方案81.根据实施方案80所述的方法，其中报道分子的可检测的标记物是荧光标记物，并且其中所述检测报道分子包括检测来自受关注区域内报道分子的荧光标记物的荧光发射。[0921]实施方案82.根据实施方案81所述的方法，其进一步包括：在第二时间段将包括室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发报道分子的荧光标记物的波长。[0922]实施方案83.根据实施方案82所述的方法，其中：在第二时间段后对受关注区域内的荧光发射进行检测；在第三时间段内对受关注区域内的荧光发射进行两次或更多次检测；和/或在第三时间段内基本上连续地对受关注区域内的荧光发射进行检测。[0923]实施方案84.根据实施方案83所述的方法，其进一步包括：在第四时间段将包含室的至少一部分的微流体装置的一部分但不是流动区域暴露于电磁辐射，其中第四时间段足以对室的部分中存在的任何报道分子的荧光标记物进行光漂白，所述室的部分任选地由受关注区域包含；和检测室的光漂白部分内的荧光发射。[0924]实施方案85.根据实施方案84所述的方法，其中：在第四时间段后对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测；在第五时间段内对室的光漂白部分内的荧光发射进行两次或更多次检测；和/或在第五时间段内基本上连续地对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测。[0925]实施方案86.根据实施方案85所述的方法，其中所述检测室的光漂白部分内的荧光发射发生在所述暴露第四时间段后(例如，在包含非光漂白荧光标记物的报道分子已扩散到所述室中后)约5秒至约20秒。[0926]实施方案87.根据实施方案84至86中任一项所述的方法，其中所述暴露第四时间段和检测室的光漂白部分中的荧光发射的步骤重复一次或多次(例如，1、2、3、4、5次或更多次)。[0927]实施方案88.根据实施方案73至87中任一项所述的方法，其进一步包括：将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含任何报道分子；和允许至少一部分未结合的报道分子扩散出室，其中对位于受关注区域内的报道分子的检测发生在选定的时间，使得已扩散出室的未结合的报道分子的量比已扩散出室的rmsa复合物的量至少多2倍。[0928]实施方案89.根据实施方案77所述的方法，其中将第三流体介质引入流动区域包括使第三流体介质流经流动区域一个额外时间段。[0929]实施方案90.根据实施方案89所述的方法，其中额外时间段基于对未结合的报道分子和rmsa复合物的扩散谱的模拟来选择。[0930]实施方案91.根据实施方案89所述的方法，其中额外时间段为约20分钟至约50分钟。[0931]实施方案92.根据实施方案73至91中任一项所述的方法，其中受关注区域包括室的至少一部分，所述室的至少一部分沿从室内向外进入流动区域的扩散的轴对齐。[0932]实施方案93.根据实施方案73至92中任一项所述的方法，其中检测位于受关注区域内的报道分子包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中至少一些可检测信号从位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出。[0933]实施方案94.根据实施方案93所述的方法，其中检测位于受关注区域内的报道分子进一步包括通过从可检测信号的测量强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。[0934]实施方案95.根据实施方案93或94所述的方法，其进一步包括在将生物微物体引入室之前的时间测量受关注区域内的背景信号的强度。[0935]实施方案96.根据实施方案93至95中任一项所述的方法，其中针对在室内观察到的多个细胞对测量的可检测信号强度或减去背景的信号强度进行归一化。[0936]实施方案97.根据实施方案73至96中任一项所述的方法，其进一步包括量化被分析物的分泌水平。[0937]实施方案98.根据实施方案73至97中任一项所述的方法，其进一步包括对室提供分泌得分。[0938]实施方案99.根据实施方案98所述的方法，其中根据实施方案12至25中任一项所述的方法确定分泌得分。[0939]实施方案100.根据实施方案73至99中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量是报道分子的分子量的至少两倍。[0940]实施方案101.根据实施方案73至99中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量比报道分子的分子量大至少四倍。[0941]实施方案102.根据实施方案73至99中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量比报道分子的分子量大至少十倍[0942]实施方案103.根据实施方案73至102中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的外源标签包括肽序列。[0943]实施方案104.根据实施方案103所述的方法，其中肽序列包括flag表位、多聚组氨酸序列、血凝素(ha)表位或myc表位。[0944]实施方案105.根据实施方案103所述的方法，其中肽序列包含氨基酸序列(从n端到c端)dykddddk(seqidno:12)。[0945]实施方案106.根据实施方案103所述的方法，其中肽序列包含氨基酸序列(从n端到c端)hhhhhh(seqidno:13)。[0946]实施方案107.根据实施方案103至106中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包括蛋白。[0947]实施方案108.根据实施方案107所述的方法，其中结合组分的蛋白是抗体。[0948]实施方案109.根据实施方案108所述的方法，其中抗体识别flag表位。[0949]实施方案110.根据实施方案106所述的方法，其中报道分子的结合组分包括螯合剂。[0950]实施方案111.根据实施方案110所述的方法，其中螯合剂包括次氮基三乙酸(nta)。[0951]实施方案112.根据实施方案73至111中任一项所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物包括蛋白。[0952]实施方案113.根据实施方案112所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物是抗体，或任选地是糖基化抗体。[0953]实施方案114.根据实施方案112所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物是除抗体以外的蛋白，其任选地是糖基化蛋白。[0954]实施方案115.根据实施方案73至114中任一项所述的方法，其中所述微流体装置包括多个室，其中生物微物体被引入多个室中的至少两个室中，并且其中所述方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每一个室进行的。[0955]实施方案116.根据实施方案115所述的方法，其进一步包括比较多个室中至少两个室的室的分泌水平。[0956]实施方案117.根据实施方案115所述的方法，其进一步包括比较多个室中多于一个室的分泌得分。[0957]实施方案118.根据实施方案115至117中任一项所述的方法，其进一步包括：选择至少两个室中的一个或多个室；以及从每个选择的室输出一个或多个生物微物体。[0958]实施方案119.根据实施方案118所述的方法，其中来自每个选择的室的一个或多个生物微物体进一步从微流体装置中输出。[0959]实施方案120.根据实施方案119所述的方法，其中单独输出选择的室。[0960]实施方案121.根据实施方案73至120中任一项所述的方法，其中受关注区域包括图像区域，其对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，并沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。[0961]实施方案122.根据实施方案121所述的方法，其中受关注区域基本上由图像区域组成。[0962]实施方案123.根据实施方案73至122中任一项所述的方法，其中所述方法是自动化的。[0963]实施方案124.一种评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物的水平的方法，该方法包括：将生物微物体引入到微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室含有第一流体介质；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群向室内的第一流体介质中分泌被分析物；在第一时间段将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包含多个报道复合物，并且其中每个报道复合物包括被配置成结合分泌的被分析物的第一复合物组分和结合第一复合物的第二复合物组分，其中第二复合物组分包含可检测的标签物，并且其中第一复合物组分与分泌的被分析物的结合减少或消除了第二复合物组分与第一复合物组分的结合；允许多个报道复合物的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个第一复合物组分:分泌的被分析物(fccsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的第二复合物组分，其中受关注区域包括室的至少一部分。[0964]实施方案125.根据实施方案124所述的方法，其中可检测的标记物包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。[0965]实施方案126.根据实施方案124所述的方法，其中第二复合物组分的可检测的标记物是荧光标记物，并且其中所述检测第二复合物组分包括检测来自受关注区域内第二复合物组分的荧光标记物的荧光发射。[0966]实施方案127.根据实施方案124至126中任一项所述的方法，其进一步包括：在第二时间段将包括室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发第二复合物组分的荧光标记物的波长。[0967]实施方案128.根据实施方案127所述的方法，其中：在第二时间段后对受关注区域内的荧光发射进行检测；在第三时间段内对荧光发射进行两次或更多次检测；和/或在第三时间段内基本上连续地对荧光发射进行检测。[0968]实施方案129.根据实施方案124至128中任一项所述的方法，其中室具有分离区域和将分离区域流体连接到流动区域的连接区域，并且其中分离区域和连接区域被配置为使得分离区域中流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域中流体介质的组分进行交换。[0969]实施方案130.根据实施方案124至129中任一项所述的方法，其中生物微物体是生物细胞，并且其中所述方法还包括将室内的生物细胞扩增为生物细胞的克隆群。[0970]实施方案131.根据实施方案124至130中任一项所述的方法，其进一步包括用培养基灌注流动区域，其中灌注发生在将生物微物体引入室中之后并且在将第二流体介质引入流动区域中之前。[0971]实施方案132.根据实施方案131所述的方法，其中培养基包括可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。[0972]实施方案133.根据实施方案124至132中任一项所述的方法，其中将第二流体介质引入流动区域包括在第一时间段使第二流体介质流经流动区域。[0973]实施方案134.根据实施方案133所述的方法，其中第一时间段为约30分钟至约60分钟。[0974]实施方案135.根据实施方案124至134中任一项所述的方法，其中受关注区域包括室的至少一部分，所述室的至少一部分沿从室内向外进入流动区域的扩散的轴对齐。[0975]实施方案136.根据实施方案124至135中任一项所述的方法，其中检测位于受关注区域内的第二复合物组分包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中至少一些可检测信号从位于受关注区域内的第二复合物组分的可检测的标记物发出。[0976]实施方案137.根据实施方案136所述的方法，其中检测位于受关注区域内的第二复合物组分进一步包括通过从可检测信号的测量强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。[0977]实施方案138.根据实施方案136或137所述的方法，其进一步包括在将生物微物体引入室之前的时间测量受关注区域内的背景信号的强度。[0978]实施方案139.根据实施方案136至138中任一项所述的方法，其中针对在室内观察到的多个细胞对测量的可检测信号强度或减去背景的信号强度进行归一化。[0979]实施方案140.根据实施方案124至139中任一项所述的方法，其进一步包括量化被分析物的分泌水平。[0980]实施方案141.根据实施方案124至139中任一项所述的方法，其进一步包括对室提供分泌得分。[0981]实施方案142.根据实施方案141所述的方法，其中根据实施方案12至25(即，来自所选实施方案的列举)中任一项所述的方法确定分泌得分。[0982]实施方案143.根据实施方案124至142中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量小于5kd。[0983]实施方案144.根据实施方案124至142中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量小于2kd。[0984]实施方案145.根据实施方案124至142中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量小于1kd。[0985]实施方案146.根据实施方案124至145中任一项所述的方法，其中报道复合物的第一复合物组分包含至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。[0986]实施方案147.根据实施方案124至145中任一项所述的方法，其中报道复合物的第一复合物组分包括肽或蛋白。[0987]实施方案148.根据实施方案124至147中任一项所述的方法，其中报道复合物的第二复合物组分包含具有seqidno:1至10中任一项的序列的肽。[0988]实施方案149.根据实施方案124至147中任一项所述的方法，其中报道复合物的第二复合物组分包括蛋白a、蛋白g或蛋白a或蛋白g的igg结合片段。[0989]实施方案150.根据实施方案124至147中任一项所述的方法，其中报道分子的第二复合物组分包括适体。[0990]实施方案151.根据实施方案124至147中任一项所述的方法，其中报道复合物的第二复合物组分包括分泌的被分析物的全部或部分(例如，分泌的被分析物与第一复合物组分结合所需的部分)。[0991]实施方案152.根据实施方案124至151中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物竞争性地抑制第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[0992]实施方案153.根据实施方案124至151中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物非竞争性地抑制第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[0993]实施方案154.根据实施方案153所述的方法，其中分泌的被分析物通过变构机制抑制第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[0994]实施方案155.根据实施方案124至154中任一项所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物包括肽、糖、寡核苷酸或寡核苷。[0995]实施方案156.根据实施方案124至154中任一项所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物是代谢物或除蛋白、糖或核酸以外的有机分子。[0996]实施方案157.根据实施方案124至156中任一项所述的方法，其中微流体装置包括多个室，其中生物微物体被引入多个室中的至少两个室中，并且其中所述方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每一个室进行的。[0997]实施方案158.根据实施方案157所述的方法，其进一步包括比较多个室中至少两个室的室的分泌水平。[0998]实施方案159.根据实施方案157所述的方法，其进一步包括比较多个室中多于一个室的分泌得分。[0999]实施方案160.根据实施方案157至159中任一项所述的方法，其进一步包括：选择至少两个室中的一个或多个室；以及从每个选择的室输出一个或多个生物微物体。[1000]实施方案161.根据实施方案160所述的方法，其中来自每个选择的室的一个或多个生物微物体进一步从微流体装置中输出。[1001]实施方案162.根据实施方案161所述的方法，其中单独输出选择的室。[1002]实施方案163.根据实施方案124至162中任一项所述的方法，其中受关注区域包括图像区域，其对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，并沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。[1003]实施方案164.根据实施方案163所述的方法，其中受关注区域基本上由图像区域组成。[1004]实施方案165.根据实施方案124至164中任一项所述的方法，其中所述方法是自动化的。[1005]实施方案166.一种克隆系发育方法，所述方法包括：执行实施方案66、117和159中任一项所述的方法；从多个室中选择一组室，其中该组室的每个室具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分；从微流体装置输出包含在选择的一组室的每个室中的一个或多个生物微物体；在相应的反应容器中扩增从选择的一组室的每个室中输出的一个或多个生物微物体；以及测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而对每个生物微物体或克隆群确定分泌水平。[1006]实施方案167.根据实施方案166所述的方法，其中受关注区域包括图像区域，其对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，并沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。[1007]实施方案168.根据实施方案167所述的方法，其中受关注区域基本上由图像区域组成。[1008]实施方案169.根据实施方案166至168中任一项所述的方法，其中所述方法是自动化的。[1009]实施方案170.一种用于评估生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的试剂盒，所述试剂盒包括：微流体装置，其包括具有流动区域的外壳和多个室，其中每个室与流动区域流体连接，并且其中流动区域和室被配置为包含流体介质；和报道复合物，其包括被配置为与分泌的被分析物结合的第一复合物组分，以及与第一复合物组分结合并包含可检测的标记物的第二复合物组分，其中分泌的被分析物与第一复合物组分的结合抑制或阻止第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[1010]实施方案171.根据实施方案170所述的试剂盒，其中报道复合物的第一复合物组分包含至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。[1011]实施方案172.根据实施方案170所述的试剂盒，其中报道复合物的第一复合物组分包括肽或蛋白。[1012]实施方案173.根据实施方案170至172中任一项所述的试剂盒，其中报道复合物的第二复合物组分包含具有seqidno:1至10中任一项的序列的肽。[1013]实施方案174.根据实施方案170至172中任一项所述的试剂盒，其中报道复合物的第二复合物组分包括蛋白a、蛋白g或蛋白a或蛋白g的igg结合片段。[1014]实施方案175.根据实施方案170至172中任一项所述的试剂盒，其中报道分子的第二复合物组分包括适体。[1015]实施方案176.根据实施方案170至172中任一项所述的试剂盒，其中报道复合物的第二复合物组分包括分泌的被分析物的全部或部分(例如，分泌的被分析物与第一复合物组分结合所需的部分)。[1016]实施方案177.根据实施方案170至176中任一项所述的试剂盒，其中分泌的被分析物竞争性地抑制第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[1017]实施方案178.根据实施方案170至176中任一项所述的试剂盒，其中分泌的被分析物非竞争性地抑制第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[1018]实施方案179.根据实施方案178所述的试剂盒，其中分泌的被分析物通过变构机制抑制第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[1019]实施方案180.一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机执行用于测定由生物微物体所产生的被分析物的量的方法，其中所述方法是权利要求45至47、96至98和138至140中任一项所述的方法。[1020]实施方案181.根据实施方案180所述的非暂态计算机可读介质，其中系统是实施方案1至11中任一项所述的系统。[1021]实施方案182.一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统执行用于克隆系发育的方法的至少一部分，其中所述方法是实施方案166至169中任一项所述的方法，并且其中系统至少执行步骤直到并且包括从微流体装置输出包含在选择的一组室中的每个室中的一个或多个生物微物体为止。[1022]实施方案183.根据实施方案182所述的非暂态计算机可读介质，其中系统是实施方案1至11中任一项所述的系统。[1023]实施方案184.一种评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的方法，该方法包括：将生物微物体引入到微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室含有第一流体介质；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群向室内的第一流体介质中分泌被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包含多个报道分子，并且其中每个报道分子包含被配置为结合分泌的被分析物的结合组分和可检测的标记物；允许多个报道分子中的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的报道分子。[1024]实施方案185.根据实施方案184所述的方法，其进一步包括：将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含任何报道分子；以及允许至少一部分未结合的报道分子扩散出室。[1025]实施方案186.根据实施方案185所述的方法，其中检测位于受关注区域内的报道分子在选择的时间发生，使得已经从室中扩散出来的未结合的报道分子的量比已经从室中扩散出来的rmsa复合物的量至少大2倍。。[1026]实施方案187.根据实施方案185或186中任一项所述的方法，其中将第三流体介质引入流动区域包括在第一时间段使第三流体介质流经流动区域。[1027]实施方案188.根据实施方案185至187中任一项所述的方法，其中第一时间段为约30分钟至约60分钟。[1028]实施方案189.根据实施方案187或188中任一项所述的方法，其中检测位于微流体装置内的受关注区域内的报道分子按照以下进行：在第二时间段之后进行；在第二时间段内进行两次或更多次；或在第二时间段内基本上连续进行。[1029]实施方案190.根据实施方案184至189中任一项所述的方法，其进一步包括量化被分析物的分泌水平。[1030]实施方案191.根据实施方案184至190中任一项所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物是抗体，或任选地是糖基化抗体。[1031]实施方案192.根据实施方案184至191中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分与抗体或糖基化抗体的fc区结合。[1032]实施方案193.根据实施方案184至192中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分结合抗体重链(例如，包含重链肽的一个或多个氨基酸残基的表位)。[1033]实施方案194.根据实施方案184至193中任一项所述的方法，其中生物微物体是生物细胞。[1034]实施方案195.根据实施方案184至194中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包含至少一种核酸。[1035]实施方案196.根据实施方案184至195中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包含至少一种氨基酸。[1036]实施方案197.根据实施方案184至196中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包含适体。[1037]实施方案198.根据实施方案184至197中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包括肽或蛋白。[1038]实施方案199.根据实施方案198所述的方法，其中报道分子的结合组分包含具有seqidno:1至10中任一项的序列的肽。[1039]实施方案200.根据实施方案198所述的方法，其中报道分子的结合组分包括蛋白a、蛋白g或蛋白a或蛋白g的igg结合片段。[1040]实施方案201.根据实施方案184至200中任一项所述的方法，其中可检测的标记物包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。[1041]实施方案202.根据实施方案201所述的方法，其中报道分子的可检测的标记物是荧光标记物，并且其中所述检测报道分子包括检测来自受关注区域内报道分子的荧光标记物的荧光发射。[1042]实施方案203.根据实施方案202所述的方法，其进一步包括：在第三时间段将包括室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发报道分子的荧光标记物的波长。[1043]实施方案204.根据实施方案203所述的方法，其进一步包括：在第四时间段将包含室但不是流动区域的微流体装置的一部分暴露，其中第四时间段足以对室中存在的任何报道分子的荧光标记物进行光漂白。[1044]实施方案205.根据实施方案204所述的方法，其中在所述检测受关注区域内的荧光发射之前进行所述暴露第四时间段。[1045]实施方案206.根据实施方案204或205中任一项所述的方法，其中所述检测受关注区域内的荧光发射在所述暴露第四时间段后(例如，在包含非光漂白荧光标记物的报道分子已扩散到所述室中后)约5秒至约20秒发生。[1046]实施方案207.根据实施方案204至206中任一项所述的方法，其中所述暴露第四时间段和检测荧光发射的步骤重复一次或多次(例如，1、2、3、4、5次或更多次)。[1047]实施方案208.根据实施方案194至206中任一项所述的方法，其进一步包括用培养基灌注流动区域，其中灌注发生在将生物微物体引入室中之后并且在将第二流体介质引入流动区域中之前。[1048]实施方案209.根据实施方案208所述的方法，其中培养基包括可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。[1049]实施方案210.根据实施方案184至209中任一项所述的方法，其中检测位于受关注区域内的报道分子包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中至少一些可检测信号从位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出。[1050]实施方案211.根据实施方案210所述的方法，其中检测位于受关注区域内的报道分子进一步包括通过从可检测信号的测量强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。[1051]实施方案212.根据实施方案211所述的方法，其中在将生物微物体引入微流体装置的室之前，通过将第四流体介质引入流动区域来确定背景信号，其中第四流体介质包含多个报道分子，以及允许报道分子在流动区域和室之间达到平衡。[1052]实施方案213.根据实施方案184至212中任一项所述的方法，其中针对在室内观察到的多个细胞对测量的可检测信号强度或减去背景的信号强度进行归一化。[1053]实施方案214.根据实施方案184至213中任一项所述的方法，其进一步包括对室提供分泌得分。[1054]实施方案215.根据实施方案214所述的方法，其中根据实施方案12至25(即，来自所选实施方案的列举)中任一项所述的方法确定分泌得分。[1055]实施方案216.根据实施方案184至215中任一项所述的方法，其中将生物微物体引入微流体装置的室包括选择生物微物体并选择性地将选择的生物微物体移动到室中。[1056]实施方案217.根据实施方案216所述的方法，其中选择是正选择(例如，对生物微物体进行指示健康细胞或表达构建体在细胞基因组中成功/靶向整合的标志物的染色，并且选择阳性染色的生物微物体)。[1057]实施方案218.根据实施方案216所述的方法，其中选择是负选择(例如，对生物微物体进行指示不健康细胞或表达构建体在细胞基因组中未成功整合的标志物的染色，并且选择未被染色的生物微物体)。[1058]实施方案219.根据实施方案218所述的方法，其中对生物微物体进行膜联蛋白v染色。[1059]实施方案220.根据实施方案184至219中任一项所述的方法，其中微流体装置包括多个室，其中生物微物体被引入多个室中的至少两个室中，并且其中所述方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每一个室进行的。[1060]实施方案221.根据实施方案220所述的方法，其进一步包括：选择至少两个室中的一个或多个室；以及从每个选择的室输出一个或多个生物微物体。[1061]实施方案222.根据实施方案221所述的方法，其中来自每个选择的室的一个或多个生物微物体进一步从微流体装置中输出。[1062]实施方案223.根据实施方案222所述的方法，其中单独输出选择的室。[1063]实施方案224.根据实施方案222或223中任一项所述的方法，其中将来自每个选择的室的一个或多个生物微物体中的每一个均输出到被优化为支持克隆活力的培养基中。[1064]实施方案225.根据实施方案184至224中任一项所述的方法，其中所述方法是自动化的。[1065]实施方案226.一种克隆系发育方法，所述方法包括：执行实施方案184至225中任一项所述的方法；从多个室中选择一组室，其中该组室的每个室具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分；从微流体装置输出包含在选择的一组室的每个室中的一个或多个生物微物体；在相应的反应容器中扩增从选择的一组室的每个室中输出的一个或多个生物微物体；以及测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而对每个生物微物体或克隆群确定分泌水平。[1066]实施方案227.根据实施方案226所述的方法，其中受关注区域包括图像区域，其对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，并沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。[1067]实施方案228.根据实施方案227所述的方法，其中受关注区域基本上由图像区域组成。[1068]实施方案229.根据实施方案226至228中任一项所述的方法，其中所述方法是自动化的。[1069]实施方案230.一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统执行用于测定由生物微物体所产生的被分析物的量的方法，其中所述方法是权利要求184至229中任一项所述的方法。[1070]实施方案231.根据实施方案230所述的非暂态计算机可读介质，其中系统是实施方案1所述的系统。[1071]实施方案232.一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统执行用于克隆系发育的方法的至少一部分，其中所述方法是实施方案230至231中任一项所述的方法，并且其中系统至少执行步骤直到并且包括从微流体装置输出包含在选择的一组室中的每个室中的一个或多个生物微物体为止。[1072]实施方案233.根据实施方案232所述的非暂态计算机可读介质，其中系统是实施方案1所述的系统。[1073]实施例234.一种评估多个生物微物体或多个由其生成的生物微物体的群间的可溶性被分析物的相对分泌水平的方法，该方法包括：将多个生物微物体引入到微流体装置的多个室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中多个室中的每个室与流动区域流体连接并且含有第一流体介质；允许多个生物微物体中的每一个生物微物体或由其生成的生物微物体的群向室内的第一流体介质中分泌可溶性被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包含多个可溶性报道分子，并且其中每个报道分子均包含：被配置为与分泌的被分析物结合的结合组分；和可检测的标记物；允许多个可溶性报道分子中的一部分扩散到多个室中并与其中分泌的可溶性被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含报道分子；允许未结合的可溶性报道分子扩散出室；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的可溶性报道分子。[1074]实施方案235.根据实施方案234所述的方法，其中室包括分离区域，其中分离区域与二次流动分离。[1075]实施方案236.根据实施方案234或235中任一项所述的方法，其中室包括连接区域，该连接区域与流动区域中的流体介质的直接流动分离。[1076]实施方案237.根据实施方案234至236中任一项所述的方法，其中将多个生物微物体中的单个生物微物体布置在多个室中的单个室中。[1077]实施方案238.根据实施方案234至237中任一项所述的方法，其中可溶性报道分子的浓度为可溶性报道分子对被分析物的kd的约1-10倍。[1078]实施方案239.根据实施方案234至238中任一项所述的方法，其中流动区域中的第二流体介质以约0.1-10秒的刷新率刷新，并且刷新率是替换流动区域中全部流体体积的时间段。[1079]实施方案240.根据实施方案234至239中任一项所述的方法，其中受关注区域位于室的钩区域内。[1080]实施方案241.根据实施方案234至240中任一项所述的方法，其进一步包括：对多个室中的每个室获得相对分泌水平或分泌得分；并基于所获得的分泌得分对多个室进行评级；以及基于评级对多个室进行排序。[1081]实施方案242.根据实施方案234至241中任一项所述的方法，其中多个报道分子包括至少两个不同的报道分子，每个报道分子具有不同的标记物。[1082]实施方案243.一种评估多个生物微物体或由其生成的生物微物体的群的可溶性被分析物的相对分泌水平的方法，该方法包括：将第一流体介质引入微流体装置的多个室中，其中微流体装置包括具有流体连接到多个室的流动区域的外壳，其中第一流体介质包括第一批多个可溶性报道分子；获取微流体装置的图像；将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质不包含可溶性报道分子；将多个生物微物体的子集引入多个室的子集中；允许多个生物微物体或由其生成的生物微物体的群在室内分泌可溶性被分析物；将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质包含第二批多个可溶性报道分子，其中每个报道分子均包含：被配置为结合可溶性分泌的被分析物的结合组分；和可检测的标记物；允许第二批多个可溶性报道分子的一部分扩散到室中并与其中分泌的可溶性被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的一个或多个受关注区域内的可溶性报道分子。[1083]实施方案244.根据实施方案243所述的方法，其中室包括分离区域，其中分离区域与二次流动分离。[1084]实施方案245.根据实施方案243或244中任一项所述的方法，其中室包括连接区域，该连接区域与流动区域中的流体介质的直接流动分离。[1085]实施方案246.根据实施方案243至245中任一项所述的方法，其中将多个生物微物体中的单个生物微物体布置在多个室中的单个室中。[1086]实施方案247.根据实施方案243至246中任一项所述的方法，其中可溶性报道分子的浓度为可溶性报道分子对被分析物的kd的约1-10倍。[1087]实施方案248.根据实施方案243至247中任一项所述的方法，其中流动区域中的第二流体介质以约0.1-10秒的刷新率刷新，并且刷新率是替换流动区域中全部流体体积的时间段。[1088]实施方案249.根据实施方案243至248中任一项所述的方法，其中图像是在t＝0时获取的第一图像，可溶性报道分子的检测包括在t＝1时获取第二图像，其中在t＝l时，流动区域和多个室之间的未结合的可溶性报道分子的扩散已接近稳态。[1089]实施方案250.根据实施方案243至249中任一项所述的方法，其中受关注区域包括多个室中每个室的连接区域的至少一部分，所述方法进一步包括：从第二图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室的至少一部分确定包含每个连接区域的至少一部分的受关注区域中的可溶性rmsa复合物的相对量，其中受关注区域中的可溶性rmsa复合物的相对量用于生成可溶性rmsa复合物量的变化的线性近似值，并且线性近似值的斜率用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。[1090]实施方案251.根据实施方案250所述的方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第二图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[1091]实施方案252.根据实施方案243至249中任一项所述的方法，其中微流体装置包含多个室，并且其中受关注区域是多个室中每个室的钩区域，所述方法进一步包括：从第二图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室中的至少一部分量化钩区域中的可溶性rmsa复合物的相对量，其中钩区域中可溶性rmsa复合物的相对量用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。[1092]实施方案253.根据实施方案252所述的方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第二图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[1093]实施方案254.根据实施方案243至253中任一项所述的方法，其进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第二图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[1094]实施方案255.根据实施方案243至254中任一项所述的方法，其中第一批多个和第二批多个可溶性报道分子包含相同的标记物。[1095]实施方案256.根据实施方案243至254中任一项所述的方法，其中第一批多个和第二批多个可溶性报道分子包括两种不同的报道分子，每种报道分子具有不同的标记物。[1096]实施方案257.一种评估跨多个生物微物体或由其生成的生物微物体的群的可溶性被分析物的相对分泌水平的方法，该方法包括：将第一流体介质引入微流体装置的多个室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳和流体连接到流动区域的室，其中第一流体介质包括第一批多个报道分子；获取微流体装置的第一图像；将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质不包含报道分子；将生物微物体引入室中；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群在室内分泌可溶性被分析物；将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质包含第二批多个报道分子，其中每个报道分子均包含：被配置为结合分泌的被分析物的结合组分；和可检测的标记物；允许第二批多个报道分子的一部分扩散到室中并与其中分泌的可溶性被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；获取微流体装置的第二图像；将第四流体介质引入流动区域，其中第四流体介质不包含报道分子；以及检测位于微流体装置内的一个或多个受关注区域内的报道分子。[1097]实施方案258.根据实施方案257所述的方法，其中室包括分离区域，其中分离区域与二次流动分离。[1098]实施方案259.根据实施方案257或258中任一项所述的方法，其中室包括连接区域，该连接区域与流动区域中的流体介质的直接流动分离。[1099]实施方案260.根据实施方案257至259中任一项所述的方法，其中将多个生物微物体中的单个生物微物体布置在多个室中的单个室中。[1100]实施方案261.根据实施方案257至260中任一项所述的方法，其中可溶性报道分子的浓度为可溶性报道分子对被分析物的kd的1-10倍。[1101]实施方案262.根据实施方案257至261中任一项所述的方法，其中流动区域中的第二流体介质以约0.1-10秒的刷新率刷新，并且刷新率是替换流动区域中全部流体体积的时间段。[1102]实施方案263.根据实施方案257至262中任一项所述的方法，其中检测报道分子包括获取微流体装置的第三图像。[1103]实施方案264.根据实施方案263所述的方法，其中受关注区域包括多个室中每个室的连接区域的至少一部分，所述方法进一步包括：从第三图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室的至少一部分量化每个连接区域的多个子区域中每个子区域中的可溶性rmsa复合物的量，其中多个子区域的一部分中的可溶性rmsa复合物的量用于生成线性近似值，并且线性近似值的斜率用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。[1104]实施方案265.根据实施方案264所述的方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[1105]实施方案266.根据实施方案264所述的方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像、第二图像和背景图像来获得校正图像。[1106]实施方案267.根据实施方案263所述的方法，其中受关注区域是多个室中每个室的钩区域，所述方法进一步包括：从第三图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室中的至少一部分量化钩区域中的rmsa复合物的量，其中钩区域中rmsa复合物的量用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。[1107]实施方案268.根据实施方案267所述的方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[1108]实施方案269.根据实施方案268所述的方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像、第二图像和背景图像来获得校正图像。[1109]实施方案270.根据实施方案257至262中任一项所述的方法，其中第二图像用于确定未结合的报道分子在流动区域和室之间的扩散是否已达到稳态。[1110]实施方案271.根据实施方案257至270中任一项所述的方法，其进一步包括：获得多个室中每个室的相对分泌水平或分泌得分；并基于所获得的分泌得分对多个室进行评级；以及基于评级对多个室进行排序。[1111]实施方案272.根据实施方案257至271中任一项所述的方法，其中第一批多个和第二批多个可溶性报道分子包含相同的标记物。[1112]实施方案273.根据实施方案257至271中任一项所述的方法，其中第一批多个和第二批多个可溶性报道分子包括两种不同的报道分子，每种报道分子具有不同的标记物。当前第1页12当前第1页12
背景技术：
：：1.总体上，本文所公开的实施方案涉及用于对限定在规定区域内的微物体的量化或定性参数进行光学测量的系统、装置和方法。更具体地，需要成像系统和方法，其能够精确地测定由限定在微流体装置内的室(例如，隔离室)中的微物体所产生的被分析物的量。技术实现要素：2.一方面，提供了一种用于测定生物微物体所产生的被分析物的量的系统。该系统可以包括图像获取单元。该图像获取单元可以包括微流体装置支撑物，其能够固定微流体装置，其中微流体装置包括流动区域和与流动区域流体连接的多个室。多个室中的每个室均可以容纳一个或多个生物微物体。图像获取单元可以进一步包括成像元件，其被配置为捕捉微流体装置的多个室和流动区域的一个或多个测定图像。该系统可以进一步包括与图像获取单元通信连接的图像处理单元。图像处理单元可以包括受关注区域确定引擎，其被配置为接收每个捕捉的测定图像并对测定图像中描绘的每个室定义受关注区域。受关注区域可以包括图像区域，其对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，和/或沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。图像处理单元可以进一步包括评分引擎，其被配置为分析每个室的受关注区域内的图像区域的至少一部分，以确定指示每个室中被分析物的量的得分。3.另一方面，提供了一种用于测定由生物微物体所产生的被分析物的量的方法。该方法可以包括接收微流体装置的成像数据的步骤，该微流体装置包括流动区域和与流动区域流体连接的多个室。成像数据可以包括被分析物测定图像以及背景噪声图像和信号参比图像中的一种或两种。该方法可以进一步包括对每个室定义受关注区域。受关注区域可以包括室内的图像区域，该图像区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，和/或沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。该方法甚至可以进一步包括确定得分(例如，提供芯片上各个室的相对评级的得分)，其中该得分通过分析每个室中受关注区域的至少一部分图像区域来指示每个室中被分析物的量。4.另一方面，提供了一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机执行用于测定生物微物体所产生的被分析物的量的图像处理方法。该方法可以包括接收微流体装置的成像数据，该微流体装置包括流动区域和多个与流动区域流体连接的室。成像数据可以包括被分析物测定图像以及背景噪声图像和信号参比图像中的一种或两种。该方法还可以包括对每个室定义受关注区域。受关注区域可以包括室内的图像区域，该图像区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，和/或沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。该方法甚至还可以包括通过分析每个室的受关注区域的图像区域的至少一部分来确定指示每个室中的被分析物的量的得分。5.另一方面，提供了一种评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌被分析物的水平的方法，该方法包括：将生物微物体引入到微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室含有第一流体介质；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群向室内的第一流体介质中分泌被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质含有多个可溶性报道分子，并且其中每个可溶性报道分子包含：结合组分，其被配置为与分泌的被分析物结合；和可检测的标记物；允许多个可溶性报道分子中的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物，其中受关注区域包括室的至少一部分。6.另一方面，提供了一种克隆系发育的方法，该方法包括：将单个生物微物体引入到微流体装置的多个室中的每一个中，其中微流体装置还包括具有流动区域的外壳，并且其中多个室中的每一个与流动区域流体连接且含有第一流体介质；允许每个生物微物体或由其生成的生物微物体的克隆群向相应的室中含有的第一流体介质中分泌被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包括多个可溶性报道分子，其中每个可溶性报道分子包含结合组分，其被配置为与分泌的被分析物结合；和可检测的标记物；允许多个可溶性报道分子中的一部分扩散进入多个室中的每一个中并与其中分泌的被分析物的至少一部分结合，从而在多个室中的每一个中产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；对于多个室中的每一个，检测从相应的受关注区域发出的信号的强度，其中受关注区域包括相应的室的至少一部分，并且其中从受关注区域发出的信号的至少一部分是从位于受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物的可检测的标记物发出的；对于多个室中的每一个，基于所检测的从相应的受关注区域发出的信号强度确定得分；从多个室中选择一组室，其中该组中的每个室具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分；和从微流体装置输出所选择的室的组的每个室内含有的一个或多个生物微物体。在某些实施方案中，该方法进一步包括在相应的反应容器中扩增从所选择的室的组中的每个室中输出的一个或多个生物微物体以形成克隆群；以及测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而对每个克隆群确定分泌水平。7.另一方面，提供了一种用于评价生物微物体或由其生成的生物微物体的群的被分析物分泌水平的试剂盒，包括：微流体装置，其包括具有流动区域的外壳；和室，其中室与流动区域流体连接，并且其中流动区域和室被配置为含有流体介质；和可溶性报道分子，其包含可检测的标记物和被配置为与被分析物结合的结合组分。在某些实施方案中，可溶性报道分子在溶液中提供。在其他实施方案中，可溶性报道分子以干燥(例如，冻干)形式提供。8.在各种实施方案中，提供了一种用于评估生物微物体或由其生成的生物微物体的群的被分析物分泌水平的方法，该方法包括：将生物微物体引入微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室含有第一流体介质；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群将被分析物分泌到室内的第一流体介质中；将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质包含多个可溶性报道分子，并且其中每个可溶性报道分子包含被配置为结合分泌的被分析物的结合组分和可检测的标记物；允许多个可溶性报道分子的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含任何可溶性报道分子；允许至少一部分未结合的报道分子扩散到室外；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物，其中受关注区域位于室的非冲刷区域内。9.在各种实施方案中，提供了一种用于评估生物微物体或由其生成的生物微物体的群的被分析物分泌水平的方法，该方法包括：将第一流体介质引入流动区域，其中第一流体介质包含多个可溶性报道分子，并且其中每个可溶性报道分子包括被配置为结合分泌的被分析物的结合组分和可检测的标记物；测量受关注区域内可检测信号的强度；将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质不包含任何可溶性报道分子；将生物微物体引入微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群将被分析物分泌到室内的第一流体介质中；将第三流体介质引入流动区域，其中第二流体介质包括多个可溶性报道分子，并且其中每个可溶性报道分子包括被配置为结合分泌的被分析物的结合组分和可检测的标记物；允许多个可溶性报道分子的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物。10.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域包括室的至少一部分，其沿着从室内向外扩散到流动区域中的轴排列。11.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域在室的非冲刷区域内。12.在各种实施方案中，进一步提供了一种方法，其包括将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含任何可溶性报道分子；允许至少一部分未结合的可溶性报道分子扩散到室外；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物。13.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中检测位于受关注区域内的可溶性报道分子发生在选定的时间，使得已扩散到室外的未结合的可溶性报道分子的量比已扩散到室外的可溶性rmsa复合物的量大至少2倍。14.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中该方法进一步包括量化被分析物中的分泌水平。15.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少两倍。在各种实施方案中，提供了一种方法，其中分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少四倍。在各种实施方案中，提供了一种方法，其中分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少十倍。16.在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物包括蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。17.在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物是抗体或任选地是糖基化抗体。18.在各种实施方案中，生物微物体是生物细胞。19.在各种实施方案中，可溶性报道分子的结合组分包含至少一个氨基酸和/或至少一个核酸。20.在各种实施方案中，可溶性报道分子的结合组分包含肽或蛋白。21.在各种实施方案中，可溶性报道分子的结合组分包含具有seqidno:1至10中任一个的序列的肽。22.在各种实施方案中，可溶性报道分子的结合组分包含蛋白a、蛋白g或蛋白a或蛋白g的igg结合片段。23.在各种实施方案中，可溶性报道分子的结合组分包含适体。24.在各种实施方案中，可检测的标记物包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。25.在各种实施方案中，可溶性报道分子的可检测的标记物是荧光标记物，并且其中所述检测可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物包括检测来自受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物的荧光标记物的荧光发射。26.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中在第二时间段后进行所述检测荧光发射；所述检测荧光发射在第二时间段内进行两次或更多次；或所述检测荧光发射在第二时间段内基本上连续地进行。27.在各种实施方案中，进一步提供了一种方法，该方法包括在第三时间段内将包含室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发可溶性报道分子的荧光标记物的波长。28.在各种实施方案中，进一步提供了一种方法，该方法包括在第四时间段内暴露微流体装置的一部分，该部分包括室但不包括流动区域，其中第四时间段足以光漂白室中存在的任何可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物的荧光标记物。在各种实施方案中，在所述检测受关注区域内的荧光发射之前进行所述暴露第四时间段。29.在各种实施方案中，所述检测受关注区域内的荧光发射发生在所述暴露第四时间段后(例如，在包含非光漂白荧光标记物的报道分子已扩散到所述室中后)约5秒至约20秒。30.在各种实施方案中，该方法进一步包括用培养基灌注流动区域，其中灌注发生在将生物微物体引入室中之后并且在将第二流体介质引入流动区域中之前。31.在各种实施方案中，培养基包括可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。32.在各种实施方案中，将第二流体介质引入流动区域包括在第一时间段内使第二流体介质流过流动区域。33.在各种实施方案中，第一时间段为约30至约60分钟。34.在各种实施方案中，检测位于受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中可检测信号中的至少一些从位于受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物的可检测的标记物发出。35.在各种实施方案中，检测位于受关注区域内的可溶性报道分子进一步包括通过从可检测信号的测量强度中减去背景信号强度来确定减去背景的信号强度。36.在各种实施方案中，可检测信号的测量强度或减去背景的信号强度针对室中观察到的多个细胞进行归一化。37.在各种实施方案中，该方法进一步包括对室提供分泌得分。38.在各种实施方案中，根据实施方案12至25中任一项所述的方法(即，来自所选实施方案的列举)来确定分泌得分。39.在各种实施方案中，微流体装置包括多个室，其中生物微物体被引入多个室的至少两个室中，并且其中该方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每一个进行的。40.在各种实施方案中，该方法进一步包括比较多个室中至少两个室的室的水平。41.在各种实施方案中，该方法进一步包括比较多个室中多于一个室的分泌得分。42.在各种实施方案中，该方法进一步包括选择至少两个室中的一个或多个；以及从每个选择的室输出一个或多个生物微物体。43.在各种实施方案中，将来自每个选择的室的一个或多个生物微物体进一步从微流体装置中输出。44.在各种实施方案中，单独输出选择的室。45.在各种实施方案中，受关注区域包括图像区域，该图像区域对应于室中对测量被分析物浓度波动最敏感的区域，和/或在测量分析物波动时对室中生物微物体的位置最不敏感的区域。46.在各种实施方案中，受关注区域包括图像区域，该图像区域对应于室内对测量最敏感的区域。在各种实施方案中，受关注区域基本上由图像区域组成。在各种实施方案中，该方法是自动化的。47.在各种实施方案中，提供了一种用于克隆细胞系发育的方法，该方法包括进行上述方法中的任一种，从多个室中选择一组室，其中该组的每个室均具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分；从微流体装置输出包含在选择的一组室中的每个室中的一个或多个生物微物体；在相应的反应容器中扩增从选择的一组室中的每个室中输出的一个或多个生物微物体；以及测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而对每个生物微物体或克隆群确定分泌水平。48.在各种实施方案中，受关注区域包括图像区域，其对应于室中对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中生物微物体的位置最不敏感，和/或沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸的区域。在各种实施方案中，该方法是自动化的。49.在各种实施方案中，提供了一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统执行一种用于确定生物微物体产生的被分析物的量的方法，其中该方法是上述方法中的任一种。50.在各种实施方案中，提供了一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统执行一种用于克隆系发育的方法的至少一部分，其中该方法是上述任一权利要求所述的方法，并且其中系统至少执行步骤直到并且包括从微流体装置输出包含在选择的一组室中的每个室中的一个或多个生物微物体为止。51.根据各种实施方案，提供了一种评估跨多个生物微物体或跨由其生成的生物微物体的群的被分析物分泌相对水平的方法，该方法包括：将多个生物微物体引入到微流体装置的多个室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中多个室中的每个室与流动区域流体连接，并且其中多个室含有第一流体介质；允许多个生物微物体或由其生成的生物微物体的群向多个室内的第一流体介质中分泌可溶性被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包含多个可溶性报道分子，并且其中每个报道分子包含：结合组分，其被配置为与分泌的被分析物结合；和可检测的标记物；允许多个可溶性报道分子中的一部分扩散到多个室中并与其中分泌的可溶性被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的可溶性报道分子和/或可溶性rmsa复合物。52.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中多个室中的每个室均包括分离区域，该分离区域与流动区域中第二流体介质的二次流动分离。53.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中多个室中的每个室均包含连接区域，该连接区域与流动区域中第二流体介质的直接流动分离。54.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中多个生物微物体中的单个生物微物体被设置在多个室中的单个室中。55.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中可溶性报道分子的浓度是被分析物的可溶性报道分子的kd的约1-10倍。56.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中流动区域中的第二流体介质以约0.1-10秒的刷新率刷新，并且刷新率是替换流动区域中全部流体体积的时间段。57.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中允许多个报道分子的一部分扩散进入多个室中包括允许多个报道分子跨流动区域和多个室达到平衡状态。58.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中在引入第二流体介质后3小时内达到平衡状态。59.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：对多个室中的每个室获得分泌水平或分泌得分；和基于获得的分泌得分对多个室进行评级。60.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中多个报道分子包含至少两个不同的报道分子，每个报道分子具有不同的标记物。61.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中每个室包括朝向流动区域的单个开口。62.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中流动区域包括微流体通道，并且每个室包括分离区域和将分离区域与微流体通道流体连接的连接区域，其中连接区域具有朝向微流体通道的近端开口和朝向分离区域的远端开口。63.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域至少部分在室的分离区域内。64.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域在室的钩区域内。65.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域靠近多个生物微物体中的生物微物体所在的区域。66.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域沿着在多个室和流动区域之间扩散的轴(例如沿着在多个室的分离区域和微流体通道之间扩散的轴，例如沿着连接区域定义的扩散的轴)。67.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域不沿着在多个室和流动区域之间扩散的轴(例如不沿着在多个室的分离区域和微流体通道之间扩散的轴，例如不沿着连接区域定义的扩散的轴)。68.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域包括对应于多个室中的室内的区域的图像区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，和/或在测量被分析物波动时对室中生物微物体的位置最不敏感。69.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中检测位于微流体装置内受关注区域内的报道分子是在报道分子扩散至多个室中并且报道分子与其中分泌的被分析物的结合处于稳态条件或接近稳态条件之后进行的。70.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含报道分子；和允许至少一部分未结合的可溶性报道分子从多个室中扩散出来。71.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中来自第二流体介质的多个可溶性报道分子是第一批多个可溶性报道分子，并且在将多个生物微物体引入微流体装置的多个室之前，所述方法进一步包括：将第四流体介质引入流动区域，其中第四流体介质包含第二批多个可溶性报道分子；获取微流体装置的图像；和将第五流体介质引入流动区域，其中第五流体介质不包含可溶性报道分子。72.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中图像是在t＝0时获取的第一图像，可溶性报道分子的检测包括在t＝1时获取第二图像，其中在t＝l时，流动区域和多个室之间的未结合的可溶性报道分子的扩散已接近稳态。73.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域包括多个室中每个室的连接区域的至少一部分，所述方法进一步包括：从第二图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以确定受关注区域中可溶性rmsa复合物的相对量，所述受关注区域包括多个室的至少部分室中的每个连接区域的至少一部分。74.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域中可溶性rmsa复合物的相对量用于生成可溶性rmsa复合物量变化的线性近似值，并且线性近似值的斜率用于比较室之间分泌的被分析物的产生。75.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第二图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。76.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域是多个室中每个室的钩区域，所述方法进一步包括：从第二图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室的至少一部分量化钩区域中可溶性rmsa复合物的相对量，其中钩区域中可溶性rmsa复合物的相对量用于比较各个室之间分泌的可溶性被分析物的产生。77.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第二图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。78.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中第一批多个可溶性报道分子和第二批多个可溶性报道分子包含相同的标记物。79.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中第一批多个可溶性报道分子和第二批多个可溶性报道分子包含两种不同的报道分子，每种报道分子具有不同的标记物。80.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中所述图像是在t＝0时获取的第一图像，所述方法进一步包括：在将第三流体介质引入流动区域之前，并且在允许多个可溶性报道分子的部分扩散到多个室中并与其中分泌的可溶性被分析物结合之后，获取微流体装置的第二图像。81.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中报道分子的检测包括获取微流体装置的第三图像。82.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域包括多个室中每个室的连接区域的至少一部分，所述方法进一步包括：从第三图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室的至少一部分量化每个连接区域的多个子区域中每个子区域中的可溶性rmsa复合物的量，其中，多个子区域中部分子区域中的可溶性rmsa复合物的量用于生成线性近似值，并且线性近似值的斜率用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。83.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。84.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像、第二图像和背景图像来获得校正图像。85.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中受关注区域是多个室中每个室的钩区域，所述方法进一步包括：从第三图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室中的至少一部分量化钩区域中的rmsa复合物的量，其中钩区域中rmsa复合物的量用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。86.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。87.在各种实施方案中，提供了一种方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像、第二图像和背景图像来获得校正图像。88.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中所述第二图像用于确定流动区域和多个室之间未结合的报道分子的扩散是否已达到稳态。89.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少两倍。90.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少四倍。91.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少十倍。92.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中生物微物体分泌的被分析物包括蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸之外的有机分子，囊泡或病毒。93.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中生物微物体分泌的被分析物是抗体，或任选地是糖基化抗体。94.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中报道分子的结合组分与抗体重链h1结构域结合。95.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中报道分子的结合组分与抗体轻链(例如，包含轻链肽的一个或多个氨基酸残基的表位)结合。96.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中报道分子的结合组分与λ轻链(例如，包含λ轻链肽的一个或多个氨基酸残基的表位)结合。97.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中报道分子的结合组分与κ轻链(例如，包含κ轻链肽的一个或多个氨基酸残基的表位)结合。98.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中微流体装置包括多个室，其中生物微物体被引入多个室的至少两个室中的每个室，并且其中所述方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每个室进行的。99.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中进一步包括：100.比较多个室的至少两个室的室分泌水平。101.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中进一步包括：102.比较多个室中多于一个室的分泌得分。103.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中将多个生物微物体引入微流体装置的多个室中包括选择生物微物体和选择性地将所选择的生物微物体移动到多个室内。104.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中选择是正选择。105.在各种实施方案中，提供了一种方法，其中选择是负选择。106.在各种实施方案中，提供了一种克隆系发育方法，其进一步包括：从多个室中选择一组室，其中该组室的每个室具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分；从微流体装置输出包含在选择的一组室的每个室中的一个或多个生物微物体；在相应的反应容器中扩增从选择的一组室的每个室中输出的一个或多个生物微物体；和任选地，测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而对每个生物微物体或克隆群确定分泌水平。107.本文所附权利要求书中提供了另外的方法。108.附图简要说明109.为了更完整地理解本文所公开的原则及其优势，现在参考以下描述与附图的结合，其中：110.图1a示出了根据本公开的一些实施方案用于与微流体装置和相关的控制装置一起使用的系统的实例。111.图1b和1c示出了根据本公开的一些实施方案的微流体装置。112.图2a和2b示出了根据本公开的一些实施方案的室(例如，分离室)。113.图2c示出了根据本公开的一些实施方案的详细的室。114.图2d-f示出了根据本公开的一些其他实施方案的室。115.图2g示出了根据本公开的一个实施方案的微流体装置。116.图2h示出了根据本公开的一个实施方案的微流体装置的经涂覆的表面。117.图3a示出了根据本公开的一些其他实施方案的详细的室。118.图3b示出了根据本公开的一些实施方案用于与微流体装置和相关的控制装置一起使用的系统的具体实例。119.图3c示出了根据本公开的一些实施方案的成像装置。120.图4a-4c是根据本公开的一些实施方案的测定的图解表示。121.图5a-5c是根据本公开的一些其他实施方案的测定的图示。122.图6是根据本公开的一些实施方案的微流体装置的室内的扩散特征的示意图。123.图7a-7b是根据本公开的一些实施方案的分子的经计算的扩散速率的图解表示。124.图8a-8b是根据本公开的一些实施方案的分子的经计算的和经实验证实的扩散速率的图解表示。125.图9a-9b是根据本公开的一些实施方案的微流体装置的室内的扩散特征的图解表示。126.图10a-10b是根据本公开的一些其他实施方案的微流体装置的室内的扩散特征的图解表示。127.图11a-11b是根据本公开的其他实施方案的微流体装置的室内的扩散特征的图解表示。128.图12a-12c是根据本公开的一些实施方案的微流体装置的室内的扩散特征和用于评估来自生物微物体的产物的分泌水平的受关注区域的图解和照片表示。129.图13a-13b描绘了根据本公开的一些实施方案归一化之前和之后微流体装置的照片图像。130.图14a-14c是根据本公开的一些实施方案的微流体装置内的测定图像及其受关注区域的测定数据的图解和照片表示。131.图15是根据本公开的一些实施方案的微流体装置内的多个室的中值强度值的叠加的图解表示。132.图16a和16b是根据本公开的一些实施方案的由设置于微流体装置内的生物微物体分泌被分析物的图解表示。133.图17示出了根据本公开的一些实施方案实施的对室中存在的生物微物体所分泌的被分析物的量进行量化的步骤。134.图18示出了根据本公开的一些实施方案实施的计算表示由生物微物体分泌的被分析物的量的绝对值或相对值的一系列步骤。135.图19示出了根据本公开的一些实施方案实施的评估表示由细胞的克隆群所分泌的被分析物的量的绝对值或相对值的步骤。136.图20是根据本公开的一些实施方案所生成的滴定曲线的图解表示。137.图21是根据本公开的一些实施方案的包括坞识别和测定得分的微流体装置的一部分的归一化的测定图像的照片表示。138.图22是根据本公开的一些实施方案的培养和测定序列的过程的照片和图解表示。139.图23a-23b是根据本公开的一些实施方案的微流体装置的所有室的测定值的图解表示。140.图24是根据本公开的一些实施方案的微流体装置的所选的室中的克隆群和各自的放大的克隆群的测定值之间的相关性的图解表示。141.图25是示出根据各种实施方案的计算机系统的框图。142.图26是根据各种实施方案的用于评估被分析物的量的系统的示意图。143.图27是根据各种实施方案的用于评估被分析物的量的系统的示意图。144.图28是根据各种实施方案的微流体装置的室的横截面。145.图29和30是描绘根据各种实施方案的用于测定被分析物的量的方法的示例性流程图。146.图31是描绘根据各种实施方案的时间和荧光之间关系的示例图。147.图32示出了根据各种实施方案的光漂白室。148.图33a-33c示出了根据各种实施方案的对小分子被分析物的示例性细胞系发育测定。149.图34是根据各种实施方案的用于评估被分析物的量的系统的示意图。150.图35是根据各种实施方案的微流体装置的室的横截面。151.图36示出了根据本公开的各种实施方案的为量化由室中存在的生物微物体分泌的被分析物的量而进行的步骤。152.图37示出了根据本公开的各种实施方案的为量化由室中存在的生物微物体分泌的被分析物的量而进行的步骤。153.图38示出了根据本公开的各种实施方案的为量化由室中存在的生物微物体分泌的被分析物的量而进行的步骤。154.图39示出了根据本公开的各种实施方案的为量化由多个室中存在的多个生物微物体分泌的被分析物的量而进行的步骤。155.图40a-40g示出了为了评估对测量来自微流体装置钩区域中的rmsa复合物的信号的改进而进行的模拟实验的各个方面。156.图41a-41b示出了比较冲洗测定和平衡测定的示例性数据。157.图42a-42b示出了显示为平衡测定拍摄的平均图像的信号改善的示例性数据。158.应当理解，附图不一定是按比例绘制的，附图中物体也不一定是相对于彼此按比例绘制的。附图的描绘旨在使本文所公开的装置、系统和方法的各种实施方案清楚和容易理解。尽可能地，在整个附图中会使用相同的附图标记来指代相同的或类似的部件。此外，应当理解，附图并不意图以任何方式限制本教导的范围。159.发明详述160.本说明书描述了本公开的示例性实施方案和应用。然而，本公开并不限于这些示例性实施方案和应用，也不限于示例性实施方案和应用在本文中操作或描述的方式。此外，附图可以示出简化或局部视图，并且附图中的要素的尺寸可能被夸大或者不成比例。另外，由于本文使用术语“在......上”、“附接到”、“连接到”、“耦合到”或类似的词，一个要素(例如，材料、层、衬底等)可以“在另一要素上”、“附接到另一要素”、“连接到另一要素”或“耦合到另一要素”，而不论该一个要素是直接在该另一要素上、附接到该另一要素、连接到该另一要素或耦合到该另一要素，还是在该一个要素和该另一元素之间有一个或多个间隔要素。此外，除非上下文另有规定，否则如果提供方向(例如，上方、下方、顶部、底部、侧面、上、下、在……下、在……下、上部、下部、水平、垂直、“x”、“y”、“z”等)的话，它们是相对的并且仅作为示例提供，并且为了便于说明和讨论而不是作为限制。另外，在提及要素列表(例如，要素a、b、c)的情况下，这样的提及旨在包括所列要素本身中的任何一个、少于所有列出的要素的任何组合和/或所有列出的要素的组合。说明书中的章节划分仅为了便于审查，并不限制所讨论要素的任何组合。161.在微流体特征的尺寸被描述为具有宽度或面积的情况下，通常相对于x轴和/或y轴尺寸来描述该尺寸，这两个尺寸都位于与微流体装置的衬底和/或盖平行的平面内。可以相对于z轴方向描述微流体特征的高度，该z轴方向垂直于平行于微流体装置的衬底和/或盖的平面。在一些情况下，微流体特征(例如通道或通路)的横截面积可以参考x轴/z轴、y轴/z轴或x轴/y轴面积。162.如本文所用的“基本上”意指足以用于预期目的。因此，术语“基本上”允许由绝对或完美状态、尺寸、测量、结果等的微小的、无关紧要的变化，例如本领域普通技术人员所预期但不明显影响整体性能的变化。当与数值或者可以表示为数值的参数或特性相关地使用时，“基本上”意味着在百分之十之内。163.术语“多个(ones)”意味着不止一个。164.如本文所用的术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。165.如本文所用的术语“置于”在其含义内包括“位于”。166.如本文所用，“微流体装置”或“微流体设备”是这样的装置：其包括一个或多个分离的微流体管路，所述微流体管路被配置为容纳流体，每个微流体管路包括流体互连的管路元件，包括但不限于区域、流动路径、通道、室和/或坞；以及至少一个开口，所述开口被配置为允许流体(以及任选地悬浮在流体中的微物体)流入和/或流出微流体装置。通常，微流体装置的微流体管路将包括流动区域(该流动区域可以包括微流体通道)和至少一个室，并且将容纳小于约1ml(例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2μl)的流体体积。在某些实施方案中，微流体管路容纳约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300μl。微流体管路可以被配置为具有与微流体装置中的第一开口(例如，入口)流体连接的第一端和与微流体装置中的第二开口(例如，出口)流体连接的第二端。167.如本文所用的“纳米流体装置”或“纳米流体设备”是一种具有微流体管路的微流体装置类型，所述微流体管路含有至少一个管路元件，所述管路元件被配置为容纳小于约1μl的流体体积，例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nl或更少。纳米流体装置可以包括多个管路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多)。在某些实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约100pl至1nl、100pl至2nl、100pl至5nl、250pl至2nl、250pl至5nl、250pl至10nl、500pl至5nl、500pl至10nl、500pl至15nl、750pl至10nl、750pl至15nl、750pl至20nl、1至10nl、1至15nl、1至20nl、1至25nl或1至50nl的流体体积。在其他实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约20nl至200nl、100至200nl、100至300nl、100至400nl、100至500nl、200至300nl、200至400nl、200至500nl、200至600nl、200至700nl、250至400nl、250至500nl、250至600nl或250至750nl的流体体积。168.微流体装置或纳米流体装置在本文中可以指“微流体芯片”或“芯片”；或者“纳米流体芯片”或“芯片”。169.如本文所用的“微流体通道”或“流动通道”是指微流体装置的流动区域，其长度显著长于水平和垂直尺寸。例如，流动通道可以是水平或垂直尺寸的长度的至少5倍，例如，长度的至少10倍、长度的至少25倍、长度的至少100倍、长度的至少200倍、长度的至少500倍、长度的至少1,000倍、长度的至少5,000倍，或更长。在一些实施方案中，流动通道的长度为约100,000微米至约500,000微米，包括其间的任何值。在一些实施方案中，水平尺寸为约100微米至约1000微米(例如，约150至约500微米)，并且垂直尺寸为约25微米至约200微米(例如，约40到约150微米)。应当注意，流动通道可以在微流体装置中具有各种不同的空间配置，因此不限于完美线性的元件。例如，流动通道可以是或包括具有以下配置的一个或多个部分：曲线、弯曲、螺旋、倾斜、下降，叉状(例如，多个不同的流动路径)，及其任何组合。另外，流动通道沿其路径可以具有不同的横截面积，加宽和收缩以在其中提供所需的流体流动。流动通道可以包括阀，并且阀可以是微流体领域中已知的任何类型。包括阀的微流体通道的实例公开在美国专利6,408,878和9,227,200中，其每一篇均通过引用整体并入本文。170.如本文所用的术语“障碍物”通常是指凸起或类似类型的结构，其足够大以便部分地(但不完全地)阻碍目标微物体在微流体装置中的两个不同区域或管路元件之间的移动。两个不同的区域/管路元件可以是例如微流体室的连接区域和分离区域。171.如本文所用的术语“收缩”通常是指微流体装置中的管路元件(或两个管路元件之间的界面)的宽度变窄。收缩可以位于例如本公开的微流体室的分离区域和连接区域之间的界面处。172.如本文所用的术语“透明”是指允许可见光通过而在通过时基本上不改变光的材料。173.如本文所用，“亮视场”照明和/或图像是指从广谱光源对微流体视场的白光照明，其中对比度是通过视场中物体对光的吸收形成的。174.如本文所用的术语“微物体”通常是指可以根据本公开分离和/或处理的任何微观物体。微物体的非限制性实例包括：无生命的微物体，例如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠、luminextm珠等)；磁珠；微米棒；微丝；量子点等；生物微物体，例如细胞；生物细胞器；囊泡或复合物；合成囊泡；脂质体(例如，合成的或衍生自膜制品)；脂质纳米筏(nanoraft)等；或无生命微物体和生物微物体的组合(例如，附接于细胞的微珠、脂质体涂覆的微珠、脂质体涂覆的磁珠等)。珠子可以包括共价或非共价附接的部分/分子，例如荧光标志物、蛋白、碳水化合物、抗原、小分子信号传导部分或能够用于测定的其他化学/生物物质。脂质纳米筏已经被描述在例如ritchieetal.(2009)“reconstitutionofmembraneproteinsinphospholipidbilayernanodiscs,”methodsenzymol.,464:211-231中。175.如本文所用的术语“细胞”可以与术语“生物细胞”互换使用。生物细胞的非限制性实例包括真核细胞；植物细胞；动物细胞，例如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、禽类细胞、鱼细胞等；原核细胞；细菌细胞；真菌细胞；原生动物细胞等；从组织(例如肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝脏、肺、神经组织等)解离的细胞；免疫细胞，例如t细胞、b细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等；胚胎(例如，受精卵)；卵母细胞；卵子；精子细胞；杂交瘤；培养的细胞；来自细胞系的细胞；癌细胞；感染的细胞；转染和/或转化的细胞；报道细胞等。哺乳动物细胞可以是例如人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、灵长类动物等。176.如果集落中能够繁殖的所有活细胞是衍生自单亲细胞的子细胞，则生物细胞的集落是“克隆的”。在某些实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过10次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过14次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均来自单亲细胞不超过17次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过20次分裂。术语“克隆细胞”是指同一克隆集落的细胞。177.如本文所用的生物细胞的“集落”是指2个或更多个细胞(例如约2至约20、约4至约40、约6至约60、约8至约80、约10至约100、约20至约200、约40至约400、约60至约600、约80至约800、约100至约1000或大于1000个细胞)。178.如本文所用的术语“维持(一个或多个)细胞”是指提供包含流体和气体组分以及任选的表面的环境，其提供保持细胞存活和/或扩增所必需的条件。179.如本文所用，术语“扩增”在提及细胞时指的是细胞数目的增加。180.流体介质的“组分”是介质中存在的任何化学或生物化学分子，包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷、核酸、氨基酸、肽、蛋白、糖、碳水化合物、脂质、脂肪酸、胆固醇、代谢物等。181.如本文所用的“捕捉部分”是为微物体提供识别位点的化学或生物物质、功能或基序。所选类型的微物体可以识别原位产生的捕捉部分，并且可以与原位产生的捕捉部分结合或与其具有亲合力。非限制性实例包括抗原、抗体和细胞表面结合基序。182.如本文所用，“可流动聚合物”是可溶于或可分散于流体介质中的聚合物单体或大分子单体(例如，预聚物溶液)。可流动聚合物可以被输入到微流体流动区域中，并与其中的流体介质的其他组分一起流动。183.如本文所用的“光引发聚合物”是指这样的聚合物(或可用于产生聚合物的单体分子)：其在暴露于光时能够共价交联，形成特定的共价键，改变固定化的化学基序周围的区域选择性化学，或者形成导致物理状态变化的离子对，从而形成聚合物网络。在一些情况下，光引发聚合物可以包括这样的聚合物区段：其与一个或多个能够共价交联的化学部分结合，形成特定的共价键，改变固定化的化学基序周围的区域选择性化学，或形成导致物理状态变化的离子对。在一些情况下，光引发聚合物可能需要可光活化的自由基引发剂以引发聚合物网络的形成(例如，通过聚合物的聚合)。184.如本文所用的“抗体”是指免疫球蛋白(ig)，且包括多克隆和单克隆抗体两者；灵长类化的(primatized)(例如，人化的)；鼠类；小鼠-人；小鼠-灵长类；和嵌合的；并且可以是完整分子、其片段(例如scfv、fv、fd、fab、fab'和f(ab)'2片段)或者完整分子和/或片段的多聚体或聚集体；并且可以天然存在或者例如通过免疫、合成或基因工程产生。如本文所用的“抗体片段”是指衍生自抗体或与抗体相关的片段，其与抗原结合并且在一些实施方案中可以被衍生化以表现出通过例如掺入半乳糖残留物而促进清除和摄取的结构特征。这包括例如f(ab)、f(ab)'2、scfv、轻链可变区(vl)、重链可变区(vh)及其组合。185.如本文关于流体介质所用的“扩散(diffuse)”和“扩散(diffusion)”是指流体介质的组分沿着浓度梯度向下的热力学运动。186.短语“介质的流动”意味着流体介质主要是由于除扩散之外的任何机制的整体移动。例如，介质的流动可以包括流体介质由于点之间的压力差而从一个点移动到另一个点。这样的流动可以包括液体的连续、脉冲、周期性、随机、间歇或往复流动，或其任何组合。当一种流体介质流入另一种流体介质时，可能导致湍流和介质的混合。187.短语“基本上没有流动”是指流体介质的流速，其随时间平均小于材料的组分(例如，受关注的被分析物)扩散到流体介质中或在流体介质内扩散的速率。这样的材料的组分的扩散速率可以取决于例如温度、组分的尺寸以及组分和流体介质之间的相互作用的强度。188.如本文所用，术语“直接流动(directflow)”是指微流体装置流动区域内主要流动方向上的流动。在大多数情况下，这种流动将是受控速率的层流(laminarflow)，所述受控速率由溶液通过入口移动进入装置和通过出口移动出装置的速率决定。通常，流动区域将是连接入口和出口的区域，例如通道。189.如本文所用，术语“二次流动”是指与流动区域流体连接的室的区域中的流体流动，其中室中经历二次流动的区域中的流体流速是流动区域中流速的100％到0.1％之间。在某些实施方案中，室中经历二次流动的区域中的流体流速是相邻流动区域中流速的100％到0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％或5％之间。在某些实施方案中，流动区域是通道。在某些实施方案中，二次流动发生在隔离坞的连接区域中。在某些情况下，二次流动包括来自流动区域的流体，该流动区域在流动区域和室中朝向流动区域的开口之间的接合处扩张到室中。在其他情况下，二次流动包括在靠近流动区域的室区域中产生的旋涡，其中流动区域中流过并扩张到室开口处的流体层流负责产生这些旋涡。包含“二次流动”的这些旋涡的存在可以增加相邻流动区域和可在其中设置“二次流动”的室(例如，包含这些旋涡可能形成的连接区域的室)之间的流体和溶质交换速率，交换速率随着流动区域中层流速率的增加而增加。190.如本文所用，术语“分离区域”是指微流体装置的室中的区域，该区域与微流体装置流动区域(例如通道)中流体的直接流动和可存在于室的另一部分的二次流动分离。通常，在分离区域中，溶质通过扩散的移动速率将大于流体流动产生的溶质移动速率，因此扩散成为可溶性组分进入或离开“分离区域”的主要方式。191.如本文关于微流体装置内的不同区域所用的短语“流体连接”是指当不同区域基本上充满流体(例如流体介质)时，每个区域中的流体被连接以形成单一的液体。这并不意味着不同区域中的流体(或流体介质)在组成上必然相同。相反，微流体装置的不同流体连接的区域中的流体可以具有不同的组成(例如，不同浓度的溶质，例如蛋白、碳水化合物、离子或其他分子)，当溶质沿着其各自的浓度梯度向下移动和/或流体流过微流体装置时，这些组成处于变化中。192.如本文所用的“流动路径”是指一个或多个流体连接的管路元件(例如，通道、区域、室等)，其限定介质流动的轨迹并受介质流动的轨迹影响。因此，流动路径是微流体装置的冲刷(swept)区域的示例。其他管路元件(例如，非冲刷(unswept)区域)可以与包括流动路径的管路元件流体连接，而不受流动路径中的介质流动的影响。193.如本文所用，术语“钩区域”是指微流体装置的任何子区域或受关注区域，其不太可能在其中设置细胞，并且其与流动区域中的直接流动和/或二次流动(例如，由流动区域中直接层流产生的涡流产生的流动)分离。194.如本文所用，“分离微物体”将微物体限制在微流体装置内的限定区域。195.如本文所用，术语“刷新率”是流动区域的体积除以流速的比率。该“刷新率”表示替换流动区域中的全部流体体积所需的时间量。196.微流体(或纳米流体)装置可以包括“冲刷”区域和“非冲刷”区域。如本文所用的“冲刷”区域包括微流体管路的一个或多个流体互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件经历介质的流。冲刷区域的管路元件可以包括例如区域、通道以及全部或部分室。如本文所用的“非冲刷”区域包括微流体管路的一个或多个流体互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件基本上不经历流体的流动。非冲刷区域可以流体连接到冲刷区域，条件是流体连接被构造成在冲刷区域和非冲刷区域之间能够实现扩散但基本上没有介质流动。因此，微流体装置可以被构造成基本上将非冲刷区域与冲刷区域中的介质流动分离，同时在冲刷区域和非冲刷区域之间基本上仅能够实现扩散性流体连通。例如，微流体装置的流动通道是冲刷区域的示例，而微流体装置的分离区域(下文进一步详细描述)是非冲刷区域的示例。197.可以在这种微流体装置中测定生物微物体(例如，生物细胞)产生特定生物材料(例如，蛋白，例如抗体)的能力。在测定的一个特定实施方案中，可以将包含待测定用于产生受关注的被分析物的生物微物体(例如，细胞)的样品材料加载到微流体装置的冲刷区域中。可以选择具有特定特征的那些生物微物体(例如，哺乳动物细胞，例如人细胞)并将其置于非冲刷区域中。然后，可以使剩余的样品材料从冲刷区域流出，并使测定材料流入到冲刷区域中。因为所选择的生物微物体处于非冲刷区域中，所以所选择的生物微物体基本上不受剩余样品材料的流出或测定材料的流入的影响。可以允许所选择的生物微物体产生受关注的被分析物，其可以从非冲刷区域扩散到冲刷区域中，受关注的被分析物可以在其中与测定材料反应以产生局部的可检测的反应，每个反应可以与特定的非冲刷区域相关联。可以分析与检测到的反应相关的任何非冲刷区域，以评估非冲刷区域中的哪些生物微物体(如果有的话)是足够的受关注的被分析物的生产者。198.微流体装置和用于操作和观察这种装置的系统。图1a示出了可以用于保留、分离、测定、或培养生物微物体的微流体装置100和系统150的实例。示出了微流体装置100的透视图，其盖110被部分切除以提供微流体装置100中的局部视图。微流体装置100通常包括具有流动路径106的微流体管路120，流体介质180可以任选地携带一个或多个微物体(未示出)经过流动路径106流入和/或流过微流体管路120。虽然在图1a中示出了单个微流体管路120，但合适的微流体装置可以包括多个(例如，2或3个)这样的微流体管路。无论如何，微流体装置100可以被配置为纳米流体装置。如图1a所示，微流体管路120可以包括多个微流体室124、126、128和130，其中每个室可以具有与流动路径106为流体连通的一个或多个开口。在图1a的装置的一些实施方案中，室可以仅具有与流动路径106为流体连通的单个开口。如下文进一步讨论的，微流体室包括已被优化用于即使当介质180流过流动路径106时，仍然将微物体保留在微流体装置(例如微流体装置100)中的各种特征和结构。然而，在描述上述之前，提供了对微流体装置100和系统150的简要说明。199.如图1a中大体示出的，微流体管路120由外壳102来限定。尽管外壳102可以被物理地构造成不同的配置，但是在图1a所示的实例中，外壳102被描绘为包括支撑结构104(例如，基部)、微流体管路结构108和盖110。支撑结构104、微流体管路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体管路结构108可以被布置在支撑结构104的内表面109上，并且盖110可以被布置在微流体管路结构108上方。微流体管路结构108与支撑结构104和盖110一起可以限定微流体管路120的元件。200.如图1a所示，支撑结构104可以位于微流体管路120的底部，盖110可以位于微流体管路120的顶部。或者，支撑结构104和盖110可以以其他取向来配置。例如，支撑结构104可以位于微流体管路120的顶部，盖110可以位于微流体管路120的底部。无论如何，可以存在一个或多个开口107，每个开口107均包括进入或离开外壳102的通路。通路的实例包括阀、门、通孔等。如图所示，开口107是由微流体管路结构108中的间隙产生的通孔。然而，开口107可以位于外壳102的其他组件(例如盖110)中。图1a中仅示出了一个开口107，但微流体管路120可以具有两个或更多个开口107。例如，可以存在第一开口107，其用作流体进入微流体管路120的入口，并且可以存在第二开口107，其用作流体离开微流体管路120的出口。开口107是用作入口还是出口可以取决于流体流过流动路径106的方向。201.支撑结构104可以包括一个或多个电极(未示出)和衬底或多个互连的衬底。例如，支撑结构104可以包括一个或多个半导体衬底，每个半导体衬底电连接到电极(例如，半导体衬底的全部或一部分可以电连接到单个电极)。支撑结构104还可以包括印刷电路板组件(“pcba”)。例如，半导体衬底可以安装在pcba上。202.微流体管路结构108可以限定微流体管路120的管路元件。当微流体管路120填充有流体时，这样的管路元件可以包括可以流体互连的空间或区域，例如流动区域(其可以包括或者是一个或多个流动通道)、室、坞、阱(trap)等。在图1a所示的微流体管路120中，微流体管路结构108包括框架114和微流体管路材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体管路材料116。框架114可以是例如基本上包围微流体管路材料116的相对刚性的结构。例如，框架114可以包括金属材料。203.微流体管路材料116可以用空腔等进行图案化，以限定微流体管路120的管路元件和互连。微流体管路材料116可以包括柔性材料，例如柔性聚合物(例如橡胶、塑料、弹性体、硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(“pdms”)等)，其可以是透气性的。可以构成微流体管路材料116的材料的其他实例包括模制玻璃；可蚀刻材料，例如硅氧烷(例如，可光图案化的硅氧烷或“pps”)、光致抗蚀剂(例如，su8)等。在一些实施方案中，此类材料(以及因此微流体管路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气的。无论如何，微流体管路材料116可以被布置在支撑结构104上和框架114内。204.盖110可以是框架114和/或微流体管路材料116的集成(integral)部件。或者，盖110可以是结构上不同的元件，如图1a所示。盖110可以包括与框架114和/或微流体管路材料116相同或不同的材料。类似地，支撑结构104可以是与框架114或微流体管路材料116分开的结构(如图所示)，或者是框架114或微流体管路材料116的集成部件。同样地，框架114和微流体管路材料116可以是如图1a所示的分离结构或同一结构的集成部件。205.在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似性质的材料。在一些实施方案中，盖110可以包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，例如pdms。在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料和可变形材料两者。例如，盖110的一个或多个部分(例如，位于室124、126、128、130上方的一个或多个部分)可以包括与盖110的刚性材料交界的可变形材料。在一些实施方案中，盖110还可以包括一个或多个电极。该一个或多个电极可以包括导电氧化物，例如氧化铟锡(ito)，其可以涂覆在玻璃或类似的绝缘材料上。或者，该一个或多个电极可以是柔性电极，例如嵌入在可变形材料例如聚合物(例如pdms)中的单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合。已经在例如us2012/0325665(chiou等人)中描述了可以用于微流体装置中的柔性电极，其内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，可以修饰盖110(例如，通过调节向内朝向微流体管路120的表面的全部或一部分)以支持细胞粘附、活力和/或生长。该修饰可以包括合成或天然聚合物的涂层。在一些实施方案中，盖110和/或支撑结构104可以是透光的。盖110还可包括至少一种可透气的材料(例如，pdms或pps)。206.图1a还示出了用于操作和控制微流体装置(例如微流体装置100)的系统150。系统150包括电源192、成像装置194(结合在成像模块164内，其中装置194未在图1a本身中示出)以及倾斜装置190(倾斜模块166的一部分，其中装置190未在图1a中示出)。207.电源192可以向微流体装置100和/或倾斜装置190提供电力，根据需要提供偏置电压或电流。电源192可以例如包括一个或多个交流(ac)和/或直流(dc)电压或电流源。成像装置194(成像模块164的一部分，如下文所讨论的)可以包括用于捕捉微流体管路120内的图像的装置，例如数码相机。在一些情况下，成像装置194还包括具有快速帧速率和/或高灵敏度(例如，用于低光应用)的检测器。成像装置194还可以包括用于将刺激性辐射和/或光束引导到微流体管路120中并收集从微流体管路120(或其中包含的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。所发射的光束可以在可见光谱中，并且可以例如包括荧光发射。所反射的光束可以包括源自led或诸如汞灯(例如高压汞灯)或氙弧灯的宽光谱灯的反射的发射。如针对图3b所讨论的，成像装置194还可以包括显微镜(或光具组)，其可以包括或不包括目镜。208.系统150还包括倾斜装置190(倾斜模块166的一部分，如下文所讨论的)，其被配置为使微流体装置100围绕一个或多个旋转轴旋转。在一些实施方案中，倾斜装置190被配置为围绕至少一个轴来支撑和/或保持包括微流体管路120的外壳102，使得微流体装置100(以及因此微流体管路120)可以保持在水平取向(即，相对于x轴和y轴为0°)、垂直取向(即，相对于x轴和/或y轴为90°)或其间的任何取向。微流体装置100(和微流体管路120)相对于轴的取向在本文中被称为微流体装置100(和微流体管路120)的“倾斜”。例如，倾斜装置190可以使微流体装置100相对于x轴倾斜0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或其间的任何角度。水平取向(以及因此x轴和y轴)被定义为垂直于由重力限定的垂直轴。倾斜装置还可以使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴和/或y轴倾斜任何大于90°的程度，或者使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴或y轴倾斜180°，以完全反转微流体装置100(和微流体管路120)。类似地，在一些实施方案中，倾斜装置190使微流体装置100(和微流体管路120)围绕由流动路径106或微流体管路120的一些其他部分限定的旋转轴倾斜。209.在一些情况下，将微流体装置100倾斜成垂直取向，使得流动路径106位于一个或多个室的上方或下方。如本文所用的术语“上方”表示流动路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上高于一个或多个室(即，在流动路径106上方的室中的物体会具有比流动路径中的物体更高的重力势能)。如本文所用的术语“下方”表示流动路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上低于一个或多个室(即，在流动路径106下方的室中的物体会具有比流动路径中的物体更低的重力势能)。210.在一些情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕平行于流动路径106的轴倾斜。此外，微流体装置100可以被倾斜至小于90°的角度，使得流动路径106位于一个或多个室的上方或下方，而不是位于室的正上方或正下方。在其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕垂直于流动路径106的轴倾斜。在另外其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕既不平行也不垂直于流动路径106的轴倾斜。211.系统150还可以包括介质源178。介质源178(例如，容器、贮液器等)可以包括多个部分或容器，每个部分或容器用于容纳不同的流体介质180。因此，介质源178可以是在微流体装置100外部并与之分离的装置，如图1a所示。或者，介质源178可以整体或部分地位于微流体装置100的外壳102内部。例如，介质源178可以包括作为微流体装置100的一部分的贮液器。212.图1a还示出了描绘构成系统150的一部分并且可以与微流体装置100结合使用的控制和监测设备152的实例的简化框图。如图所示，这种控制和检测设备152的实例包括主控制器154，其包括介质模块160，用于控制介质源178；运动模块162，用于控制微流体管路120中的微物体(未示出)和/或介质(例如，介质液滴)的移动和/或选择；成像模块164，用于控制成像装置194(例如，相机、显微镜、光源或其任何组合)以捕捉图像(例如，数字图像)；以及倾斜模块166，用于控制倾斜装置190。控制设备152还可以包括其他模块168，用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其他功能。如图所示，设备152还可以包括显示装置170和输入/输出装置172。213.主控制器154可以包括控制模块156和数字存储器158。控制模块156可以包括例如数字处理器，该数字处理器被配置为根据被存储为存储器158中的非暂态数据或信号的机器可执行指令(例如，软件、固件、源代码等)进行操作。替代地或另外地，控制模块156可以包括硬连线数字电路和/或模拟电路。可以类似地配置介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168。因此，可以由如上文所讨论地配置的主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168中的任意一个或多个来实施本文所讨论的针对微流体装置100或任何其他微流体装置所执行的功能、过程、动作、行动或过程的步骤。类似地，主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168可以通信地耦接，以发送和接收本文所讨论的任何功能、过程、动作、行动或步骤中使用的数据。214.介质模块160控制介质源178。例如，介质模块160可以控制介质源178以将选择的流体介质180输入到外壳102中(例如，通过入口开口107)。介质模块160还可以控制从外壳102中移除介质(例如，通过出口开口(未示出))。因此，可以将一种或多种介质选择性地输入到微流体管路120中以及从其中移除。介质模块160还可以控制微流体管路120内的流动路径106中的流体介质180的流动。例如，在一些实施方案中，在倾斜模块166使倾斜装置190将微流体装置100倾斜到期望的倾斜角度之前，介质模块160停止介质180在流动路径106中和通过外壳102的流动。215.运动模块162可以被配置为控制微流体管路120中的微物体(未示出)的选择、捕集和移动。如下文参考图1b和1c所讨论的，外壳102可以包括介电电泳(dep)、光电镊子(oet)和/或光电润湿(oew)配置(图1a中未示出)，并且运动模块162可以控制电极和/或晶体管(例如，光电晶体管)的激活，以选择和移动流动路径106和/或室124、126、128、130中的微物体(未示出)和/或介质液滴(未示出)。216.成像模块164可以控制成像装置194。例如，成像模块164可以接收和处理来自成像装置194的图像数据。来自成像装置194的图像数据可以包括由成像装置194捕捉的任何类型的信息(例如，存在或不存在微物体、介质液滴、标记物(例如荧光标记物)的累积等)。使用由成像装置194捕捉的信息，成像模块164还可以计算微流体装置100内物体(例如，微物体、介质液滴)的位置和/或这些物体的运动速率。217.倾斜模块166可以控制倾斜装置190的倾斜运动。替代地或另外地，倾斜模块166可以控制倾斜速率和时机，以优化微物体经由重力向一个或多个室的转移。倾斜模块166与成像模块164通信地耦接，以接收描述微流体管路120中的微物体和/或介质液滴的运动的数据。使用该数据，倾斜模块166可以调节微流体管路120的倾斜，以便调节微物体和/或介质液滴在微流体管路120中移动的速率。倾斜模块166还可以使用该数据来迭代地调节微流体管路120中的微物体和/或介质液滴的位置。218.在图1a所示的实例中，微流体管路120被示为包括微流体通道122和室124、126、128、130。每个室均包括通向通道122的开口，但是其他部分被包围，使得室可以将坞内的微物体与通道122的流动路径106中或其他室中的流体介质180和/或微物体基本上分离。室的壁从底座的内表面109延伸到盖110的内表面，以提供外壳。室到微流体通道122的开口被取向为与流体介质180的流动106成一角度，使得流动106不被引导到室中。流动可以与室的开口的平面相切或垂直。在一些情况下，室124、126、128、130被配置为物理地围住微流体管路120内的一个或多个微物体。根据本公开的室可以包括各种形状、表面和特征，如下文将详细讨论和示出的，其被优化为与dep、oet、oew、流体流动和/或重力一起使用。219.微流体管路120可以包括任何数目的微流体室。尽管示出了五个室，但微流体管路120可以具有更少或更多的室。如图所示，微流体管路120的微流体室124、126、128和130各自包括不同的特征和形状，这些特征和形状可以提供用于保持、分离、测定或培养生物微物体的一个或多个益处。在一些实施方案中，微流体管路120包括多个相同的微流体室。220.在图1a所示的实施方案中，示出了单个通道122和流动路径106。然而，其他实施方案可以含有多个通道122，每个通道均被配置为包括流动路径106。微流体管路120还包括与流动路径106和流体介质180为流体连通的入口阀或开口107，由此流体介质180可以经由入口开口107进入通道122。在一些情况下，流动路径106包括单个路径。在一些情况下，单个路径被布置为z字形图案，由此流动路径106以交替的方向穿过微流体装置100两次或更多次。流动路径106中的流动可以从入口进行至出口，或可以反向从出口进行至入口。221.在一些情况下，微流体管路120包括多个平行的通道122和流动路径106，其中每个流动路径106内的流体介质180沿相同的方向流动。在一些情况下，每个流动路径106内的流体介质沿正向或反向中的至少一个方向流动。在一些情况下，配置多个室(例如，相对于通道122)，使得室可以平行地加载目标微物体。222.在一些实施方案中，微流体管路120还包括一个或多个微物体阱132。阱132通常形成在形成通道122的边界的壁中，并且可以与微流体室124、126、128、130中的一个或多个的开口相对地设置。在一些实施方案中，阱132被配置为成从流动路径106接收或捕捉单个微物体。在一些实施方案中，阱132被配置为从流动路径106接收或捕捉多个微物体。在一些情况下，阱132包括大约等于单个目标微物体的体积的体积。223.阱132还可以包括开口，其被配置为帮助目标微物体流入阱132。在一些情况下，阱132包括开口，该开口的高度和宽度近似地等于单个目标微物体的尺寸，由此防止更大的微物体进入微物体阱。阱132还可以包括被配置为帮助将目标微物体保留在阱132内的其他特征。在一些情况下，阱132相对于微流体室的开口对齐并且位于通道122的相对侧上，使得当微流体装置100围绕平行于微流体通道122的轴倾斜时，被捕集的微物体按照使得微物体落入室的开口中的轨迹离开阱132。在一些情况下，阱132包括小于目标微物体的侧通道134，以便有助于穿过阱132的流动，从而增加在阱132中捕捉微物体的可能性。224.在一些实施方案中，经由一个或多个电极(未示出)将介电电泳(dep)力施加在流体介质180(例如，在流动路径中和/或在室中)上，以操纵、运输、分离和分类位于其中的微物体。例如，在一些实施方案中，将dep力施加到微流体管路120的一个或多个部分，以便将单个微物体从流动路径106转移到期望的微流体室中。在一些实施方案中，使用dep力来防止室(例如，室124、126、128或130)内的微物体从其中被替换。此外，在一些实施方案中，使用dep力来从室中选择性地移除先前根据本公开的实施方案收集的微物体。在一些实施方案中，dep力包括光电镊子(oet)力。225.在其他实施方案中，通过一个或多个电极(未示出)将光电润湿(oew)力施加到微流体装置100的支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置(例如，有助于限定流动路径和/或多个室的位置)，以操纵、运输、分离和分类位于微流体管路120中的液滴。例如，在一些实施方案中，将oew力施加到支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置，以将单个液滴从流动路径106转移到期望的微流体室中。在一些实施方案中，使用oew力来防止室(例如，室124、126、128或130)内的液滴从其中被替换。此外，在一些实施方案中，使用oew力来从室中选择性地去除先前根据本公开的实施方案收集的液滴。226.在一些实施方案中，将dep和/或oew力与其他力(例如流动和/或重力)组合，以便操纵、运输、分离和分类微流体管路120内的微物体和/或液滴。例如，可以将外壳102倾斜(例如，通过倾斜装置190)，以将流动路径106和位于其中的微物体定位在微流体室的上方，并且重力可以将微物体和/或液滴运输到室中。在一些实施方案中，可以在施加其他力之前施加dep和/或oew力。在其他实施方案中，可以在施加其他力之后施加dep和/或oew力。在其他情况下，可以在施加其他力的同时或者以与其他力交替地的方式施加dep和/或oew力。227.图1b、1c和2a-2h示出了可以用于实施本公开的实施方案的微流体装置的各种实施方案。图1b描述了其中微流体装置200被配置为光致动的电动力学装置的实施方案。本领域已知多种光致动的电动力学装置，包括具有光电镊子(oet)配置的装置和具有光电润湿(oew)配置的装置。在以下美国专利文献中示出了合适的oet配置的实例，其均通过引用整体并入本文：美国专利号re44,711(wu等人)(最初以美国专利号7,612,355颁发)；和美国专利号7,956,339(ohta等人)。美国专利号6,958,132(chiou等人)和美国专利申请公开号2012/0024708(chiou等人)中示出了oew配置的实例，上述两者都通过引用整体并入本文。光致动的电动力学装置的另一个实例包括组合的oet/oew配置，在美国专利公开号20150306598号(khandros等人)和20150306599(khandros等人)以及其对应的pct公开wo2015/164846和wo2015/164847中示出其实例，其均通过引用整体并入本文。228.已经在例如us2014/0116881(申请号14/060,117，2013年10月22日提交)、us2015/0151298(申请号14/520,568，2014年10月22日提交)和us2015/0165436(申请号14/521,447，2014年10月22日提交)中描述了具有室的微流体装置的实例，其中可以放置、培养和/或监测生物微物体，这些申请中的每一个都通过引用整体并入本文。美国申请号14/520,568和14/521,447也描述了分析在微流体装置中培养的细胞的分泌的示例性方法。前述申请中的每一个还描述了微流体装置，其被配置为产生介电电泳(dep)力，例如光电镊子(oet)，或被配置为提供光电润湿(oew)。例如，us2014/0116881的图2中所示的光电镊子装置是可以在本公开的实施方案中用于选择和移动单个生物微物体或一组生物微物体的装置的实例。229.微流体装置运动配置。如上文所述，系统的控制和监测设备可以包括运动模块，用于选择和移动微流体装置的微流体管路中的物体，例如微物体或液滴。微流体装置可以具有各种运动配置，这取决于被移动物体的类型和其他考虑因素。例如，可以使用介电电泳(dep)配置来选择和移动微流体管路中的微物体。因此，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括dep配置，其用于在微流体管路120中的流体介质180中的微物体上选择性地诱导dep力，从而选择、捕捉和/或移动单个微物体或微物体组。或者，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括电润湿(ew)配置，其用于在微流体管路120中的流体介质180中的液滴上选择性地诱导ew力，从而选择、捕捉和/或移动单个液滴或液滴组。230.图1b和1c中示出了包含dep配置的微流体装置200的一个实例。虽然为了简化的目的，图1b和1c分别示出了具有区域/室202的微流体装置200的外壳102的一部分的侧截面图和顶截面图，但应当理解，区域/室202可以是具有更详细结构的流体管路元件的一部分，例如生长室、隔离室、流动区域或流动通道。此外，微流体装置200可以包括其他流体管路元件。例如，微流体装置200可以包括多个生长室或室和/或一个或多个流动区域或流动通道，例如本文关于微流体装置100所描述的那些。dep配置可以被结合到微流体装置200的任何这种流体管路元件中，或者其选择的部分中。还应当理解，上文或下文描述的微流体装置组件和系统组件中的任一个可以被结合到微流体装置200中和/或与微流体装置200组合使用。例如，上述包括控制和监测设备152的系统150可以与微流体装置200一起使用，该微流体装置200包括介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和其他模块168中的一个或多个。231.如图1b所示，微流体装置200包括具有底部电极204和覆盖底部电极204的电极活化衬底206的支撑结构104，以及具有顶部电极210的盖110，顶部电极210与底部电极204间隔开。顶部电极210和电极活化衬底206限定区域/室202的相对表面。因此，包含在区域/室202中的介质180在顶部电极210和电极活化衬底206之间提供电阻连接(resistiveconnection)。还示出了电源212，其被配置为连接到底部电极204和顶部电极210并且在这些电极之间产生偏置电压，如在区域/室202中产生dep力所需要的。电源212可以是例如交流(ac)电源。232.在某些实施方案中，图1b和1c中所示的微流体装置200可以具有光致动的dep配置。因此，改变来自光源216的光218的图案(其可以由运动模块162控制)可以选择性地激活和去激活电极活化衬底206的内表面208的区域214处的dep电极的变化图案。(下文中，具有dep配置的微流体装置的区域214被称为“dep电极区域”。)如图1c所示，指向电极活化衬底206的内表面208的光图案218可以以诸如正方形的图案照亮选择的dep电极区域214a(以白色示出)。在下文中将未被照亮的dep电极区域214(交叉阴影线)称为“暗”dep电极区域214。通过dep电极活化衬底206(即，从底部电极204直到与流动区域106中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)的相对电阻抗大于在每个暗dep电极区域214处通过区域/室202中的介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对电阻抗。然而，被照亮的dep电极区域214a表现出通过电极活化衬底206的减小的相对阻抗，其小于在每个被照亮的dep电极区域214a处通过区域/室202中的介质180的相对阻抗。233.在电源212被激活的情况下，前述dep配置在被照亮的dep电极区域214a和相邻的暗dep电极区域214之间的流体介质180中产生电场梯度，这又产生了吸引或排斥流体介质180中附近微物体(未示出)的局部dep力。因此，通过改变从光源216投射到微流体装置200中的光图案218，可以在区域/室202的内表面208处的许多不同的此类dep电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥流体介质180中微物体的dep电极。dep力是吸引还是排斥附近的微物体可以取决于诸如电源212的频率和介质180和/或微物体(未示出)的介电性质之类的参数。234.图1c中所示的被照亮的dep电极区域214a的正方形图案220仅是一个实例。可以通过投射到微流体装置200中的光图案218照亮(并由此激活)dep电极区域214的任何图案，并且可以通过改变或移动光图案218来重复地改变被照亮/激活的dep电极区域214的图案。235.在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料或由其组成。在这样的实施方案中，电极活化衬底206的内表面208可以是无特征的。例如，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅(a-si:h)层或由其组成。a-si:h可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-si:h层可以具有约500nm至约2.0μm的厚度。在这样的实施方案中，根据光图案218，可以在电极活化衬底206的内表面208上的任何地方以任何图案形成dep电极区域214。因此，无需固定dep电极区域214的数目和图案，但是可以将其对应于光图案218。已经在例如美国专利号re44,711(wu等人)(最初颁布为美国专利号7,612,355)中描述了具有包括光电导层(例如上文所述的光电导层)的dep配置的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。236.在其他实施方案中，电极活化衬底206可以包括衬底，该衬底包括多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和形成半导体集成电路的导电层，例如在半导体领域中已知的。例如，电极活化衬底206可以包括多个光电晶体管，包括例如横向双极光电晶体管，每个光电晶体管均对应于dep电极区域214。或者，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)，其中每个这样的电极均对应于dep电极区域214。电极活化衬底206可以包括此类光电晶体管或光电晶体管控制的电极的图案。例如，该图案可以是排列成行和列的基本上为正方形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列，如图2b所示。或者，图案可以是形成六边点格(hexagonallattice)的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列。无论图案如何，电路元件都可以在电极活化衬底206的内表面208处的dep电极区域214与底部电极210之间形成电连接，并且可以由光图案218选择性地激活和去激活那些电连接(即，光电晶体管或电极)。当未被激活时，每个电连接都可以具有高阻抗，使得通过电极活化衬底206(即，从底部电极204到与区域/室202中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)的相对阻抗大于在相应的dep电极区214处通过介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对阻抗。然而，当被光图案218中的光激活时，通过电极活化衬底206的相对阻抗小于在每个被照亮的dep电极区域214处通过介质180的相对阻抗，从而在相应dep电极区域214处激活dep电极，如上文所述。因此，以光图案218所确定的方式，可以在区域/室202中的电极活化衬底206的内表面208处的许多不同的dep电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥介质180中的微物体(未示出)的dep电极。237.已经在例如美国专利号7,956,339(ohta等人)(参见例如图21和22中所示的装置300及其描述)中描述了具有包含光电晶体管的电极活化衬底的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。已经在例如美国专利公开号2014/0124370(short等人)(参见例如整个附图中所示的装置200、400、500、600和900及其描述)中描述了具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。238.在dep配置的微流体装置的一些实施方案中，顶部电极210是外壳102的第一壁(或盖110)的一部分，并且电极活化衬底206和底部电极204是外壳102的第二壁(或支撑结构104)的一部分。区域/室202可以位于第一壁和第二壁之间。在其他实施方案中，电极210是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极活化衬底206和/或电极210中的一个或两个是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源216可以替代地用于从下方照亮外壳102。239.利用具有dep构造的图1b-1c的微流体装置200，通过将光图案218投射到微流体装置200中，以便以围绕并捕捉微物体的图案(例如，正方形图案220)来激活电极活化衬底206的内表面208的dep电极区域214a处的第一组一个或多个dep电极，运动模块162可以选择区域/室202中的介质180中的微物体(未示出)。然后，通过相对于微流体装置200移动光图案218以激活dep电极区域214处的第二组一个或多个dep电极，运动模块162可以移动原位产生的捕捉的微物体。或者，可以相对于光图案218来移动微流体装置200。240.在其他实施方案中，微流体装置200可以具有不依赖于电极活化衬底206的内表面208处的dep电极的光激活的dep配置。例如，电极活化衬底206可以包括位于与包括至少一个电极的表面(例如，盖110)相对的位置的选择性可寻址且可激发的电极。可以选择性地打开和闭合开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)以激活或去激活dep电极区域214处的dep电极，从而在激活的dep电极附近的区域/室202中的微物体(未示出)上产生净dep力。取决于诸如电源212的频率和区域/室202中的介质(未示出)和/或微物体的介电性质的特征，dep力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和去激活一组dep电极(例如，在形成正方形图案220的一组dep电极区域214处)，可以在区域/室202中捕捉和移动区域/室202中的一个或多个微物体。图1a中的运动模块162可以控制这类开关，从而激活和去激活各个dep电极，以选择、捕集和移动区域/室202周围的特定微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址且可激发的电极的de配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经被描述在例如美国专利号6,294,063(becker等人)和6,942,776(medoro)中，其全部内容通过引用并入本文。241.作为又一个实例，微流体装置200可以具有电润湿(ew)配置，其可以代替dep配置，或者可以位于微流体装置200与具有dep配置的部分分离的部分中。ew配置可以是光电润湿配置或电介质上的电润湿(ewod)配置，两者都是本领域已知的。在一些ew配置中，支撑结构104具有夹在介电层(未示出)和底部电极204之间的电极活化衬底206。介电层可以包括疏水材料和/或可涂覆有疏水材料，如下文所述。对于具有ew配置的微流体装置200，支撑结构104的内表面208是介电层或其疏水涂层的内表面。242.介电层(未示出)可以包括一个或多个氧化物层，并且可以具有约50nm至约250nm(例如，约125nm至约175nm)的厚度。在某些实施方案中，介电层可以包括氧化物层，例如金属氧化物(例如，氧化铝或氧化铪)层。在某些实施方案中，介电层可以包括除金属氧化物之外的介电材料，例如硅氧化物或氮化物。无论确切的组成和厚度如何，介电层可以具有约10kohms至约50kohms的阻抗。243.在一些实施方案中，介电层的向内朝向区域/室202的表面涂覆有疏水材料。疏水材料可以包括例如氟化碳分子。氟化碳分子的实例包括全氟聚合物，例如聚四氟乙烯(例如，teflon)或聚(2,3-二氟亚甲基-全氟四氢呋喃)(例如，cytoptm)。构成疏水材料的分子可以共价键合到介电层的表面。例如，疏水材料的分子可以借助于诸如硅氧烷基团、膦酸基团或硫醇基团的连接基团共价结合到介电层的表面。因此，在一些实施方案中，疏水材料可以包含烷基封端的硅氧烷、烷基封端的膦酸或烷基封端的硫醇。烷基可以是长链烃(例如，具有至少10个碳或至少16、18、20、22或更多个碳的链)。或者，可以使用氟化(或全氟化)碳链代替烷基。因此，例如，疏水材料可以包括氟代烷基封端的硅氧烷、氟代烷基封端的膦酸或氟代烷基封端的硫醇。在一些实施方案中，疏水涂层的厚度为约10nm至约50nm。在其他实施方案中，疏水涂层的厚度小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)。244.在一些实施方案中，具有电润湿配置的微流体装置200的盖110也涂覆有疏水材料(未示出)。疏水材料可以是用于涂覆支撑结构104的介电层的相同疏水材料，并且疏水涂层可以具有与支撑结构104的介电层上的疏水涂层的厚度基本相同的厚度。此外，盖110可以包括以支撑结构104的方式夹在介电层和顶部电极210之间的电极活化衬底206。盖110的电极活化衬底206和介电层可以具有与支撑结构104的电极活化衬底206和介电层相同的组成和/或尺寸。因此，微流体装置200可以具有两个电润湿表面。245.在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料，例如上文所述的那些。因此，在某些实施方案中，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅层(a-si:h)或由其组成。a-si:h可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-si:h层可以具有约500nm至约2.0μm的厚度。或者，如上文所述，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)。具有光电润湿配置的微流体装置在本领域中是已知的和/或可以用本领域已知的电极活化衬底来构建。例如，美国专利号6,958,132(chiou等人)(其全部内容通过引用并入本文)公开了具有诸如a-si:h的光电导材料的光电润湿配置，而上文引用的美国专利公开号2014/0124370(short等人)公开了具有由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底。246.因此，微流体装置200可以具有光电润湿配置，并且光图案218可以用于激活电极活化衬底206中的光电导ew区域或光响应ew电极。电极活化衬底206的这类激活的ew区域或ew电极可以在支撑结构104的内表面208(即，覆盖介电层或其疏水涂层的内表面)处产生电润湿力。通过改变入射在电极活化衬底206上的光图案218(或相对于光源216移动微流体装置200)，可以移动与支撑结构104的内表面208接触的液滴(例如，包含水性介质、溶液或溶剂)穿过区域/室202中存在的不混溶流体(例如，油介质)。247.在其他实施方案中，微流体装置200可以具有ewod配置，并且电极活化衬底206可以包括不依赖于光来激活的选择性可寻址且可激发的电极。因此，电极活化衬底206可以包括这类电润湿(ew)电极的图案。例如，图案可以是排列成行和列的基本上正方形的ew电极的阵列，如图2b所示。或者，图案可以是形成六边点格的基本上六边形ew电极的阵列。无论图案如何，都可以通过电开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)选择性地激活(或去激活)ew电极。通过选择性地激活和去激活电极活化衬底206中的ew电极，可以在区域/室202内移动与经覆盖的介电层或其疏水涂层的内表面208接触的液滴(未示出)。图1a中的运动模块162可以控制此类开关，从而激活和去激活各个ew电极，以选择和移动区域/室202周围的特定液滴。具有有选择性可寻址且可激发的电极的ewod配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经描述在例如美国专利号8,685,344(sundarsan等人)中，其全部内容通过引用并入本文。248.无论微流体装置200的配置如何，电源212可以用于提供为微流体装置200的电路供电的电势(例如，ac电压电势)。电源212可以与图1中参引的电源192相同或者是其组件。电源212可以被配置为向顶部电极210和底部电极204提供ac电压和/或电流。对于ac电压，电源212可以提供这样的频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围：其如上文所述，足以产生足够强的净dep力(或电润湿力)以在区域/室202中捕集和移动各个微物体(未示出)，和/或还如上文所述，足以改变区域/室202中支撑结构104的内表面208(即，介电层和/或介电层上的疏水涂层)的润湿性质。这样的频率范围和平均或峰值功率范围在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利号6,958,132(chiou等人)、美国专利号re44,711(wu等人)(最初作为美国专利号7,612,355颁布)和美国专利申请公开号us2014/0124370(short等人)、us2015/0306598(khandros等人)和us2015/0306599(khandros等人)。249.室。在图2a-2c中描绘的微流体装置230内示出了一般室224、226和228的非限制性实例。每个室224、226和228可以包括分离结构232，其限定了分离区域240和将分离区域240流体连接到通道122的连接区236。连接区域236可以包括通向微流体通道122的近端开口234和通向分离区域240的远端开口238。连接区域236可以被配置为使得从微流体通道122流入室224、226、228的流体介质(未示出)的流动的最大穿透深度不延伸到分离区域240中。在一些实施方案中，来自微流体通道中流动的流线(streamline)不进入分离区域。因此，由于连接区域236，布置在室224、226、228的分离区域240中的微物体(未示出)或其他材料(未示出)可以与微流体通道122中的介质180流分离且基本上不受其影响。250.图2a-2c的室224、226和228各自具有单个开口，该开口直接通向微流体通道122。室的开口可以从微流体通道122侧向开放。电极活化衬底206在微流体通道122和室224、226和228二者的下方。室的外壳内的电极活化衬底206的上表面(形成室的底板)被设置在与微流体通道122(或者，如果不存在通道，则为流动区域)内的电极活化衬底206的上表面(形成微流体装置的流动通道(或流动区域)的底板)相同水平面上或基本相同的水平面上。电极活化衬底206可以是无特征的，或者可以具有不规则或图案化的表面，其从其最高凸起到其最低凹陷变化小于约3微米、2.5微米、2微米、1.5微米、1微米、0.9微米、0.5微米、0.4微米、0.2微米、0.1微米或更小。跨越微流体通道122(或流动区域)和室的衬底的上表面中的高度变化可以小于室的壁或微流体装置的壁的高度的约3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％或0.1％。虽然详细描述了微流体装置200，但这也适用于本文所述的微流体装置100、230、250、280、290、300、400、500、900、1000、1100、1200中的任一个。251.因此，微流体通道122可以是冲刷区域的示例，并且室224、226、228的分离区域240可以是非冲刷区域的实例。诸如224、226、228的室可以具有分离区域，其中每个分离区域仅有一个开口，该开口朝向隔离坞的连接区域开放。如此配置的在分离区域内外的流体介质交换基本上仅限于通过扩散进行。应当注意，微流体通道122和室224、226、228可以被配置为包含一种或多种流体介质180。在图2a-2b所示的实例中，开口222被连接到微流体通道122，并允许将流体介质180引入到微流体装置230中或从其中移除。在引入流体介质180之前，微流体装置可以装填有气体，如二氧化碳气体。一旦微流体装置230包含流体介质180，就可以选择性地产生和停止微流体通道122中的流体介质180的流动242。例如，如图所示，开口222可以被布置在微流体通道122的不同位置处(例如，相对端)，并且可以从用作入口的一个开口222到用作出口的另一个开口222形成介质的流动242。252.图2c示出了根据本公开的室224的实例的详细视图。还示出了微物体246的实例。253.已知的是，微流体通道122中的流体介质180经过室224的近端开口234的流动242可以产生介质180进入和/或离开室224的二次流动244。为了将室224的分离区域240中的微物体246与二次流动244分离，室224的连接区域236的长度lcon(即，从近端开口234到远端开口238)应当大于二次流动244进入连接区域236的穿透深度dp。穿透深度dp取决于多种因素，包括微流体通道122的形状，其可以由近端开口234处的连接区域236的宽度wcon定义；近端开口234处的微流体通道122的宽度wch；近端开口234处的通道122的高度hch；和连接区域236的远端开口238的宽度。在这些因素中，近端开口234处的连接区域236的宽度wcon和近端开口234处的通道122的高度hch倾向于是最重要的。此外，穿透深度dp可受到通道122中流体介质180的速率和流体介质180粘度的影响。然而，这些因素(即速率和粘度)可能变化很大，而穿透深度dp不会发生显著变化。例如，对于在近端开口234处的连接区域236的宽度wcon为约50微米、在近端开口122处的通道122的高度hch为约40微米，且在近端开口122处的微流体通道122的宽度wch为约100微米至150微米的微流体芯片230，二次流动244的穿透深度dp的范围从流速为0.1微升/秒时小于1.0倍wcon(即小于50微米)到流速为20微升/秒时约2.0倍wcon(即约100微米)，这代表在流体介质180的速率增加200倍的情况下，dp仅增加约2.5倍。因此，对于每个室224，可以识别通道122中的流体介质180的流动242的最大速度vmax，确保二次流动244的穿透深度dp不超过连接区域236的长度lcon。只要微流体通道122中的流体介质180的流动242的速率不超过最大速度vmax，所得到的二次流动244就可以被完全包含在连接区域236内并且不进入分离区域240。因此，微流体通道122中的介质180的流动242将不会将微物体246拖曳出分离区域240。相反，无论微流体通道122中的流体介质180的流动242如何，位于分离区域240中的微物体246将停留在分离区域240中。254.此外，只要微流体通道122中的介质180的流动242的速率不超过vmax，微流体通道122中的流体介质180的流动242就不会把混杂的颗粒(例如，微粒和/或纳米颗粒)从微流体通道122移动到室224的分离区域240中。因此，使连接区域236的长度lcon大于二次流动244的最大穿透深度dp可以防止一个室224被来自微流体通道122或另一个室(例如，图2d中的室226、228)的混杂的颗粒污染。255.因为微流体通道122和室224、226、228的连接区域236可能受到微流体通道122中的介质180的流动242的影响，所以微流体通道122和连接区域236可以被认为是微流体装置230的冲刷(或流动)区域。另一方面，室224、226、228的分离区域240可以被认为是非冲刷(或非流动)区域。例如，微流体通道122中的第一流体介质180中的组分(未示出)可以基本上仅通过第一介质180的组分从微流体通道122扩散通过连接区域236并进入分离区域240中的第二流体介质248中而与分离区域240中的第二流体介质248混合。类似地，分离区域240中的第二介质248的组分(未示出)可以基本上仅通过第二介质248的组分从分离区域240扩散通过连接区域236并进入微流体通道122中的第一介质180中而与微流体通道122中的第一介质180混合。在一些实施方案中，室的分离区域与流动区域之间通过扩散进行的流体介质交换的程度大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于约99％的流体交换。第一介质180可以是与第二介质248相同的介质或不同的介质。此外，第一介质180和第二介质248可以开始相同，然后变得不同(例如，通过分离区域240中的一个或多个细胞来调节第二介质248，或者通过改变流过微流体通道122的介质180)。256.在一些实施方案中，微流体通道122和室224、226、228的尺寸可以相对于微流体通道122中的流体介质180的流动242的向量如下定向：微流体通道宽度wch(或微流体通道122的横截面积)可以基本上垂直于介质180的流动242；连接区域236在开口234处的宽度wcon(或横截面积)可以基本上平行于微流体通道122中的介质180的流动242；和/或连接区域的长度lcon可以基本上垂直于微流体通道122中的介质180的流动242。前述仅是示例，并且微流体通道122和室224、226、228的相对位置可以相对于彼此为其他取向。257.如图2c所示，连接区域236的宽度wcon从近端开口234到远端开口238可以是均匀的。因此，连接区域236在远端开口238处的宽度wcon可以是本文中为连接区域236在近端开口234处的宽度wcon所标识的任何值。或者，连接区域236在远端开口238处的宽度wcon可以大于连接区域236在近端开口234处的宽度wcon。258.如图2c所示，分离区域240在远端开口238处的宽度可以与连接区域236在近端开口234处的宽度wcon基本上相同。因此，分离区域240在远端开口238处的宽度可以是本文中为连接区域236在近端开口234处的宽度wcon所标识的任何值。或者，分离区域240在远端开口238处的宽度可以大于或小于连接区域236在近端开口234处的宽度wcon。此外，远端开口238可以小于近端开口234，并且连接区域236的宽度wcon可以在近端开口234和远端开口238之间变窄。例如，使用各种不同的几何形状(例如，斜切连接区域、使连接区域成斜面)，连接区域236可以在近端开口和远端开口之间变窄。此外，连接区域236的任何部分或子部分可以变窄(例如，连接区域与近端开口234相邻的一部分)。259.图2d-2f描绘了包含微流体管路262和流动通道264的微流体装置250的另一示例性实施方案，其是图1a的相应微流体装置100、管路132和通道134的变体。微流体装置250还具有多个室266，其是上述室124、126、128、130、224、226或228的另外的变体。特别地，应当理解，图2d-2f中所示的装置250的室266可以代替装置100、200、230、250、280、290、300、400、500、900、1000、1100、1200中的上述室124、126、128、130、224、226或228中任一个。类似地，微流体装置250是微流体装置100的另一变体，并且还可以具有与上述微流体装置100、200、230、250、280、290、300、400、500、900、1000、1100、1200相同或不同的dep配置，以及本文所述的其他微流体系统组件中的任一个。260.图2d-2f的微流体装置250包括支撑结构(在图2d-2f中不可见，但可以与图1a中所描绘的装置100的支撑结构104相同或基本上类似)、微流体管路结构256和盖(在图2d-2f中不可见，但可以与图1a中所描绘的装置100的盖122相同或基本上类似)。微流体管路结构256包括框架252和微流体管路材料260，其可以与图1a中所描绘的装置100的框架114和微流体管路材料116相同或基本上类似。如图2d所示，由微流体管路材料260所定义的微流体管路262可以包括多个通道264(示出了两个，但可以有更多个)，多个室266与其流体连接。261.每个室266可以包括分离结构272、分离结构272内的分离区域270、以及连接区域268。从微流体通道264处的近端开口274到分离结构272处的远端开口276，连接区域268将微流体通道264流体连接至分离区域270。通常，根据上文对图2b和2c的讨论，通道264中的第一流体介质254的流动278可以产生第一介质254从微流体通道264进入和/或离开室266的相应连接区域268的二次流动282。262.如图2e所示，每个室266的连接区域268通常包括在至通道264的近端开口274与至分离结构272的远端开口276之间延伸的区域。连接区域268的长度lcon可以大于二次流动282的最大穿透深度dp，在这种情况下，二次流动282将延伸到连接区域268中而不被再引导向分离区域270(如图2d所示)。或者，如图2f所示，连接区域268可以具有小于最大穿透深度dp的长度lcon，在这种情况下，二次流动282将延伸通过连接区域268并且被再引导向分离区域270。在后一种情况下，连接区域268的长度lc1和lc2的和大于最大穿透深度dp，使得二次流动282不延伸到分离区域270中。无论连接区域268的长度lcon是否大于穿透深度dp，或者连接区域268的长度lc1和lc2的和是否大于穿透深度dp，通道264中的第一介质254的不超过最大速度vmax的流动278会产生具有穿透深度dp的二次流动，并且室266的分离区域270中的微物体(未示出，但可以与图2c中所示的微物体246相同或基本上类似)不会被通道264中的第一介质254的流动278拖曳离开分离区域270。通道264中的流动278也不会将混杂的物质(未示出)从通道264拖曳到室266的分离区域270中。这样，扩散是微流体通道264中的第一介质254中的组分可以从微流体通道264移动到室266的分离区域270中的第二介质258中的唯一机制。类似地，扩散是室266的分离区域270中的第二介质258中的组分可以从分离区域270移动到微流体通道264中的第一介质254中的唯一机制。第一介质254可以是与第二介质258相同的介质，或者第一介质254可以是与第二介质258不同的介质。或者，第一介质254和第二介质258可以在开始时相同，然后变得不同，例如，通过分离区域270中的一个或多个细胞调节第二介质，或者通过改变流过微流体通道264的介质。263.如图2e所示，微流体通道264中的微流体通道264的宽度wch(即，横切流体介质流过微流体通道的方向，如图2d中的箭头278所示)可以基本上垂直于近端开口274的宽度wcon1，并且因此基本上平行于远端开口276的宽度wcon2。然而，近端开口274的宽度wcon1和远端开口276的宽度wcon2不需要基本上彼此垂直。例如，近端开口274的宽度wcon1定向于其上的轴(未示出)与远端开口276的宽度wcon2定向于其上的另一轴之间的角度可以不同于垂直，并因此不是90°。可选择的定向角度的实例包括以下角度：约30°至约90°、约45°至约90°、约60°至约90°等。264.图3a示出了包含微流体管路结构308的微流体装置300的另一示例性实施方案，所述微流体装置包括通道322和室324，其特征和特性与本文所述的微流体装置100、200、230、250、280、290、300、400、500、900、1000、1100、1200和本文所述的任何其他微流体装置的室类似。265.图3a的示例性微流体装置包括微流体通道322，如本文所述，微流体通道322具有宽度wch，并且包含第一流体介质302的流动310和一个或多个室324(图3中仅示出一个)。每个室324均具有长度ls、连接区域336和分离区域340，其中分离区域340包含第二流体介质304。连接区域336具有近端开口334，所述近端开口334具有宽度wcon1并且朝向微流体通道322开放，以及远端开口338，所述远端开口338具有宽度wcon2并且朝向分离区域340开放。如本文所述，宽度wcon1可与wcon2相同或不同。每个室324的壁可以由微流体管路材料316形成，该材料可以进一步形成连接区域壁330。连接区域壁330可以对应于相对于近端开口334侧向放置的结构，并且至少部分延伸到室322的封闭部分内。在一些实施方案中，连接区域336的长度lcon至少部分由连接区域壁330的长度l壁定义。连接区域壁330可以具有长度l壁，其被选择为大于二次流动344的穿透深度dp。因此，二次流动344可以完全包含在连接区域内，而不延伸到分离区域340中。266.连接区域壁330可以定义钩区域352，其是室324的分离区域340的子区域。尽管术语“钩区域”用于指分离区域340的该子区域，但“钩区域”可以更广泛地解释为微流体室的任何区域，该区域与直接和/或二次流动分离，并且其中不太可能具有或不具有细胞。由于连接区域壁330延伸到室的内腔中，因此连接区域壁330可以作为物理屏障以掩蔽钩区域352不受二次流动344的影响，同时选择l壁的长度，从而有助于钩区域的范围。在一些实施方案中，连接区域壁330的长度l壁越长，钩区域352被掩蔽得越多。267.在如图2a-2g和3a所示配置的室中，分离区域可以具有任何类型的形状和大小，并且可以被选择调控营养物质、试剂和/或介质向室中的扩散，以到达室的远壁，例如，与连接区域向流动区域(或微流体通道)的近端开口相对。可进一步选择分离区域的大小和形状以调控生物微物体的废物和/或分泌产物通过室连接区域的近端开口从分离区域向流动区域的扩散。一般来说，分离区域的形状对室将微物体与流动区域中的直接流动分离的能力来说并不重要。268.在室的一些其他实施方案中，分离区域可以具有多于一个开口，这些开口将分离区域与微流体装置的流动区域流体连接。然而，对于具有将分离区域与流动区域(或两个或更多个流动区域)流体连接的多个n个开口的分离区域，可以对n-1个开口设置阀门。当n-1个具有阀门的开口关闭时，分离区域仅有一个有效开口，并且进出分离区域的材料交换仅通过扩散进行。269.微流体管路元件尺寸。如本文所述，可选择隔离坞和隔离坞开放向的微流体通道的各种尺寸和/或特征，以限制污染物或不需要的微物体从流动区域/微流体通道被引入隔离坞的分离区域；将流体介质中的组分从通道或分离区域的交换限制为基本上仅扩散交换；促进将微物体转移进和/或转移出隔离坞；和/或促进生物细胞的生长或扩增。对于本文所述的任何实施方案，微流体通道和隔离坞可以具有任何合适的尺寸组合，可以由技术人员根据本公开的教导进行选择。270.对于本文所述的任何微流体装置，微流体通道可以沿着其长度具有均匀的横截面高度，即基本均匀的横截面高度，也可以是本文所述的任何横截面高度。在沿微流体通道的任何点上，通道的基本均匀的横截面高度(其上表面由盖的内表面定义，且其下表面由底座的内表面定义)可以与沿通道的任何其他点处的横截面高度基本相同，例如，该横截面高度与通道内任何其他位置的横截面高度具有不超过约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更小的差异。271.此外，本文所述的微流体装置的室，例如隔离坞，可以相对于室开口向的微流体通道基本上以共面方向布置。也就是说，室的封闭体积由上表面(由盖的内表面定义)、下表面(由底座的内表面定义)和壁(由微流体管路材料定义)形成。因此，室的下表面可以与微流体通道的下表面共面，例如基本共面。室的上表面可以与微流体通道的上表面共面，例如基本共面。因此，室的横截面高度可以具有本文所述的任何值，即与通道相同，例如基本相同，并且微流体装置内的室和微流体通道在整个微流体装置的流动区域内可以具有基本均匀的横截面高度，并且可以在整个微流体装置中基本共面。272.室的下表面和微流体通道的共面性可以对使用dep或磁力在微流体装置内重新定位微物体提供明显的优势。当室的下表面和室开口向的微流体通道具有共面方向时，可以极大地促进微物体的进坞和出坞，尤其是选择性进坞/选择性出坞。273.隔离坞的连接区域的近端开口的宽度(例如，wcon或wcon1)至少与隔离坞拟用于的微物体(例如生物细胞，其可以是植物细胞，例如植物原生质体)的最大尺寸一样大。在一些实施方案中，近端开口具有约20微米、约40微米、约50微米、约60微米、约75微米、约100微米、约150微米、约200微米或约300微米的宽度(例如，wcon或wcon1)。以上仅为实例，并且近端开口的宽度(例如，wcon或wcon1)可以选择为上述任何值之间的值(例如，约20-200微米、约20-150微米、约20-100微米、约20-75微米、约20-60微米、约50-300微米、约50-200微米、约50-150微米、约50-100微米、约50-75微米、约75-150微米、约75-100微米、约100-300微米、约100-200微米或约200-300微米)。274.在一些实施方案中，隔离坞的连接区域可以具有从近端开口到朝向隔离坞分离区域的远端开口的长度(例如lcon)，该长度为近端开口宽度(例如，wcon或wcon1)的至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3.0倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少4.5倍、至少5.0倍、至少6.0倍、至少7.0倍、至少8.0倍、至少9.0倍或至少10.0倍。因此，例如，隔离坞的连接区域的近端开口的宽度(例如，wcon或wcon1)可以是约20微米至约200微米(例如，约50微米至约150微米)，并且连接区域的长度lcon可以是近端开口宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)。作为另一个实例，隔离坞的连接区域的近端开口的宽度(例如，wcon或wcon1)可以是约20微米至约100微米(例如，约20微米至约60微米)，并且连接区域的长度lcon可以是近端开口宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)。275.隔离坞开口向的微流体装置的微流体通道可以具有指定的大小(例如宽度或高度)。在一些实施方案中，隔离坞连接区域的近端开口处的微流体通道的高度(例如，hch)可以在以下任何范围内：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。上述仅为实例，且微流体通道(例如122)的高度(例如，hch)可以选择在上文列出的任何值之间。此外，微流体通道122的高度(例如，hch)可以选择为微流体通道的区域中的任何高度，而不是隔离坞近端开口处的高度。276.隔离坞连接区域的近端开口处的微流体通道的宽度(例如，wch)可以在以下任何范围内：约20-500微米、20-400微米、20-300微米、20-200微米、20-150微米、20-100微米、20-80微米、20-60微米、30-400微米、30-300微米、30-200微米、30-150微米、30-100微米、30-80微米、30-60微米、40-300微米、40-200微米、40-150微米、40-100微米、40-80微米、40-60微米、50-1000微米，50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-300微米、60-200微米、60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、70-100微米、80-100微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米、100-120微米、200-800微米、200-700微米或200-600微米。上述仅为实例，且微流体通道的宽度(例如，wch)可以选择为介于上述任何值之间的值。此外，微流体通道的宽度(例如，wch)可以选择为微流体通道的区域中的任何这些宽度，而不是隔离坞近端开口处的宽度。在一些实施方案中，隔离坞连接区域的近端开口处的微流体通道的宽度wch(例如，与流经通道的大量流体的流动方向成横向)可以基本垂直于近端开口的宽度(例如，wcon或wcon1)。277.隔离坞连接区域近端开口处的微流体通道的横截面积可以是约500-50,000平方微米、500-40,000平方微米、500-30,000平方微米、500-25,000平方微米、500-20,000平方微米、500-15,000平方微米、500-10,000平方微米、500-7,500平方微米、500-5,000平方微米、1,000-25,000平方微米、1,000-20,000平方微米、1,000-15,000平方微米、1,000-10,000平方微米、1,000-7,500平方微米、1,000-5,000平方微米、2,000-20,000平方微米、2,000-15,000平方微米、2,000-10,000平方微米、2,000-7,500平方微米、2,000-6,000平方微米、3,000-20,000平方微米、3,000-15,000平方微米、3,000-10,000平方微米、3,000-7,500平方微米或3,000至6,000平方微米。上述仅为实例，且近端开口处微流体通道的横截面积可以选择为介于上述任何值之间。在各种实施方案中，微流体通道的非近端开口区域处的微流体通道横截面积也可以选择为介于上述任何值之间。在一些实施方案中，横截面积被选择为在微流体通道的整个长度上基本均匀的值。278.在一些实施方案中，微流体芯片被配置为使得隔离坞连接区域的近端开口(例如234或334)的宽度(例如，wcon或wcon1)可以为约20微米至约200微米(例如，约50微米至约150微米)，连接区域的长度lcon(例如，236或336)可以是近端开口宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)，并且微流体通道在近端开口处的高度(例如，hch)可以是约30微米至约60微米。作为另一个实例，隔离坞连接区域的近端开口(例如234或334)的宽度(例如，wcon或wcon1)可以是约20微米至约100微米(例如，约20微米至约60微米)，连接区域的长度lcon(例如，236或336)可以是近端开口宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)，并且微流体通道在近端开口处的高度(例如，hch)可以是约30微米至约60微米。上述仅为实例，且近端开口(例如234或274)的宽度(例如，wcon或wcon1)、连接区域的长度(例如lcon)和/或微流体通道(例如122或322)的宽度(例如，wch)可以选择为介于上述任何值之间的值。然而，通常情况下，隔离坞连接区域近端开口的宽度(wcon或wcon1)小于微流体通道的宽度(wch)。在一些实施方案中，近端开口的宽度(wcon或wcon1)是微流体通道宽度(wch)的约8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、25％或30％。也就是说，微流体通道的宽度(wch)可以是隔离坞连接区域近端开口的宽度(wcon或wcon1)的至少2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或至少10.0倍。279.在一些实施方案中，通道122、322、618、718的大小wc(例如，横截面宽度wch、直径、面积等)可以是室开口如隔离坞开口234、334等的大小wo(例如，横截面宽度wcon、直径、区域等)的约一又四分之一(1.25)倍、约一又二分之一(1.5)倍、约2倍、约二又二分之一(2.5)倍、约三(3)倍或更多倍。这可以减少材料通过开口234、334从选择的室(例如，图2b中的隔离坞224、226)扩散到通道122、322、618、718并随后重新进入下游或相邻室(例如隔离坞228)的二次流动范围和扩散速率(或扩散通量)。分子(例如，受关注的被分析物，例如抗体)的扩散速率取决于许多因素，包括(但不限于)温度、介质粘度和分子扩散系数d0。例如，在约20℃的水性溶液中，igg抗体的d0为约4.4x10-7cm2/秒，而细胞培养基的动力学粘度为约9x10-4m2/秒。因此，在约20℃的细胞培养基中，抗体的扩散速率为约0.5微米/秒。因此，在一些实施方案中，从位于隔离坞(例如224、226、228、324)内的生物微物体扩散到通道122、322、618、718的时间段可以是约10分钟或更少(例如，约9、8、7、6、5分钟或更少)。扩散的时间段可以通过改变影响扩散速率的参数来操控。例如，介质的温度可以升高(例如，达到生理温度，例如约37℃)或降低(例如，到约15℃、10℃或4℃)，从而分别提高或降低扩散速率。可选地，或另外，如本文所讨论的，可以增加或减少介质中的溶质浓度以将选择的坞与来自其他上游坞的溶质分离开。280.因此，在一些变化中，隔离坞连接区域近端开口处的微流体通道的宽度(例如，wch)可以是约50至500微米、约50至300微米、约50至200微米、约70至500微米、约70至300微米、约70至250微米、约70至200微米，约70至150微米、约70至100微米，约80至500微米、约80至300微米、约80至250微米、约80至200微米、约80至150微米、约90至500微米、约90至300微米、约90至250微米、约90至200微米、约90至150微米、约100至500微米、约100至300微米、约100至250微米、约100至200微米或约100至150微米。在一些实施方案中，隔离坞连接区域近端开口处的微流体通道的宽度wch可以是约70至250微米、约80至200微米或约90至150微米。室(如隔离坞)开口的宽度wcon可以是约20至100微米；约30至90微米；或约20至60微米。在一些实施方案中，wch为约70至250微米，且wcon为约20至100微米；wch为约80至200微米，且wcon为约30至90微米；wch为约90至150微米，且wcon为约20至60微米；或其wch和wcon宽度的任何组合。281.在一些实施方案中，隔离坞连接区域近端开口(例如234或334)的宽度(例如，wcon或wcon1)是近端开口处流动区域/微流体通道高度(例如，hch)的2.0倍或更小(例如2.0倍、1.9倍、1.8倍、1.5倍、1.3倍、1.0倍、0.8倍、0.5倍或0.1倍)，或具有位于上述任意两个值定义的范围内的值。282.在一些实施方案中，隔离坞连接区域近端开口(例如234或334)的宽度wcon1可以与朝向其分离区域的远端开口(例如238或338)的宽度wcon2相同。在一些实施方案中，近端开口的宽度wcon1可以不同于远端开口的宽度wcon2，并且wcon1和/或wcon2可以选自对wcon或wcon1描述的任何值。在一些实施方案中，定义近端开口和远端开口的壁(包括连接区域壁)可以基本上彼此平行。在一些实施方案中，定义近端开口和远端开口的壁可以选择为不彼此平行。283.连接区域的长度(例如lcon)可以是约1-600微米、5-550微米、10-500微米、15-400微米、20-300微米、20-500微米、40-400微米、60-300微米、80-200微米、约100-150微米、约20-300微米、约20-250微米、约20-200微米、约20-150微米、约20-100微米、约30-250微米、约30-200微米、约30-150微米、约30-100微米、约30-80微米、约30-50微米、约45-250微米、约45-200微米、约45-100微米、约45-80微米、约45-60微米、约60-200微米、约60-150微米、约60-100微米或约60-80微米。上述仅为实例，且连接区域的长度(例如lcon)可以选择为介于上述任何值之间的值。284.隔离坞的连接区域壁的长度(例如l壁)可以是隔离坞连接区域近端开口的宽度(例如，wcon或wcon1)的至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3.0倍或至少3.5倍。在一些实施方案中，连接区域壁的长度l壁可以是约20-200微米、约20-150微米、约20-100微米、约20-80微米或约20-50微米。以上仅为实例，且连接区域壁的长度l壁可以选择为介于上述任何值之间。285.隔离坞的长度ls可以是约40-600微米、约40-500微米、约40-400微米、约40-300微米、约40-200微米、约40-100微米或约40-80微米。上述仅为实例，且隔离坞的长度ls可以选择为介于上述任何值之间。286.根据一些实施方案，隔离坞可以具有指定的高度(例如hs)。在一些实施方案中，隔离坞的高度hs为约20微米至200微米(例如，约20微米到约150微米、约20微米至约100微米、约20微米至约60微米、约30微米至约150微米，约30微米至约100微米、约30微米至约60微米、约40微米至约150微米、约40微米至约100微米或约40微米至约60微米)。上述仅为实例，且隔离坞的高度hs可以选择为介于上述任何值之间。287.隔离坞近端开口处的连接区域的高度hcon可以是以下任何高度内的高度：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。以上仅为实例，且连接区域的高度hcon可以选择为介于上述任何值之间。通常，连接区域的高度hcon被选择为与连接区域近端开口处的微流体通道高度hch相同。此外，隔离坞的高度hs通常被选择为与连接区域的高度hcon和/或微流体通道的高度hch相同。在一些实施方案中，hs、hcon和hch可被选择为与上文针对所选微流体装置列出的任何值相同的值。288.分离区域可以被配置为仅含有一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对较少数量的微物体。在其他实施方案中，分离区域可以含有多于10个、多于50个或多于100个的微物体。因此，分离区域的体积可以是例如至少1x104、1x105、5x105、8x105、1x106、2x106、4x106、6x106、1x107、3x107、5x1071x108、5x108或8x108立方微米或更大。以上仅为实例，且分离区域可以被配置为包含被选择为介于上述任何值之间的微物体数量和体积(例如，体积在1x105立方微米和5x105立方微米之间，体积在5x105立方米微米和1x106立方微米之间，体积在1x106立方微米和2x106立方微米之间，或体积在2x106立方微米和1x107立方微米之间)。289.根据一些实施方案，微流体装置的隔离坞可以具有指定的体积。可选择指定体积的隔离坞(或隔离坞的分离区域)，使得单个细胞或少量细胞(例如2-10或2-5)能够快速习惯于培养基，从而获得有利(或最佳)生长条件。在一些实施方案中，隔离坞的体积为约5x105、6x105、8x105、1x106、2x106、4x106、8x106、1x107、3x107、5x107或约8x107立方微米或更大。在一些实施方案中，隔离坞的体积为约1纳升至约50纳升、2纳升至约25纳升、2纳升至约20纳升、约2纳升至约15纳升或约2纳升至约10纳升。上述仅为实例，且隔离坞的体积可以选择为介于上述任何值之间的任何值。290.根据一些实施方案，微流体通道(例如122或322)内的流体介质流动可具有指定的最大速度(例如，vmax)。在一些实施方案中，最大速度(例如，vmax)可设置为约0.2、0.5、0.7、1.0、1.3、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.7、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24或25微升/秒。上述仅为实例，且微流体通道内的流体介质流动的最大速度(例如，vmax)可以选择为介于上述任何值之间的值。微流体通道内的流体介质流动通常可以以低于vmax的速率流动。尽管vmax可能因通道和向其开口的隔离坞的具体大小和数量而异，但流体介质可以以以下速率流动：约0.1微升/秒至约20微升/秒；约0.1微升/秒至约15微升/秒；约0.1微升/秒至约12微升/秒、约0.1微升/秒至约10微升/秒；约0.1微升/秒至约7微升/秒钟，但不超过vmax。在典型工作流程的某些部分中，流体介质的流速可以是约0.1微升/秒；约0.5微升/秒；约1.0微升/秒；约2.0微升/秒；约3.0微升/秒；约4.0微升/秒；约5.0微升/秒；约6.0微升/秒；约7.0微升/秒；约8.0微升/秒；约9.0微升/秒；约10.0微升/秒；约11.0微升/秒；或由上述值的其中两个值定义的任何范围，例如1-5微升/秒或5-10微升/秒。微流体通道中流体介质的流速可以等于或小于约12微升/秒；约10微升/秒；约8微升/秒，或约6微升/秒。291.在各种实施方案中，微流体装置具有隔离坞，其配置如本文所讨论的任何实施方案中所述，其中微流体装置具有约5至约10个隔离坞、约10至约50个隔离坞、约25至约200个隔离坞和约100至约500个隔离坞、约200至约1000个隔离坞、约500至约1500个隔离坞、约1000至约2500个隔离坞、约2000至约5000个隔离坞、约3500至约7000个隔离坞、约5000至约10000个隔离坞、约7500至约15000个隔离坞、约12500至约20000个隔离坞、约15000至约25000个隔离坞、约20000至约30000个隔离坞、约25000至约35000个隔离坞、约30000至约40000个隔离坞、约35000至约45000个隔离坞或约40000至约50000个隔离坞。隔离坞不必都是相同的大小，并且可以包括多种配置(例如，不同的宽度、隔离坞内的不同特征)。292.图2g示出了根据一个实施方案的微流体装置280。图2g中所示的微流体装置280是微流体装置100的程式化示意图。在实施中，微流体装置280及其组成管路元件(例如，通道122和室128)会具有本文所讨论的尺寸。图2g中所示的微流体管路120具有两个开口107、四个不同的通道122和四个不同的流动路径106。微流体装置280还包括向每个通道122开口的多个室。在图2g所示的微流体装置中，室具有与图2c中所示的室类似的几何形状，因此具有连接区域和分离区域这两者。因此，微流体管路120包括冲刷区域(例如，通道122和连接区域236的在二次流动244的最大穿透深度dp内的部分)和非冲刷区域(例如，分离区域240和连接区域236的不在二次流动244的最大穿透深度dp内的部分)这两者。293.图3b至3c示出了可用于操作和观察根据本公开的微流体装置(例如，100、200、230、250、280、290、300、400、500、900、1000、1100、1200)的系统150的各种实施方案。如图3b所示，系统150可以包括结构(“巢”)305，其被配置为保持微流体装置320，或本文所述的任何其他微流体装置。巢305可以包括插座(socket)301，其能够与微流体装置320(例如，光致动的电动力学装置100)交界并提供从电源192到微流体装置320的电连接。巢305还可以包括集成的电信号生成子系统304。电信号生成子系统303可以被配置为向插座301提供偏置电压，使得当插座301承载微流体装置320时，在微流体装置320中的一对电极两端施加偏置电压。因此，电信号生成子系统303可以是电源192的一部分。向微流体装置320施加偏置电压的能力并不意味着当插座301承载微流体装置320时会一直施加偏置电压。相反，在大多数情况下，将间歇地施加偏压电压，例如，仅在需要时施加，以促进在微流体装置320中生成电动力，例如介电电泳或电润湿。294.如图3b所示，巢305可以包括印刷电路板组件(pcba)322。电信号生成子系统303可以被安装在pcba322上并被电集成到其中。示例性支撑件包括也安装在pcba322上的插座301。295.通常，电信号生成子系统303将包括波形发生器(未示出)。电信号生成子系统303还可以包括示波器(未示出)和/或被配置为放大从波形发生器接收到的波形的波形放大电路(未示出)。示波器(如果有的话)可以被配置为测量供给至由插座301承载的微流体装置320的波形。在某些实施方案中，示波器在微流体装置320附近(并且远离波形发生器)的位置处测量波形，从而确保更精确地测量实际施加到装置的波形。从示波器测量所获得的数据可以被例如作为反馈提供给波形发生器，并且波形发生器可以被配置为基于这样的反馈而调整其输出。合适的组合式波形发生器和示波器的示例是redpitayatm。296.在某些实施方案中，巢305还包括控制器307，例如用于检测和/或控制电信号生成子系统303的微处理器。合适的微处理器的实例包括arduinotm微处理器，例如arduinonanotm。控制器307可以用于执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154(图1a中所示)进行通信以执行功能和分析。在图3a所示的实施方案中，控制器307通过界面309(例如，插头或连接器)与主控制器154通信。297.在一些实施方案中，巢305可以包括电信号生成子系统303，其包括redpitayatm波形发生器/示波器单元(“redpitaya单元”)和波形放大电路，该波形放大电路将redpitaya单元所产生的波形放大并且将放大的电压传送给微流体装置320。在一些实施方案中，redpitaya单元被配置为测量微流体装置320处的放大的电压，然后根据需要调节其自身的输出电压，使得在微流体装置320处测量到的电压是期望值。在一些实施方案中，波形放大电路可以具有由安装在pcba322上的一对dc-dc转换器产生的 6.5v至-6.5v的电源，从而在微流体装置320处产生高达13vpp的信号。298.如图3b所示，支撑结构305(例如，巢)还可以包括热控制子系统306。热控制子系统306可以被配置为调节由支撑结构305保持的微流体装置320的温度。例如，热控制子系统306可以包括peltier热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。peltier热电装置可以具有被配置为与微流体装置320的至少一个表面相交界的第一表面。冷却单元可以是例如冷却块(未示出)，例如液体冷却铝块。peltier热电装置的第二表面(例如，与第一表面相对的表面)可以被配置为与这种冷却块的表面交界。冷却块可以被连接到流体路径314，流体路径314被配置为使冷却的流体循环通过冷却块。在图3a所示的实施方案中，支撑结构300包括入口315和出口318，以从外部贮液器(未示出)接收冷却的流体，将冷却的流体引入到流体路径314中并通过冷却块，然后将冷却的流体返回到外部贮液器。在一些实施方案中，peltier热电装置、冷却单元和/或流体路径314可以被安装在支撑结构305的壳体312上。在一些实施方案中，热控制子系统306被配置为调节peltier热电装置的温度，以实现微流体装置320的目标温度。peltier热电装置的温度调节可以例如通过热电电源实现，例如通过pololutm热电电源(pololuroboticsandelectronicscorp.)实现。热控制子系统306可以包括反馈电路，例如由模拟电路提供的温度值。或者，反馈电路可以由数字电路提供。299.在一些实施方案中，巢305可以包括具有反馈电路的热控制子系统306，该反馈电路是包括电阻器(例如，具有1kohm /-0.1％的阻抗， /-0.02ppm/c0的温度系数)和ntc热敏电阻(例如，具有1kohm /-0.01％的标称阻抗)的模拟分压器电路(未示出)。在一些情况下，热控制子系统306测量来自反馈电路的电压，然后使用计算出的温度值作为机载pid控制环路算法的输入。来自pid控制环路算法的输出可以驱动例如pololutm马达驱动器(未示出)上的定向和脉冲宽度调制的信号引脚，以致动热电电源，从而控制peltier热电装置。300.巢305可以包括串行端口324，其允许控制器308的微处理器经由界面310(未示出)与外部主控制器154进行通信。另外，控制器307的微处理器可以与电信号生成子系统303和热控制子系统306进行通信(例如，经由plink工具(未示出))。因此，经由控制器307、界面309和串行端口324的组合，电信号生成子系统303和热控制子系统306可以与外部主控制器154进行通信。以这种方式，除了其他方面之外，主控制器154还可以通过执行用于输出电压调节的定标(scaling)计算来辅助电信号生成子系统304。经由耦接到外部主控制器154的显示装置170提供的图形用户界面(gui)(未示出)可以被配置为绘制分别从热控制子系统306和电信号生成子系统303获得的温度和波形数据。替代地或另外地，gui可以允许更新控制器307、热控制子系统306和电信号生成子系统303。301.如上文所讨论的，系统150可以包括成像装置194。在一些实施方案中，成像装置194包括光调制子系统350(参见图3c)。光调制子系统335可以包括数字镜像装置(dmd)或微快门阵列系统(msa)，其中任一个都可以被配置为接收来自光源332的光并将接收到的光的一部分发送到显微镜350的光具组中。或者，光调制子系统335可以包括产生其自身光的装置(因此无需光源332)，例如有机发光二极管显示器(oled)、硅基液晶(lcos)装置、铁电硅基液晶装置(flcos)或透射式液晶显示器(lcd)。光调制子系统335可以是例如投影仪。因此，光调制子系统350能够发射结构光和非结构光。在某些实施方案中，系统150的成像模块164和/或运动模块162可以控制光调制子系统330。302.在某些实施方案中，成像装置194还包括显微镜350。在这样的实施方案中，巢305和光调制子系统335可以被单独地配置为安装在显微镜350上。显微镜350可以是例如标准研究级别的光学显微镜或荧光显微镜。因此，巢305可以被配置为安装在显微镜350的载物台344上和/或光调制子系统335可以被配置为安装在显微镜350的端口上。在其他实施方案中，本文所述的巢305和光调制子系统335可以是显微镜350的集成部件。303.在某些实施方案中，显微镜350还可以包括一个或多个检测器348。在一些实施方案中，检测器348由成像模块164控制。检测器348可以包括目镜、电荷耦合器件(ccd)、相机(例如，数码相机)或其任何组合。如果存在至少两个检测器348，则一个检测器可以是例如快速帧率相机，而另一个检测器可以是高灵敏度相机。此外，显微镜350可以包括光具组，其被配置为接收从微流体装置320反射和/或发射的光，并将反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到一个或多个检测器348上。显微镜的光具组还可以包括用于不同检测器的不同镜筒透镜(未示出)，使得每个检测器上的最终放大率可以是不同的。304.在某些实施方案中，成像装置194被配置为使用至少两个光源。例如，可以使用第一光源332来产生结构光(例如，经由光调制子系统335)，并且可以使用第二光源334来提供非结构光。第一光源332可以产生用于光驱动的电运动和/或荧光激发的结构光，且第二光源333可以用于提供亮视场照明。在这些实施方案中，运动模块164可以用于控制第一光源332，并且成像模块164可以用于控制第二光源333。显微镜350的光具组可以被配置为(1)接收来自光调制子系统335的结构光，并且当该装置被巢305保持时，将结构光聚焦在微流体装置(例如，光致动的电动力学装置)中的至少第一区域上，以及(2)接收从微流体装置反射和/或发射的光，并将这种反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到检测器348上。光具组还可以被配置为接收来自第二光源的非结构光，并且当该装置被巢305保持时，将非结构光聚焦在微流体装置的至少第二区域上。在某些实施方案中，微流体装置的第一和第二区域可以是重叠的区域。例如，第一区域可以是第二区域的子集。在其他实施方案中，第二光源333可以另外地或替代地包括激光，其可以具有任何合适的光波长。图3c中所示的光学系统的表示仅是示意性表示，并且光学系统可以包括另外的滤光器、陷波滤波器、透镜等。当第二光源333包括用于亮视场和/或荧光激发的一个或多个光源以及激光照明时，光源的物理布置可以与图3c中所示的不同，并且可以在光学系统内的任何合适的物理位置引入激光照明。光源333和光源332/光调制子系统335的示意性位置也可以互换。305.在图3c中，第一光源332被显示为将光提供给光调制子系统335，其将结构光提供给系统355的显微镜350的光具组(未示出)。第二光源333被显示为经由分束器335将非结构光提供给光具组。来自光调制子系统335的结构光和来自第二光源333的非结构光一起从分束器337通过光具组行进到达第二分束器(或二向色滤光器339，取决于光调制子系统335提供的光)，光在此通过物镜340向下反射到样品平面342。然后，从样品平面342反射和/或发射的光向上返回通过物镜340、通过分束器和/或二向色滤光器339，并返回到二向色滤光器346。到达二向色滤光器346的光的仅仅一部分穿过并到达检测器348。306.在一些实施方案中，第二光源333发射蓝光。利用适当的二向色滤光器346，从样品平面342反射的蓝光能够穿过二向色滤光器346并到达检测器348。相反，来自光调制子系统335的结构光从样品平面342反射，但不穿过二向色滤光器346。在该实例中，二向色滤光器346滤除波长长于495nm的可见光。只有从光调制子系统发射的光不包括短于495nm的任何波长时，对来自光调制子系统335的光的这种滤除才算完成(如图所示)。在实施中，如果来自光调制子系统335的光包括短于495nm的波长(例如，蓝色波长)，则来自光调制子系统的一些光会穿过滤光器346到达检测器348。在这样的实施方案中，滤光器346作用于改变从第一光源332和第二光源333到达检测器348的光量之间的平衡。如果第一光源332显著强于第二光源333，则这可能是有益的。在其他实施方案中，第二光源333可以发射红光，并且二向色滤光器346可以滤除除了红光之外的可见光(例如，波长短于650nm的可见光)。307.涂覆溶液和涂覆剂。不希望受理论的限制，当微流体装置的至少一个或多个内表面已经被调节或涂覆以便呈现有机和/或亲水分子层(其提供微流体装置和保持在其中的生物微物体之间的主要界面)时，可以促进微流体装置(例如，dep配置的和/或ew配置的微流体装置)内的生物微物体(例如，生物细胞)的维持(即，生物微物体在微流体装置内表现出增加的活力、更大的扩增和/或更大的可携带性)。在一些实施方案中，微流体装置的一个或多个内表面(例如，dep配置的微流体装置的电极活化衬底的内表面、微流体装置的盖和/或管路材料的表面)可以用涂覆溶液和/或涂覆剂处理或改性，以产生所需的有机和/或亲水分子层。308.涂层可以在引入生物微物体之前或之后施加，或者可以与生物微物体同时引入。在一些实施方案中，生物微物体可以在包含一种或多种涂覆剂的流体介质中输入到微流体装置中。在其他实施方案中，在将生物微物体引入到微流体装置中之前，将微流体装置(例如，dep配置的微流体装置)的内表面用包含涂覆剂的涂覆溶液处理或“装填”。309.在一些实施方案中，微流体装置的至少一个表面包括涂层材料，其提供适合于维持和/或扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层(例如提供如下文所述的经调节的表面)。在一些实施方案中，微流体装置的基本上所有内表面都包括涂层材料。经涂覆的内表面可以包括流动区域(例如，通道)、室或室的表面，或其组合。在一些实施方案中，多个室中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在其他实施方案中，多个流动区域或通道中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在一些实施方案中，多个室中的每一个和多个通道中的每一个的至少一个内表面都涂覆有涂层材料。310.涂覆剂/溶液。可以使用任何方便的涂覆剂/涂覆溶液，包括但不限于：血清或血清因子、牛血清白蛋白(bsa)、聚合物、洗涤剂、酶及其任何组合。311.基于聚合物的涂层材料。至少一个内表面可以包括包含聚合物的涂层材料。聚合物可以与至少一个表面共价或非共价地结合(或可以非特异性地粘附)。聚合物可以具有多种结构基序，例如嵌段聚合物(和共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)和接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)中所发现的，所有这些都可以适用于本文公开的方法。312.聚合物可以包括含有亚烷基醚部分的聚合物。大量的含亚烷基醚的聚合物可以适用于本文所述的微流体装置。一类非限制性示例性的含亚烷基醚的聚合物是两性非离子嵌段共聚物，其包括在聚合物链内具有不同比例和位置的聚氧乙烯(peo)和聚氧丙烯(ppo)子单元的嵌段。pluronic聚合物(basf)是这类嵌段共聚物，并且在本领域中已知适合于在与活细胞接触时使用。聚合物的平均分子量mw可以为约2000da至约20kda。在一些实施方案中，peo-ppo嵌段共聚物可以具有大于约10(例如，12-18)的亲水-亲油平衡(hlb)。可用于产生经涂覆的表面的特定pluronic聚合物包括pluronicl44、l64、p85和f127(包括f127nf)。另一类含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(pegmw《100,000da)或可替代地，聚氧乙烯(peo，mw》100,000)。在一些实施方案中，peg可以具有约1000da、5000da、10,000da或20,000da的mw。313.在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有羧酸部分的聚合物。羧酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚乳酸(pla)。在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磷酸酯部分的聚合物，该磷酸酯部分在聚合物主链的末端处或者从聚合物的主链悬垂。在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磺酸部分的聚合物。磺酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚苯乙烯磺酸(pssa)或聚茴香脑磺酸。在进一步的实施方案中，涂层材料可以包括含有胺部分的聚合物。聚氨基聚合物可以包括天然多胺聚合物或合成的多胺聚合物。天然多胺的实例包括精胺、亚精胺和腐胺。314.在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有糖部分的聚合物。在一个非限制性实例中，诸如黄原胶或葡聚糖的多糖可以适合于形成可以在微流体装置中减少或防止细胞粘附的材料。例如，大小为约3kda的葡聚糖聚合物可以用于为微流体装置内的表面提供涂层材料。315.在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有核苷酸部分的聚合物，即核酸，其可以具有核糖核苷酸部分或脱氧核糖核苷酸部分，从而提供聚电解质表面。核酸可以仅含有天然核苷酸部分或者可以含有非天然核苷酸部分，其包含核碱基、核糖或磷酸酯部分类似物，例如7-脱氮腺嘌呤、戊糖、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯部分，但不限于此。316.在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有氨基酸部分的聚合物。含有氨基酸部分的聚合物可以包括含有天然氨基酸的聚合物或含有非天然氨基酸的聚合物，其均可以包括肽、多肽或蛋白。在一个非限制性实例中，蛋白可以是牛血清白蛋白(bsa)和/或包含白蛋白的血清(或多种不同血清的组合)和/或一种或多种作为涂覆剂的其他类似蛋白。血清可以来自任何方便的来源，包括但不限于胎牛血清、绵羊血清、山羊血清、马血清等。在某些实施方案中，bsa在涂覆溶液中存在的浓度为约1mg/ml至约100mg/ml，包括5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml，或更高或介于其间的任何值。在某些实施方案中，血清在涂覆溶液中存在的浓度可以为约20％(v/v)至约50％v/v，包括25％、30％、35％、40％、45％，或更高或介于其间的任何值。在一些实施方案中，bsa可以作为涂覆剂以5mg/ml存在于涂覆溶液中，而在其他实施方案中，bsa可以作为涂覆剂以70mg/ml存在于涂覆溶液中。在某些实施方案中，血清作为涂覆剂以30％存在于涂覆溶液中。在一些实施方案中，可以在涂层材料内提供细胞外基质(ecm)蛋白，用于获得优化的细胞粘附以促进细胞生长。可以包含在涂层材料中的细胞基质蛋白可以包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、含rgd的肽(例如纤连蛋白)或层粘连蛋白。在其他实施方案中，可以在微流体装置的涂层材料内提供生长因子、细胞因子、激素或其他细胞信号传导物质。317.在一些实施方案中，涂层材料可以包括含有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分或氨基酸部分中超过一种的聚合物。在其他实施方案中，经聚合物调节的表面可以包括超过一种聚合物的混合物，每种聚合物具有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分和/或氨基酸部分，其可以独立地或同时地并入到涂层材料中。318.共价连接的涂层材料。在一些实施方案中，至少一个内表面包括共价连接的分子，其提供适于在微流体装置内维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层，为这些细胞提供调节的表面。319.共价连接的分子包括连接基团，其中连接基团与微流体装置的一个或多个表面共价连接，如下文所述。连接基团还与被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分共价连接。320.在一些实施方案中，被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括烷基或氟代烷基(包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子表面)；磺酸盐阴离子；羧基甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。321.在各种实施方案中，被配置为在微流体装置中提供适合于维持/扩增的生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括非聚合部分，例如烷基部分、取代的烷基部分(例如，氟代烷基部分(包括但不限于全氟代烷基部分))、氨基酸部分、醇部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸部分、氨基磺酸部分或糖部分。或者，共价连接的部分可以包括聚合部分，其可以是上文所述的任何部分。322.在一些实施方案中，共价连接的烷基部分可以包含形成直链(例如，至少10个碳或至少14、16、18、20、22或更多个碳的直链)的碳原子并且可以是无支链的烷基部分。在一些实施方案中，烷基可以包括取代的烷基(例如，烷基中的一些碳可被氟化或全氟化)。在一些实施方案中，烷基可以包括第一区段(其可以包括全氟代烷基)，其连接至第二区段(其可以包括未取代的烷基)，其中第一和第二区段可以直接或间接(例如，通过醚链接)连接在一起。烷基的第一区段可以位于连接基团的远端，并且烷基的第二区段可以位于连接基团的近端。323.在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一个氨基酸，其可以包括超过一种类型的氨基酸。因此，共价连接的部分可以包括肽或蛋白。在一些实施方案中，共价连接的部分可以包括氨基酸，其可以提供两性离子表面以支持细胞生长、活力、可携带性(portability)或其任何组合。324.在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一个亚烷基氧化物部分，并且可以包括如上文所述的任何亚烷基氧化物聚合物。一类有用的含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(pegmw《100,000da)或者聚氧乙烯(peo，mw》100,000)。在一些实施方案中，peg可以具有约1000da、5000da、10,000da或20,000da的mw。325.共价连接的部分可以包括一种或多种糖。共价连接的糖可以是单糖、二糖或多糖。可以修饰共价连接的糖，以引入反应性配对部分，其允许偶联或加工用于表面的附接。示例性的反应性配对部分可以包括醛、炔烃或卤素部分。可以以随机方式修饰多糖，其中可以修饰每种糖单体或仅修饰多糖内的一部分糖单体，以提供可以直接或间接偶联至表面的反应性配对部分。一个实例可以包括葡聚糖多糖，其可以经过非支链的连接部分间接地偶联到表面。326.共价连接的部分可以包括一个或多个氨基。氨基可以是取代的胺部分、胍部分、含氮杂环部分或杂芳基部分。含氨基的部分可以具有允许对微流体装置内以及任选地对室和/或流动区域(例如，通道)内的环境进行ph修饰的结构。327.提供经调节的表面的涂层材料可以仅包含一类共价连接的部分，或者可以包括超过一种不同类型的共价连接的部分。例如，经氟代烷基调节的表面(包括全氟代烷基)可以具有多个共价连接的部分，它们全部相同，例如具有相同的连接基团和与表面的共价连接、相同的总长度和相同数目的氟代亚甲基单元，包括氟代烷基部分。或者，涂层材料可以具有超过一种类型的与表面附接的共价连接部分。例如，涂层材料可以包括具有共价连接的具有指定数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基部分的分子，并且还可以包括另一组分子，其具有共价连接到具有更大数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基链的带电荷部分，其可以提供在经涂覆的表面上呈现较大部分的能力。在这种情况下，具有不同的、空间要求更低的末端和更少的主链原子的第一组分子能够有助于使整个衬底表面功能化，从而防止与构成衬底本身的硅/氧化硅、氧化铪或氧化铝的不期望的粘附或接触。在另一个实例中，共价连接的部分可以提供两性离子表面，其在表面上以随机的方式呈现交替的电荷。328.经调节的表面性质。除了经调节的表面的组成之外，其他因素(例如疏水材料的物理厚度)可能影响dep力。各种因素可能改变经调节的表面的物理厚度，例如在衬底上形成经调节的表面的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂、溢流和静电涂覆)。在一些实施方案中，经调节的表面的厚度为约1nm至约10nm；约1nm至约7nm；约1nm至约5nm；或其间的任何单个值。在其他实施方案中，由共价连接的部分形成的经调节的表面可以具有约10nm至约50nm的厚度。在各种实施方案中，如本文所述制备的经调节的表面具有小于10nm的厚度。在一些实施方案中，当共价连接至微流体装置的表面(例如，dep配置的衬底表面)时，经调节的表面的共价连接的部分可以形成单层，并且可以具有小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)的厚度。这些值与通过例如旋涂制备的表面的值(其厚度通常为约30nm)形成对比。在一些实施方案中，经调节的表面不需要完美形成的单层以适当地作用于在dep配置的微流体装置内操作。329.在各种实施方案中，提供微流体装置的经调节表面的涂层材料可以提供所需的电性质。不希望受理论的限制，影响涂覆有特定涂层材料的表面的稳健性的一个因素是固有电荷捕捉。不同的涂层材料可能捕捉电子，这可能导致涂层材料的破坏。涂层材料中的缺陷可能增加电荷捕捉并导致涂层材料的进一步破坏。类似地，不同的涂层材料具有不同的介电强度(即导致介电击穿的最小施加电场)，这可能影响电荷捕捉。在某些实施方案中，涂层材料可以具有降低或限制电荷捕捉量的整体结构(例如，紧密堆积的单层结构)。330.除了其电性质之外，经调节的表面还可以具有有益于与生物分子一起使用的性质。例如，相对于烷基封端的链，含有氟代(或全氟代)碳链的经调节的表面可以在减少表面结垢量方面提供益处。如本文所用的表面结垢是指沉积在微流体装置的表面上的任意物质的量，其可以包括生物材料(例如，蛋白及其降解产物、核酸和各自的降解产物，等等)的永久性或半永久性沉积。331.单一或多部分调节的表面。如下文所述的，共价连接的涂层材料可以通过已经含有被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分的分子的反应形成。或者，共价连接的涂层材料可以在两步顺序中通过将被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分偶联至表面修饰配体(它本身已经与表面共价连接)而形成。332.制备共价连接的涂层材料的方法。在一些实施方案中，共价连接至微流体装置的表面(例如，包括室和/或流动区域的至少一个表面)的涂层材料具有式1或式2的结构。当将涂层材料一步引入到表面中时，它具有式1的结构，而当将涂层材料以多步法引入时，它具有式2的结构。[0333][0334]涂层材料可以共价连接到dep配置或ew配置的衬底的表面的氧化物上。dep或ew配置的衬底可以包括硅、氧化硅、氧化铝或氧化铪。氧化物可以作为衬底的初始化学结构的一部分存在，或者可以被如下所讨论地引入。[0335]涂层材料可以经由连接基团(“lg”)与氧化物连接，该连接基团可以是由硅氧烷或膦酸基团与氧化物反应而形成的甲硅烷氧基或膦酸酯基团。被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分可以是本文所述的任何部分。连接基团lg可以直接或间接连接到被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。当连接基团lg直接连接至该部分时，不存在任选的连接部分(“l”)，且n为0。当连接基团lg间接连接至该部分时，存在连接部分l，且n为1。连接部分l可以具有线性部分，其中线性部分的主链可以包括1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和/或磷原子的任何组合的非氢原子，其受本领域中已知的化学键合的限制。它可以被可以选自醚、氨基、羰基、酰氨基和/或膦酸酯基、亚芳基、亚杂芳基或杂环基的一个或多个部分的任何组合所中断。在一些实施方案中，连接部分l的主链可以包括10至20个原子。在其他实施方案中，连接部分l的主链可以包括约5个原子至约200个原子；约10个原子至约80个原子；约10个原子至约50个原子；或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，主链原子均为碳原子。[0336]在一些实施方案中，可以在多步法中向衬底的表面添加被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分，并且该部分具有上文所示的式2的结构。该部分可以是上文所述的任何部分。[0337]在一些实施方案中，偶联基团cg表示由反应性部分rx和反应性配对部分rpx(即，被配置为与反应性部分rx反应的部分)的反应所得到的基团。例如，一种典型的偶联基团cg可以包括羧酰氨基基团，其是氨基与羧酸衍生物(例如，活化的酯、酰氯等)反应的结果。其他cg可以包括亚三唑基、羧酰氨基、硫代酰氨基、肟、巯基、二硫化物、醚或烯基，或者可以在反应性部分与其相应的反应性配对部分反应时形成的任何其他合适的基团。偶联基团cg可以位于连接基团l的第二末端(即，邻近被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分的末端)，连接基团l可以包括如上文所述的元素的任何组合。在一些其他实施方案中，偶联基团cg可以中断连接基团l的主链。当偶联基团cg是亚三唑基时，它可以是由click偶联反应产生的产物并且可以进一步被取代(例如，二苯并环辛烯基稠合的亚三唑基)。[0338]在一些实施方案中，使用化学气相沉积将涂层材料(或表面修饰的配体)沉积在微流体装置的内表面上。可以任选地改进气相沉积工艺，例如，通过暴露于溶剂浴、超声处理或其组合而预清洁盖110、微流体管路材料116和/或衬底(例如，dep配置的衬底的电极活化衬底206的内表面208，或ew配置的衬底的支撑结构104的介电层)。替代地或另外地，这种预清洁可以包括在氧等离子体清洁剂中处理盖110、微流体管路材料116和/或衬底，其可以去除各种杂质，同时引入经氧化的表面(例如，表面上的氧化物，其可以如本文所述进行共价修饰)。或者，可以使用液相处理，例如盐酸和过氧化氢的混合物或硫酸和过氧化氢的混合物(例如，食人鱼溶液，其可以具有约3:1至约7:1的硫酸与过氧化氢的比率)代替氧等离子体清洁剂。[0339]在一些实施方案中，在微流体装置200已经被组装以形成限定微流体管路120的外壳102之后，使用气相沉积来涂覆微流体装置200的内表面。不希望受理论的限制，将这样的涂层材料沉积在完全组装的微流体管路120上可能有益于防止由微流体管路材料116和电极活化衬底206介电层和/或盖110之间变弱的结合所引起的分层。在采用两步法的实施方案中，可以通过如上文所述的气相沉积引入表面修饰配体，随后引入被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。该随后的反应可以通过在溶液中将表面修饰的微流体装置暴露于合适的偶联剂来进行。[0340]图2h描绘了微流体装置290的横截面视图，该微流体装置290具有提供经调节的表面的示例性共价连接的涂层材料。如所示，涂层材料298(示意性地示出)可以包括与底座286(其可以是dep衬底)的内表面294和微流体装置290的盖288的内表面292两者共价结合的紧密堆积的分子单层。涂层材料298可以被设置在邻近且向内朝向微流体装置290的外壳284的基本上所有内表面294、292上，在一些实施方案中并且如上文所讨论的，包括用于定义微流体装置290内的管路元件和/或结构的微流体管路材料的表面(未示出)。在可选的实施方案中，涂层材料298可以仅被设置在微流体装置290的一个或一些内表面上。[0341]在图2h所示的实施方案中，涂层材料298可以包括单层有机硅氧烷分子，每个分子经由甲硅烷氧基连接部分296共价键合到微流体装置290的内表面292、294。可以使用任何上文所讨论的涂层材料298(例如，烷基封端的、氟代烷基封端的部分、peg封端的部分、葡聚糖封端的部分或含有用于有机硅氧基部分的正电荷或负电荷的末端部分)，其中末端部分被设置在其朝向外壳的末端(即，涂层材料298的单层的未与内表面292、294结合并且邻近外壳284的部分)。[0342]在其他实施方案中，用于涂覆微流体装置290的内表面292、294的涂层材料298可以包括阴离子、阳离子或两性离子部分，或其任何组合。不希望受理论的限制，通过在微流体管路120的外壳284的内表面上提供阳离子部分、阴离子部分和/或两性离子部分，涂层材料298可以与水分子形成强的氢键，使得所产生的水合水充当将生物微物体与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。另外，在涂层材料298与涂覆剂结合使用的实施方案中，涂层材料298的阴离子、阳离子和/或两性离子可以与存在于外壳284中的介质180(例如，涂覆溶液)中的非共价涂覆剂(例如，溶液中的蛋白)的带电荷部分形成离子键。[0343]在其他实施方案中，涂层材料可以包含或经化学修饰以在其朝向外壳的末端提供亲水涂覆剂。在一些实施方案中，涂层材料可以包括含亚烷基醚的聚合物，例如peg。在一些实施方案中，涂层材料可以包括多糖，例如葡聚糖。与上文所讨论的带电荷部分(例如，阴离子、阳离子和两性离子部分)一样，亲水涂覆剂可以与水分子形成强的氢键，使得所得的水合水充当将生物微物体与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。[0344]适当的涂层处理和修饰的进一步细节可以在2016年4月22日提交的美国专利申请系列号15/135,707中找到，其通过引用整体并入。[0345]用于在微流体装置的室内维持细胞活力的另外的系统组件。为了促进细胞群的生长和/或扩增，可以通过系统的另外的组件提供有利于维持功能细胞的环境条件。例如，此类另外的组件可以提供营养物、细胞生长信号传导物质、ph调节、气体交换、温度控制和从细胞中除去废产物。[0346]测定由生物微物体分泌的被分析物。在一些实施方案中，本公开提供了用于对室中存在的生物分子进行量化的方法、系统和装置。在一些实施方案中，生物分子是由生物细胞或任何其他能够产生分泌的被分析物的生物微生物分泌的被分析物。[0347]在生物生产工业中，在采用目前可得的仪器和工作流程时，一个严重的问题是识别具有期望水平的生产水平和生长习性的克隆群的费用、时间和困难。例如，开发新的抗体生产线可能需要数月的工作并且在人员、设备和材料上花费数百万美元。如本文所述，在扩增群中非常早期(例如在接种个体创建细胞(foundingcell)后3、4、5、6或7天)筛选和识别微流体装置内有希望的克隆的能力可以提供显著的时间和成本优势。申请人已经发现，如本文所述的纳米流体环境，特别是基于室的纳米流体环境，提供了示例性的克隆群彼此分离，提供从每个单独的克隆群获得测定结果而没有来自位于微流体装置内的其他克隆群的污染的能力。还已经发现，使用本文所述的方法确定分泌的被分析物的相对或绝对量的测定，即使在克隆扩增的早期阶段进行，也可以在更典型的宏观级的扩增(例如，摇瓶等)时与期望的分泌的被分析物的生产相关联。此外，在这样的早期阶段筛选单个克隆的能力还可以允许识别满足特定的生长速率和/或更强大生产的要求的期望克隆(例如，高度生产性克隆，其对培养环境中的物质(例如代谢废物或耗尽的营养物)的水平更具抵抗力)。[0348]申请人发现的另一个优点是，可以在不使用过多资源的情况下更充分地探索多个细胞作为克隆群的潜在创建细胞，因为本文描述的纳米流体室(例如，室)允许同时以极小的体积同时生长/测定多达数千个个体的创建细胞。[0349]另外，本文描述的纳米流体环境允许通过来自重复测定的反馈来检查特定条件对细胞的影响。例如，与细胞分泌产物(本文的方法中的被分析物)的大规模生产更密切相关的条件和材料(例如培养基)可以用于发现和表征最合适的克隆用于进一步检查。在另一个实例中，可以以更可重复的方式检查用于b细胞抗体刺激的不同刺激方案，并且可以对其进行测定以便更一致地评估一种方案相对于另一种方案的益处。[0350]使用扩散谱进行检测和量化。如本文所述，可以使用与分泌的被分析物结合的报道分子来量化生物微物体的分泌的被分析物的量。报道分子包括与待量化的分泌的被分析物结合的结合组分和用于检测报道分子的量的信号组分。报道分子在其未结合状态(例如，未与分泌的被分析物结合)的扩散速率高于其结合状态(例如，与分泌的被分析物的一个或多个分子结合)。在一些实施方案中，未结合的和结合的报道分子之间的扩散速率的差异将是报道分子所结合的分泌的被分析物分子的大小的函数。在一些实施方案中，报道分子可以以使扩散速率减慢的构象与分泌的被分析物结合。例如，报道分子可以以这样的构象与分泌的被分析物的多个拷贝结合：其中分泌的被分析物聚集并且部分地由于其构象而缓慢扩散。本文描述的方法利用报道分子(未结合的)与结合的报道分子:被分析物复合物(rmsa)之间的扩散速率的差异来量化分泌的被分析物的量。[0351]在微流体通道中的流动条件下的扩散测定。图4a-4c示出了根据本公开的一些实施方案的测定。在图4a中，通过使在流242内使含有一定浓度的报道分子412的流体流入到微流体装置400的通道122中，将报道分子412(每个具有可检测的标记物)引入到微流体通道122中。室424、426、428各自与包含不同数目的分泌生物被分析物410的细胞402、404、406的微流体通道122流体连接。室424、426、428中的每一个包括连接区域436和分离区域440(仅为了清楚起见，室424是如此标记的唯一的坞)。连接区域436和分离区域440具有如上文所述的特性，并且限制被引入到通道122中的物质的接触(例如，在分离区域440内，在通道122内流动的物质可以仅通过扩散进入分离区域，而不是直接流入分离区域中)。在图4a所示的时间点，分泌的被分析物410的分子在细胞附近。[0352]图4b示出了在稍后的时间点与图4a中的微流体装置相同的区域。报道分子412可以在通道122和室424、426、428内快速扩散，使得报道分子412的浓度在通道122和室424、426、428的内部之间平衡。如图4b中所示，报道分子412已达到稳态浓度，以在室424、426、428内基本均匀。含有报道分子412的介质的流动242被不含报道分子412的介质的流动242代替，并且通道122不含有显著量的报道分子。[0353]当每个室424、426、428内的报道分子412接触分泌的被分析物410的分子时，报道分子412可以与被分析物410结合，形成报道分子:被分析物复合物414，并提供局部可检测信号，该信号与分泌的被分析物410的量有关。随着流动242的继续，报道分子扩散出室，进入通道122并从微流体装置输出。然而，如图4b所示，报道分子:被分析物复合物410的扩散比未结合的报道分子412的扩散慢，因为它具有更大的分子量(和有效尺寸)并且有差异地不会那么快速地从室424、426、428中扩散出来。[0354]图4c示出了在更后的时间点与图4a和4b中的微流体装置相同的区域，在该时间点分泌的被分析物410和报道分子:被分析物复合物414从分泌的被分析物410的来源(例如，细胞402、404、406)扩散到通道122。流动242在通道122内继续，从而允许报道分子412比报道分子:被分析物复合物410更快地扩散出每个室424、426、428。[0355]报道分子:被分析物复合物扩散得更慢，因为分泌的被分析物分子410可以具有比报道分子412更大的分子量(和相关的在溶液中的有效尺寸)。在分泌的被分析物是抗体并且报道分子是肽或适体的实施方案中，分子量的差异是显著的。在任何情况下，结合的报道分子:被分析物复合物414的重量(并且相应的，大小)大于未结合的报道分子412的重量，因此报道分子:被分析物复合物414可以比未结合的报道分子412更慢地扩散，相对于未结合的报道分子412所提供的均匀信号，其提供不同的扩散谱和相关的可检测信号。另外，生物微物体502、504、506继续分泌被分析物410，提供更多的靶标以与仍然位于室524、526、528内的报道分子412结合。可以选择一个时间点，其中未结合的报道分子正在或已经从室中扩散出来的百分比超过阈值，允许对基本上或主要仅来自每个室424、426、428内的报道分子:被分析物复合物414的可检测信号成像。在一些实施方案中，当已从室中扩散出来的未结合的报道分子412的量为约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或由前述值中的两个所限定的任何范围时，获取测定图像。替代地或另外地，在一些实施方案中，当已从室中扩散出来的未结合的报道分子412的量比已从室中扩散出来的结合的报道分子:被分析物复合物414的量高约1.25x、1.5x、2.0x、2.5x、3.0x、3.5x、4.0x、4.5x、5.0x、7.5x、10x、25x、50x或100x时，获取测定图像。[0356]在测定图像中获得的可检测信号可以与室中生物微物体的数目成比例。室424被示出为含有6个生物微物体，室426被示出为含有4个生物微物体，并且室428被示出为含有2个生物微物体，并且在一些实施方案中，来自各个室的测定信号可以与那些细胞数目成比例。在一些实施方案中，被分析物的分泌可以取决于测定信号获取时间的细胞周期状态，并且来自多个室中的每一个的信号可能与每个室内的细胞数目基本上不成比例。另外，如图4c所示，虽然所有细胞402、404、406均分泌被分析物410，但不同细胞群(例如，不同克隆)可以以不同的速率分泌生物被分析物410。因此，即使当针对每个室中存在的细胞402、404、406的数目进行归一化时，产生的被分析物410的量(以及从报道分子:被分析物复合物414检测到的扩散谱信号的所得强度)也可能在室与室之间不相同。可以在该时间段内获得一个或多个测定图像，其可以用于表征成像的室424、426、428内的分泌的被分析物410的量。下文描述了为了得到所产生的分泌的被分析物410的量的相对或绝对量化而进行的分析。[0357]如上所述，报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物扩散得更慢，因为分泌的被分析物分子可能比报道分子具有更大的分子量(以及溶液中的相关有效大小)。在分泌的被分析物为抗体且报道分子为肽或适体的实施方案中，分子量的差异显著。在任何情况下，结合的rsma复合物的重量(以及相应的大小)大于未结合的报道分子的重量，因此，rsma复合物可以扩散得比未结合的报道分子慢，相对于未结合的报道分子提供的均匀信号，它提供了独特的扩散谱和相关的可检测信号。[0358]未结合的报道分子和rmsa复合物之间在分子量差异的加入(keyingin)可能会影响本文讨论的用于涉及小分子量分子(分泌的小分子量被分析物)的产生的工作流程的一些测定方法的兼容性。由于扩散速率必然与所讨论组分的重量/大小有关，并且不同的扩散谱允许收集有价值的可检测信号，因此当结合由细胞分泌的小分子量分子时，如何减缓测定试剂的扩散似乎并不明显。因此，这可能导致结合的荧光物质和游离的荧光物质之间的扩散速率没有明显差异，因此似乎没有明确的途径来获得必要的扩散谱来收集必要的可检测信号。通过克服这个问题，本文所公开的各种实施方案可以涉及例如小代谢物、生物燃料或其他受关注的小分子的分泌来实现。[0359]测量小分子的产生可以例如通过根据各种实施方案反转细胞系发育测定来完成，其中较亮的荧光室将指示不是最高产生的细胞系，而是较弱的产生系。在一个实例中，已知与小分子靶结合的分子(例如，大分子量蛋白或蛋白复合物，称为“锚”)将首先与感兴趣靶的荧光版本在芯片外结合。这种荧光复合物(锚 荧光靶)将在整个芯片中，包括在含有可能分泌靶的非荧光版本的细胞的室中平衡。在这些未标记靶的存在下，结合动力学将驱动标记靶与室内浓度远远更高的未标记靶的交换。在冲洗干净通道一段时间后，不被锚结合的荧光靶将迅速从室扩散。因此，当读取该冲洗后的荧光水平时，较暗的观察室将等同于那些分泌更多小分子量靶的室。[0360]图33a-c示出了根据各种实施方案的该方法的实例。在图33a中，将具有结合的荧光分子3720的高分子量锚蛋白3710(例如，抗体)(标记靶)引入含有细胞3760和分泌的未标记靶3730的室3750。在图33b中，结合动力学驱动标记靶3720与未标记靶3730的交换。例如，假设目的是寻找产生最高量的fciii肽的细胞。为了实现这一点，鉴于上述情况，可以添加预结合在芯片外的锚(anchoroffchip)上的标记的fciii。在将这种标记靶引入室后，随着时间的推移，将在室中发生细胞分泌的未标记fciii和在锚上预平衡的标记的fciii之间的交换。最后，在图33c中，交换完成，并且可以冲洗通道以允许未结合的荧光靶扩散到坞外。由此，可以使用标准图像捕捉和分析(如本文所述)来观察荧光水平。然而，与寻找指示高分泌水平的更明亮的室相反，由于未结合的荧光靶被移除，较暗的室分泌更多的小分子靶。[0361]在微流体通道中的非流动条件下的扩散测定。图5a至5c示出了根据本公开的一个实施方案的测定。在图5a中，通过使含有一定浓度的报道分子412的流体流入通道122，将各自具有可检测的标记物的报道分子412引入到微流体装置500的微流体通道122中。图5a还示出了与含有各种数目的分泌生物被分析物410的细胞502、504、506的微流体通道122流体连接的室524、526、528。室524、526、528中的每一个包括连接区域536和分离区域540(为了清楚起见，室524是唯一标记的坞)。连接区域536和分离区域540具有如上文所述的特性，并且限制引入到通道122中的物质的接触(例如，在分离区域540内，在通道122内流动的物质可以仅通过扩散而不是通过直接流入分离区域而进入分离区域)。在图5a所示的时间点，分泌的被分析物410的分子在细胞附件。[0362]图5b示出了在稍后的时间点与图5a中的微流体装置相同的区域。报道分子412可以在通道122和室524、526、528内快速扩散，使得报道分子412的浓度在通道122和室524、526、528的内部之间平衡。如图5b中所示，报道分子412已经达到稳态浓度平衡，使得未结合的报道分子412的浓度在室524、526、528和通道122中可以是基本上均匀的。当报道分子412的浓度平衡到室524、526、528中时，停止通道中的流动。当报道分子412接触分泌的被分析物410的分子时，报道分子412可以与被分析物410结合，形成报道分子:被分析物复合物414，并提供与分泌的被分析物410的量相关的局部可检测信号。[0363]图5c示出了在更后的时间点与图5a和5b中的微流体装置相同的区域，在该时间点分泌的被分析物410和报道分子:被分析物复合物414从分泌的被分析物410的来源(例如，细胞502、504、506)扩散到通道122。在该时间点，通道122中没有流动。[0364]如上文所述，分泌的被分析物分子410可以具有比报道分子412更大的分子量(和相关的在溶液中的有效尺寸)。因此，报道分子:被分析物复合物414可以比未结合的报道分子412更慢地扩散，相对于未结合的报道分子412所提供的均匀信号，其提供不同的扩散谱和相关的可检测信号。另外，生物微物体502、504、506继续分泌被分析物410，提供更多的靶标以与仍然被位于室524、526、528内的报道分子412结合。[0365]扩散谱和/或相关的信号可以与室中的生物微物体的数目成比例。室524被示出为含有6个生物微物体，室526被示出为含有4个生物微物体，且室528被示出为含有2个生物微物体。然而，在一些其他实施方案中，各个室524、526、528中的细胞502、504、506可以以大约相同的速率分泌被分析物410，并且从报道分子:被分析物复合物414检测到的信号的所得强度可以与每个室中存在的细胞502、504、506的数目成比例。然而，被分析物的分泌可以取决于测定信号获取时间的细胞周期状态。此外，如图5c所示，虽然所有细胞502、504、506均分泌被分析物，但不同细胞群(例如，不同克隆)可以以不同的速率分泌生物被分析物410。因此，即使当针对每个室中存在的细胞502、504、506的数目进行归一化时，产生的被分析物410的量(以及从报道分子:被分析物复合物414检测到的扩散谱信号的所得强度)也可能在室与室之间不相同。可以在该时间段内获得一个或多个测定图像，其可以用于表征成像的室524、526、528内的分泌的被分析物410的量。下文描述了为了得到所产生的分泌的被分析物410的量的相对或绝对量化而进行的分析。[0366]分泌的被分析物。由生物微物体分泌的被分析物可以是蛋白、糖、核酸、分子量小于3kd的有机分子、囊泡、病毒及其任何组合。分泌的被分析物可以是天然表达的被分析物(例如，野生表达的)或可以是生物工程被分析物(例如，由基因插入、缺失、修饰等产生的产物)。作为核酸的分泌的被分析物可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸，可以包括天然或非天然核苷酸。作为病毒的分泌的被分析物可以是病毒颗粒、载体或噬菌体。作为糖的分泌的被分析物可以是单糖、二糖或多糖。糖的非限制性实例可以包括葡萄糖、海藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖、核糖、黄原胶或壳聚糖。分泌的小有机分子可以包括但不限于生物燃料、油、聚合物或药物，例如大环内酯类抗生素。作为蛋白的分泌的被分析物可以是抗体或抗体片段。作为蛋白的分泌的被分析物可以是血液蛋白，例如白蛋白、球蛋白(例如，α2-巨球蛋白、丙种球蛋白、β-2微球蛋白、结合珠蛋白)、补体蛋白(例如，组分3或4)、转铁蛋白、凝血酶原、α1抗胰蛋白酶等；激素，如胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、生长激素、生长因子(如fgf、hgf、ngf、egf、pdgf、tgf、促红细胞生成素、igf、tnf)、卵泡刺激素、黄体生成素、瘦素等；纤维蛋白，例如丝或细胞外基质蛋白(例如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白、多能蛋白聚糖、骨唾液蛋白)；酶，例如金属蛋白酶(例如，基质金属蛋白酶(mmp))或其他类型的蛋白酶(例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬酰胺肽裂解酶)、淀粉酶、纤维素酶、过氧化氢酶、果胶酶等；细菌、酵母或原生动物蛋白；植物蛋白；或病毒蛋白，如衣壳蛋白或包膜蛋白。作为蛋白的分泌的被分析物可以是抗体、抗体片段、酶(包括但不限于蛋白水解酶)、工程化(通常为细胞内蛋白)蛋白，例如白蛋白，和/或结构蛋白，包括但不限于蚕丝或蜘蛛丝)。该列举不是限制性的，并且可以通过该方法评估任何可以被工程化以被分泌的蛋白。分泌的被分析物可以是抗体-药物缀合物。可以具有蛋白、糖、核酸、分子量小于3kd的有机分子和/或病毒的组合的分泌的被分析物的非限制性实例可以包括蛋白聚糖或糖蛋白。[0367]报道分子及其特性。报道分子可以包括被设计用于与分泌的被分析物结合的结合组分，并且还可以包括可检测的标记物。结合组分可以是被配置成与分泌的被分析物结合的任何合适的结合配偶体。结合组分可以是蛋白、肽、核酸或分子量小于3kd的小有机分子。例如，结合组分可以是与另一个核酸序列特异性结合的核酸序列或与蛋白特异性结合的肽(例如识别特定抗体的表位)。在一些实施方案中，结合组分可以与生物微物体的分泌的被分析物家族非特异性结合。例如，结合组分可以是与igg结构域特异性结合的肽或与核酸序列家族中存在的结构域结合的核酸。在一些实施方案中，报道分子可以是多价的，其包含多于一个的结合组分以与分泌的被分析物的多于一个的拷贝结合或与分泌的被分析物的家族的多于一个成员结合。为了便于讨论，如本文所用的术语分泌的被分析物可以指特定的分泌的被分析物分子或分泌的被分析物家族。因此，rmsa复合物的化学计量可以变化。例如，与分泌的被分析物的一个拷贝结合的报道分子可以具有1:1化学计量的rmsa复合物。或者，rmsa复合物可以具有2:1、3:1、4:1、2:2、4:2或其他化学计量的报道分子:分泌的被分析物。报道分子可以具有任何合适的分子量，条件是由报道分子:被分析物复合物的扩散特征所定义的表观“大小”(其取决于分子量)比报道分子本身足够“大”，以观察未结合的报道分子和rmsa复合物之间的差异性扩散。报道分子的分子量可以是分泌的被分析物的分子量的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或相同。在一些实施方案中，报道分子的分子量小于分泌的被分析物的分子量的约50％、40％、30％、20％、10％。rmsa复合物的分子量可以比报道分子的分子量高至少2x、4x、10x、20x、30x、40x、50x或其间的任何数。rmsa复合物的分子量可以比未结合的报道分子的分子量高2倍、4倍或50倍。[0368]用于一类分泌的被分析物:抗体的报道分子。适于与抗体结合的报道分子包括被配置成与igg的区域结合的蛋白、肽和适体。表1中示出了适于在报道分子内使用以检测抗体的结合组分的非限制性列表。[0369]表1：化合物作为用于检测抗体的报道分子的结合组分。[0370]id.no:10)的结构。[0375]cpd7具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-xaa7-xaa8-xaa9-xaa10-xaa11-leu-val-trp-cys-xaa16-xaa17-xaa18-xaa19-xaa20的结构，(seqid.no:1)，其中：xaa1是任何氨基酸或不存在；xaa2是任何氨基酸或不存在；xaa3是任何氨基酸或不存在；xaa4是任何氨基酸或不存在；xaa5是cys或ser；xaa6是任何氨基酸；xaa7是任何氨基酸；xaa8是任何氨基酸；xaa9是任何氨基酸；xaa10是任何氨基酸；xaa11是任何氨基酸；xaa16是任何氨基酸或不存在；xaa17是任何氨基酸或不存在；xaa18是任何氨基酸或不存在；xaa19是任何氨基酸或不存在；且xaa20是任何氨基酸或不存在。[0376]cpd8具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-xaa7-xaa8-xaa9-gly-glu-leu-val-trp-cys-xaa16-xaa17-xaa18-xaa19-xaa20的结构，(seqid.no:2)，其中：xaa1是任何氨基酸或不存在；xaa2是任何氨基酸或不存在；xaa3是任何氨基酸或不存在；xaa4是任何氨基酸或不存在；xaa5是cys或ser；xaa6是任何氨基酸；xaa7是任何氨基酸；xaa8是任何氨基酸；xaa9是任何氨基酸；xaa16是任何氨基酸或不存在；xaa17是任何氨基酸或不存在；xaa18是任何氨基酸或不存在；xaa19是任何氨基酸或不存在；且xaa20是任何氨基酸或不存在。[0377]cpd9具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-xaa7-xaa8-xaa9-gly-glu-leu-val-trp-cys-xaa16-xaa17-xaa18-xaa19-xaa20的结构，(seqid.no:3)，其中：xaa1是任何氨基酸或不存在；xaa2是任何氨基酸或不存在；xaa3是任何氨基酸或不存在；xaa4是任何氨基酸或不存在；xaa5是cys或ser；xaa6是ala、ser或thr；xaa7是trp或tyr；xaa8是his或trp；xaa9是leu或met；xaa16是任何氨基酸或不存在；xaa17是任何氨基酸或不存在；xaa18是任何氨基酸或不存在；xaa19是任何氨基酸或不存在；且xaa20是任何氨基酸或不存在。[0378]cpd10具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-xaa7-xaa8-xaa9-gly-glu-leu-val-trp-cys-xaa16-xaa17-xaa18-xaa19-xaa20的结构，(seqid.no:4)，其中：xaa1是任何氨基酸或不存在；xaa2是任何氨基酸或不存在；xaa3是任何氨基酸或不存在；xaa4是ser、arg或asp；xaa5是cys或ser；xaa6是ala、ser或thr；xaa7是trp或tyr；xaa8是his或trp；xaa9是leu或met；xaa16是glu、ser、thr或val；xaa17是任何氨基酸或不存在；xaa18是任何氨基酸或不存在；xaa19是任何氨基酸或不存在；且xaa20是任何氨基酸或不存在。[0379]cpd11具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-xaa7-xaa8-leu-val-trp-cys-xaa13的结构，(seqid.no:5)，其中：xaa1是任何氨基酸或不存在；xaa2是cys或ser；xaa3是任何氨基酸；xaa4是任何氨基酸；xaa5是任何氨基酸；xaa6是任何氨基酸；xaa7是任何氨基酸；xaa8是任何氨基酸；且xaa13是任何氨基酸或不存在。[0380]cpd12具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-gly-glu-leu-val-trp-cys-xaa13的结构，(seqid.no:6)，其中：xaa1是任何氨基酸或不存在；xaa2是cys或ser；xaa3是任何氨基酸；xaa4是任何氨基酸；xaa5是任何氨基酸；xaa6是任何氨基酸；且xaa13是任何氨基酸或不存在。[0381]cpd13具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-gly-glu-leu-val-trp-cys-xaa13的结构，(seqid.no:7)，其中：xaa1是任何氨基酸或不存在；xaa2是cys或ser；xaa3是ala、ser或thr；xaa4是trp或tyr；xaa5是his或trp；xaa6是leu或met；且xaa13是任何氨基酸或不存在。[0382]cpd14具有xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-gly-glu-leu-val-trp-cys-xaa13的结构，(seqid.no:8)，其中：xaa1是ser、arg或asp；xaa2是cys或ser；xaa3是ala、ser或thr；xaa4是trp或tyr；xaa5是his或trp；xaa6是leu或met；且xaa13是glu、ser、thr或val。[0383]结合组分不限于对igg具有高亲合力的物质(例如，对于表1的cpd1和cpd2已知的纳摩尔浓度)。在一些实施方案中，具有大于约100毫摩尔浓度或1微摩尔浓度的亲合力的结合组分可以成功地用于该基于扩散的测定中以检测抗体。[0384]对于其他类型的分泌的被分析物，可以使用不同类型的报道分子的结合组分。例如，可以使用不可逆蛋白酶抑制剂来检测蛋白水解酶，例如用于丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶的氟甲基酮抑制剂。可以使用工程化的被分析物的适体，如糖类或大环内酯类抗生素。可以使用抗体或其片段来检测白蛋白、结构蛋白或大环内酯类抗生素。如本领域已知的，可以使用与分泌的被分析物的任何合适的结合组分。[0385]报道分子:纯化标签。目前的细胞系发育测定可依赖于抗体中普遍存在的fc区。然而，许多治疗性蛋白和为合成生物学应用而产生的蛋白缺乏该部分，因此可能与某些细胞系发育测定不兼容。这些非抗体蛋白中的许多已经包含或可以被设计为包含遗传编码的残基，这些残基引入用于纯化的短氨基酸“标签”。[0386]根据各种实施方案，可以将当前的芯片上(on-chip)滴度测定改进为使用对纯化标签(即用于纯化的短氨基酸“标签”)特异的荧光标记的小分子。这种改进允许解决目前许多细胞系发育测定无法触及的许多蛋白类型。[0387]在一个实例中，将六组氨酸(his6)标签编码到感兴趣蛋白的n端或c端；该标签随后用于通过使用ni-nta(nα,nα-双(羧甲基)-l-赖氨酸，镍(ii)复合物)柱纯化his6标记的蛋白，该柱以高亲和力特异性结合六组氨酸。这种化学相互作用可用于用荧光标记的物质(例如，来自例如sigma的ni-ntaatto缀合物)标记his6标签。业内公知，ni-ntaatto缀合物可以提供对his标记的融合蛋白的特异性和高灵敏度检测。与atto染料缀合的ni-ntaatto复合物对多聚组氨酸标签具有特异性，并且可以以最小的交叉反应进行。具体地，每个ni-nta部分与一对组氨酸侧链结合，并且每个ni-nta可以用荧光团标记。此外，两个或三个ni-nta基团可以交联在一起以增加结合亲和力。[0388]低分子量分泌的报道复合物。如上所述，测量小分子的产生(低分子量分泌)可以例如通过根据各种实施方案反转细胞系发育测定来完成，其中较亮的荧光室将指示不是最高产生的细胞系，而是较弱的产生系。为了提供这个，已知与小分子靶结合的分子(例如，大分子量蛋白或蛋白复合物，称为“锚”)可以首先与感兴趣靶的荧光版本在芯片外结合。这种荧光报道分子复合物(锚 荧光靶)将在整个芯片中，包括在含有可能分泌靶的非荧光版本的细胞的室中平衡。在这些未标记靶的存在下，结合动力学将驱动标记靶与室内浓度远远更高的未标记靶的交换。在冲洗干净通道一段时间后，不被锚结合的荧光靶将迅速从室扩散。因此，当读取该冲洗后的荧光水平时，较暗的观察室将等同于那些分泌更多小分子量靶的室。[0389]可检测的标记物。报道分子还可包括可见的、发光的、磷光的或荧光的可检测的标记物。在一些实施方案中，可检测的标记物可以是荧光标记物。可以使用任何合适的荧光标记物，包括但不限于荧光素、罗丹明、花青、菲或任何其他类别的荧光染料标记物。有用的荧光染料标记物的一些实例包括荧光素(可用作用于标记报道分子的结合组分的硫代异氰酸酯活性物质)、alexafluor594((af594，thermofisherscientific，目录号a20004(nhs酯))mw819.8，ex/em590/617nm)或hilytefluortm555(anaspecinc.，目录号as-81250)mw869，ex/em550/566nm(cy3滤光器)。在一些实施方案中，报道分子，例如适体或捕捉寡核苷酸，可以包括fret标记的寡核苷酸，其可以包括但不限于分子信标、双杂交探针、scorpion或eclipse探针。fret标记的寡核苷酸探针或探针对可以包括荧光标记物，其在发生杂交事件之前不发荧光。在一些实施方案中，可检测的标记物直接或间接地共价连接至报道分子的结合组分。在一些其他实施方案中，捕捉寡核苷酸可以是报道分子的结合组分，并且内源或外源荧光染料可以是可检测的标记物，使得报道分子的可检测的标记物可能是不可检测的，直到捕捉寡核苷酸与被分析物(例如，嵌入染料)结合。在一些实施方案中，报道分子的可检测的标记物直到rmsa复合物形成后才可检测到，因为可检测的信号转移到结合前不存在的新波长。在一些实施方案中，例如共价连接到报道分子的结合组分的嵌入染料。在其他实施方案中，可检测的标记物可以是同位素。[0390]在其他实施方案中，可检测的标记物和结合组分是单个部分，例如提供可检测信号的蛋白或核酸(例如自身可检测的蛋白，例如绿色荧光蛋白(gfp)，或核糖核酸适体，例如“spinach”，它是与gfp等同的rna)。spinach含有3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮(dfhbi)作为荧光可检测的标记物。[0391]扩散模拟。本文描述的方法利用与分泌的被分析物从室的分离区域到流动区域(例如，微流体通道)的差异扩散相关的模型和观察。许多软件程序可以用于模拟生物微物体的分泌的被分析物的行为，包括但不限于comsol、matlab和/或各种数字模拟和计算机辅助设计工具。[0392]图6示出了一种类型的室的模型，其具有一个生物细胞(602)，该细胞被置于室624的底部，在分离区域640内，在远离室624向通道122的开口的点处。扩散线610示出了细胞602的分泌的被分析物从分离区域640通过连接区域636扩散到通道122的轨迹。可以看出，当扩散物质通过连接区域时，扩散线集中并线性地流动到通道122。扩散速率由分泌的被分析物的扩散系数来定义，并可以被模拟如下。[0393]特定的分泌的被分析物的扩散系数d被定义为：[0394]d＝(1/f)ktꢀꢀ(公式1)[0395]其中f是摩擦系数，k是玻尔兹曼常数，t是绝对温度。摩擦系数f取决于分泌的被分析物在其中扩散的溶剂的粘度(η)以及分泌的被分析物的大小和形状。具有球形球的分泌的被分析物具有最小化的摩擦系数，但是非对称的形状，例如具有确定的结构约束的抗体或其他蛋白，将导致更大的f。另外，如果分泌的被分析物具有与溶剂的相互作用，例如氢键或者与分泌的被分析物缔合的水合水，则摩擦系数也会增加。一些通用的扩散系数如表2所示。[0396]表2：示例性扩散系数。[0397]通用物质ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ扩散系数[0398]水中的小分子(《1kda)ꢀꢀꢀꢀ1-1.5x10-5cm2s-1[0399]小蛋白(《20kda)ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ10-6cm2s-1[0400]分泌的被分析物的扩散可以用以下公式表示：[0401]《x2》＝qidt(公式2)[0402]其中《x2》是均方位移，x是在时间t内从所选择的行程起始点的平均距离。qi的值取决于扩散是否是在1、2或3维下评估的。[0403]利用这些公式，可以模拟报道分子扩散进出具有确定构型的室的时间和rmsa复合物的时间，并且对于分子量为约150kda范围的抗体分泌的被分析物，在图7a和7b中显示了这些时间。在图7b中，曲线712模拟了像分子量为约2.5kda的cpd3这样的小肽的行为，其中小肽被计算为能够在25-30分钟内从通道扩散进入室并在其内平衡，所述室的配置类似于室424、524、624等(分别参见图4a-c、5和6)。相反，曲线714模拟了大得多的分子量为约45kda的cpd1的行为。该较大的分子提供了更多与溶剂相互作用的机会，并且在45-50分钟之间达不到完全平衡。[0404]在图7b中，示出了四种不同物质在从被配置为类似于424、624的室中扩散出来方面的行为。在该图中，曲线716示出了针对小肽cpd3计算的从被配置为类似于室424、524、624等的室中扩散出来的速率。将小肽cpd3基本上从室中消除约25分钟。相反，当cpd3与分泌的被分析物igg(ms150kda)结合时，曲线722(三角形)显示了计算的含有cpd3的rmsa复合物的扩散行为，其中在60分钟后保留少量rmsa复合物。曲线718(菱形)显示了计算的cpd1(蛋白a，45kda的蛋白)的扩散行为，其因此需要超过50分钟才能基本上完全扩散。当该蛋白与分泌的抗体(mw150kda)复合时，曲线724(虚线片段)显示出与cpd3:igg复合物相似的缓慢扩散速率，并且在60分钟后仍显示复合物保留。[0405]图8a显示了对于报道分子的两种不同的结合组分中的每一种计算的报道分子和rmsa复合物之间的差异。曲线826显示了针对cpd3:cpd3/igg对在室内的最大浓度差异的测定时间优化，以观察由rmsa复合物产生的最大信号和由未结合的报道分子引起的最小信号，这似乎是在微流体通道中恢复的介质流动约15分钟，其将任何扩散的物质从微流体装置中输出。曲线828显示了cpd1的差异曲线，显示了在室内未结合的cdp-1和含有cpd1的rmsa复合物之间的浓度差异，并且显示了最大化的差异在稍后的时间点(在25分钟或更长时间后的某个时间)出现。图8b显示了未结合的cpd1的扩散入(上图)和扩散出(下图)的实验时间，显示了与计算值的合理相关性。这些组模拟和执行实验表明，有可能找到优化的时间点，用于观察基本上来自报道分子:分泌的被分析物复合物的可检测信号，以评估特定室内被分析物的分泌水平。[0406]沿扩散轴的区域的选择。图9a-b和10a-b显示了用于确定一个区域的模拟实验，从该区域中，从测定图像中提取量化测量值(相对或绝对)。在图9a-b中，对扩散流动和来自rmsa复合物的所得荧光信号强度进行模拟，以考虑生物细胞902、904、906在微流体装置900的室924(其类似于室424、524、624)内的位置的影响。对于细胞902，使用距离室的底部(0微米)约25微米的位置对该效果进行模拟，该位置远离室924到通道122的开口；在与室924的底部约100微米的距离处对细胞904进行模拟；且在与室924的底部约180微米的距离处对细胞906进行模拟(参见图9a和图9b的水平轴)。为了模拟的简化，每个细胞被模拟为位于沿着线952所示的朝向室的开口的扩散轨迹的中心轴。这些位置中的每一个位于室的分离区域940内，并且远离室的连接区域936，因此确保从分离区域940内的细胞902、904、906检测到的信号强度不受来自通道122中的流动242的流动效应的影响。图9a的y轴表示报道分子(或等效的rmsa复合物，因为该实验仅依赖于检测到的荧光强度)的归一化浓度。如图9a所示，荧光信号的强度(模拟包括以下约束：902、904、906均以相同的速率产生分泌的被分析物)对于细胞902是最高的，因为荧光标记的复合物比904、906以更单向的方式扩散，这是由于其位置接近室924的底部。细胞904、906具有更大的使标记的rmsa复合物在所有方向上扩散的能力。该模型确定的是可以识别一个区域，其中信号强度对由于被标记物质的浓度(例如，rmsa复合物)的变化而引起的荧光信号强度的变化最敏感，并且对细胞902、904、906位于沿着室924和通道122之间的扩散轴的确切位置(即区域944)最不敏感，如图9a和9b所示。细胞位置不敏感区域944是用于评估室924内的生物微物体的分泌的被分析物的相对或绝对量的受关注区域(aoi)的至少一部分。在一些实施方案中，aoi可以包括室924和/或通道122的附加部分。[0407]针对大细胞群对室进行优化。图10a和10b示出了用于不同配置的室1024的如图9a和9b所示的类似构造的模拟实验。显示了生物细胞1002、1004、1006在微流体装置1000的室1024(类似于室224、226、228)内的位置的影响。对于细胞1002，使用距室底部(0微米)约25微米的位置对该效果进行模拟，该位置远离室1024到通道122的开口；在距室1024的底部约100微米的距离处对细胞1004进行模拟；且在距室1024的底部约180微米的距离处对细胞1006进行模拟(参见图10a和图10b的水平轴)。为了模拟的简化，每个细胞被模拟为位于沿着线1052所示的朝向室的开口的扩散轨迹的中心轴。这些位置中的每一个位于室的分离区域1040内，并且远离室的连接区域1036，因此确保从分离区域1040内的细胞1002、1004、1006检测到的信号强度不受来自通道122中的流动242的流动效应的影响。图10a的y轴表示报道分子(或等效的rmsa复合物，因为该实验仅依赖于检测到的荧光强度)的归一化浓度，并且所示浓度的讨论如上文针对图9a所述。该模型确定的是可以识别一个区域，其中信号强度对由于被标记物质的浓度(例如，rmsa复合物)的变化而引起的荧光信号强度的变化最敏感，并且对细胞1002、1004、1006位于沿着室1024和通道122之间的扩散轴的确切位置(即区域1044)最不敏感，如图10a和10b所示。细胞位置不敏感区域1044是用于评估室1024内的生物微物体的分泌的被分析物的相对或绝对量的aoi的至少一部分。在一些实施方案中，aoi可以包括室1024和/或通道122的附加部分，其位于沿着室1024和通道之间的扩散轴。[0408]在一些实施方案中，可以改变室的几何形状以提供分泌的被分析物的最佳扩散谱。图11a示出了微流体装置1100的一部分，其包括通道122和室1124、1126，所述室1124、1126被设计成提供优化的扩散谱。具体地，室1124、1126具有可以容纳大量生物微物体1102的分离区域，这可以用于提供更大的信号强度以用于评估细胞1102的分泌的被分析物的量(相对或绝对)。[0409]在一些实施方案中，室1124的分离区域1140可以容纳从0.1到100nl的体积。在特定实施方案中，如图11b所示，分离区域1140可以容纳6nl的体积。室1124、1126可以容纳多达100、200、300、400或500个微物体。在一些实施方案中，室可以容纳最多300-400个微物体。[0410]室1124、1126各自具有连接区域1136，连接区域1136被配置为将分离区域1140中的生物微物体1102与连接区域1136分离，从而产生足够的距离以使分泌的被分析物扩散远离其来源(例如，分泌被分析物的生物微物体1102之一)。该分离减少了来自rmsa复合物的局部信号的干扰或重叠，所述rmsa复合体仍然在生物微物体1102处或其上缔合(例如，不自由地扩散)，其扩散轨迹沿着预期的扩散轨迹1130的线。通过消除这种重叠，从aoi的至少一部分或整个aoi产生的浓度值将表示来自结合的报道分子在其扩散时的信号。在一些实施方案中，通过连接区域1136相对于分离区域1140的收缩而将连接区域1136与分离区域1140分离。在一些实施方案中，连接区域1136的宽度为10-30微米，长度为40-200微米。在特定实施方案中，连接区域1136的宽度为20微米，长度为100至200微米。[0411]图11b描绘了生物微物体1102的分泌的被分析物从室1124内通过连接区域1136并且向外至通道122的通量线1120和浓度梯度线110。连接区域1136的部分可以被选择为aoi的至少一部分，并且可以是对细胞位置不敏感并且对在测定图像中观察到的强度变化敏感的区域的一部分。[0412]评估受关注区域(aoi)。图12a显示了aoi的示意图，从中提取数据用于确定来自生物微物体的分泌的被分析物的相对或绝对量。选择aoi1250以包括：分离区域1240中的区域、(微流体装置1200中的室1224的)连接区域1236中的区域；和通道122的一部分，所有这些都沿着从室1224到通道122的扩散轴对齐。在该实施方案中，在微流体通道122中存在流动242，从而减少了包含在aoi内的通道部分内的任何可检测信号。选择aoi在室内终止的点，以防止与生物物体1202重叠，该生物物体1202分泌被分析物并从其发出可检测信号。如图12a所示，扩散线1210指向连接区域1236，并在进入连接区域1236时与扩散轴对齐。还示出了浓度梯度线1220。[0413]图12b是显示对室1224的测定图像的照片，其具有“327”的标识号1260，这指示其在微流体装置1200内的位置。识别号有助于关联亮视场和荧光图像位置，还有助于用户从选择的室中选择、操作和导出细胞。图12b的室1224具有存在于分离区域(未标出)内的一个生物微物体1202。测定图像清楚地显示了室内大量的荧光信号，其从生物微物体1202发射。显示了aoi1250，其被照相地施加，并沿着扩散轴对齐并沿着扩散轨迹1252居中。aoi是20像素宽，其根据连接区域126的宽度(在图12b中未标出)来选择，并且被分成20个子区域。aoi可以具有到每个子区域的其他像素大小，并且子区域的数目可以从大约1到大约50变化。aoi的子区域1254是aoi的所有子区域中位于距离通道122最远的子区域，但是被选择为不与生物微物体1202重叠。aoi的第二端处的子区域是子区域1258，其位于通道122内。重要的是，子区域1256的组是图9a-b和10a-b的细胞位置不敏感区域944、1044，从中检测到的荧光用于评估室内的生物微物体的分泌的被分析物的相对或绝对量。[0414]图12c示出了在aoi中检测到的荧光的图解表示，其中水平轴上的值表示子区域1(对应于图12b的子区域1254)，其是位于aoi至生物微物体1202的最近端的子区域；且子区域20对应于图12b的子区域1258，其在aoi在通道122中的最近端。在aoi中检测到的荧光的量与分泌的被分析物的量成比例。可以使用各种数学运算来提取关于分泌的被分析物的相对或绝对量的信息，并在下面的部分中详细讨论。[0415]测定图像的归一化。在可以处理测定图像以评估分泌的被分析物的相对或绝对量之前，可以对原始测定图像进行归一化。图13a示出了原始测定图像，其显示诸如光源、光调制子系统(例如dmd)、图像捕捉装置(例如相机)的系统组件的方差(variance)和非线性之类的误差。[0416]用于在流动条件下进行的测定的方法a。在一个实施方案中，可以如下面的公式通过从原始测定图像中的每个像素中减去暗参比图像和信号参比图像校正来对原始测定图像进行归一化：[0417][0418]可以通过在使任何介质流动到装置中之前对微流体装置进行成像来获得暗参比图像。可以通过在每个像素处减去暗参比值来校正自发荧光误差和其他系统误差。信号参比图像可以校正衰减(rolloff)、光漂白误差或相机误差，并且通过使报道分子或仅报道分子流过整个微流体装置以达到报道分子或荧光标记物的平衡浓度而获得。在提取荧光数据用于量化目的之前，可以以这种方式校正原始测定图像中的每个像素。归一化的测定图像显示在图13b中。[0419]用于在非流动条件下进行的测定的一些实施方案的方法b。作为归一化的第一步，如上文所述，从存在结合和未结合的报道分子的微流体装置的图像中减去暗参比图像，以产生“减去暗参比的图像”。[0420]作为第二步，从减去自发荧光的图像中移除或“掩蔽”图13a的原始测定图像中不存在结合和未结合的报道分子的部分(即，限定微流体装置中的室和通道的壁)，以产生“掩蔽的减去暗参比的图像”。如本领域技术人员所理解的，该步骤也可以在减去自发荧光之前进行。[0421]作为产生图13a的归一化的图像的第三步，将掩蔽的减去自发荧光的图像中的每个像素的强度值除以基于掩蔽的减去自发荧光的图像中的所有像素计算的全局平均强度。通过将每个像素的强度值除以全局平均强度，对每个像素生成包含增益校正因子的图像或类似数据结构(例如，矩阵)(“增益校正图像”)。产生增益校正图像的其他方法是本领域技术人员公知的。[0422]作为产生图13a中描绘的归一化的图像的第四步，对增益校正图像进行平滑算法以减少随机噪声。在该方法的一些实施方案中可以不采用该步骤。具体地，对增益校正图像进行盒滤波器平滑算法，该算法使用9像素乘9像素盒滤波器，其在为每个像素生成局部平均值时说明图像的掩蔽部分。如本领域技术人员可以理解的，可以使用其他平滑算法，例如均值滤波、高斯滤波、梯度加权滤波、序列统计滤波、鲁棒平滑滤波、crimmins噪声消除滤波、边缘保持滤波和自适应中值滤波。[0423]作为产生图13b中描绘的归一化的图像的第五步骤，可以将平滑后的增益校正图像乘以减去自发荧光的图像以产生归一化的图像。[0424]这些方法可以以相同或不同的顺序组合任何前述步骤和方法。[0425]用于在非流动条件下进行的测定的一些实施方案的方法c。可以使用另一种使图像归一化的方法，这依赖于通道内未结合的报道分子的基本均匀的浓度，因为其比结合的rmsa复合物的扩散速率更高。可以使用通道的亮度来归一化图像以校正上述误差。[0426]因此，在另一实施方案中，可以使用靠近室的通道中的亮度来获得图13b的归一化图像，以校正微流体装置的区域视图上的亮度量的任何变化。这种归一化方法依赖于以下事实：预期通道中不具有任何存在的被分析物(或任何rmsa复合物)，因此可以使用不具有存在的被分析物的微流体装置的任何区域来执行该方法。[0427]为了基于通道强度进行归一化，作为第一步，针对每个室识别通道r中预期不具有任何存在的被分析物的区域。在一些实施方案中，该区域r可以是对应于室上方的通道区域的预定义的区域r。在其他实施方案中，可以基于其他信息识别每个室的区域r或者基于图像计算每个室的区域r。[0428]对于通道r的每个区域，基于该区域内的像素计算亮度值br。在计算亮度值之前，可以如上所述减去、掩蔽或以其他方式处理用于计算亮度值的图像。在一些实施方案中，br是区域r内的像素的平均亮度值。[0429]在计算每个区域r的平均亮度值br之后，可以将坞和通道的图像划分为一系列区域a，其中每个区域a包含相应的区域r。可以计算该区域，使得区域r位于区域a的中心。在特定的实施方案中，可以通过生成每个区域r的矩心的voronoi图或delauney三角测量来计算区域a。在其他实施方案中，每个区域r不需要在其相应的区域a中居中，并且可以基于分割微流体装置的预定义的区域来计算。对于每个区域a，针对与区域a相关联的区域r，基于针对最亮区域计算的最大亮度值brmax除以亮度值br来计算增益校正因子。增益校正因子可以用于生成增益校正图像，该增益校正图像可以与另一个图像(例如减去自发荧光的图像)相乘以产生归一化的图像。在用于归一化之前，还可以如上文所述地使增益校正因子图像平滑。[0430]测定信号的量化。在一些实施方案中，rmsa的扩散谱可以用于量化室内存在的rmsa复合物的量。扩散谱提供了一系列值(“浓度值”)，其表示rmsa复合物从其源向通道扩散时的浓度。[0431]在识别aoi之后，可以应用其他变换。例如，可以通过丢弃离群值和/或异常像素、其他形式的全局/局部归一化、空间转换以及变换像素的空间(例如，从多维空间到二维空间，或相反)来处理每行中的像素。[0432]根据实施方案，可以以不同的方式使用强度值来计算浓度值。在一些实施方案中，可以在固定点处对aoi进行采样以生成与固定点处的强度值相对应的一组浓度值。在一些实施方案中，可以将aoi分段成一系列区段，并且可以计算每个区段的中值或平均强度。基于实施方案和所需的分辨率，计算的浓度值的数目可以低至1并且高至表示扩散轨迹的线中的像素的数目。[0433]取决于实施方案，浓度值可以以不同方式组合，以量化来自存在的结合的报道分子的信号的量(以及因此分泌的被分析物的量)。在一些实施方案中，可以将浓度值绘图以评估浓度值是否表现出与扩散谱一致的特征。取决于实施方案，可以使用多种算法来将线拟合到浓度值并计算线的特性，例如与线相关的斜率和误差。合适的线拟合算法包括：最小二乘法、多项式拟合、曲线拟合和erfc拟合。其他算法是本领域技术人员已知的。下面更全面地描述转化荧光强度值以获得浓度值的方法。[0434]图14a是标识号为“1107”的一个室1424的测定图像(照片)，并且其中示出了预期的扩散轨迹线1452。将aoi1450投影到测定图像上，并且在该实例中，具有约12个像素的宽度，并且沿着由线限定的轴将其分段成20个相等的区段(区段未示出)。计算20个相等区段中的每一个的中值强度，然后将其绘制为图14b的图中的浓度值。在图的横轴上，区段号1-20根据它们与源(即分泌分泌的被分析物的细胞)的距离编号，其中具有低数字的区段号表示最接近于最远离通道的室区域中的细胞的aoi的区段。[0435]图14b描绘了表示一组室的浓度值的一系列曲线，其是根据前一段中讨论的方法和下面的其他部分产生的。为了产生图14b中所示的一系列曲线，不基于室中的细胞数目对每个室生成的浓度值进行归一化。然而，在另一实施方案中，可以基于每个室中的细胞数目对浓度值和所得曲线进行归一化。如图14b所示，每个室的曲线(浓度值)的斜率可以用于评估每个室中存在的分泌的被分析物的相对量。换句话说，斜率可以用作得分，使得室可以相对于彼此分级和排序，并且在本文的一些实施方案中，“斜率”和“得分”可以互换使用。在一些情况下，得分可以被称为分泌得分。更具体地，在室中存在的生物微物体(例如细胞)产生分泌的被分析物的情况下，斜率可以用于评估每个室中的细胞产生分泌的被分析物的相对能力(例如，细胞分泌抗体的相对能力)。如下文所讨论的，可以使用不同的方法来计算分泌的被分析物的相对或绝对量，包括对aoi的子区域中的所有点进行求和，所述子区域对室中细胞的位置不敏感并且对观察到的荧光强度的变化最敏感(例如，图12b的区域1256、图10a-b的区域1044和图9a-b的区域944)。[0436]另外，可以评估曲线的形状以评估每个室的浓度值是否与预期的参数一致或指示系统误差。例如，图14b中标记为“坞1497”的曲线的形状不对应于针对其他室观察到的曲线的形状，而标记为“坞1107”的曲线的形状确实对应于预期的扩散谱。如图14a所示，坞1107具有从其室到通道的报道分子的可见梯度，这导致其曲线对应于预期的扩散谱。如图14c所示，具有标识号坞1497的室1426具有预期的扩散轨迹线1452和aoi1450。然而，室1426靠近含有气泡的通道，其中气泡的弯月面1401在图像中显示为白色椭圆。气泡的存在导致图14b中描绘的坞1497的异常曲线。在各种实施方案中，可以应用线性回归的分段的aoi的区域可以被选择为区段(子区域)9-13，如上文所讨论的，其包含连接区域的部分并且已经被识别为对荧光强度变化最敏感并且对室内的生物微物体的位置最不敏感。[0437]图15显示了从微流体装置内的多个室获得的多条曲线的叠加，这些曲线表示通过本文所述的任何方法得到的强度值(以及因此的浓度值)。相对于图的垂直轴绘制的每条曲线中的每个点的强度值已经被归一化以便于重叠。沿水平轴的值以“y”的值等于零开始，表示每个aoi的y维度中的第一个像素(并且类似于图9a-b、10a-b、12a-b以及14a和c中所示的aoi，其在物理上位于微流体装置的通道内并且位于室的外部)。沿着水平轴被标记为“200”的点对应于多个室的每个aoi中的最后一个像素，其是最接近于分泌被分析物的细胞的aoi的边界，因此是从rmsa复合物发出可检测信号的来源。如图所示，从对室内的细胞位置最不敏感并且对荧光强度的变化最敏感的aoi的部分1544获得的浓度值被显示在与约90到约130之间的y值相关的曲线部分中。可以看出，在该区域中施加线性形状并提取其斜率的数学运算紧密地表示数据的状态。[0438]在包含数千个克隆群(每个克隆群衍生自放置在单独的室中的单个细胞)的纳米流体装置上进行测定，可以提供每个克隆群的量化。如图16a和b所示，增强了发现稀有高产克隆的能力。如果假设通过泊松统计很好地描述了来自细胞的随机分泌池的滴度分布，那么滴度分布应当符合伽玛分布。在图16a中，叠加在滴度的条形图分布上的曲线(其从得分获得并针对多个室中的每一个中存在的细胞数目进行归一化，并以任意单位(a.u.)表示)显示出良好的一致性。绝大多数克隆群以小于50到小于100a.u.表达被分析物，并且非常少的单个滴度超出了250a.u.及以上的高范围。现在将相对比生产率相对于生长速率(沿水平轴)绘图，显示相同的数据。叠加在图上的曲线显示恒定滴度的线，其再次显示大多数克隆(不论其是快速或缓慢生长的克隆)以低于100a.u.表达被分析物，并且不是寻求用于细胞系发育的期望的高产克隆。仅在1670、1680和1690区域内发现的少数克隆是稀有的高产者。然而，这些克隆不是由最初接种的单个细胞产生的最快生产的克隆。如果将这些细胞与其他细胞混合作为较大生长环境(例如孔板或摇瓶)的一部分，则这些稀有的高产克隆很可能会被较快生长的生产力较低的克隆的生长所超过。如果试图选择随机单细胞组进行扩增，则试图识别这些克隆会需要大量的采样工作，需要大量的资源输入来增加到有可能看到这些细胞所需的细胞数目。在此处提供的系统中，可以获得所有克隆群的滴度(或得分)，并且知晓生产性克隆的物理位置(参见下文的图21)。此外，可以仅选择所选择的克隆并将其物理移动，以进一步扩增/亚克隆；可以单独地进行选择和移动以防止被其他细胞群污染。筛选由最初接种的细胞产生的所有克隆的机会提供了极大改进的用于筛选和选择分泌期望的被分析物的细胞的方法。[0439]根据各种实施方案，光漂白后荧光恢复(frap)可以是进行所分泌分子的芯片上浓度测量(即分泌速率)的另一种技术。特别地，细胞分泌的未标记分子的浓度和/或结合亲和力应可以通过监测光漂白后的荧光恢复来检测。该技术可在本文讨论的各种细胞系发育测定(cld测定)中的不同点实施，例如，在平衡步骤期间，通常进行该平衡步骤以在芯片上产生均匀的试剂浓度。frap可在该步骤中进行，其中每个室中有游离试剂群、分泌分子群和与感兴趣的分泌分子结合的试剂的群。通过光漂白室的区域，例如50-100μm的盒，或甚至颈部本身，可以观察到游离试剂和结合的群重新扩散到该区域中。游离试剂由于扩散速率快而通常恢复快，而结合的复合物由于扩散速率较慢而恢复慢。然后，快速恢复过程幅度(图31中的h1)与缓慢恢复过程幅度(图31的h2)的比率可以形成浓度(分泌速率)的量度，其中恢复时间常数分别由试剂和结合的复合物的分子量确定。图31的a部分代表低分泌分子，而图31的b部分代表高分泌分子。此外，下文更详细讨论的光电定位(optoelectropositioning，oep)技术可用于获得更多的光功率以减少漂白时间，允许使用较不稳定的染料，并允许在监控步骤中以较低的投影仪功率成像。[0440]因此，根据各种实施方案，提供了一种评估生物微物体或由其生成的生物微物体的群的被分析物分泌水平的方法。所述方法可以包括将生物微物体引入微流体装置的室，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室包含第一流体介质。所述方法还可以包括允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群将被分析物分泌到室内的第一流体介质中，并在第一时间段内将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质包含多个报道分子。该方法还可以包括允许多个报道分子的一部分扩散到室中，并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物，并检测位于微流体装置内受关注区域内的报道分子，其中受关注区域包括室的至少一部分。报道分子(或每个报道分子)可以包含配置为与分泌的被分析物结合的结合组分和可检测的标记物。[0441]根据各种实施方案，提供了一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统进行一种使用frap技术确定由生物微物体或由其生成的生物微物体的群产生的被分析物的量的方法。对此，图25的框图提供了一种实例计算机系统，该框图示出了计算机系统3100，在此计算机系统上可以实现本教导的实施方案。下文将提供计算机系统3100的详细信息。[0442]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，可检测的标记物可以包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。报道分子的可检测的标记物可以是荧光标记物，其中所述检测报道分子包括检测来自受关注区域内的报道分子的荧光标记物的荧光发射。[0443]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括在第二时间段内将包含室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发报道分子的荧光标记物的波长。该方法还可以包括在第二时间段后对受关注区域内的荧光发射进行检测，在第三时间段内对受关注区域内的荧光发射进行两次或更多次检测，和/或在第三时间段内基本上连续地对受关注区域内的荧光发射进行检测。[0444]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括在第四时间段内将包含室的至少一部分的微流体装置的一部分但不是流动区域暴露于电磁辐射，其中第四时间段足以对室的部分中存在的任何报道分子的荧光标记物进行光漂白，和检测室的光漂白部分内的荧光发射。可在第四时间段后对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测，可在第五时间段内对室的光漂白部分内的荧光发射进行两次或更多次检测；和/或可在第五时间段内基本上连续地对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测。此外，对室的光漂白部分内的荧光发射的检测可以在所述第四时间段内暴露后约5秒至约20秒之间发生。此外，在第四时间段内暴露和检测室的光漂白部分中的荧光发射的步骤可以重复一次或多次。[0445]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，室的光漂白部分由受关注区域包含。[0446]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，室具有分离区域和将分离区域与流动区域流体连接的连接区域，其中分离区域和连接区域被配置为使得分离区域中流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域中流体介质的组分交换。[0447]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，生物微物体是生物细胞，并且其中所述方法还包括将室内的生物细胞扩增为生物细胞的克隆群。[0448]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括用培养基灌注流动区域，其中灌注可以在将生物微物体引入室之后以及在将第二流体介质引入流动区域之前进行。[0449]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，第一时间段为约30分钟至约60分钟。[0450]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含任何报道分子，并且允许至少一部分未结合的报道分子扩散出室，其中对位于受关注区域内的报道分子的检测发生在选定的时间，使得已扩散出室的未结合的报道分子的量比已扩散出室的rmsa复合物的量至少多2倍。[0451]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，其中受关注区域可以包括沿从室内向外扩散到流动区域的轴排列的室的至少一部分。检测位于受关注区域内的报道分子的步骤可以包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中可检测信号中的至少一些从位于受关注区域内的报道细胞的可检测的标记物发出。[0452]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，检测位于受关注区域内的报道分子的步骤还可以包括通过从可检测信号的测量强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。该方法还可以包括在将生物微物体引入室之前的时间测量受关注区域内背景信号的强度。可检测信号的测量强度或减去背景的信号强度可针对室中观察到的多个细胞进行归一化。[0453]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括量化被分析物的分泌水平。该方法还可以包括提供室的分泌得分。分泌得分可以根据实施方案12至25中任一项所述的方法(即，来自下文所选实施方案的列举)来确定。[0454]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，报道分子的结合组分可以包含肽或蛋白。报道分子的结合组分可以包含具有seqidno:1至10中任一项的序列的肽。报道分子的结合组分可以包括蛋白a、蛋白g或蛋白a或蛋白g的igg结合片段。[0455]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，由生物微物体分泌的被分析物可以是抗体。由生物微物体分泌的被分析物可以是除抗体以外的蛋白。[0456]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，微流体装置可以包括多个室，其中生物微物体被引入多个室中的至少两个室中，并且其中该方法的剩余部分针对所述至少两个室中的每一个进行。该方法还可以包括比较多个室中的至少两个室的室的分泌水平。[0457]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，受关注区域可以包括图像区域，其对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，并沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。[0458]现在参考图32，根据各种实施方案，提供了frap的方法。在图32的a部分中，允许试剂在室中平衡。在图32的b部分中，使用例如结构光来诱导局部光漂白。如该图所示，局部区域为框3540。在图32的c部分中，当未漂白的游离试剂进入局部区域3550时，观察到部分恢复。如上所述，游离试剂由于扩散速率快，通常恢复快。在图32的d部分中，当未漂白的结合复合物进入局部区域时，观察到完全恢复(未绘示为已达到平衡，因此消除了任何可观察到的局部区域)。如上所述，由于扩散速率慢且通常分子量较高，结合复合物的恢复速率通常慢(比游离试剂慢)。[0459]frap具有许多潜在优势。例如，frap可以允许重复测定或在任何时候试剂达到平衡。frap可以比典型的扩散梯度技术更快地进行。frap用户可以获得重复的时间序列分泌测量，以辨析随时间的生物尖峰噪声，从而有可能导致以更少细胞和更短培养时间改善生物噪声统计。浓度测量在视场内和视场之间都是独立的，因为该技术测量的是室内快速和缓慢恢复过程的相对幅度。这不应受到室成像顺序，或室位于视场的哪个部分的影响。此外，例如，frap可用于测量结合亲和力，因为上述比率也会受到亲和力的强烈影响。[0460]因此，根据各种实施方案，提供了一种用于评估生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的方法。该方法可以包括将生物微物体引入微流体装置的室，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室包含第一流体介质。该方法还可以包括允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群将被分析物分泌到室内的第一流体介质中，并在第一时间段内将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质包含多个报道分子。该方法还可以包括允许多个报道分子的一部分扩散到室中，并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物，并检测位于微流体装置内受关注区域内的报道分子，其中受关注区域包括室的至少一部分。报道分子(或每个报道分子)可以包括被配置为与分泌的被分析物结合的结合组分和可检测的标记物。[0461]根据各种实施方案，提供了一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统进行一种使用frap技术确定由生物微物体或由其生成的生物微物体的群产生的被分析物的量的方法。对此，图25的框图提供了一种实例计算机系统，该框图示出了计算机系统3100，在此计算机系统上可以实现本教导的实施方案。下文将提供计算机系统3100的详细信息。[0462]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，可检测的标记物可以包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。报道分子的可检测的标记物可以是荧光标记物，其中所述检测报道分子包括检测来自受关注区域内的报道分子的荧光标记物的荧光发射。[0463]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括在第二时间段内将包含室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发报道分子的荧光标记物的波长。该方法还可以包括在第二时间段后对受关注区域内的荧光发射进行检测，在第三时间段内对受关注区域内的荧光发射进行两次或更多次检测，和/或在第三时间段内基本上连续地对受关注区域内的荧光发射进行检测。[0464]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括在第四时间段内将包含室的至少一部分的微流体装置的一部分但不是流动区域暴露于电磁辐射，其中第四时间段足以对室的部分中存在的任何报道分子的荧光标记物进行光漂白，和检测室的光漂白部分内的荧光发射。可在第四时间段后对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测，可在第五时间段内对室的光漂白部分内的荧光发射进行两次或更多次检测；和/或可在第五时间段内基本上连续地对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测。此外，对室的光漂白部分内的荧光发射的检测可以在所述第四时间段内暴露后约5秒至约20秒之间发生。此外，在第四时间段内暴露和检测室的光漂白部分中的荧光发射的步骤可以重复一次或多次。[0465]根据使用frap技术评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，室的光漂白部分由受关注区域包含。[0466]方法。提供了一种用于评估生物微物体或由其生成的生物微物体的群的被分析物的分泌水平的方法，该方法包括：将生物微物体引入到微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室含有第一流体介质；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群向室内的第一流体介质中分泌被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质含有多个报道分子，并且其中每个报道分子包括被配置为与分泌的被分析物结合的结合组分和可检测的标记物；允许多个报道分子的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的报道分子，其中受关注区域包括室的至少一部分。[0467]在一些实施方案中，流动区域还可以含有第一流体介质。在其他实施方案中，流动区域可以含有与第一流体介质不同的流体介质。[0468]在一些实施方案中，报道分子可以与分泌的被分析物结合，从而形成rmsa复合物，其中rmsa复合物的报道分子:分泌的被分析物的化学计量可以是1:1、2:1、3:1、4:1、2:2、4:2等。[0469]在用于评估被分析物分泌水平的方法的各种实施方案中，检测报道分子可以包括检测未结合的报道分子以及检测作为rmsa复合物的一部分的报道分子。[0470]在各种实施方案中，室可以具有分离区域和将分离区域流体连接到流动区域的连接区域，其中分离区域和连接区域被配置为使得分离区域中的流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域中的流体介质的组分进行交换。[0471]在用于评估被分析物的分泌水平的方法的各种实施方案中，该方法还包括将室内的生物微物体扩增成生物微物体的克隆群。[0472]在各种实施方案中，该方法还可以包括用培养基灌注流动区域，其中灌注发生在将生物微物体引入到室中之后并且在将第二流体介质引入到流动区域中之前。在一些实施方案中，培养基可以与第一介质相同。[0473]在各种实施方案中，培养基可以包括可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。在一些实施方案中，可以通过包括饲养细胞的上清液培养基的一部分来改善在微流体装置内培养的细胞的活力，所述饲养细胞的上清液培养基的一部分提供刺激或以其他方式支持在微流体装置内培养的细胞的辅助生物分子。饲养细胞本身可以不存在于微流体装置内，但可以在标准反应容器中培养。可以收集由饲养细胞的存在而调节的培养基的部分并将其递送到微流体装置。在其他实施方案中，可以根据需要测量和改变溶解氧的量，与在培养孔板、摇瓶等中的这种调节相比，在本文所述的微流体环境中，这可能是个简便的过程。在一些其他实施方案中，可以监测和改变微流体环境内的培养基的ph，这也是比在标准使用的塑料器皿中更简便的过程。[0474]在其他实施方案中，可以将耗尽的生长培养基添加到微流体环境中，其可以充当选择机制以分析微流体环境中的哪些克隆仍然可以更容易地产生分泌的被分析物，或者可以用于接近各种类型的反应容器(其可以包括孔板、摇瓶和生物反应器)的放大环境。在其他实施方案中，可以添加可溶性刺激性组分例如抗体(包括但不限于cd28)、细胞因子、生长因子等，其可以刺激微流体环境内的细胞比引入刺激性组分之前更快速地产生被分析物或产生不同的被分析物。在其他实施方案中，可以将一种或多种被配置为防止细胞彼此粘附和粘附到坞的化合物和/或试剂添加到培养基中。[0475]在一些实施方案中，向培养基中这些添加中的一种或多种可以对室内的一个或多个细胞赋予选择压力。[0476]在各种实施方案中，将第二流体介质引入到流动区域中包括使第二流体介质流过流动区域经历第一时间段。在一些实施方案中，第一时间段可以基于未结合的报道分子的扩散谱的模拟。在一些实施方案中，第一时间段可以是约30至约60分钟。[0477]该方法还可以包括将第三流体介质引入到流动区域中，其中第三流体介质不包括报道分子；以及允许至少一部分未结合的报道分子从室中扩散出来，其中检测位于受关注区域内的报道分子在选择的时间发生，使得已经从室中扩散出来的未结合的报道分子的量比已经从室中扩散出来的rmsa复合物的量至少大2倍。检测可以包括检测未结合的报道分子和检测作为rmsa复合物一部分的报道分子。在各种实施方案中，将第三流体介质引入到流动区域中可以包括使第三流体介质流过流动区域经历第二时间段。在一些实施方案中，可以基于未结合的报道分子和rmsa复合物的扩散谱的模拟来选择第二时间段。[0478]在各种实施方案中，受关注区域可以包括沿着从室内扩散出来进入流动区域中的轴对齐的室的至少一部分。在各种实施方案中，检测位于受关注区域内的报道分子可以包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中至少一些可检测信号是由位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出的。在一些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多的可检测信号是由位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出的。在一些实施方案中，检测位于受关注区域内的报道分子还可以包括通过从测量的可检测信号的强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。可能不必在每次检测报道分子时测量背景信号。在一些实施方案中，可以基于已知/标准条件(例如，芯片类型、芯片中室的位置、可检测的标记物的类型、第一流体介质的组分)预先确定背景信号。[0479]该方法还可以包括在将生物微物体引入到室之前的时间测量受关注区域内的背景信号的强度。在各种实施方案中，可以针对在室内观察到的多个细胞对测量的可检测信号的强度或减去背景的信号强度进行归一化。[0480]在各种实施方案中，该方法还可以包括对被分析物的分泌水平进行量化。对产物的分泌水平进行量化可以基于多个测量中的任何一个，例如可检测信号的测量强度或减去背景的信号强度，其中任一个都可以针对视野中的暗角进行归一化。该方法还可以包括为室提供分泌得分。可以根据以下部分中的任何方法确定分泌得分，其中描述了处理检测的和/或归一化的荧光信号的方法。[0481]在各种实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以是报道分子的分子量的至少两倍。在一些实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少四倍。在其他实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少十倍。[0482]在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。在一些实施方案中，报道分子的结合组分可以包含肽或蛋白。在一些实施方案中，报道分子的结合组分可以包含具有seqidno：1至10中任一个序列的肽。在一些其他实施方案中，报道分子的结合组分包含蛋白a、蛋白g或者蛋白a或蛋白g的igg结合片段。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含适体。[0483]在各种实施方案中，可检测的标记物可以包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。在一些实施方案中，可检测的标记物可以是荧光标记物。[0484]在各种实施方案中，由生物微物体分泌的被分析物可以包含蛋白、糖、核酸；蛋白、糖或核酸以外的有机分子；囊泡或病毒。在一些实施方案中，由生物微物体分泌的被分析物可以是抗体。在其他实施方案中，由生物微物体分泌的被分析物可以是除抗体之外的蛋白。[0485]在各种实施方案中，微流体装置可以包括多个室，其中布置步骤可以包括将生物微物体布置在多个室的至少一部分内。在各种实施方案中，该方法还可以包括比较多个室的室子组中每个室的分泌水平的步骤。该方法还可以包括比较多个室中多于一个室的得分的步骤。在一些实施方案中，该方法还可以包括对分泌水平进行量化的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括选择多个室中的一个或多个以及从所选的一个或多个室中输出生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。在各种实施方案中，该方法允许进行亚克隆和通过进一步扩增和测定所得亚克隆群而对亚克隆进行比较分析。这可以通过将所选的克隆群移动到微流体装置内的另一组室并且针对所选的群的每个单独细胞再次扩增来实现。在其他实施方案中，该方法还可以包括从微流体装置中输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。在各种实施方案中，可以在每个所选的室上单独地执行从室输出到通道或从室和/或通道输出离开微流体装置的步骤(例如，可以在一系列输出步骤中输出来自一组所选的室的细胞，每次一个室)。在一些实施方案中，布置在室内的细胞可以来自先前测定的室，允许进行亚克隆和对亚克隆进行比较分析。例如，特定抗体的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量特异性抗体的细胞。类似地，蛋白家族(例如具有igg结构域的抗体)的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量抗体的细胞。在一些实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的室的所有细胞将被选择并在相同的室或芯片的其他包含区域中扩增。在其他实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的相同室的一个或多个细胞将被选择并在不同的室中扩增。在一些实施方案中，可以对扩增的细胞重复(1x、2x、3x、4x或更多次)执行上文所讨论的用于生成相对或绝对值的步骤。[0486]在另一个实施方案中，该方法的应用可以允许通过重复测定的反馈来检查特定条件对细胞的影响。例如，可以使用与分泌的被分析物的大规模生产更密切相关的条件和材料，以便找到并表征最合适的克隆用于进一步检查。在另一个实例中，可以以更可重复的方式检查用于b细胞抗体刺激的不同刺激方案，并且可以对其进行测定以便更一致地评估一种方案相对于另一种方案的益处。[0487]根据各种实施方案，提供了一种评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的方法。该方法可以包括将生物微物体引入微流体装置的室，其中微流体装置可以包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室包含第一流体介质。该方法还可以包括允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群将包含外源标签的被分析物分泌到室内的第一流体介质中，和将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质包含多个报道分子。该方法还可以包括允许多个报道分子的一部分扩散到室中，并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物，和检测位于微流体装置内的受关注区域内的报道分子，其中受关注区域包括室的至少一部分。报道分子(或每个报道分子)可以包含被配置成与分泌的被分析物的外源标签结合的结合组分和可检测的标记物。[0488]根据各种实施方案，提供了一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统进行一种使用外源标签确定由生物微物体或由其生成的生物微物体的群产生的被分析物的量的方法。对此，图25的框图提供了一种实例计算机系统，该框图示出了计算机系统3100，在此计算机系统上可以实现本教导的实施方案。下文将提供计算机系统3100的详细信息。[0489]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，室可以具有分离区域和将分离区域与流动区域流体连接的连接区域，其中分离区域和连接区域被配置为使得分离区域中的流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域中的流体介质的组分进行交换。[0490]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，生物微物体是生物细胞，其中所述方法还包括将室内的生物细胞扩增成生物细胞的克隆群。[0491]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括用培养基灌注流动区域，其中灌注可以在将生物微物体引入室之后和将第二流体介质引入流动区域之前进行。[0492]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，将第二流体介质引入流动区域可以包括在第一时间段内使第二流体介质流经流动区域。第一时间段为约30分钟至约60分钟。[0493]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，可检测的标记物可以包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。报道分子的可检测的标记物可以是荧光标记物，并且其中所述检测报道分子包括检测来自受关注区域内的报道分子的荧光标记物的荧光发射。[0494]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括在第二时间段内将包含室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发报道分子的荧光标记物的波长。另外，可以在第二时间段后对受关注区域内的荧光发射进行检测，在第三时间段内对受关注区域内的荧光发射进行两次或更多次检测，和/或在第三时间段内基本上连续地对受关注区域内的荧光发射进行检测。[0495]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括在第四时间段内将包含室的至少一部分的微流体装置的一部分但不是流动区域暴露于电磁辐射，其中第四时间段足以对室的部分中存在的任何报道分子的荧光标记物进行光漂白，和检测室的光漂白部分内的荧光发射。另外，可以在第四时间段后对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测，在第五时间段内对室的光漂白部分内的荧光发射进行两次或更多次检测；和/或可在第五时间段内基本上连续地对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测。更进一步地，所述暴露第四时间段和检测室的光漂白部分内的荧光发射的步骤可以重复一次或多次。下文更详细地讨论了对室的区域(区域、受关注区域或受关注区)进行光漂白后荧光恢复(frap)以对分泌的分子进行芯片上浓度测量(即分泌速率)的过程。[0496]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法还可以包括将第三流体介质引入到流动区域中，其中第三流体介质不包括任何报道分子；以及允许至少一部分未结合的报道分子从室中扩散出来，其中检测位于受关注区域内的报道分子在选择的时间发生，使得已经从室中扩散出来的未结合的报道分子的量比已经从室中扩散出来的rmsa复合物的量至少大2倍。[0497]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，该方法可进一步包括量化被分析物的分泌水平。该方法还可以包括对室提供分泌得分。[0498]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，分泌的被分析物的外源标签可以包含肽序列。肽序列可以包括flag表位、多聚组氨酸序列、血凝素(ha)表位或myc表位。肽序列可以包含氨基酸序列(从n端到c端)dykddddk(seqidno:11)。肽序列可以包含氨基酸序列(从n端到c端)hhhhhh(seqidno:12)。[0499]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，报道分子的结合组分是抗体。报道分子的结合组分可以包含螯合剂。[0500]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，由生物微物体分泌的被分析物可以包括蛋白。由生物微物体分泌的被分析物可以是抗体。[0501]根据利用外源标签评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的各种实施方案，微流体装置可以包括多个室，其中生物微物体被引入多个室中的至少两个室中，并且其中所述方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每一个进行的。该方法还可以包括比较多个室中至少两个室的室的分泌水平。该方法还可以包括选择至少两个室中的一个或多个，和将每个所选室中的一个或多个生物微物体输出到微流体装置外。[0502]现在转向图17，图17中展示了工作流程1700，以示出根据本公开的一些实施方案执行的用于对室中存在的分泌的被分析物的量进行量化的功能。[0503]在框1702中，使产生分泌的被分析物的生物微物体保持在微流体装置中的一个或多个室中。例如，生物微物体可以在室内培养或者使用包括重力和/或介电电泳力的各种手段加载到室中，所述重力和/或介电电泳力可以是光致动的。每个室可以包含单个生物微物体或多个生物微物体。多个生物微物体可以是由单个生物微物体产生的生物微物体的克隆群(例如，细胞的克隆群体)，或者可以是生物微物体的异质群。[0504]在框1704中，向通道和室提供具有信号组分和与分泌的被分析物结合的结合组分的报道分子。例如，可以使报道分子流入通道并且允许其扩散到向通道开口的室中。可以使用向通道提供报道分子的其他手段。[0505]在框1706中，允许报道分子在微流体装置内(例如在通道和室内)扩散，直到其在其未结合状态下达到稳态浓度平衡。取决于报道分子的分子量，达到稳态浓度平衡所需的时间量可以变化。[0506]在框1708中，报道分子与存在于室中的分泌的被分析物结合。在一些实施方案中，在通道内恢复流动，并且未结合的报道分子从室中扩散出来。[0507]在框1710中，生成包含未结合的报道分子和rmsa复合物的室和通道的图像。取决于报道分子的信号组分，可能有必要使微流体装置经受特定的光(例如使荧光团经受特定频率的光)或引入另外的试剂以使信号组分可视化。[0508]在框1712中，分析室和通道的图像以计算室中存在的分泌的被分析物的量。[0509]根据本文讨论的各种实施方案，微流体装置可以包括多个室，其中生物微物体被引入多个室中的至少两个室中，并且其中所述方法的剩余部分是针对至少两个室中的每一个进行的。此外，提供了克隆系发育的示例方法，该方法还包括比较多个室中至少两个室的室的分泌水平。此外，该方法可以包括从多个室中选择一组室，其中该组室中的每个室具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分，从微流体装置输出所选择的室的组中的每个室内含有的一个或多个生物微物体；在相应的反应容器中扩增从所选择的室的组中的每个室中输出的一个或多个生物微物体，以及测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而对每个生物微物体或克隆群确定分泌水平。[0510]根据各种实施方案，提供了一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统执行用于克隆系发育的方法的至少一部分。该系统至少执行步骤直到并且包括从微流体装置输出包含在选择的一组室中的每个室中的一个或多个生物微物体为止。对此，图25的框图提供了一种实例计算机系统，该框图示出了计算机系统3100，在此计算机系统上可以实现本教导的实施方案。下文将提供计算机系统3100的详细信息。[0511]现在转到图18，图18中展示了工作流程1800，以示出根据本公开的一些实施方案执行的用于计算表示分泌的被分析物的量的绝对或相对值的功能。[0512]在框1802中，对包括通道和室的微流体装置的图像进行归一化以校正系统误差。如上文所讨论的，可以使用多种不同的归一化算法来校正系统误差。在一些实施方案中，使用增益校正因子对图像进行归一化。在一些实施方案中，使用在与室相邻的通道中存在的荧光信号的量来对图像进行归一化。在一些实施方案中，在归一化期间从微流体装置的图像中减去自发荧光图像。[0513]在框1804中，识别表示从室内的分泌的被分析物的源(例如室内的细胞)到室近侧的通道的预期扩散轨迹的轴的线。识别沿着预期扩散轨迹的轴对齐，并且从室内延伸到通道中的aoi。aoi的至少一部分包括对信号强度具有最大敏感度同时还对室内的细胞位置不敏感的区域。如上文所讨论的，可以通过对多个不同参数(包括但不限于：室的几何形状、室内分泌的被分析物的源的位置、分泌的被分析物的分子量以及通道内存在(或不存在)流动)进行计算模拟来确定aoi和对信号具有最大敏感度/对细胞位置不敏感的相应区域。[0514]在框1806中，基于在aoi处生成一个或多个浓度值，该aoi包含对细胞位置不敏感且对信号变化最敏感的aoi的至少一部分。根据该实施方案，可以基于在aoi内采样像素或者将aoi分区成像素组来计算浓度值。[0515]在框1808中，使用一个或多个浓度值来计算表示每个室中存在的分泌的被分析物的量的相对或绝对值。如上文所讨论的，可以基于每个室中存在的生物微物体(例如，细胞)的数目对针对给定的室计算的一个或多个浓度值进行归一化。在一些实施方案中，一个或多个浓度值可以用于产生表示从分泌的被分析物的源到通道的扩散谱的曲线或其他复合值。在这些实施方案中，拟合至浓度值(或其他复合值)的曲线的线的斜率可以评估与室相关的分泌得分，并且可以用于评估每个室相对于其他室中存在的分泌的被分析物的量(即分泌的被分析物的相对值)。[0516]另一方面，提供了一种克隆系发育的方法，该方法包括：将单个生物微物体引入到微流体装置的多个室中的每一个中，其中微流体装置还包括具有流动区域的外壳，且其中多个室中的每一个与流动区域流体连接且含有第一流体介质；允许每个生物微物体或由其生成的生物微物体的克隆群向相应的室中含有的第一流体介质中分泌被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包括多个报道分子，其中每个报道分子包括结合组分，其被配置为与分泌的被分析物结合；和可检测的标记物；允许多个报道分子中的一部分扩散进入多个室中的每一个并与其中分泌的被分析物的至少一部分结合，从而在多个室中的每一个中产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；对于多个室中的每一个，检测从相应的受关注区域发出的信号的强度，其中受关注区域包括相应的室的至少一部分，且其中从受关注区域发出的信号的至少一部分是从位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出的；对于多个室中的每一个，基于所检测的从相应的受关注区域发出的信号强度确定得分；从多个室中选择一组室，其中该组中的每个室具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分；从微流体装置输出所选的室的组的每个室内含有的一个或多个生物微物体；在相应的反应容器中扩增从所选的室的组的每个室中输出的一个或多个生物微物体；以及测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而测定每个生物微物体或克隆群的分泌水平。最高被分析物生产者可以是生产者中前50％的生产者之一。在一些实施方案中，最高被分析物生产者以前55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％生产克隆或更高的速率产生被分析物。或者，最高生产者可以以大于阈值量生产被分析物。[0517]在各种实施方案中，得分可以是从相应的受关注区域发出的信号的强度，或者可以基于从相应的受关注区域发出的信号的强度来计算。[0518]多个室中的每一个可以具有分离区域和将分离区域流体连接到流动区域的连接区域，并且分离区域和连接区域可以被配置为使得分离区域中的流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域中的流体介质的组分交换。[0519]在各种实施方案中，该方法还包括将多个室中的一些或所有室内的单个生物微物体扩增成生物微物体的克隆群。在各种实施方案中，该方法还包括用培养基灌注流动区域，其中在将单个生物微物体引入到多个室之后并且在将第二流体介质引入到流动区域中之前进行灌注。培养基可以与第一介质相同。灌注可以连续或间歇进行。[0520]在一些实施方案中，培养基可以包括可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。在一些实施方案中，可以通过包括饲养细胞的上清液培养基的一部分来改善在微流体装置内培养的细胞的活力，所述饲养细胞的上清液培养基的一部分提供刺激或以其他方式支持在微流体装置内培养的细胞的辅助生物分子。饲养细胞本身可以不存在于微流体装置内，但可以在标准反应容器中培养。可以收集由饲养细胞的存在而调节的培养基的部分并将其递送到微流体装置。在其他实施方案中，可以根据需要测量和改变溶解氧的量，与在培养孔板、摇瓶等中的这种调节相比，在本文所述的微流体环境中，这是简易的过程。在一些其他实施方案中，可以监测和改变微流体环境内的培养基的ph，这也是比标准使用的塑料器皿中更简易的过程。[0521]在其他实施方案中，可以将耗尽的生长培养基添加到微流体环境中，其可以充当选择机制以分析微流体环境中的哪些克隆仍然可以更容易地产生分泌的被分析物，或者可以用于接近各种类型的反应容器(其可以包括孔板、摇瓶和生物反应器)的放大环境。在其他实施方案中，可以添加可溶性刺激性组分例如抗体(包括但不限于cd28)、细胞因子、生长因子等，其可以刺激微流体环境内的细胞比引入刺激性组分之前更快速地产生被分析物或产生不同的被分析物。在其他实施方案中，可以将一种或多种被配置为防止细胞彼此粘附以及粘附到室的化合物和/或试剂添加到培养基中。[0522]在该方法的各种实施方案中，将第二流体介质引入到流动区域中可以包括使第二流体介质流过流动区域经历第一时间段。可以基于未结合的报道分子的扩散谱的模拟来选择第一时间段。在一些实施方案中，第一时间段可以是约30至约60分钟。[0523]在各种实施方案中，该方法还包括：将第三流体介质引入到流动区域中，其中第三流体介质不包含报道分子；以及允许至少一部分未结合的报道分子从室中扩散出来，其中检测从多个室中每一个室的相应的受关注区域发出的信号的强度在选择的时间发生，使得已经从室中扩散出来的未结合的报道分子的量比已经从室中扩散出来的rmsa复合物的量至少大2倍。在一些实施方案中，将第三流体介质引入到流动区域中可以包括使第三流体介质流过流动区域经历第二时间段。在一些实施方案中，可以基于未结合的报道分子和rmsa复合物的扩散谱的模拟来选择第二时间段。在一些实施方案中，第二时间段可以是约20至约50分钟。[0524]在该方法的各种实施方案中，受关注区域可以包括沿着从室内扩散出来进入流动区域的轴对齐的室的至少一部分。[0525]在该方法的各种实施方案中，检测从多个室中的每一个的相应的受关注区域发出的信号的强度可以包括从测量的可检测信号的强度中减去背景信号的强度以确定减去背景的信号强度。可能不必在每次检测报道分子时测量背景信号。在一些实施方案中，可以基于已知/标准条件(例如，芯片类型、芯片中室的位置、可检测标记物的类型、第一流体介质的组件)预先确定背景信号。[0526]在各种实施方案中，该方法还可以包括在将生物微物体引入到室中之前的时间测量多个室中每一个的相应的受关注区域内的背景信号的强度。在一些实施方案中，可以针对在相应的室内观察到的多个细胞对测量的可检测信号的强度或减去背景的信号强度进行归一化。[0527]在各种实施方案中，可以根据以下部分中的任何方法确定多个室的得分，其中描述了处理检测的和/或归一化的荧光信号的方法。[0528]在各种实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以是报道分子的分子量的至少两倍。在一些实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少四倍。在其他实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少十倍。[0529]在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包括至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。在一些实施方案中，报道分子的结合组分可以包括肽或蛋白。在一些实施方案中，报道分子的结合组分可以包括具有seqidno：1至10中任一个序列的肽。在一些其他实施方案中，报道分子的结合组分包含蛋白a、蛋白g或蛋白a或蛋白g的igg结合片段。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包括适体。[0530]在各种实施方案中，可检测的标记物可以包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。在一些实施方案中，可检测的标记物可以是荧光标记物。[0531]在各种实施方案中，由生物微物体分泌的被分析物可以包括蛋白、糖、核酸；蛋白、糖或核酸以外的有机分子；囊泡或病毒。在一些实施方案中，由生物微物体分泌的被分析物可以是抗体。在其他实施方案中，由生物微物体分泌的被分析物可以是除抗体之外的蛋白。[0532]在各种实施方案中，反应容器可以是孔板、摇瓶或生物反应器中的孔。反应容器的体积可以大于约20微升、约100微升、约1毫升、约10毫升、约100ml、约1l或更高。生物反应器可以具有以下一个或多个特征：具有o2和co2独立控制的ph和溶解氧(do)的闭环控制；用于反应器设置、进料、碱添加和取样的自动液体处理，其可以更密切地靠近用于大量生产分泌的被分析物的反应器的环境，其可以具有20l、50l、50加仑、200加仑或更大的体积。生物反应器可具有相对小的体积，例如10ml或15ml(例如，ambr15tm(tapbiosystems)生物反应器)。生物反应器可具有整合的活力分析能力。[0533]图19中展示了工作流程1900，以示出根据本公开的一些实施方案执行的用于评估表示细胞的克隆群中分泌的被分析物的量的绝对或相对值的功能。[0534]在框1902中，选择单个细胞用于扩增。如上文所讨论的，可以基于测定结果选择细胞，或者可以基于其他特征(例如表型和/或形态)选择细胞。[0535]在框1904中，将单个细胞扩增成细胞的克隆群。在一些实施方案中，可以在细胞增殖时分析细胞的克隆群的方面。例如，可以分析增殖速率、细胞的形态和细胞粘附，以评估细胞的总体健康和/或活力。[0536]在框1906中，评估由细胞的克隆群产生的分泌的被分析物的绝对或相对值。在一些实施方案中，可以如上文关于图12a-c和15所述地评估绝对或相对值。在一些实施方案中，可以使用其他方法评估绝对或相对值，例如美国专利申请号14/964,025中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。[0537]在框1908中，可以基于细胞的克隆群产生的分泌的被分析物的绝对或相对值从细胞的克隆群中选择一个或多个细胞。在一些实施方案中，可以基于如上文所讨论的在细胞增殖期间观察到的细胞的克隆群的方面来选择一个或多个细胞。在一些实施方案中，可以输出所选的细胞用于分析或进一步扩增(例如作为细胞系扩增以产生分泌的被分析物)。如上文所讨论的，在一些实施方案中，可以重复扩增单个细胞和分析克隆群以产生分泌的被分析物的过程，以评估第二分泌的被分析物的绝对或相对量或者评估单个细胞是否稳定地产生在框1906中量化的分泌的被分析物。[0538]分泌的被分析物浓度的绝对值：滴定曲线。在一些实施方案中，可以使用扩散的理论模型，基于一个或多个浓度值和/或生物微物体在一个室中分泌的被分析物的已知量来产生绝对值。根据该实施方案，可以使用不同的扩散理论模型，基于一个或多个浓度值来计算被分析物的绝对值。根据该实施方案，理论模型可以模拟各种现象或评价不同的假设。[0539]在一些实施方案中，可以使用滴定曲线来产生生物微物体分泌的被分析物的绝对值。在这些情况下，可以将各种已知量的被分析物引入到微流体装置中并用于产生表示被分析物的已知量的绝对值。表示被分析物的已知量的绝对值可以用于产生滴定曲线，其部分地证明绝对值与被分析物的各种已知量之间的线性关系。在一些实施方案中，可以产生对应于被分析物的已知量的多个绝对值，使得滴定曲线包含“动态范围”，其显示给定各种系统参数时被分析物的精确量化的上限和下限(即产生具有线性关系的绝对值的被分析物的最高和最低量)。[0540]取决于该实施方案，可以使用各种复制期望的扩散谱的方法，以允许以与在室中的源处产生(例如由室中的细胞产生)的被分析物相同的方式产生已知浓度的被分析物的浓度值。在一些实施方案中，将变化的已知浓度的受关注的被分析物与报道分子一起孵育。在大多数实施方案中，报道分子的浓度将超过与被分析物的所有拷贝结合所必需的报道分子的量。在一些实施方案中，报道分子的浓度将是与被分析物的所有拷贝结合所需的量的大约5-200倍。然而，该范围可以基于报道分子对被分析物的结合亲合力而变化。例如，在报道分子对被分析物具有强结合亲合力的实施方案中，报道分子的浓度可以是与被分析物的所有拷贝结合所需的量的2-200倍。在使用fitc标记的cpd4(表1)与igg结合的具体实施方案中，fitc标记的cpd4的浓度可以是与igg的所有拷贝结合所需的量的5-100倍。该方法不限于使用cpd4，而是可以使用任何适用于扩散测定本身的报道分子。例如，可以使用荧光标记的cpd1、cpd2、cpd3、cpd5、cpd6(表1)来产生滴定曲线，并且荧光团可以是任何适当选择的荧光团，例如alexafluor594或hilytefluortm555。[0541]在一些实施方案中，通过将未结合的报道分子提供给包含分泌的被分析物的室，可以生成预期的扩散谱。在未结合的报道分子和结合的报道分子:被分析物复合物达到平衡的足够时间段(例如，平衡期)之后，随着时间，报道分子和报道分子:被分析物复合物在微流体装置的室和通道中达到平衡状态。在某些情况下，在接近平衡状态和/或处于平衡状态时拍摄图像。示例性的时间段或平衡期为1-3小时。然而，平衡期可以大于10分钟、大于30分钟、大于1小时、大于1.5小时、大于2小时、大于2.5小时、大于3小时、大于3.5小时、大于4小时或大于4.5小时。可选地或另外，在rmsa复合物和未结合的报道分子达到平衡状态之后，或者在平衡期结束后，可以为通道提供另一种介质流，该介质流通过用不包含报道分子的流体介质替换流动区域中的流体介质来消除报道分子(即冲洗)。在这样的情况下。因此，来自通道和室的冲刷区域的rmsa复合物和未结合的报道分子被冲洗出流动区域。此外，布置在室中的rmsa复合物和未结合的报道分子从室扩散至通道。然而，如上所述，未结合的报道分子的扩散速率高于rmsa复合物。因此，未结合的报道分子从微流体装置中扩散出来比rmsa复合物快得多，rmsa复合体具有更大的质量，因此半径也更大。由于半径较大的分子扩散得较慢(参见下面的stokes-einstein方程)，半径较小的分子扩散得更快，因此游离试剂(半径较小)将比包含分泌的被分析物和结合的报道分子的rmsa复合物更快地从坞中扩散出来。[0542][0543]该差异允许基于aoi(受关注区域)的子区域的中值强度值来量化浓度值，如上文关于图12a-c和15所述，并且如下文针对特定数据操纵所讨论的。[0544]图20描绘了根据一个具体实施方案产生的滴定曲线。具体地，图20描绘了一系列绝对值(在y轴上标记为“芯片上测定滴度得分”)，其对应于igg的已知量(在x轴上以微克/ml表示)。具体地，用于产生图20中所示的滴定曲线的igg的已知量为0.001526、0.003052、0.006104、0.012207、0.024414、0.048828、0.097656、0.195313、0.390625、0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5微克/ml。[0545]为了产生表示图20中所示的igg的已知量的绝对值(标记为测定得分)，将已知量的igg在含有fitc标记的cpd4的溶液中孵育。为了确保igg的所有拷贝的结合和检测，在溶液中包括与igg的所有拷贝结合所需的fitc标记的cpd4的量的6倍。然后，用溶液灌注微流体装置45分钟，接着用细胞系培养基(thermofishercdcho培养基)以10微升/秒的速度冲洗通道。冲洗通道后，使fitc标记的cpd4和igg从室扩散到通道10分钟。然后对微流体装置进行成像并用于为微流体装置中的每个室产生测定得分，如下文所述。该过程最初使用最高量的igg(即，12.5微克/毫升)进行，并且每次使用较低量的igg连续重复。[0546]在对微流体装置成像后，通过取对微流体装置中每个室所产生的各个绝对值的平均值来计算每个已知量的igg的测定得分。如上文针对图12-15所述，通过取对室所产生的浓度值的斜率来生成每个单独的绝对值。具体地，基于所选的aoi产生浓度值，并基于该浓度值计算每个室的斜率。在产生浓度值之前，将图像归一化并经受如上文针对图13a-b所述的增益校正因子。在计算每个室的斜率之后，将微流体装置中所有室的所有斜率的平均值用作测定得分。[0547]一旦产生，滴定曲线(例如图20中所示的滴定曲线)就可以用于产生未知量的分泌的被分析物的绝对值。如图20所示，滴定曲线中的测定得分可以用任何线拟合算法拟合，以产生定义绝对值(即，测定得分)和分析物(即，igg抗体)的已知量之间关系的斜率方程。然后，基于在实验条件下观察到的测定得分，斜率方程可以用于产生表示在实验条件(即产生未知量的被分析物的细胞)下存在的被分析物的量的绝对值。为了产生图20中所示的滴定曲线，使用tableau软件生成基于测定得分的标准偏差使用95％置信区间的对数拟合模型。[0548]如图20所示，已知量的igg的测定得分证明了从大约1微克/ml开始的线性关系。也就是说，测定得分证明了响应于igg增加量的成比例增加。在低于1毫克/ml的浓度下，未观察到线性关系。因此，图20中所示的滴定曲线显示了动态范围，其具有大约1微克/ml的精确量化的下限。图20中所示的滴定曲线未显示上限，因为对应于igg的最高量的测定得分在表现出与igg的已知量的线性关系的测定得分的范围内。[0549]如图20中所描绘的曲线所示，通常在实验条件(即在室内分泌igg的细胞)下观察到的测定得分在滴定曲线上以灰色标注并标记为“典型的测定滴度范围”。由于在实验条件下观察到的测定得分在证明与igg的已知量的线性关系的测定得分的范围内，因此图20产生的斜率可以用于计算通常在实验条件下产生的igg的量。[0550]试剂盒。可以提供试剂盒用于评估生物微物体或由其生成的生物微物体的群的被分析物的分泌水平，包括微流体装置，其包括具有流动区域的外壳；和室，其中室与流动区域流体连接，并且其中流动区域和室被配置为含有流体介质；和报道分子，其包含可检测的标记物和被配置为与被分析物结合的结合组分。[0551]在试剂盒的各种实施方案中，微流体装置的室可以具有分离区域和将分离区域流体连接到流动区域的连接区域，其中分离区域和连接区域被配置为使得流体介质的组分基本上仅通过扩散在流动区域和室的分离区域之间进行交换。在各种实施方案中，微流体装置的外壳可以包括基部，流动区域和室设置在该基部上。在一些实施方案中，外壳的基部可以包括具有介电电泳配置的基底。介电电泳配置可以是光致动的。在各种实施方案中，流动区域可以是通道。在一些实施方案中，微流体装置可以包括多个室，其可以与如本文所述的任何室类似地配置。在一些实施方案中，微流体装置的至少一个内表面包括共价修饰的表面。在各种实施方案中，试剂盒的微流体装置可以与本文所述的任何微流体装置类似地配置，并且可以以任何组合具有任何组件、尺寸和/或微流体管路元件的多样性。[0552]在试剂盒的各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包括至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。在一些实施方案中，报道分子的结合组分可以包括肽或蛋白。在各种实施方案中，肽或蛋白结合组分可以是与人或鼠igg结合的肽或蛋白。在一些实施方案中，报道分子的结合组分可以是cpd1、cpd2、cpd3、cpd4、cpd7、cpd8、cpd9、cpd10、cpd11、cpd12、cpd13或cpd14中的任一种(参见表1)。在一些实施方案中，报道分子的结合组分可以是cpd1、cpd2、cpd3或cpd4(参见表1)。在一些实施方案中，与人或鼠igg结合的蛋白结合组分可以是cpd1或cpd2(参见表1)。在其他实施方案中，报道分子的结合组分包括适体。在各种实施方案中，适体可以是cpd5或cpd6(表1)。在一些实施方案中，报道分子的适体结合组分与igg的fc结合。[0553]在试剂盒的各种实施方案中，报道分子的可检测的标记物可以包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。在一些实施方案中，可检测的标记物是荧光标记物。荧光标记物可以是罗丹明、荧光素或花青荧光染料。[0554]在试剂盒的各种实施方案中，试剂盒还可以包含流体介质。流体介质可以被配置为维持、扩增生物微物体或由其生成的生物微物体的群或对其提供选择压力。[0555]在试剂盒的各种实施方案中，试剂盒还可以包含被配置为使微流体装置的一个或多个表面调节的试剂。在一些实施方案中，试剂可以被配置为共价修饰微流体装置的一个或多个表面。[0556]根据各种实施方案，提供一种试剂盒，用于评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平。所述试剂盒可以包括微流体装置和报道复合物。微流体装置可以包括具有流动区域的外壳和多个室，其中每个室与流动区域流体连接，并且其中流动区域和室被配置为包含流体介质。报道复合物可以包括被配置为与分泌的被分析物结合的第一复合物组分，以及与第一复合物组分结合并包含可检测的标记物的第二复合物组分，其中分泌的被分析物与第一复合物组分的结合抑制或阻止第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[0557]计算机实施的系统[0558]计算机实施的系统。图25是示出计算机系统3100的框图，可以根据它实施各种实施方案。根据各种实施方案，计算机系统3100可以包括总线3102或用于传递信息的其他通信机制，以及与总线3102耦接用于处理信息的处理器3104。在各种实施方案中，计算机系统3100还可以包括存储器3106，其可以是所示的随机存取存储器(ram)或其他动态存储设备，耦接到总线3102，用于确定将由处理器3104执行的指令。存储器3106还可以用于在执行要由处理器3104执行的指令期间存储临时变量或其他中间信息。在各种实施方案中，计算机系统3100还可以包括另一存储器3108，例如只读存储器(rom)3108或耦接到总线3102的用于存储用于处理器3104的静态信息和指令的其他静态存储设备。可以提供诸如磁盘或光盘的存储设备3110并将其耦接到总线3102用于存储信息和指令。[0559]在各种实施方案中，计算机系统3100可以通过总线3102耦接到显示器3112，例如阴极射线管(crt)或液晶显示器(lcd)，用于向计算机用户显示信息。包括字母数字键和其他键的输入设备3114可以耦接到总线3102，用于将信息和命令选择传送到处理器3104。另一种类型的用户输入设备是光标控制3116，例如鼠标、轨迹球或光标方向键，用于将方向信息和命令选择传送到处理器3104并用于控制显示器3112上的光标移动。该输入设备3114通常在两个轴(第一轴(即，x)和第二轴(即，y))上具有两个自由度，其允许设备指定平面中的位置。然而，应当理解的是，本文还考虑了允许3维(x、y和z)光标移动的输入设备3114。[0560]与本文所述的各种实施方案一致，响应于处理器3104执行包含在存储器3106中的一个或多个指令的一个或多个序列，计算机系统3100可以提供结果。这些指令可以从另一计算机可读介质或计算机可读存储介质(例如存储设备3110)读入存储器3106。包含在存储器3106中的指令序列的执行可以使处理器3104执行本文描述的方法。或者，可以使用硬连线电路代替软件指令或与软件指令组合以实现本教导。因此，本教导的执行不限于硬件电路和软件的任何特定组合。[0561]本文使用的术语“计算机可读介质”(例如，数据存储、数据存储器等)或“计算机可读存储介质”是指参与向处理器3104提供指令以供执行的任何介质。这种介质可以采取多种形式，包括但不限于非易失性介质、易失性介质和传输介质。非易失性介质的实例可以包括但不限于光盘、固态硬盘、磁盘，例如存储设备3110。易失性介质的实例可以包括但不限于动态存储器，例如存储器3106。传输介质的实例可以包括但不限于同轴电缆、铜线和光纤，包括包含总线3102的导线。[0562]计算机可读介质的常见形式包括，例如，软盘、软磁盘、硬盘、磁带或任何其他磁介质、cd-rom、任何其他光学介质、穿孔卡、纸带、任何其他具有孔图案的物理介质、ram、prom和eprom、flash-eprom、任何其他存储器芯片或盒式磁带或计算机可以读取的任何其他有形介质。[0563]除了计算机可读介质之外，还可以提供指令或数据作为在通信装置或系统中包括的传输介质上的信号，以向计算机系统3100的处理器3104提供一个或多个指令的序列以供执行。例如，通信设备可以包括具有指示指令和数据的信号的收发器。指令和数据被配置为使一个或多个处理器执行本文公开中概述的功能。数据通信传输连接的代表性实例可以包括但不限于电话调制解调器连接、广域网(wan)、局域网(lan)、红外数据连接、nfc连接等。[0564]应当理解，本文描述的方法、流程图、示意图和所附的公开内容可以使用计算机系统3100作为独立设备或者在诸如云计算网络的共享计算机处理资源的分布式网络上来执行。[0565]被分析物量化器系统[0566]被分析物量化器系统。根据各种实施方案，公开了用于确定由微物体产生的被分析物的量的系统和方法。被分析物可以包括例如来自微物体的分泌物，其中微物体可以是生物微物体。被分析物可以包括例如蛋白、糖、核酸、抗体、抗原；蛋白、糖、核酸以外的有机分子；囊泡或病毒。如下文所讨论的，被分析物的量可以是相对量。[0567]图26是根据各种实施方案的用于确定由微物体产生的被分析物的量的系统的示意图。如本文所描绘的，系统3200可以包括图像获取单元3202、图像处理单元3204和显示器3212，其用于输出数据和经由相关联的输入设备(未示出)接收用户输入。[0568]图像获取单元3202(例如，但不限于，上文的图1中所描绘的成像模块164)可以包括微流体装置支撑物3214(例如但不限于上文的图1和3b中所描绘的支撑结构104和300)和成像元件3216(例如但不限于上文提到的成像装置194)。[0569]微流体装置支撑物3214可以被定位并设计成固定微流体装置。微流体装置可包括本文所述的各种实例(例如但不限于上文的图1b-1c、2a-2b、2d、2g-2h、3a、4a-4c、5a-5c、9b、10b、11a-11b和12a-12b中所描绘的微流体装置200、230、250、280、290、320、400、500、900、1000、1100和1200)中的任一种。或者，支撑物3214可以与微流体装置集成。微流体装置可以包括流动区域和可以流体连接到流动区域的一个或多个室，其中每个室可以容纳一个或多个微物体。如前文所述，该室可以是例如室。应当理解的是，该室可以具有如它们所用的特定应用所要求的任何形状、尺寸或取向。如前文所述，流动区域可以是单个微流体通道，或多个微流体流动通道(例如但不限于如上文的图1a和2a-2c中所描绘的通道122，以及如上文的图2d-2f中所描绘的流动通道264)，其提供单个流动路径或多个流动路径(例如但不限于上文的图1a和2b中所描绘的流动路径106，以及上文的图2c-2d、4a-4c、5a、9b、10b、12a中所描绘的介质242和278的流动)。流动区域可以与单个或多个室流体连通。或者，流动区域可以通过可逆闭合件(例如，阀)与单个室或多个室流体连通。流动区域可以被配置为通过如前文所述的入口接收材料流。材料流可包括例如微物体、结合剂或试剂的流，或者包括该材料的介质的流。微流体装置可以进一步被配置为通过流动路径接收结合剂(例如，报道分子)的流动并进入室。结合剂可以在与被分析物结合时发射电磁辐射，例如由结合剂的可检测的标记物发射的光(例如，荧光，uv等)。被分析物可以包括例如来自微物体的分泌物，其中微物体可以是生物微物体。被分析物可包括例如蛋白、糖、核酸、抗体、抗原；蛋白、糖或核酸以外的有机分子；囊泡或病毒。[0570]成像元件216可以被配置为捕捉微流体装置的多个室和流动区域一个或多个测定图像3222(参见图27)。成像元件3216可以被进一步配置为捕捉一个或多个相应的背景图像3218(参见图27)和/或一个或多个相应的信号参比图像3220(参见图3)，以如下文所详细讨论地与一个或多个测定图像3222相关联地进行分析和执行。[0571]在将任何外来物质(例如，微物体、结合剂或其他试剂)引入到微流体装置中之前，可以由成像元件3216获取背景图像3218(参见，例如，图27)。在这样做时，背景图像3218捕捉设备中特别是受关注区域中的任何背景噪声，这在下文中进一步讨论。背景噪声可能是由于例如伪影或仪器设置和成像参数-例如，来自激发源的光、相机噪声和环境光。背景噪声还可以归因于例如由样品、容器、成像介质的自发荧光或由未与特定靶标结合的荧光团产生的荧光所赋予的背景荧光。背景图像中包含什么样的图像区域取决于如何在进行中的系统中执行成像。例如，如下文将详细描述的，根据所使用的校准方法，可能期望不同的背景图像区域。[0572]在将结合剂引入到室中至一定水平使得结合剂浓度在受关注区域(“aoi”)中平衡之后，成像元件3216可以获取信号参比图像3220(参见，例如，图27)。在这样做时，信号参比图像3220捕捉设备中的图像获取畸变。这种畸变可以源于例如微流体或成像元件设计。图像畸变类型可以包括例如图像边缘效应、透视畸变、桶形畸变、枕形畸变、胡须畸变和色差。信号参比图像区域可包括aoi、靠近室的流动区域和相关联的aoi的图像，或两者。信号参比图像中包含什么样的图像区域取决于如何在进行中的系统中执行成像。例如，如下文进一步详细提供的，取决于系统执行的校准方法，可以使用不同的信号参比图像区域。[0573]图26的系统3200的图像处理单元3204可以通信地连接到图像获取单元3202。在各种实施方案中，图像处理单元3204可以包括受关注区域确定引擎3206(aoi引擎3206)和评分引擎3210。应当理解，被描绘为图像处理单元3204的一部分(并且在此描述)的每个组件(例如，引擎、模块等)可以作为硬件、固件、软件或其任何组合来实现。[0574]在各种实施方案中，图像处理单元3204可以作为具有图像获取单元3202的集成的仪器系统组合件来实现。也就是说，图像处理单元3204和图像获取单元3202可以被容纳在相同的壳体组合件中，并通过传统的设备/组件连接装置(例如，串行总线、光缆、电缆等)进行通信。[0575]在各种实施方案中，图像处理单元3204可以作为独立的计算设备(如上文在图26中所示)来实现，其经由光学、串行端口、网络或调制解调器连接通信地连接到图像获取单元3202。例如，图像处理单元可以经由lan或wan连接来连接，该lan或wan连接允许将由图像获取单元3202获取的成像数据传输到分析用图像处理单元3204。[0576]在各种实施方案中，图像处理单元3204的功能可以在共享计算机处理资源(诸如云计算网络)的分布式网络上实现，该分布式网络经由wan(或等效的)连接通信地连接到图像获取单元3202。例如，图像处理单元3204的功能可以被划分为在诸如amazonwebservicestm的云处理服务上的一个或多个计算节点中实现。[0577]受关注区域确定引擎3206(aoi引擎3206)可以被设计和配置为从成像元件3216接收捕捉的测定图像，并为测定图像中描绘的每个室限定aoi。受关注区域确定引擎3206可以被编程为通过在aoi内包括对测量被分析物浓度波动最敏感的室内的图像区域来定义适当的aoi。例如，这可以是室内这样的区域：其中可以由成像元件3216测量电磁辐射(例如光发射(例如，荧光、uv等))的最小波动。甚至更进一步地，图像区域可以包括当测量被分析物波动时对室中的微物体的位置最不敏感的图像区域。例如，这将是室内这样的区域：其中电磁辐射(例如光发射(例如，荧光、uv等))的测量的灵敏度受室中微物体的存在的影响最小。aoi甚至可以被进一步限定为沿着扩散轴3302(参见图28)在相应的室和与相应的室流体连通的流动区域之间延伸。如下文将更详细地讨论的，该aoi也可以是在例如图32中示出的室的非冲刷区域。[0578]在图28中描绘的示例性实施方案中，可以使用关于微流体装置及其相应室的空间信息来确定扩散轴3302。该空间信息可以源自包含在系统3200中的cad模型、相关的软件或单独的软件包，以产生定义的未对齐的aoi3224。然后，用于成像元件和微流体装置的校准算法可以将图像数据映射到该cad模型，以获得适当的扩散轴3302。基于该映射应用空间校正变换3226，受关注区域确定引擎3206可以产生一组对齐的aoi3228。aoi可以从受关注区域确定引擎3206自动确定，或者可以通过用户输入到显示器3212中手动确定。[0579]图26的系统3200的评分引擎3210可以被设计和配置为分析每个室的受关注区域内的图像区域的至少一部分，以确定指示每个室中的被分析物的量的得分。此外，由于得分可以是无量纲的值，其可以通过评分引擎3210与其他得分进行比较，以指示被分析物的相对量或浓度，所确定的得分可以转换为用户的浓度单位。[0580]为了确定得分，评分引擎3210可以使用各种模型。如下文所讨论的，一些模型可以是利用例如荧光数据的模型，所述荧光数据量化与每个室、流动区域或二者中的被分析物结合的结合剂(例如，报道分子)的量。被分析物可以包括例如来自室内的微物体的分泌物，其中微物体可以是生物微物体。评分引擎3210可以使用结合的报道分子数据(例如，荧光值)，特别是跨aoi的结合的报道分子数据，以确定相应室的得分，其指示该室中被分析物的量。评分模型的非限制性实例包括将线性回归分析应用于每个室的aoi的图像区域的一部分上的发光数据(例如，荧光值或一些其他类型的可检测的信号)、将s形模型应用于aoi、使用对产生受关注的被分析物的生物微物体的位置不变的aoi的平均强度或者对每个室的aoi的图像区域的一部分上的发光数据(例如，荧光值或一些其他类型的可检测的信号)进行积分。[0581]例如，s形模拟通过s形或逻辑曲线、方程和细节来靠近aoi中的扩散梯度。使用参数(例如生长速率、渐近线之间的差异和拐点位置)组合的量化模型，可以产生必要的准确度和/或精度。可以通过例如非线性回归或曲线回归来估计模型的参数，这取决于所使用的s形曲线的确切形式。常见的模型参数估计技术包括例如levenberg-marquardt、单形和模拟退火。可以使用启发式技术来初始化参数，以进一步帮助确保在诸如非线性回归的迭代拟合技术期间的收敛。例如，可以通过aoi极值处的子区域的平均值粗略估计上下渐近线。[0582]或者，如图27的实施方案中所示，在将上述评分模型应用于aoi之前，评分引擎3210可以将对齐的aoi3228沿着扩散轴3302分隔成单独的区段3230(参见图28)。图28描绘了微流体装置的一部分的实例，包括流动区域3308、室3306、扩散轴3302、多个区段3304和微物体3310。区段3304的数目可以根据需要变化，以执行必要的评分模型。区段3304的数目可以是例如20。对于区段3304，评分引擎3210可以计算中值3232，其中该值可以是例如电磁辐射值，例如荧光值，其指示与每个室3306、流动区域3308或二者内的被分析物结合的结合剂(例如，报道分子)的量。被分析物可以包括例如来自微物体3310的分泌物，其中微物体可以是生物微物体。然后，评分引擎3210可以基于一组参数经由子部分量化过程3234确定区段3304(或区间(bins))的子集。[0583]评分引擎3210可以使用编码到或者远程提供给(例如，无线地、远程软件程序、用户输入)评分引擎3210的一组指令，经由子部分量化过程3234确定区段(或区间)3304的子集。该组指令可以基于例如使用例如微物体类型、室中的微物体计数、区段计数(或区间计数)、子部分计数和子部分位置的不同组合进行的先前数值模拟。使用该数据，可以编码指令，其将受关注的微物体与各种数值模拟相关联，以确定用于分析受关注的生物微物体的适当的区段子集。[0584]区段3304的子集可以包括确定所述室3306的得分所需的总区段计数内的任何区段的组。例如，基于所提供的一组参数或指令，评分引擎3210可以将箱9-13识别为用于确定特定室的得分的箱的子集。应用评分模型，例如先前描述的那些，评分引擎3210然后可以确定所述室的得分，例如分泌得分3236。[0585]或者，根据各种实施方案，图像处理单元3204还可以包括在例如图26和图27中示出的校准引擎3208。校准引擎3208可以被设计和配置成针对由来自微流体装置并在测定图像捕捉期间的背景噪声引起的图像畸变，应用每个室的aoi归一化过程3238。然后可以通过评分引擎3210对得到的校准图像aoi进行评分。如上文所述，背景噪声可能是由于例如伪影或仪器设置和成像参数-例如，来自激发源的光、相机噪声和环境光。背景噪声还可以归因于例如由样品、容器、成像介质的自发荧光或由未与特定靶标结合的荧光团产生的荧光所赋予的背景荧光。测定图像捕捉期间的图像畸变可以源自例如微流体装置设计或成像装置设计。图像畸变类型可以包括例如图像边缘效应、投影仪不均匀性、相机晕光、透视畸变、桶形畸变、枕形畸变、胡须畸变和色差。[0586]校准引擎3208可以被设计和配置成针对在测定图像捕捉之前和/或在测定图像捕捉期间引入的来自微流体装置的图像畸变，对每个室的aoi或至少每个室的aoi的图像区域进行归一化。校准引擎3208可以通过从测定图像和/或信号参比图像中减去背景图像并且考虑在信号参比图像中捕捉的图像获取畸变来实现这一点。然后可以通过评分引擎3210对得到的归一化图像aoi进行评分。[0587]针对特征提取和异常检测，存在用于对图像进行归一化的各种模型。[0588]在一个实施方案中，通过统计推断的数据排除可以在对aoi进行归一化之前去除异常。可以利用诸如计算所有aoi数据的分布内的给定数据点的z得分的基本统计变换来检测可能具有非常低或非常高强度的异常，例如异物。[0589]根据各种实施方案，通过统计推断的数据排除可以在对aoi进行归一化之前去除异常。因为理想的扩散谱通常沿着与扩散轴正交的任何线具有恒定值，所以可以统计地推断aoi中是否存在诸如异物的异常并且从模拟中排除那些数据点。可以将aoi中的每个数据点转换为z得分，其表示由于随机变化而发生的概率。例如，给定aoi，其中i是给定点处的强度值，μ是平均强度值，σ是标准偏差，y表示扩散方向，x与其正交，给定点的z得分可以通过方程(1)计算：[0590](1)[0591]由该方程产生的z得分可以用于排除z得分幅度大于给定阈值的数据。可以重复该过程以迭代地去除不同尺寸和强度的异常。[0592]根据各种实施方案，分段模拟可以在对aoi进行归一化之前去除异常。基于扩散谱沿着与扩散轴正交的任何方向理想地恒定的原理，可以在aoi的n列上独立地拟合分析模型。在理想的系统中，这些模型都会产生相同的参数估计。在实践中，它们将是正态分布的。然而，在异常的情况下，例如未对齐或存在异物，在参数估计的分布中将存在另外的模式。通过将诸如模型与aoi列数据的相关性的信息与所有参数估计的分布中给定参数的大小的普遍性相结合，可以确定哪些模型反映了异常结果，因此应当从进一步分析中排除。这可以与上述z得分技术结合使用，以适当地对受关注的数据进行归一化。[0593]根据各种实施方案，根据方程(2)，可以使用捕捉的背景图像“a”和信号参比图像“c”数据产生在点x,y处的测定图像的归一化值(i校正)：[0594](2)[0595]根据各种实施方案，产生g得分以对aoi中的所有数据点进行归一化。在捕捉背景图像“a”和信号参比图像“c”之后，可以根据方程(3)计算校正因子“g”：[0596](3)[0597]然后可以如下应用校正因子g，以根据方程(4)确定用于对aoi进行评分的测定图像的归一化的值(i校正)：[0598](4)i校正(x,y)＝g(x,y)(i原始(x,y)-a(x,y))[0599]使用测定图像的归一化的值，可以将评分引擎3210进一步设计和配置为分析每个室的归一化的受关注区域的一部分，以确定指示每个室中被分析物的量的得分。如上文所详细讨论的，评分模型的实例包括将线性回归分析应用于每个室的归一化的受关注区域的一部分，或者对每个室的归一化的受关注区域的一部分上的荧光值(或一些其他类型的可检测的信号)进行积分。[0600]或者，根据各种实施方案，不是使用aoi的信号参比图像和背景图像，使用靠近室和相关联的aoi的流动区域以及微流体装置的其他不含生物微物体的区域的信号参比图像和/或背景图像，校准引擎3208可以应用上述用于校准的实施方案于。这些“非aoi”图像可以与测定图像数据结合使用，以对测定图像数据进行归一化，如上文所详细讨论的。[0601]根据各种实施方案，图像获取单元3202和图像处理单元3204可以集成到单个物理单元中。或者，图像获取单元3202和图像处理单元3204可以可分离地定位，以独立单元提供，使得各单元仍然通信地连接以交换信息。[0602]上述图像处理单元3204的每个组件可以是硬件，或者可以部分或全部是软件模块。[0603]图29是示出用于确定由微物体产生的被分析物的量的方法的示例性流程图。如本文所描绘的，步骤3410详细描述了可由图26的系统3200的图像获取单元3202的受关注区域引擎3206使用的示例性工作流程。在步骤3410中，受关注区域引擎3206接收微流体装置的成像数据，该微流体装置包括流动区域和与流动区域流体连接的多个室，其中成像数据可以包括背景噪声图像、信号参比图像和被分析物测定图像的其中之一或组合。在将任何外来物质(例如，微物体、结合剂或其他试剂)引入到微流体装置中之前，可以通过成像元件3216获取背景图像。在这样做时，背景图像捕捉与系统3200相关联的任何背景噪声和设备上的区域的图像捕捉。先前描述了背景噪声的实例。在将结合剂引入到室中至一定水平使得结合剂浓度在装置中平衡之后，成像元件3216可以获取信号参比图像。在这样做时，信号参比图像捕捉与系统3200相关联的图像获取畸变以及设备上的区域的相关联的图像捕捉。[0604]所接收的成像数据可包括例如由与一个或多个室、流动区域或二者中的被分析物结合的结合剂(例如，报道分子)发射的荧光确定的荧光发射数据。被分析物可以包括例如来自微物体的分泌物，其中微物体可以是生物微物体。来自生物微物体的分泌物可以包括例如蛋白、糖、核酸、分子量小于3kd的有机分子或病毒。如前所述，室可以是例如室。[0605]如本文所描绘的，步骤3420和3430详细描述了可以由图26的系统3200的图像处理单元3204的评分引擎3210使用的示例性工作流程。在步骤3420中，图像处理单元3204可以为每个室定义受关注区域(“aoi”)。aoi可以包括室内对测量被分析物浓度波动最敏感的图像区域。aoi还可以包括当测量被分析物波动时对室中的微物体的位置最不敏感的图像区域，并且甚至进一步地，图像区域可以沿着室和流动区域之间的扩散轴延伸。[0606]在步骤3430中，评分引擎3210可以通过分析每个室的aoi的一部分来确定指示每个室中的被分析物的量的得分。为了确定每个室的得分，评分引擎3210可以使用如上文所讨论的各种模型。一些模型可以是利用例如荧光数据的模型，所述荧光数据量化与被分析物结合的结合剂(例如，报道分子)的量。被分析物可以包括例如来自室内的微物体的分泌物，其中微物体可以是生物微物体。评分引擎3210可以使用结合的报道分子数据(或荧光值)，特别是跨aoi的结合的报道分子数据，以确定相应室的得分，其指示该室中被分析物的量。评分模型的非限制性实例包括将线性回归分析应用于每个室的归一化的受关注区域的一部分，或者对每个室的归一化的受关注区域的一部分上的荧光值(或一些其他类型的可检测的信号)进行积分。[0607]图30示出了可以应用于成像数据以获得被分析物测定图像中的每个室的归一化的aoi的校准方法。如本文所描绘的，步骤3510至3530详细描述了可由图26的图像处理单元3204的校准引擎3208使用的校准方法的示例性工作流程。[0608]在步骤3510中，校准引擎3208可以从图像获取单元3202接收成像数据，其可以包括如前文所讨论的背景图像、信号参比图像和被分析物测定图像的成像数据的其中之一或组合。如前文所讨论的，成像数据可以是来自微流体装置上每个室的受关注区域的荧光值的形式。成像的荧光可以是源自背景噪声(对于背景图像)、填充受关注区域的结合剂(对于信号参比图像)或来自与被分析物结合的结合剂(例如报道分子，对于被分析物测定图像)的发射的荧光，其中被分析物可以包括例如来自存在于室中的生物微物体的分泌物。[0609]在步骤3520中，校准引擎3208可以从信号参比图像和被分析物测定图像值中减去背景图像值。在这样做时，将系统中已经存在的任何背景噪声从信号参比图像和被分析物测定图像值中去除，以获得不再受噪声影响的两个图像的背景校正值。[0610]在步骤3530中，校准引擎3208可以通过比较信号参比图像和被分析物测定图像值的背景校正值来进一步校正被分析物测定图像值，以解决先前描述的将通过信号参比图像识别的图像获取畸变。该比较将产生归一化的被分析物测定图像值，特别是在aoi内。上文提供了确定归一化的值的相关公式和计算的实例。[0611]使用归一化的数据，评分引擎3210可以通过分析每个室的现在归一化的aoi的一部分来确定指示每个室中的被分析物的量的得分。[0612]本文描述的方法可以根据应用通过各种手段来实现。例如，这些方法可以用硬件、固件、软件或其任何组合来实现。对于硬件实现，处理单元可以在一个或多个专用集成电路(asic)、数字信号处理器(dsp)、数字信号处理装置(dspd)、可编程逻辑装置(pld)、现场可编程门阵列(fpga)、处理器、控制器、微控制器、微处理器、电子设备、被设计用于执行本文所述功能的其他电子单元或其组合中实现。[0613]在各种实施方案中，本教导的方法可以以固件和/或软件程序以及用诸如c、c 等传统编程语言编写的应用程序实现。如果以固件和/或软件实现，则本文描述的实施方案可以在非暂态计算机可读介质上实现，其中存储有程序用于使计算机执行上述方法。应当理解，本文描述的各种引擎可以在计算机系统(例如图25的计算机系统3100)上提供，从而处理器3104将根据由存储器组件3106/3108/3110和通过输入设备3114提供的用户输入中的任何一个或其组合提供的指令来执行由这些引擎提供的分析和确定。[0614]钩区域模拟[0615]对由室和流动区域组成的几何形状内的层流和扩散传输进行模拟，以确定室内对rmsa复合物(例如，结合的rmsa复合物、结合的复合物等)信号敏感的位置。使用单室几何形状对模型进行参数化。模拟中使用的边界条件如图40a所示。在含有可溶性报道分子的液体介质先前已流入流动区域后，当不含可溶性报道分子(例如，报道分子、报道物等)的液体介质通过流动区域流入微流体时，流体流场在时间上是恒定的，输入流速为4.8mm/s，以匹配测定的冲洗步骤中在实验上使用的1.7μl/s体积流速。每种物质(例如，可溶性报道分子、rmsa复合物等)均独立考虑，并且在整个几何形状中，游离可溶性报道分子的初始浓度设置为1mol/m3。浓度是扩散方程中的常数项，因此该值可以归一化为标准曲线的每个条件的实际值。t＝0时，在进行测定之前，将入口处的浓度设置为零，以匹配冲洗。通道的出口是一个自由边界，允许流体和分子运输出几何形状。[0616]扩散系数使用stokes-einstein方程(d＝kt/(6πηr))估算，其中k是boltzmann常数，t是绝对温度，η是液体动力粘度，r是分子半径。游离报道分子的半径可以估算为rmin＝0.066m1/3，其中m是分子的分子量(单位为道尔顿)，rmin单位为纳米。这提供了报道分子的最小估算尺寸，因为它假设报道分子是一个填充球体。[0617]除了一些代表性分子量的扩散系数外，表3还列出了示例性的感兴趣的可溶性报道分子以及分子量和估算的扩散系数。[0618]表3.分子量和估算的扩散系数[0619][0620][0621]使用示例性报道分子spotlighthu3进行标准曲线实验，以基于最小化cv(方差系数)和最大化检测下限来确定何时应进行荧光测量。在标准曲线中，可溶性报道分子和分泌的被分析物分子的混合物在96孔板中温育，然后被导入芯片。平衡后，以0.17μl/s的速率从通道中冲洗混合物。在该冲洗期间，在芯片上进行荧光成像，以观察报道分子和rmsa复合物向室外的扩散。表4总结了所使用的条件。在所有条件下，报道分子的摩尔超出分泌的被分析物至少8倍。[0622]表4：igg1-spotlighthu3的标准曲线条件[0623]报道物μg/ml4444444μm1.71.71.71.71.71.71.7被分析物μg/ml012481632nm06.713.326.753.3106.7213.3[0624]将使用以下假设在数值模拟中重新创建这些条件。首先，基于所有目标分子都被报道分子结合并且解离速率慢于测量时间段的假设，忽略结合动力学。因此，报道分子和rmsa复合物的扩散可以用初始浓度独立处理：[rmsa复合物]＝[分泌的被分析物]，且[报道分子]＝[报道分子]o-[分泌的被分析物]。另一个假设是，忽略可溶性报道分子平衡和测定冲洗之间的冲洗步骤。此外，还忽略室之间的扩散相互作用。[0625]为了对标准曲线进行模拟(model)，对报道分子和结合的rmsa复合物以如表3所示的扩散系数进行了两个独立的模拟。除了报道分子(分子量较小，扩散性较强)和结合的rmsa复合物(分子量较大，扩散性较弱)的扩散系数不同外，每个模拟的条件几乎相同。使用图40b所示的边界条件，以10秒的分辨率持续一小时(3600秒)，对报道分子和结合的rmsa复合物向坞外的扩散进行了时间依赖性模拟。在每个时间点，计算空间中每个点的浓度。这如图40c所示，其示出了测定的原理。虽然报道分子和结合的rmsa复合物以相同的浓度起始，但扩散性较强的报道分子在坞中的浓度下降速度比结合的rmsa复合物更快。因此，与没有生物微物体分泌分泌的被分析物的室相比，具有生物微物体分泌分泌的被分析物的室将显示更大的荧光强度。[0626]通过在固定空间点对模拟中的浓度进行采样，可以分析从坞的扩散。图40d显示了结合的rmsa复合物在室内三个不同位置的时间过程。当分子被二次流动冲刷，然后随时间呈指数衰减时，室连接区域中的十字(图40d中的a和b)在前两分钟内经历超指数衰减。然而，室的钩区域(图40d中的c)在整个时间过程中呈指数衰减。通过在图40d中a和b之间的室连接区域底部的荧光信号的斜率对测定进行评分。当仪器在多个视场中以及在单个视场中的空间变化上对微流体芯片进行成像时，采用归一化以校正一次测量中的时间变化。如何对测定进行评分中的复杂性可能更高，但测定区域内浓度的线性斜率与得分成正比。[0627]结合游离的报道分子和结合的复合物(rmsa复合物)模拟以建立扩散梯度测定的模型。可使用报道分子和rmsa复合物(例如，结合的rmsa复合物)浓度模拟结果的线性组合生成标准曲线条件下的总荧光信号和测定得分。在标准曲线测量中，假设所有目标分泌的被分析物均与报道分子结合，因此[rmsa复合物]＝[分泌的被分析物]，并被从报道分子浓度中完全减去，给出[报道物]＝[报道物]o-[分泌的被分析物]。这些值可以乘以模拟值(以1的初始浓度开始)以得出总信号(以浓度单位表示)：[0628][0629]测定得分是信号经过如图40d所示的室连接区域中的两个位置的斜率，但由于空间距离对所有条件都是相同的，我们可以将得分简化为[0630]得分(t)＝信号(0,-125,20,t){红x}-信号(0,-75,20,t){蓝x}[0631]其中x大小以微米为单位，原点是室连接区域开口的中心，且流动区域深度为40微米。这种情况下的得分单位为δ浓度。[0632]利用信号和得分的关系，可以从报道分子和rmsa复合物的模拟创建标准曲线的条件。图40e显示了32μg/ml(213nm)分泌的被分析物和4μg/ml(1.7μm)报道物的测定区域中平均信号和测定得分，其中标绘了单个组分的贡献。由于初始的报道分子摩尔浓度要高得多，所以总信号和测定得分在早期由报道分子的贡献主导。报道分子的贡献比rmsa复合物减少得更快，因为它具有更高的扩散性。报道分子和目标对测定得分的贡献在830秒左右达到相等，之后测定得分由rmsa复合物的贡献主导。图6显示了标准曲线中使用的各种抗体浓度的测定得分。图6的插图中显示了580秒的单一标准曲线。观察到与图40f相同的趋势，其中随着时间的增加，观察到分泌的被分析物和报道物(例如可溶性报道分子)之间的相对分离更大，但总信号也显著降低。[0633]进行测量的合理时间是对目标浓度变化最敏感的时间，这由标准曲线的斜率表示。标准曲线的斜率(δnm信号/nm目标)随时间的变化如图40g所示。基于根据信号参比图像(例如荧光参比图像)设置测定暴露时间的假设，斜率已归一化为报道分子的浓度。如果在分泌测定期间使用相同的暴露时间，则这将设置测量动态范围的上边界。该图表明，开始冲洗后8-10分钟进行的测定将具有最高灵敏度，其中在540秒时最大。这种方法突出了报道分子和rmsa复合物的差异扩散与从坞的总扩散之间的竞争。在早期，信号主要来自报道分子，而在后期，总信号减少。该测定的最终目的是区分不同室之间的分泌。这种方法表明，最佳测量时间是当标准曲线的斜率最大化时。[0634]该预测接近经验确定的12分钟时间，表明该方法可能有利于应用于其他分子量组合。微流体芯片在冲洗过程中见到不含报道分子的介质之前的实际时间可能接近11分钟，因为在用于测定的计时器启动后会进行泵操作。此外，正如对扩散系数的讨论中所述，这两种物质的扩散性将被高估，因此这也可能是为什么预测建议在更早的时间点进行测量的原因之一。[0635]一个不同的感兴趣的分子量组合的实例是使用二抗来结合目标抗体。在这种情况下，报道分子的分子量为150kd，rmsa复合物为300kd。通过使用表3中提供的扩散系数，使用64μg/ml的报道分子浓度进行类似的分析，并且得到的相对于标准cld测定的灵敏度如图8所示。这是比标准cld测定中使用的spotlighthu3浓度低约4倍的摩尔浓度，因此，其灵敏度比如果使用与spotlighthu3-igg1条件相同的摩尔比时所见的灵敏度高4倍。然而，我们还必须假设kd足够低，以确保所有目标均与报道分子结合。无论如何，这种方法建议冲洗20-22分钟，以将针对这种分子量组合的测定灵敏度最大化。可以推断，在报道分子和目标分子具有相似分子量的情况下，可能能够进行扩散梯度测定。[0636]总之，已生成扩散梯度测定的数值模型，以预测最佳冲洗时间，从而将测定的灵敏度最大化。通过结合灌注期间报道分子和rmsa复合物从坞的扩散的独立模型，可以生成随时间的标准曲线，以确定哪个时间对坞中抗体浓度的变化最敏感。该方法预测，最佳测量时间为用介质冲洗通道后的8-10分钟，而实验确定的时间为12分钟。该预测与实验上使用的12分钟时间非常接近，表明该方法可能有助于应用于其他分子量组合。最后，然后考虑较低摩尔浓度的抗体大小的报道分子，并确定了在冲洗20-22分钟后，测定灵敏度最大化，尽管绝对灵敏度低于使用低分子量报道分子。[0637]此外，已经产生了一种估算测定何时最敏感的方法，并且该方法还可用于确定室内的哪个位置对目标分子浓度的变化最敏感。一个候选位置位于室的钩内。该位置离坞中的冲刷区域更远，所以此处的信号衰减完全是扩散性的，除非坞过度生长，否则颈部不应该有细胞。如图s2所示，使用平均信号代替斜率，并遵循正文中概述的相同方法，在560秒时产生了0.02718％动态范围/nm抗体的最大灵敏度，其与当前方法的最佳窗口大致相同(8-10分钟)。在与当前测定相同的条件下，测量钩中的平均信号比颈部信号的斜率，可使测定灵敏度增加2.8倍。这一发现必须经过实验验证，但该方法可用于为最佳测量位置提供量化估算。[0638]被分析物量化系统[0639]被分析物量化系统。根据各种实施方案，如上所述，讨论了用于测定微物体产生的被分析物的量的系统和方法。例如，被分析物可以包括来自微物体的分泌，其中微物体可以是生物微物体。被分析物可包括例如蛋白，糖，核酸，抗体，抗原，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。被分析物的量可以是相对量，如下所述。[0640]如上所述，根据各种实施方案，图26是用于确定微物体产生的被分析物的量的系统的示意图。如本文所示，系统3200可以包括图像获取单元3202、图像处理单元3204和显示器3212，其用于输出数据和经由相关联的输入设备(未示出)接收用户输入。[0641]如上所述，图像获取单元3202(例如但不限于，如上图1中所示的成像模块164)可以包括微流体装置支撑物3214(例如但不限于，如上图1和3b中所示的支撑结构104和300)和成像元件3216(例如但不限于，上文所述的成像装置194)。[0642]如上所述，微流体装置支撑物3214可以定向并设计为固定微流体装置。微流体装置可以包括本文所述的各种实例中的任何一个(例如但不限于，如上图1b-1c、2a-2b、2d、2g-2h、3a、4a-4c、5a-5c、9b、10b、11a-11b和12a-12b所示的微流体装置200、230、250、280、290、320、400、500、900、1000、1100和1200)。或者，支撑物3214可以与微流体装置集成。微流体装置可以包括流动区域和一个室，或者多个室，其可以与流动区域流体连接，其中每个室均可以容纳一个或多个微物体。如前所述，室可以是例如室。应该认识到，室可以根据其所用的特定应用的要求具有任何形状、大小或方向。如前所述，流动区域可以是单个微流体通道，或是多个微流体流动通道(例如但不限于，如上图1a和2a-2c所示的通道122，以及如上图2d-2f所示的流动通道264)，它们提供了单个流动通道或多个流动通道(例如但不限于，如上图1a和2b所示的流动通道106，和如上图2c-2d、4a-4c、5a、9b、10b、12a所示的介质242和278的流动通道)。流动区域可以与单个室或多个室流体连通。或者，流动区域可以通过可逆闭合装置(例如，阀门)与单个室或多个室流体连通。如前所述，流动区域可配置为通过入口接收材料流。材料流可以包括例如微物体、结合剂或试剂的流，或者包括材料的介质的流。微流体装置还可以被配置为通过流动通道接收结合剂(例如，报道分子)并流入室中。结合剂与被分析物结合后，可发射电磁辐射，例如由结合剂的可检测标记物发出的光(例如荧光、uv等)。被分析物可以包括，例如来自微物体的分泌物，其中微物体可以是生物微物体。被分析物可包括例如蛋白，糖，核酸，抗体，抗原，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。[0643]现在参考图34，该图示出了用于评估被分析物的量的示意图的实例，根据各种实施方案，成像元件216可以配置为捕捉微流体装置的多个室和流动区域的一个或多个测定图像3822。成像元件3216还可以被配置为捕捉一个或多个对应的背景图像3818和/或一个或多个对应的信号参比图像3820，这些图像将如下文详细讨论地与一个或更多测定图像3822一起分析和实现。[0644]在将任何外来物质(例如，微物体、结合剂或其他试剂)引入微流体装置之前，可以通过成像元件3216拍摄背景图像3818(参见图26)。如此，背景图像3818可以捕捉装置中的任何背景噪声，尤其是下文进一步讨论的受关注区域。背景噪声可能来源于，例如和如先前讨论的，伪影(artifacts)或仪器设置和成像参数-例如来自激发源的光、相机噪声和环境光。背景噪声也可能来源于，例如和如先前讨论的，样品、容器、成像介质的自荧光或不与特定目标结合的荧光团产生的荧光所导致的背景荧光。背景图像中包含什么图像区域取决于该图像在前进的系统中如何实现。例如，如上文所述，取决于使用的校准方法，可能需要不同的背景图像区域。[0645]在将结合剂引入室至结合剂(例如，报道物)浓度在受关注区域(“aoi”)中平衡的水平后，可以通过成像元件3216拍摄信号参比图像3820(参见图26)。如此，信号参比图像3820可以捕捉装置中的图像获取畸变。此类畸变可以源于例如微流体或成像元件设计。图像畸变类型可以包括例如图像边缘效果、透视畸变、桶形畸变(barreldistortion)、枕形畸变(pincushiondistortion)、胡子型畸变(mustachedistortion)和色差。信号参比图像区域可以包括aoi、靠近室的流动区域和相关aoi或两者的图像。信号参比图像中包含的图像区域取决于前进的系统如何实现该图像。例如，如下文更详细描述地，取决于系统实施的校准方法，可以使用不同的信号参比图像区域。在某些情况下，可以在引入不含结合剂(例如，报道物)的流体介质后拍摄信号参比图像，其中，在将含有结合剂的流体介质引入微流体装置后，灌注不含结合剂的流体介质；在此类情况下，信号参比图像可以称为“扩散参比图像”。[0646]如前文所讨论，图26的系统3200的图像处理单元3204可以与图像获取单元3202通信连接。类似地，图34的图像处理单元3804可以与图像获取单元3202通信连接。在各种实施方案中，图像处理单元3804可以包括受关注区域确定引擎3806(aoi引擎)和评分引擎3810。应该认识到，作为图像处理单元384的一部分示出(并在本文中描述)的每个组件(例如，引擎、模块等)可以作为硬件、固件、软件或其任意组合来实现。[0647]在各种实施方案中，图像处理单元3804可以作为具有图像获取单元3202的集成的仪器系统组合件来实现(参见图26)。也就是说，图像处理单元3804和图像获取单元3202可以被容纳在相同的壳体组合件中，并通过传统的设备/组件连接手段(例如，串行总线、光缆、电缆等)进行通信[0648]在各种实施方案中，图像处理单元3804可以作为独立的计算设备(如上文在图31中所示)来实现，其经由光学、串行端口、网络或调制解调器连接与图像获取单元3202通信连接。例如，图像处理单元可以经由lan或wan连接来连接，该lan或wan连接允许将由图像获取单元3202获取的成像数据传输到分析用图像处理单元3204。[0649]在各种实施方案中，图像处理单元3804的功能可以在共享计算机处理资源(诸如云计算网络)的分布式网络上实现，该分布式网络经由wan(或等效的)连接与图像获取单元3202通信连接。例如，图像处理单元3204的功能可以被划分为在诸如amazonwebservicestm的云处理服务上的一个或多个计算节点中实现。[0650]受关注区域确定引擎3806(aoi引擎)可以被设计和配置为从成像元件3216接收捕捉的测定图像(参见图26)，并对测定图像中示出的每个室定义aoi。可对受关注区域确定引擎3806进行编程，以通过在aoi内包括室中对测量被分析物浓度波动最敏感的图像区域来定义适当的aoi。例如，这将是室内的区域，其中可以通过成像元件3216测量电磁辐射如光发射(例如荧光、uv等)的最小波动(参见图26)。更进一步地，当测量被分析物波动时，图像区域可以包括对室中微物体位置最不敏感的图像区域。例如，这可以是室内的区域，其中电磁辐射如光发射(例如荧光、uv等)测量的灵敏度受室中存在的微物体的影响最小。aoi甚至可以进一步定义为位于室3702的非冲刷区域内(参见图35)。[0651]通过参考图35所示微流体装置的室3706的示例横截面，可以使用关于微流体装置及其相应室的空间信息来确定扩散轴3702。该空间信息可以源自系统3200中包含的cad模型、相关软件或单独的软件包，以生成定义的未对齐的aoi3824(参见图34)。然后，针对成像元件和微流体装置的校准算法可以将图像数据定位到该cad模型，以获得受关注区域3702。下文将更详细地讨论图35所示示例装置的组件和特征。[0652]回到图34，基于该定位应用空间校正变换3826，受关注区域确定引擎3806可以产生一组对齐的aoi3828。aoi可以从受关注区域确定引擎3806自动确定，或者可以通过用户输入到显示器3212中手动确定(参见图26)。[0653]如上所述，图26(和图27)的系统3200的评分引擎3210可以被设计和配置为分析每个室的受关注区域内的图像区域的至少一部分，以确定指示每个室中的被分析物的量的得分。此外，由于得分可以是无量纲的值，其可以通过评分引擎3210与其他得分进行比较，以指示被分析物的相对量或浓度，所确定的得分可以转换为用户的浓度单位。图34的评分引擎可以以基本上相同的方式操作。[0654]为了确定得分，根据各种实施方案，评分引擎3810可以使用各种模型，如上文参考图26和27所讨论的那些模型。此外，与上文关于图像处理单元3204所公开的内容相似，图像处理单元3804还可以包括校准引擎3808。校准引擎3808可以被设计和配置成针对由来自微流体装置并在测定图像捕捉期间的背景噪声引起的图像畸变，应用每个室的aoi归一化过程3838。然后可以通过评分引擎3810对得到的校准图像aoi进行评分。如上文所述，背景噪声可能是由于例如伪影或仪器设置和成像参数-例如，来自激发源的光、相机噪声和环境光。背景噪声还可以归因于例如由样品、容器、成像介质的自发荧光或由未与特定靶标结合的荧光团产生的荧光所赋予的背景荧光。测定图像捕捉期间的图像畸变可以源自例如微流体装置设计或成像装置设计。图像畸变类型可以包括例如图像边缘效应、投影仪不均匀性、相机晕光、透视畸变、桶形畸变、枕形畸变、胡须畸变和色差。[0655]校准引擎3808可以被设计和配置成针对在测定图像捕捉之前和/或在测定图像捕捉期间引入的来自微流体装置的图像畸变，对每个室的aoi或至少每个室的aoi的图像区域进行归一化。校准引擎3808可以通过从测定图像和/或信号参比图像中减去背景图像并且考虑在信号参比图像中捕捉的图像获取畸变来实现这一点。然后可以通过评分引擎3810对得到的归一化图像aoi进行评分。评分引擎3810可以被设计和配置为应用aoi量化过程3834来确定分泌得分3836。[0656]如上所述，存在各种模型用于将图像归一化以进行特征提取和异常检测。这里将不再赘述，在上文已详细讨论。[0657]根据各种实施方案，图像获取单元3802和图像处理单元3604可以集成到单个物理单元中。或者，图像获取单元3202(参见图26)和图像处理单元3804可以单独定向，在独立单元中提供，使得单元仍然通信连接以交换信息。[0658]上述图像处理单元3804的每个组件可以是硬件，或者可以部分或全部是软件模块。[0659]本文描述的方法可以根据应用通过各种手段来实现。例如，这些方法可以用硬件、固件、软件或其任何组合来实现。对于硬件实现，处理单元可以在一个或多个专用集成电路(asic)、数字信号处理器(dsp)、数字信号处理装置(dspd)、可编程逻辑装置(pld)、现场可编程门阵列(fpga)、处理器、控制器、微控制器、微处理器、电子设备、被设计用于执行本文所述功能的其他电子单元或其组合中实现。[0660]在各种实施方案中，本教导的方法可以以固件和/或软件程序以及用诸如c、c 等传统编程语言编写的应用程序实现。如果以固件和/或软件实现，则本文描述的实施方案可以在非暂态计算机可读介质上实现，其中存储有程序用于使计算机执行上述方法。应当理解，本文描述的各种引擎可以在计算机系统(例如图1的计算机系统3100)上提供，从而处理器3104将根据由存储器组件3106/3108/3110和通过输入设备3114提供的用户输入中的任何一个或其组合提供的指令来执行由这些引擎提供的分析和确定。[0661]如上文所详细讨论的，图17示出了根据各种实施方案，为了量化室中存在的分泌的被分析物的量所执行的功能。如上文所详细讨论的，图18示出了根据各种实施方案，为了计算代表分泌的被分析物的量的绝对值或相对值所执行的功能。如上文所详细讨论的，图19示出了根据各种实施方案，为了评估代表细胞克隆群中分泌的被分析物的量的绝对值或相对值所执行的功能。下文详细讨论了用于量化分泌的被分析物的量、用于计算代表分泌的被分析物的量的绝对值或相对值或用于评估代表细胞克隆群中分泌的被分析物的量的绝对值或相对值的方法的各种进一步的实施方案。[0662]方法1[0663]根据各种实施方案，提供了一种用于由评估生物微物体或生物微物体的群分泌的被分析物水平的方法。所述方法的实例在例如图36中所示。参考图36，在步骤3910将生物微物体3710(参见图35)引入室或微流体装置的室。参考图35，微流体装置可以包括具有流动区域3708的外壳，其中室3706(或室3706)与流动区域3708流体连接，并且其中室包含基本流体介质。允许生物微物体3710或由其生成的生物微物体的群将被分析物分泌到室内的基本流体介质中。[0664]回到图36，在步骤3920，将含有多个报道分子的第一流体介质引入流动区域和室。每个报道分子可以包括配置为与分泌的被分析物结合的结合区域和可检测的标记物。[0665]扩散到室中的多个报道分子的一部分可以与其中分泌的被分析物结合，从而在步骤3930产生多个报道基因:分泌的被分析物(rmsa)复合物。[0666]在步骤3940将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质不包含任何报道分子。然后，未结合的报道分子可以在步骤3950中扩散出室。然后，通过对相关一个或多个室和一个或多个流动区域拍摄的图像，在微流体装置3960内的受关注区域内检测报道分子。然后在步骤3970分析图像以计算室中的分泌产物水平。[0667]在各种实施方案中，受关注区域位于室的非冲刷区域内，例如如图35的3702所示。在各种实施方案中，受关注区域位于室内对室内细胞位置最不敏感的区域内。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室内的生物物体(例如细胞)至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。受关注区域也可以位于室内对由室边缘产生的人工背景信号最不敏感的区域中。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室边缘或壁至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。[0668]在一些实施方案中，报道分子可结合分泌的被分析物，从而形成rmsa复合物，其具有1:1、2:1、3:1、4:1、2:2、4:2等的rmsa复合物的报道分子:分泌的被分析物的化学计量比。[0669]在各种实施方案中，检测报道分子的步骤可以包括检测未结合的报道分子以及检测作为rmsa复合物一部分的报道分子。[0670]回到图35，例如，根据各种实施方案，室可以具有分离区域3705和将分离区域3705与流动区域3708流体连接的连接区域3704，其中分离区域3705和连接区域3704被配置为使得分离区域3705中任何实施的流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域3708中任何实施的流体介质的组分进行交换。[0671]根据用于评估或确定被分析物的分泌水平的各种实施方案，所述方法还包括将室内的生物微物体扩增为生物微物体的克隆群。[0672]根据用于评估或确定被分析物的分泌水平的各种实施方案，所述方法还可以包括用培养基对流动区域进行灌注，其中灌注可以在将生物微物体引入室之后以及在将第一流体介质引入流动区域之前进行。在一些实施方案中，当引入生物微物体时，培养基可以与室中的基本流体介质相同。培养基可以包括例如可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。在各种实施方案中，可以通过包括饲养细胞的上清液培养基的一部分来改善在微流体装置内培养的细胞的活力，所述饲养细胞的上清液培养基的一部分提供刺激或以其他方式支持在微流体装置内培养的细胞的辅助生物分子。饲养细胞本身可以不存在于微流体装置内，但可以在标准反应容器中培养。[0673]可以收集由于饲养细胞的存在而调节的培养基的部分并将其递送到微流体装置。在各种实施方案中，可以根据需要测量和改变溶解氧的量，与在培养孔板、摇瓶等中的这种调节相比，在本文所述的微流体环境中，这可能是个简便的过程。在各种实施方案中，可以监测和改变微流体环境内的培养基的ph，这也是比在标准使用的塑料器皿中更简便的过程。[0674]在各种实施方案中，可以将耗尽的生长培养基添加到微流体环境中，其可以充当选择机制以分析微流体环境中的哪些克隆仍然可以更容易地产生分泌的被分析物，或者可以用于接近各种类型的反应容器(其可以包括孔板、摇瓶和生物反应器)的放大环境。在各种实施方案中，可以向微流体环境内添加可溶性刺激性组分例如抗体(包括但不限于cd28)、细胞因子、生长因子等，以刺激微流体环境内的细胞比引入刺激性组分之前更快速地产生被分析物或产生不同的被分析物。在各种实施方案中，可以将一种或多种被配置为防止细胞彼此粘附以及粘附到室的化合物和/或试剂添加到培养基中。[0675]在各种实施方案中，向培养基中进行上述一种或多种添加可以对室内的一个或多个细胞赋予选择压力。[0676]在各种实施方案中，将第一流体介质引入流动区域包括在第一时间段内使第一流体介质流经流动区域。在一些实施方案中，第一时间段可基于未结合的报道分子的扩散谱的模拟。在各种实施方案中，第一时间段可以是约30至约60分钟。[0677]如上所述，根据各种实施方案，该方法还可以包括将第二流体介质引入到一个或多个流动区域和坞中，其中第二流体介质不包括报道分子；以及允许至少一部分未结合的报道分子从室中扩散出来，其中检测位于受关注区域内的报道分子在选择的时间发生，使得已经从室中扩散出来的未结合的报道分子的量比已经从室中扩散出来的rmsa复合物的量大至少2倍。检测可以包括检测未结合的报道分子和检测作为rmsa复合物一部分的报道分子。在各种实施方案中，将第二流体介质引入到流动区域中可以包括使第二流体介质在第二时间段流经流动区域。在一些实施方案中，可以基于未结合的报道分子和rmsa复合物的扩散谱的模拟来选择第二时间段。[0678]在各种实施方案中，受关注区域可以包括沿着从室内扩散出来进入流动区域中的轴对齐的室的至少一部分。在各种实施方案中，检测位于受关注区域内的报道分子可以包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中至少一些可检测信号是由位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出的。在一些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多的可检测信号是由位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出的。在各种实施方案中，检测位于受关注区域内的报道分子还可以包括通过从测量的可检测信号的强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。可能不用在每次检测报道分子时都测量背景信号。在各种实施方案中，可以基于已知/标准条件(例如，芯片类型、芯片中室的位置、可检测的标记物的类型、基本流体介质的组分)预先确定背景信号。[0679]根据各种实施方案，可以在将生物微物体引入室之前的时间测量受关注区域内的背景信号强度。在各种实施方案中，可检测信号的测量强度或减去背景的信号强度可针对室中观察到的多个生物物体(例如细胞)进行归一化。[0680]在各种实施方案中，可以量化被分析物的分泌水平，其中量化可以基于许多测量中的任何一项，例如可检测信号的测量强度或减去背景的信号强度，其任何一项都可以通过视场中的渐晕(相对于图像中心，图像的亮度或饱和度朝向边缘而降低)进行归一化。[0681]在各种实施方案中，可以提供或确定室的分泌得分。下文将详细讨论分泌评分。[0682]在各种实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以是报道分子的分子量的至少两倍。在一些实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少四倍。在其他实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少十倍。[0683]在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含肽或蛋白。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含具有seqidno：1至10中任一项的序列的肽。在各种实施方案中，报道分子的结合组分包含蛋白a、蛋白g或者蛋白a或蛋白g的igg结合片段。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含适体。[0684]在各种实施方案中，可检测的标记物可以包括例如可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。在各种实施方案中，可检测的标记物可以是荧光标记物。[0685]在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物可以包括蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物可以是抗体。在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物可以是除抗体以外的蛋白。[0686]在各种实施方案中，微流体装置可以包括多个室，其中布置步骤可以包括将生物微物体布置在多个室的至少一部分内。在各种实施方案中，如图36所示例的方法还可以包括比较多个室的室子组中每个室的分泌水平的步骤。该方法还可以包括比较多个室中多于一个室的得分的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括对分泌水平进行量化的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括选择多个室中的一个或多个以及从所选的一个或多个室中输出生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。[0687]根据本文中各种实施方案的方法可以允许进行亚克隆和通过进一步扩增和测定所得亚克隆群而对亚克隆进行比较分析。这可以例如通过将所选的克隆群移动到微流体装置内的另一组室并且针对所选的群的每个单独细胞再次扩增来实现。在各种实施方案中，如图36所示例的方法还可以包括输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群到流动区域(或通道)，或从微流体装置中输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。在各种实施方案中，可以在每个所选的室上单独地执行从室输出到通道或从室和/或通道输出离开微流体装置的步骤(例如，可以在一系列输出步骤中输出来自一组所选的室的细胞，每次一个室)。在各种实施方案中，布置在室内的细胞可以来自先前测定的室，允许进行亚克隆和对亚克隆进行比较分析。例如，特定抗体的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量特异性抗体的细胞。类似地，蛋白家族(例如具有igg结构域的抗体)的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量抗体的细胞。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的室的所有细胞将被选择并在相同的室或芯片的其他包含区域中扩增。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的相同室的一个或多个细胞将被选择并在不同的室中扩增。在各种实施方案中，可以对扩增的细胞重复(1x、2x、3x、4x或更多次)执行生成分泌的被分析物的相对或绝对值。[0688]根据各种实施方案，本文讨论的各种方法的应用可以允许通过重复测定的反馈来检查特定条件对细胞的影响。例如，可以使用与分泌的被分析物的大规模生产更密切相关的条件和材料，以便找到并表征最合适的克隆用于进一步检查。在另一个实例中，可以以更可重复的方式检查用于b细胞抗体刺激的不同刺激方案，并且可以对其进行测定以便更一致地评估一种方案相对于另一种方案的益处。[0689]方法2[0690]根据各种实施方案，提供了一种用于评估生物微物体或生物微物体的群的被分析物分泌水平的方法。例如，图37中示出了所述方法的一个实例。参考图37，在步骤4010中，向一个或多个流动区域(通道)和室提供包含多个报道分子的第一流体介质。在各种实施方案中，这些报道分子包含被配置成结合分泌的被分析物的结合组分；和可检测的标记物。[0691]在步骤4020，拍摄室和流动区域的图像，以测量受关注区域内可检测信号的强度。然后在步骤4030，将不包含任何报道分子的第二流体介质引入流动区域。然后在4040，将生物微物体引入室。允许生物微物体将被分析物分泌到室内的介质中。然后在步骤4050，将包含多个报道分子的第三流体介质引入流动区域。在步骤4060，扩散到室中的多个报道分子的一部分可以与其中分泌的被分析物结合，产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物。然后，通过对一个或多个相关室和流动区域拍摄的图像，检测微流体装置4070内受关注区域内的报道分子。然后在步骤4080分析图像以计算一个或多个室中的分泌产物的水平。[0692]在各种实施方案中，受关注区域包括室的至少一部分，其沿着从室内向外扩散到流动区域中的轴排列。图28中提供了一个实例。如图27和28所示，受关注区域可以被划分为多个区段3230。可以对每个区段3232计算平均信号，并可以将其针对区间3234的子部分进行量化。这可以用于确定分泌得分3236。[0693][方法3]或者，根据各种实施方案，受关注区域位于室的非冲刷区域内，例如如图35的3702所示。在各种实施方案中，受关注区域位于室中对室内细胞位置最不敏感的区域内。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室内的生物物体(例如细胞)至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。受关注区域也可以位于室中对室边缘产生的人工背景信号最不敏感的区域。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室边缘或壁至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。[0694]在各种实施方案中，报道分子可结合分泌的被分析物，从而形成rmsa复合物，其具有1:1、2:1、3:1、4:1、2:2、4:2等的rmsa复合物的报道分子:分泌的被分析物的化学计量比。[0695]在各种实施方案中，检测报道分子的步骤可以包括检测未结合的报道分子以及检测作为rmsa复合物一部分的报道分子。[0696]根据用于评估或确定被分析物分泌水平的各种实施方案，该方法还包括将室内的生物微物体扩增为生物微物体的克隆群。[0697]根据用于评估或确定被分析物的分泌水平的各种实施方案，所述方法还可以包括用培养基对流动区域进行灌注，其中灌注可以在将生物微物体引入室之后以及在将第一流体介质引入流动区域之前进行。在一些实施方案中，当引入生物微物体时，培养基可以与室中的第二介质相同。培养基可以包括例如可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。在各种实施方案中，可以通过包括饲养细胞的上清液培养基的一部分来改善在微流体装置内培养的细胞的活力，所述饲养细胞的上清液培养基的一部分提供刺激或以其他方式支持在微流体装置内培养的细胞的辅助生物分子。饲养细胞本身可以不存在于微流体装置内，而是可以在标准反应容器中培养。[0698]可以收集由饲养细胞的存在而调节的培养基的部分并将其递送到微流体装置。在各种实施方案中，可以根据需要测量和改变溶解氧的量，与在培养孔板、摇瓶等中的这种调节相比，在本文所述的微流体环境中，这可能是更简便的过程。在各种实施方案中，可以监测和改变微流体环境内的培养基的ph，这也是比在标准使用的塑料器皿中更简便的过程。[0699]在各种实施方案中，可以将耗尽的生长培养基添加到微流体环境中，其可以充当选择机制以分析微流体环境中的哪些克隆仍然可以更容易地产生分泌的被分析物，或者可以用于接近各种类型的反应容器(其可以包括孔板、摇瓶和生物反应器)的放大环境。在各种实施方案中，可以添加可溶性刺激性组分例如抗体(包括但不限于cd28)、细胞因子、生长因子等，其可以刺激微流体环境内的细胞比引入刺激性组分之前更快速地产生被分析物或产生不同的被分析物。在各种实施方案中，可以将一种或多种被配置为防止细胞彼此粘附以及粘附到室的化合物和/或试剂添加到培养基中。[0700]在各种实施方案中，向培养基中进行上述一种或多种添加可以对室内的一个或多个细胞赋予选择压力。[0701]在各种实施方案中，受关注区域可以包括沿着从室内扩散出来进入流动区域中的轴对齐的室的至少一部分。在各种实施方案中，检测位于受关注区域内的报道分子可以包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中至少一些可检测信号是由位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出的。在一些实施方案中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多的可检测信号是由位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出的。在一些实施方案中，检测位于受关注区域内的报道分子还可以包括通过从测量的可检测信号的强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。可能不必在每次检测报道分子时测量背景信号。在各种实施方案中，可以基于已知/标准条件(例如，芯片类型、芯片中室的位置、可检测的标记物的类型、流体介质的组分)预先确定背景信号。[0702]根据各种实施方案，可以在将生物微物体引入室之前的时间测量受关注区域内的背景信号强度。在各种实施方案中，可检测信号的测量强度或减去背景的信号强度可针对室中观察到的多个生物物体(例如细胞)进行归一化。[0703]在各种实施方案中，该方法可进一步包括定量被分析物的分泌水平。对产物分泌水平的量化可基于多种测量，如前文讨论的那些中的任一种。[0704]在各种实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以是报道分子的分子量的至少两倍。在一些实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少四倍。在其他实施方案中，分泌的被分析物的分子量可以比报道分子的分子量大至少十倍。[0705]在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含肽或蛋白。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含具有seqidno：1至10中任一项的序列的肽。在各种实施方案中，报道分子的结合组分包含蛋白a、蛋白g或者蛋白a或蛋白g的igg结合片段。在各种实施方案中，报道分子的结合组分可以包含适体。[0706]在各种实施方案中，可检测的标记物可以包括例如可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。在各种实施方案中，可检测的标记物可以是荧光标记物。[0707]在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物可以包括蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物可以是抗体。在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物可以是除抗体以外的蛋白。[0708]在各种实施方案中，微流体装置可以包括多个室，其中布置步骤可以包括将生物微物体布置在多个室的至少一部分内。在各种实施方案中，如图37所示例的方法还可以包括比较多个室的室子组中每个室的分泌水平的步骤。该方法还可以包括比较多个室中多于一个室的得分的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括对分泌水平进行量化的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括选择多个室中的一个或多个以及从所选的一个或多个室中输出生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。[0709]如上文详细描述的，根据本文中各种实施方案的方法可以允许进行亚克隆和通过进一步扩增和测定所得亚克隆群而对亚克隆进行比较分析。这可以通过将所选的克隆群移动到微流体装置内的另一组室并且针对所选的群的每个单独细胞再次扩增来实现。在各种实施方案中，如图37所示例的方法还可以包括输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群到流动区域(或通道)，或从微流体装置中输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。在各种实施方案中，可以在每个所选的室上单独地执行从室输出到通道或从室和/或通道输出离开微流体装置的步骤(例如，可以在一系列输出步骤中输出来自一组所选的室的细胞，每次一个室)。在各种实施方案中，布置在室内的细胞可以来自先前测定的室，允许进行亚克隆和对亚克隆进行比较分析。例如，特定抗体的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量特异性抗体的细胞。类似地，蛋白家族(例如具有igg结构域的抗体)的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量抗体的细胞。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的室的所有细胞将被选择并在相同的室或芯片的其他包含区域中扩增。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的相同室的一个或多个细胞将被选择并在不同的室中扩增。在各种实施方案中，可以对扩增的细胞重复(1x、2x、3x、4x或更多次)执行生成分泌的被分析物的相对或绝对值。[0710]如上所述，本文讨论的各种实施方案的应用可以允许通过重复测定的反馈来检查特定条件对细胞的影响。例如，可以使用与分泌的被分析物的大规模生产更密切相关的条件和材料，以便找到并表征最合适的克隆用于进一步检查。在另一个实例中，可以以更可重复的方式检查用于b细胞抗体刺激的不同刺激方案，并且可以对其进行测定以便更一致地评估一种方案相对于另一种方案的益处。[0711]方法3(参见方法2部分，该部分讨论了方法2的交替钩区域到颈部区域的实施方案)[0712]方法4[0713]根据各种实施方案，提供了一种用于评估生物微物体或微物体的群的被分析物分泌水平的方法。图38示出了描述该方法的示例过程的工作流程。在步骤4110，向一个或多个流动区域(通道)和室提供包含多个报道分子的第一流体介质。在各种实施方案中，这些报道分子包含被配置成结合分泌的被分析物的结合组分；和可检测的标记物。[0714]回到图38，在步骤4120，拍摄一个或多个室和流动区域的图像，以测量受关注区域内可检测信号的强度。然后在步骤4130，将不包含任何报道分子的第二流体介质引入流动区域。然后在步骤4140，将生物微物体引入室。允许生物微物体将被分析物分泌到室内的介质中。[0715]然后在步骤4150，将包含多个报道分子的第三流体介质引入流动区域。此外，随后允许多个报道分子的一部分扩散到室中。在步骤4160，报道分子与其中分泌的被分析物结合以产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物。[0716]在步骤4170中，拍摄一个或多个室和流动区域的图像，以检测微流体装置内的受关注区域内的报道分子。在步骤4180，将不包含任何报道分子的第四流体介质提供到一个或多个室和流动区域，以促进报道分子扩散出室。然后，通过对相关一个或多个室和流动区域拍摄的图像，在微流体装置4190内的受关注区域内检测报道分子。然后在步骤4195，分析图像以计算室中的分泌产物水平。[0717]在各种实施方案中，受关注区域包括室的至少一部分，其沿着从室内向外扩散到流动区域中的轴排列。图28中提供了一个实例。如图27和28所示，受关注区域可以被划分为多个区段3230。可以对每个区段3232计算平均信号，并可以将其针对区间3234的子部分进行量化。这可以用于确定分泌得分3236。[0718][方法5]或者，根据各种实施方案，受关注区域位于室的非冲刷区域内，例如如图35的3702所示。在各种实施方案中，受关注区域位于室中对室内细胞位置最不敏感的区域内。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室内的生物物体(例如细胞)至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。受关注区域也可以位于室中对室边缘产生的人工背景信号最不敏感的区域。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室边缘或壁至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。[0719]关于形成的rmsa复合物的化学计量以及其检测，请参考上文的详细讨论。[0720]根据各种实施方案，关于室和流动区域的特征，请参考上文的详细讨论。[0721]关于有关微物体的克隆群、用培养基灌注流动区域、培养基组成、耗尽的生长培养基、可溶性刺激组分、受关注区域、减去背景的信号、信号归一化、分泌得分、分泌的被分析物分子量、报道分子组成(例如，氨基酸、核酸)、可检测的标记物的特征和性质以及分泌的被分析物的组成的讨论，请参考上文的详细讨论。[0722]在各种实施方案中，微流体装置可以包括多个室，其中布置或提供生物微物体的步骤可以包括将生物微物体布置或提供在多个室的至少一部分内。在各种实施方案中，所述方法还可以包括比较多个室的室子组中每个室的分泌水平的步骤。该方法还可以包括比较多个室中多于一个室的得分的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括对分泌水平进行量化的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括选择多个室中的一个或多个以及从所选的一个或多个室中输出生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。[0723]根据本文中各种实施方案的方法可以允许进行亚克隆和通过进一步扩增和测定所得亚克隆群而对亚克隆进行比较分析。这可以例如通过将所选的克隆群移动到微流体装置内的另一组室并且针对所选的群的每个单独细胞再次扩增来实现。在各种实施方案中，所述方法还可以包括输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群到流动区域(或通道)，或从微流体装置中输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。在各种实施方案中，可以在每个所选的室上单独地执行从室输出到通道或从室和/或通道输出离开微流体装置的步骤(例如，可以在一系列输出步骤中输出来自一组所选的室的细胞，每次一个室)。在各种实施方案中，布置在室内的细胞可以来自先前测定的室，允许进行亚克隆和对亚克隆进行比较分析。例如，特定抗体的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量特异性抗体的细胞。类似地，蛋白家族(例如具有igg结构域的抗体)的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量抗体的细胞。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的室的所有细胞将被选择并在相同的室或芯片的其他包含区域中扩增。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的相同室的一个或多个细胞将被选择并在不同的室中扩增。在各种实施方案中，可以对扩增的细胞重复(1x、2x、3x、4x或更多次)执行生成分泌的被分析物的相对或绝对值。[0724]在另一个实施方案中，该方法的应用可以允许通过重复测定的反馈来检查特定条件对细胞的影响。例如，可以使用与分泌的被分析物的大规模生产更密切相关的条件和材料，以便找到并表征最合适的克隆用于进一步检查。在另一个实例中，可以以更可重复的方式检查用于b细胞抗体刺激的不同刺激方案，并且可以对其进行测定以便更一致地评估一种方案相对于另一种方案的益处。[0725]方法5[见上文段落][0726]方法6[0727]根据各种实施方案，提供了一种用于评估被分析物在多个生物微物体或生物微物体的群间的相对分泌水平的方法。图39示出了描述该方法示例过程的工作流程。如图39所示，所述方法包括可选步骤4210、4220、4230、4270和4280，根据各种实施方案，这些步骤可以选择性地执行以增强测量，例如，在实验期间增加信噪比、消除背景噪声或纠正系统错误。下文进一步描述了可选步骤4210、4220、4230、4270和4280中的每一步。[0728]参考图39，步骤4240的方法包括将包含多个生物微物体的第一流体介质引入微流体装置的多个室。在各种实施方案中，微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中多个室中的每个室均与流动区域流体连接。在微流体装置内，允许多个生物微物体或生物微物体的群将可溶性被分析物分泌到多个室内的第一流体介质中。[0729]根据各种实施方案，在步骤4250，所述方法包括将第二流体介质引入流动区域。第二流体介质包含多个可溶性报道分子，其中每个可溶性报道分子均包含被配置为结合分泌的被分析物的结合组分和可检测的标记物。另外，随后允许多个可溶性报道分子的一部分扩散到室中。[0730]在步骤4260，可溶性报道分子与其中分泌的被分析物结合，以产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物。然后，在步骤4290，通过将位于微流体装置内的受关注区域内的可溶性报道分子成像并在步骤4295中分析图像以计算微流体装置的室中的分泌或分泌产物的相对水平来检测这些复合物。[0731]在各种实施方案中，多个室中的每个室均包括分离区域，该分离区域与流动区域中第二流体介质的二次流动分离。在各种实施方案中，多个室中的每个室均包括与流动区域中第二流体介质的直接流动分离的连接区域。[0732]在各种实施方案中，多个生物微物体的单个生物微物体被布置到多个室中的单个室中。在各种实施方案中，可溶性报道分子的浓度为被分析物的可溶性报道分子的kd的约1-10倍。[0733]在各种实施方案中，以约0.1-10秒的刷新率刷新流动区域中的第二流体介质，并且刷新率是替换流动区域中全部流体体积的时间段。[0734]在各种实施方案中，允许多个报道分子的一部分扩散进入多个室中包括允许多个报道分子跨流动区域和多个室达到平衡状态。在各种实施方案中，在引入第二流体介质后3小时内达到平衡状态。[0735]在各种实施方案中，所述方法进一步包括获得多个室中每个室的分泌水平或分泌得分和基于获得的分泌得分对多个室进行评级。[0736]在各种实施方案中，可溶性报道分子包含至少两个不同的报道分子，每个报道分子均具有不同的标记物。在各种实施方案中，每个室均包括朝向流动区域的单个开口。在各种实施方案中，流动区域包括微流体通道，并且每个室均包括分离区域和将分离区域与微流体通道流体连接的连接区域。连接区域具有朝向微流体通道的近端开口和朝向分离区域的远端开口。[0737]在各种实施方案中，受关注区域包括室的至少一部分，其沿着从室内向外扩散到流动区域中的轴排列。图28中提供了一个实例。如图27和28所示，受关注区域可以被划分为多个区段3230。可以对每个区段3232计算平均信号，并可以将其针对区间3234的子部分进行量化。这可以用于确定分泌得分3236。或者，根据各种实施方案，受关注区域位于室的非冲刷区域内，例如如图35的3702所示。在各种实施方案中，受关注区域位于室中对室内细胞位置最不敏感的区域内。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室内的生物物体(例如细胞)至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。受关注区域也可以位于室中对室边缘产生的人工背景信号最不敏感的区域。在各种实施方案中，受关注区域将位于距离室边缘或壁至少1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米或10微米处。[0738]在各种实施方案中，受关注区域至少部分位于室的分离区域内。在各种实施方案中，受关注区域位于室的钩区域内。在各种实施方案中，受关注区域靠近多个生物微物体中的生物微物体所在的区域。[0739]在各种实施方案中，受关注区域沿着在多个室和流动区域之间扩散的轴(例如沿着在多个室的分离区域和微流体通道之间扩散的轴，例如沿着连接区域定义的扩散的轴)。在各种实施方案中，受关注区域不沿着在多个室和流动区域之间扩散的轴(例如不沿着在多个室的分离区域和微流体通道之间扩散的轴，例如不沿着连接区域定义的扩散的轴)。[0740]在各种实施方案中，受关注区域包括对应于多个室中的室内的区域的图像区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，并且在测量被分析物波动时对室中生物微物体的位置最不敏感。[0741]在各种实施方案中，检测位于微流体装置内受关注区域内的报道分子是在报道分子扩散至多个室中并且报道分子与其中分泌的被分析物的结合处于稳态条件或接近稳态条件之后进行的。[0742]如图39所示，所述方法包括可选步骤4280，将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含任何报道分子，以促进或允许至少一部分未结合的可溶性报道分子扩散出多个室。[0743]在各种实施方案中，来自第二流体介质的多个可溶性报道分子是第一批多个可溶性报道分子，并且在将多个生物微物体引入微流体装置的多个室之前。在各种实施方案中，所述方法任选地包括在可选步骤4210将第四流体介质引入流动区域，其中第四流体介质包含第二批多个可溶性报道分子。[0744]所述方法还包括在可选步骤4220获取包含多个室和流动区域的微流体装置的图像，随后在可选步骤4230将第五流体介质引入流动区域，其中第五流体介质不包含可溶性报道分子。[0745]在各种实施方案中，图像是在t＝0时获取的第一图像，可溶性报道分子的检测包括在可选步骤4270在t＝1时获取第二图像。在t＝l时，流动区域和多个室之间的未结合的可溶性报道分子的扩散已接近稳态。在各种实施方案中，第二图像用于确定流动区域和多个室之间的未结合的报道分子的扩散是否已达到稳态。[0746]在各种实施方案中，受关注区域包括多个室中每个室的连接区域的至少一部分，所述方法进一步包括：从第二图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室的至少一部分确定包含每个连接区域的至少一部分的受关注区域内的可溶性rmsa复合物的相对量。在各种实施方案中，受关注区域中的可溶性rmsa复合物的相对量用于生成可溶性rmsa复合物量的变化的线性近似值，并且线性近似值的斜率用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。[0747]在各种实施方案中，所述方法进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第二图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[0748]在各种实施方案中，受关注区域是多个室中每个室的钩区域，所述方法进一步包括：从第二图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室的至少一部分量化钩区域中可溶性rmsa复合物的相对量，其中钩区域中可溶性rmsa复合物的相对量用于比较各个室之间分泌的可溶性被分析物的产生。[0749]在各种实施方案中，所述方法进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第二图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[0750]在各种实施方案中，第一批多个可溶性报道分子和第二批多个可溶性报道分子包含相同的标记物。在各种实施方案中，第一批多个可溶性报道分子和第二批多个可溶性报道分子包含两种不同的报道分子，每种报道分子均具有不同的标记物。[0751]在各种实施方案中，所述图像是在t＝0时获取的第一图像，所述方法进一步包括：在将第三流体介质引入流动区域之前，并且在允许多个可溶性报道分子的部分扩散到多个室中并与其中分泌的可溶性被分析物结合之后，获取微流体装置的第二图像。[0752]在各种实施方案中，报道分子的检测包括获取微流体装置的第三图像。[0753]在各种实施方案中，受关注区域包括多个室中每个室的连接区域的至少一部分，所述方法进一步包括：从第三图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室的至少一部分量化每个连接区域的多个子区域中每个子区域中的可溶性rmsa复合物的量，其中多个子区域中部分子区域中的可溶性rmsa复合物的量用于生成线性近似值，并且线性近似值的斜率用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。[0754]在各种实施方案中，所述方法进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[0755]在各种实施方案中，所述方法进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像、第二图像和背景图像来获得校正图像。[0756]在各种实施方案中，受关注区域是多个室中每个室的钩区域，所述方法进一步包括：从第三图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室中的至少一部分量化钩区域中的rmsa复合物的量，其中钩区域中rmsa复合物的量用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。[0757]在各种实施方案中，所述方法进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[0758]在各种实施方案中，所述方法进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像、第二图像和背景图像来获得校正图像。[0759]在各种实施方案中，分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少两倍。在各种实施方案中，分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少四倍。在各种实施方案中，分泌的被分析物的分子量是可溶性报道分子分子量的至少十倍。在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物包括蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸之外的有机分子，囊泡或病毒。在各种实施方案中，生物微物体分泌的被分析物是抗体，或任选地是糖基化抗体。[0760]在各种实施方案中，报道分子的结合组分与抗体重链h1结构域结合。在各种实施方案中，报道分子的结合组分与抗体轻链(例如，包含轻链肽的一个或多个氨基酸残基的表位)结合。在各种实施方案中，报道分子的结合组分与λ轻链(例如，包含λ轻链肽的一个或多个氨基酸残基的表位)结合。在各种实施方案中，报道分子的结合组分与κ轻链(例如，包含κ轻链肽的一个或多个氨基酸残基的表位)结合。[0761]在各种实施方案中，生物微物体被引入多个室的至少两个室中的每个室，并且其中所述方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每个室进行的。[0762]在各种实施方案中，所述方法进一步包括：比较多个室的至少两个室的室分泌水平。在各种实施方案中，所述方法进一步包括：比较多个室中多于一个室的分泌得分。[0763]在各种实施方案中，将多个生物微物体引入微流体装置的多个室中包括选择生物微物体和选择性地将所选择的生物微物体移动到多个室内。在各种实施方案中，所述选择是正选择(例如，对生物微物体进行指示健康细胞或表达构建体在细胞基因组中成功/靶向整合的标志物的染色，并且选择阳性染色的生物微物体)。在各种实施方案中，提供了一种方法，其中所述选择是负选择(例如，对生物微物体进行指示不健康细胞或表达构建体在细胞基因组中未成功整合的标志物的染色，并且选择未被染色的生物微物体)。可用于正选择或负选择的标志物的非限制性实例包括但不限于：可评估细胞活力的试剂(例如，膜联蛋白v、碘化丙啶等)、可评估代谢状态的试剂(例如，线粒体膜电位试剂“mitoid染色”)、可评估igg表达的试剂(例如，蛋白-afitc、多克隆ab、抗fc荧光团等)、靶向一种或多种细胞表面标志物的抗原特异性染色剂和/或葡萄糖摄取试剂(例如，2-nbdg)。[0764]在各种实施方案中，提供了一种克隆系发育方法，其进一步包括：从多个室中选择一组室，其中该组室的每个室均具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分；从微流体装置输出包含在选择的一组室的每个室中的一个或多个生物微物体；在相应的反应容器中扩增从选择的一组室的每个室中输出的一个或多个生物微物体；以及测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而对每个生物微物体或克隆群确定分泌水平。[0765]关于形成的rmsa复合物的化学计量以及其检测，请参考上文的详细讨论。[0766]根据各种实施方案，关于室和流动区域的特征，请参考上文的详细讨论。[0767]关于有关微物体的克隆群、用培养基灌注流动区域、培养基组成、耗尽的生长培养基、可溶性刺激组分、受关注区域、减去背景的信号、信号归一化、分泌得分、分泌的被分析物分子量、报道分子组成(例如，氨基酸、核酸)、可检测的标记物的特征和性质以及分泌的被分析物的组成的讨论，请参考上文的详细讨论。[0768]在各种实施方案中，微流体装置可以包括多个室，其中布置或提供生物微物体的步骤可以包括将生物微物体布置或提供在多个室的至少一部分内。在各种实施方案中，所述方法还可以包括比较多个室的室子组中每个室的分泌水平的步骤。该方法还可以包括比较多个室中多于一个室的得分的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括对分泌水平进行量化的步骤。在各种实施方案中，该方法还可以包括选择多个室中的一个或多个以及从所选的一个或多个室中输出生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。[0769]根据本文中各种实施方案的方法可以允许进行亚克隆和通过进一步扩增和测定所得亚克隆群而对亚克隆进行比较分析。这可以例如通过将所选的克隆群移动到微流体装置内的另一组室并且针对所选的群的每个单独细胞再次扩增来实现。在各种实施方案中，所述方法还可以包括输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群到流动区域(或通道)，或从微流体装置中输出所选的生物微物体或由其生成的生物微物体的群的步骤。在各种实施方案中，可以在每个所选的室上单独地执行从室输出到通道或从室和/或通道输出离开微流体装置的步骤(例如，可以在一系列输出步骤中输出来自一组所选的室的细胞，每次一个室)。在各种实施方案中，布置在室内的细胞可以来自先前测定的室，允许进行亚克隆和对亚克隆进行比较分析。例如，特定抗体的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量特异性抗体的细胞。类似地，蛋白家族(例如具有igg结构域的抗体)的绝对或相对值可以用于选择和扩增产生大量抗体的细胞。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的室的所有细胞将被选择并在相同的室或芯片的其他包含区域中扩增。在各种实施方案中，来自与表示分泌的被分析物的量的相对或绝对值相关联的相同室的一个或多个细胞将被选择并在不同的室中扩增。在各种实施方案中，可以对扩增的细胞重复(1x、2x、3x、4x或更多次)执行生成分泌的被分析物的相对或绝对值。[0770]在另一个实施方案中，该方法的应用可以允许通过重复测定的反馈来检查特定条件对细胞的影响。例如，可以使用与分泌的被分析物的大规模生产更密切相关的条件和材料，以便找到并表征最合适的克隆用于进一步检查。在另一个实例中，可以以更可重复的方式检查用于b细胞抗体刺激的不同刺激方案，并且可以对其进行测定以便更一致地评估一种方案相对于另一种方案的益处。[0771]问题解决方案[0772]如上文所述，微流体组件通常包括一系列室或样品位置。其中许多组件通常包括一个或多个入口和出口，用于将样品、试剂、探针等移入或移出室或样品位置，以促进微流体组件内的反应和检测。通常情况下，室或样品位置相对于入口和出口串联放置，因此某些室位于更靠近入口的位置，而其他室则位于更靠近出口的位置。因此，产生了一个技术问题，因为这些配置可能会由于室靠近入口和/或出口而在样品、试剂或微物体的浓度中产生固有梯度，这可能会在比较室之间的平衡值时无意中导致测量中的系统偏差。[0773]为了说明这一技术问题，请考虑如果报道分子通过所讨论的入口递送，靠近入口的室通常将比靠近出口的室接收更多的报道分子。因此，可能需要不同的时间段来让每个室内的荧光检测达到平衡状态，该时间段取决于室相对于入口和/或出口的位置。在微流体装置中的多个室间获得了与时间相关的现象的相对测量的情况下，技术问题通过在芯片上达到平衡状态所需时间的差异体现出来。这种差异可能导致相对测量(得分、数值等)较不准确地表示芯片上每个室的测量现象，和/或限制可测定的测量组分的动态范围。[0774]例如，该技术问题扩展到了组件包括冲洗程序以清除之前递送至组件的物质(例如，在该情况下是报道分子)的情况。在本实例情况中，技术问题再次体现出来，因为报道分子的冲洗也会在各个室间具有不均匀的性能。与上述实例一样，在这些类型的冲洗情况下，虽然靠近入口的室将具有更多的报道分子，但由于它们靠近入口，它们将比靠近出口的室更能成功地冲洗出更多的报道分子。因此，与微流体组件中的其他室相比，每个室可能还是缺乏相对均匀的报道分子分布，因为样品、试剂或微物体扩散出室并进入通道，形成在靠近入口处前室(upfrontchamber)的通道区域和靠近出口近端处的后室(latterchamber)的通道区域之间的跨通道的浓度梯度。由于测量组分(例如，样品、试剂或微物体等)在通道和室中之间的浓度差异与扩散速率常数成正比，因此与测量组分扩散相关的任何相对测量或得分都将具有系统偏差。[0775]因此，对于包括一系列室或样品位置、入口和出口的微流体组件，需要解决的一个技术问题是：当任何递送的组分(例如，样品、试剂或探针)分布不均时，可能导致与每个室相关的相对指标如室中可溶性分泌的被分析物的相对浓度发生误差。[0776]本文提供的各种实施方案，例如图37和38所示的那些示例性实施方案，解决了所述技术问题，原因至少如下提供。[0777]申请人意外地发现，微流体组件(例如，微流体芯片)的一系列室或样品位置间的系统误差的技术问题可以通过优化的刷新率(例如，流体交换率、交换率)，例如约0.1-10秒来减少。刷新率可以是通道体积与流速的比率，也就是说，通道的全部体积被新试剂替换的速率。因此，优化刷新率使流体通道成为更好的试剂源(例如，跨微流体装置的试剂浓度更一致)。这一点很重要，因为随着流动区域(例如通道)成为跨微流体芯片的更一致的“源”，在邻近分泌的被分析物或室中的“槽(sink)”的区域，条件(例如，游离报道物穿过通道并进入室的梯度)变得更一致，从而提高扩散到室外的rmsa复合物产生的信号的信噪比。[0778]微流体组件(例如，微流体芯片)的一系列室或样本位置间的系统误差的技术问题也可以通过校正获取的图像来解决，以克服芯片上的噪声影响(例如，平场校正)。如所述，可以使用背景参比和信号参比(例如，荧光参比和扩散参比)来完成校正。此外，获取多个图像可以进一步帮助平均噪声。[0779]通过减少整个微流体组件(例如芯片)的系统误差(例如，入口处室环境和出口处室环境中的误差)，提高了对整个系统的室的相对评分的准确性。当报道物流入通道时(冲洗步骤之前)，通过例如使用平衡(即稳态)测定进行成像，可以改善整个系统的相对评级/评分。这样做还导致操作参数的意外发现。例如，发现被引入通道的可溶性报道物的最佳浓度在约1-10倍kd(解离常数，以浓度表示)的范围内。此外，例如，跨通道和室的试剂平衡时间可配置为在约1-3小时内发生。这些以及其他优化参数实例增加了测量的信噪比，从而改善了对芯片上室的评级/评分。[0780]除了解决技术问题外，这些参数共同进一步使得可以使用不同分子量的试剂以及在不同分子量的分泌的被分析物上进行测定。在各种实施方案中，相同的方案与不同分子量的试剂的各种组合一起使用，并用于不同分子量的分泌的被分析物。在各种实施方案中，相同的方案与单试剂一起使用，以检测不同重量的分泌的被分析物。在各种实施方案中，相同的方案与不同分子量的试剂一起使用并用于不同分子量的分泌的被分析物。[0781]此外，由于使用平衡(例如，稳态)测定的成像与时间无关，因此可以获取多个图像并用于平均噪声。平衡测定更灵敏、更准确，并支持多种该测定中可进行的新的目标分泌分子和新的检测试剂。[0782]优化扩散测定性能的一个重要考虑因素是了解通道和室(例如，坞)之间的扩散，以及该扩散在微流体组件(例如，芯片)中在不同步骤中如何变化。在平衡期间，检测试剂可以从通道导入并扩散到室(例如，坞)中，这降低了通道中检测试剂的浓度。在这种情况下，通道充当“源”(高浓度区域)，且室(例如，坞)充当“槽”(低浓度区域)。目标蛋白使室(例如，坞)中的检测试剂与分泌细胞结合，从而有效地增加室(例如，坞)的容量以充当更大的槽。为了保持恒定的浓度(恒定的源)，检测试剂需要通过持续灌注检测试剂而在通道中不断补充。因此，优化的刷新率为约0.1-10秒。[0783]由于在流体通过针头被吸入微流体芯片的情况下，存在从入口(最靠近泵的芯片端口)到出口(最靠近针头的芯片端口)或相反的定向流动，因此分子的浓度随着其在芯片上扩散到室(例如，坞)中而耗尽。结果是，通道中出口处的室(例如，坞)的检测试剂浓度较低，从而在芯片上产生梯度，直到系统完全平衡。“源”和“槽”的这种相互影响也在含有分泌分子的细胞的室(例如，坞)中发挥作用。在这种情况下，室(例如，坞)作为源起作用，而通道则是分泌分子的槽。扩散到通道中的分泌分子沿流体通道的路径长度而积累。这种作用在分泌分子增加的流动方向(入口到出口)上形成梯度。[0784]在这两种情况下，均可以使用更快的流速来缓解这种影响，以帮助通道充当更均匀的“源”或“槽”。虽然室(例如，坞)中的流体主要由扩散控制，但通道中的层流在室(例如，坞)中产生小漩涡。这些漩涡的存在可以增加通道和室(例如，坞)之间的交换速率，并且交换速率可以随着层流速率的增加而增加。[0785]稳态或平衡测定解决了进一步的技术问题。例如，如图41a和图41b所示(平均得分相比于通道部分(channelfraction))，冲洗测定中的系统偏差被测量为通道部分的函数。对于图41a和图41b中示出的实例，通过将单个克隆细胞系加载到芯片上并使用por冲洗测定和原型bkm平衡测定对芯片进行测定，以生成数据。[0786]虽然每个坞的得分会不同，但理论上每个通道部分的平均得分应该是相似的(以蓝色显示)。然而，冲洗测定中的显著斜率(从入口到出口的平均得分变化为37％)表明存在显著偏差，而平衡(例如，稳态)测定(或在游离试剂平衡期间拍摄的图像，而不是在冲洗期间拍摄的图像)作为通道部分的函数，表明几乎没有偏差或没有偏差。冲洗测定中系统误差的根本原因可能是芯片上不完全平衡的结果，或者是平衡期间灌注速率较慢的结果。例如，较慢的灌注速率不会移除流动区域中的分泌蛋白并用新鲜培养基替换通道，同时分泌蛋白从跨通道的梯度上游的室(例如，最靠近入口)扩散出来并进入流动区域(例如，通道)，并随后进入下游室(例如，最靠近出口)。从流入流动区域的上游流动区域中的分泌蛋白到下游室附近的流动区域的该梯度转而改变了下游坞中的稳态平衡，从而增加了下游坞附近的流动区域中的rmsa浓度，从而引入下游坞的得分的误差。[0787]来自代理测定(proxyassay)标准曲线的进一步数据显示了作为坞中浓度的函数的偏差，以及作为视场(fov)的函数的成像顺序(数据未显示)。在当前测定中，扩散参比可以是一个校正图像或一组图像，用于校正由于游离试剂随时间扩散而导致的信号变化。这种校正并不校正由扩散出室的结合的复合物的更高浓度梯度驱动的信号的时间依赖性，这在高分泌室中最为明显。(如菲克定律所述，扩散速率取决于梯度的大小。梯度越大，浓度随时间的变化就越大。)由于在稳态平衡下，信号没有时间依赖性，平衡将消除这种误差和对扩散参比校正的需要。[0788]总之，平衡测定通过消除通道部分和fov/时间系统误差，提高了测量精度。它可以允许使用适用于大范围分子量的单一平衡时间。例如，使用2至2.5小时的平衡时间可使所有小于150kda的试剂达到99％的平衡。此外，虽然小分子迅速扩散出室且因此不会在室中积聚太多，但使用大的检测试剂会导致减缓扩散出室的更大的结合复合物。当系统在检测试剂的存在下平衡至稳态时，室中目标蛋白的量将增加，从而产生更高的信号和提高的灵敏度。[0789]如上文所述，获取多幅图像可以进一步帮助平均噪声，从而提高信噪比。平均n幅图像可将噪声降低n的平方根。例如，平均共四幅图像可使噪声降低2级，而平均九幅图像可使噪声降低3级。例如，为了证明克隆的评级排序一致性的提高，从而证明测量的准确性，在系统完全平衡后，每隔10分钟拍摄一张图像，共拍摄一组11张连续图像。通过参照图42a和图42b，对最高的分泌克隆的子集(最高的65个克隆中的63个，不包括2个高离群值)的相关性进行分析。图42a示出了单个图像之间的相关性，而图42b示出了来自前5个图像的得分的平均值与最后6个图像的平均值的比较。当前，使用评分区域中的区域9-13来计算得分。将区域扩展到5-15以计算得分(即，梯度的斜率)进一步降低了噪声。单个图像之间的平均相关性提高到r2＝0.75 /-0.1，并且比较5和6个图像的平均值将相关性提高到r2＝0.90。进一步地，通过比较单个图像的选择，平均相关性(r2)为0.33 /-0.25(095％ci)，其中最小值为0.15，最大值为0.62。将前5个图像的平均得分与后6个图像的平均值进行比较，r2提高至0.71。[0790]分泌的被分析物[0791]分泌的被分析物。生物微物体分泌的被分析物可以是蛋白、糖、核酸、分子量小于3kd的有机分子、囊泡、病毒及其任何组合。分泌的被分析物可以是自然表达的被分析物(例如，天然表达的)或可以是生物工程化的被分析物(例如，基因插入、缺失、修饰等产生的产物)。作为核酸的分泌的被分析物可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸，可以包括天然或非天然核苷酸。作为病毒的分泌的被分析物可以是病毒颗粒、载体或噬菌体。作为糖的分泌的被分析物可以是单糖、双糖或多糖。糖的非限制性实例可包括葡萄糖、海藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖、核糖、黄原胶或壳聚糖。分泌的小有机分子可包括但不限于生物燃料、油、聚合物或药物，如大环内酯抗生素。作为蛋白的分泌的被分析物可以是抗体或抗体片段。作为蛋白的分泌的被分析物可以是血液蛋白，例如白蛋白、球蛋白(例如，α2巨球蛋白、丙种球蛋白、β2微球蛋白、结合球蛋白(haptoglobulin))、补体蛋白(例如，组分3或4)、转铁蛋白、凝血酶原、α1抗胰蛋白酶等；激素，例如胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、生长激素、生长因子(例如，fgf、hgf、ngf、egf、pdgf、tgf、促红细胞生成素、igf、tnf)、卵泡刺激素、黄体生成素、瘦素等；纤维蛋白，例如丝或细胞外基质蛋白(例如，纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白(vitronectin)、生腱蛋白(tenascin)、多能蛋白聚糖、骨唾液蛋白)；酶，例如金属蛋白酶(例如，基质金属蛋白酶(mmp))或其他类型的蛋白酶(例如，丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬酰胺肽裂解酶)、淀粉酶、纤维素酶、过氧化氢酶、果胶酶等；细菌、酵母或原生动物蛋白；植物蛋白；或病毒蛋白，例如衣壳或包膜蛋白。作为蛋白的分泌的被分析物可以是抗体、抗体片段、酶(包括但不限于蛋白水解酶)、工程化(通常是细胞内蛋白)蛋白，例如白蛋白和/或结构蛋白，包括但不限于蚕丝或蜘蛛丝)。该列表不是限制性的，并且可以通过该方法评估任何可被工程化以被分泌的蛋白。分泌的被分析物可以是抗体-药物缀合物。可具有蛋白、糖、核酸、分子量小于3kd的有机分子和/或病毒的组合的分泌的被分析物的非限制性实例可包括蛋白聚糖或糖蛋白。[0792]报道分子及其特征[0793]报道分子及其特征。[0794]报道分子可以包括被设计用于与分泌的被分析物结合的结合组分，并且还可以包括可检测的标记物。结合组分可以是被配置成与分泌的被分析物结合的任何合适的结合配偶体。结合组分可以是蛋白、肽、核酸或分子量小于3kd的小有机分子。例如，结合组分可以是与另一个核酸序列特异性结合的核酸序列或与蛋白特异性结合的肽(例如识别特定抗体的表位)。在一些实施方案中，结合组分可以与生物微物体的分泌的被分析物家族非特异性结合。例如，结合组分可以是与igg结构域特异性结合的肽或与核酸序列家族中存在的结构域结合的核酸。在一些实施方案中，报道分子可以是多价的，其包含多于一个的结合组分以与分泌的被分析物的多于一个的拷贝结合或与分泌的被分析物的家族的多于一个成员结合。为了便于讨论，如本文所用的术语分泌的被分析物可以指特定的分泌的被分析物分子或分泌的被分析物家族。因此，rmsa复合物的化学计量可以变化。例如，与分泌的被分析物的一个拷贝结合的报道分子可以具有1:1化学计量的rmsa复合物。或者，rmsa复合物可以具有2:1、3:1、4:1、2:2、4:2或其他化学计量的报道分子:分泌的被分析物。报道分子可以具有任何合适的分子量，条件是由报道分子:被分析物复合物的扩散特征所定义的表观“大小”(其取决于分子量)比报道分子本身足够“大”，以观察未结合的报道分子和rmsa复合物之间的差异性扩散。报道分子的分子量可以是分泌的被分析物的分子量的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或相同。在一些实施方案中，报道分子的分子量小于分泌的被分析物的分子量的约50％、40％、30％、20％、10％。rmsa复合物的分子量可以比报道分子的分子量高至少2x、4x、10x、20x、30x、40x、50x或其间的任何数。rmsa复合物的分子量可以比未结合的报道分子的分子量高2倍、4倍或50倍。[0795]实验[0796]系统和装置：采用optoselecttm装置，其是一种纳米流体装置，由berkeleylights,inc.制造并被也由berkeleylights,inc.制造的光学仪器控制。该仪器包括：用于芯片的安装台，其耦接到温度控制器；泵和流体介质调节组件；以及包括相机和适于激活芯片内的光电晶体管的结构光源的光具组。optoselect装置包括采用提供光电晶体管激活的oet力的optoelectropositioning(oeptm)技术配置的基底。芯片还包括多个微流体通道，每个微流体通道具有与其流体连接的多个nanopentm室(或室)。每个室的体积为约1×106立方微米。[0797]生物细胞。使用经工程改造以表达人抗体的cho细胞。计数细胞数目和活力，并将细胞密度调节至5×105/ml，以将细胞加载到optoselect装置上。[0798]设备启动。将250微升100％二氧化碳以12微升/秒的速度流入到optoselect装置中，接着是250微升含有0.1％pluronicf27的pbs(lifetechnologies目录号p6866)以12微升/秒流入，最后是250微升pbs以12微升/秒流入。随后引入培养基。[0799]培养基：使用cdcho培养基(thermofisherscientific目录号10743029)，其是市售的无蛋白且无血清的培养基、化学成分确定的培养基。[0800]培养期间的培养基灌注。根据以下两种方法之一，将培养基灌注通过optoselect装置：[0801]1.以0.01微升/秒的速度灌注2小时；以2微升/秒的速度灌注64秒；并重复。[0802]2.以0.02微升/秒的速度灌注100秒；停止流动500秒；以2微升/秒的速度灌注64秒；并重复。[0803]实施例1：使用肽报道分子评估抗体的相对产量。[0804]报道分子。一种igg结合肽，其分子量为2.4kd，用hilytefluortm555nhs酯(anaspecinc.，目录号as-81251，869da(游离酸的mw)，ex/em550/566nm(cy3滤光器))进行n-末端标记。[0805]暗参比图像采集：在引入细胞之前，首先对不存在培养基或报道分子的optoselect装置成像，获得在本文所述的方法中使用的暗参比图像，其去除背景并对每个nanopen室的图像进行归一化。[0806]信号参比图像采集：使含有浓度为1微克/ml的n末端标记的hilytefluortm555igg结合肽(报道分子)的培养基以0.005微升/秒流入optoselect装置45分钟，直至荧光化合物在nanopen室和微流体通道之间扩散并达到平衡分布。此时获取信号参比图像。然后用不含报道分子的培养基以0.03微升/秒冲洗optoselect装置25分钟。这段冲洗确保报道分子基本上完全从nanopen室扩散出来，在nanopen室内没有留下报道分子或留下微量的报道分子。或者，可以通过使荧光染料本身以相同的摩尔浓度流动来获得信号参比图像，而不需要使用荧光标记的报道分子。[0807]将分泌细胞引入到微流体装置中。将cho细胞引入到optoselect装置中，并使用装置的oep技术的介电电泳力选择性地将其置于nanopen室中。将细胞以每个nanopen室一个细胞放置。如上所述地灌注培养基，持续6天。每天拍摄亮视场图像，以记录每个nanopen室内的细胞扩增。在第一次测定之前选择6天的培养期可以根据生物细胞和分泌的被分析物的特定要求而变化。可能期望在延长的培养期的每一天进行测定(其可以包括亮视场图像)，或者可以在培养期间的选定日期进行一个或多个测定。[0808]测定信号采集。作为测定的初始步骤，获得亮视场图像以关联每个nanopen室内的细胞数目和位置。在采集亮视场图像之后，使浓度为1微克/ml的荧光报道分子以0.05微升/秒流入微流体通道45分钟，为报道分子充分扩散到每个nanopen室中提供足够的时间。在将报道分子引入到nanopen室中之后，基于如上测定的扩散速率，以0.03微升/秒重新开始不含荧光报道分子的培养基的流动25分钟。获得荧光图像。如果需要，可以在被确定为适合于特定细胞和/或由其分泌的被分析物的另外的培养/扩增期间重复该测定。[0809]被分析物相对产量的测定。在每个nanopen室内确定沿着从nanopen室内扩散的轴的受关注区域(aoi)，其包括约20像素宽和200像素长的区域，其中选择aoi的下(第一)端在分离区域内的距离nanopen室的底部(其远离向微流体通道的开口)的选定距离处，其中没有放置细胞。选择aoi长度的第二端(上端)在微流体通道本身内，这确保了位于aoi内和通道内的像素基本上没有信号。aoi的宽度沿着从nanopen室的分离区域到optoselect装置的通道的预期扩散的轨迹居中。如本文所述，aoi被细分为20个子区域(箱)，每个子区域具有20个像素的宽度和沿着10个像素的预期扩散轨迹的长度。[0810]如本文所述使用暗参比和信号参比图像对荧光测定图像进行归一化/校准，以减少系统误差，并且由于视场的不完美照射而使信号图像衰减(rolloff)。aoi中的每个像素都被处理为：[0811][0812]通过将子区域中的每个像素的信号强度相加来确定20个子区域中的每一个的中值强度。图12b中示出了由绘制每个子区域的归一化的中值强度值得到的曲线的表示，其中x轴列出了子区域1至20。子区域1是最远离通道的aoi的子区域，且子区域20是进入通道最远的aoi的子区域。对绘制子区域9-13(图12b中的区域1156)的归一化的中值强度值的曲线部分进行线性回归。如上文所述，确定这些子区域在观察到的信号强度对nanopen室的分离区域的下部(最远离通道)部分内的生物细胞的位置不敏感的区域内。将从该操作获得的斜率值用作以任意单位(a.u.)表示的得分。较大的斜率(得分)表明该nanopen室内的细胞分泌的被分析物更多。[0813]如图21所示，对于每个可见的nanopen室指示标识号和得分(顶部数字是该nanopen室的标识号，并且底部数字是该nanopen室的得分)，这明显与观察到的信号的强度相关。分别具有10.01和8.67的低得分的nanopen室563和941具有至少一个产生被分析物的细胞，但具有少量的报道分子:抗体复合物扩散出这些nanopen室中的每一个。得分分别为13.15和17.26的nanopen室563和949显示出中等得分。最后，得分分别为25.26、29.99和27.95的nanopen室560、566和942产生更大量的抗体被分析物。此处显示的得分未针对存在的细胞数目进行校正。但是，可以对此处显示的得分进行计算。原始得分或细胞计数校正的得分可以用于更容易地对nanopen室进行评级，以帮助确定在开发高产细胞系的过程中将进一步检查哪些nanopen室。也可以采用计算从nanopen室内到通道的浓度变化率的其他方法，例如曲线下面积或本文所述的其他方法，以量化每个nanopen室内分泌的被分析物的生产水平。[0814]测量相对生产率。可以针对每个nanopen室的细胞数目对得分进行校正，如图22a-b所示。在该实验中，细胞类型、培养基、报道分子、培养前图像获取、培养条件和测定条件与上述相同。图22示出了单个nanopen室的图像，在第0天和第3、4、5、6天对其获取亮视场图像，如图21的顶行中的图像所示。另外，在第3、4、5、6天中的每一天进行如上所述的测定，并且对于相同的单个nanopen室，在第3、4、5和6天的每一天的荧光图像显示为在那天相应的亮视场图像下对齐。亮视场图像用于计数存在的细胞数目，其可以在自动化过程中进行，对于所选的nanopen室，随着克隆群被扩增，显示：第0天(1个细胞)；第3天(8个细胞)；第4天(25个细胞)；第5天(65个细胞)；第6天(123个细胞)。如上文所述获得的测定得分(表示负斜率)也稳定地增加，第3天(195a.u.)；第4天(566a.u.)；第5天(1431a.u.)；第6天(2842)。因此，在第3天，nanopen室中的八个细胞得分为195(a.u.)。在第4天，相同的nanopen室现在具有25个细胞，得分为566(a.u.)。在第5天，相同的nanopen室具有65个细胞，得分为1431(a.u.)。最后，在第6天，相同的nanopen室具有123个细胞，得分为2843(a.u.)。图22的图显示了自nanopen室内细胞培养开始以来相对于以天表示的测定时间点(x轴)绘制的测定得分(y-轴)。将绝对得分除以在该时间点存在的细胞数目，以提供针对室中的细胞数目归一化的得分。这产生了所选择的nanopen室中细胞的归一化的生产率测量值(rqp)，其保持在每个细胞22.6至24.1a.u.的范围内。[0815]实施例2.抗体生产的原位评分与宏观生产和细胞系发育的相关性。[0816]系统和装置：如上文所述。[0817]细胞：如实验1中的cho细胞。[0818]培养基：与实验1中所述。[0819]报道分子：如实验1中所述。[0820]培养进行6天，并且如实验1中那样使用分子量为2.4kd的hilytefluortm555标记的igg结合肽进行基于扩散的测定。进行分析，以基于在本文所定义的aoi内观察到的信号的强度来分配得分。对optoselect装置内的每个nanopen室评估得分。在图22a和22b中，绘制了optoselect装置的每个nanopen室，其中水平轴是在芯片上获得的滴度(“得分”，或者在这种情况下，沿着细胞位置不敏感子区域(整个aoi的子区域1-20中的9-13)的中值强度值的斜率))。将每个nanopen室绘制在图的y轴上(图23a)，y轴表示在测定时在相应的nanopen室中计数的细胞数目(从亮视场图像获得)。通过选择三组nanopen室进行第一次选择，所述nanopen室具有：被分析物分泌的低(截止值小于800a.u.)得分；被分析物分泌的中等水平得评分(从刚好小于800a.u.到约1400a.u.)和被分析物分泌的高得分(从约1400到约2400a.u.)。在这些所选的组中的每一组中，存在具有大、中和低细胞数目的nanopen室。[0821]如图23b所示，包括进一步的选择，以选择具有快速生长的nanopen室；显示中等细胞倍增率的室，并且选择第三组以具有仅缓慢扩增的细胞数目。在这些组中的每一组中，存在高、中和低水平的被分析物生产的表示(得分范围在图23b的整个水平轴上)。在所有九种亚型的生长/分泌谱中的一种内选择单个nanopen室，并将所选择的室(每个室保持单独的克隆群)单独输出，首先进入孔板。通过对igg的elisa测定获得滴度。将含有克隆群的低、中和高分泌孔的进一步选择引入到125ml摇瓶中并进一步放大。[0822]通过对igg的elisa测定法测定放大的125ml摇瓶中的克隆群。所选择的克隆显示在图24中，其中每个125ml摇瓶的滴度在y轴上表示，并且相应的nanopen室(细胞来源于其中)的芯片上滴度(在上述测定中获得的以a.u.表示的得分)显示在x轴上。第一组2405源自具有低芯片上滴度(得分)的nanopen室内的细胞。一旦放大到125ml摇瓶，组2405不包括任何高产克隆。第二组2415来源于具有中等范围的芯片上滴度(得分)的nanopen室内的细胞，并且表明来自125摇瓶的中等范围的elisa滴度值。最后一组2425具有高滴度值，均高于139.1微克/ml的池平均值，并且与来自具有也很高的芯片上滴度(以a.u.表示的得分)的nanopen室的细胞相关联。因此证明，对于具有中等至高的芯片上滴度(得分，或在一个特定实施方案中，斜率)的nanopen室中的细胞，与宏观尺度群中获得的滴度水平有良好的相关性。因此，在如本文所述的optoselect装置内进行的测定产生了一种有意义的方法，以更快速地识别更大数目的高产克隆用于细胞系开发。另外，如上文关于图16b所讨论的，单独筛选每个克隆群的能力提供了识别可能不像其他非生产性克隆群那样快速生长的生产性克隆的能力。这些生长较慢、更高产的克隆在大量扩增的条件下被识别的可能性很小。[0823]实施例3.使用适体评估抗体的相对产量。[0824]系统和装置：如上文所述。[0825]细胞：如实验1中的cho细胞。[0826]培养基：与实验1中所述。[0827]报道分子：人免疫球蛋白g的适体，(apta-indextm，apt8，id#44，23-mer，mw.7.4kd，对fc结构域具有亲合力，aptagenl.l.c.序列：5’‑rgp-rgp-rap-rgp-rgp-fup-fcp-fcp-rgp-rap-rap-rap-rgp-rgp-rap-fcp-fup-fcp-fcp-3’。在序列记号中，r-前缀表示核糖核苷酸；f-前缀表示2-氟核苷酸；-p后缀表示磷酸盐；g、a、c、u是标准核苷酸缩写。它被alexafluor594(af594，thermofisherscientific，目录号a20004(nhs酯))mw819.8，ex/em590/617nm)所标记。[0828]使含有浓度为2微克/ml的alexafluor594或alexafluor594标记的适体的培养基流入optoselect装置45分钟，直到荧光化合物在nanopen室和微流体通道之间扩散并达到平衡分布。获取信号参比图像。然后用不含报道分子的培养基以0.03微升/秒冲洗optoselect装置30分钟。这段冲洗确保报道分子基本上完全扩散出nanopen室。[0829]将cho细胞引入到optoselect装置中，并使用装置的oep技术的介电电泳力选择性地将其置于nanopen室中。将细胞以每个nanopen室一个细胞放置。如上文所述灌注培养基，持续6天。每天获取亮视场图像以记录每个nanopen室内的细胞扩增。在实验的第3、4、5和6天的每一天进行测定，以检测抗体产生。[0830]测定信号采集。获得亮视场图像以关联每个nanopen室内的细胞数目和位置。在采集亮视场图像之后，使浓度为2微克/ml的荧光报道分子适体-alexafluor594流入微流体通道50分钟，为报道分子充分扩散到每个nanopen室中提供足够的时间。在将报道分子引入到nanopen室中之后，基于大约7kd的分子的扩散速率，以0.03微升/秒重新开始不含报道分子的培养基的流动30分钟。获得荧光图像。[0831]在每个nanopen室内识别沿着从nanopen室内扩散的轴的受关注区域(aoi)，其包括约20像素宽和200像素长的区域，其位置如上文实验1中所述。aoi的宽度沿着从nanopen室的分离区域到optoselect装置的通道的预期扩散的轨迹居中。aoi被细分为20个子区域(箱或区段)，每个子区域具有20个像素的宽度和沿着预期扩散轨迹的10个像素的长度。如本文所述使用暗参比和信号参比图像对荧光测定图像进行归一化/校准，以减少系统误差，并且由于视场的不完美照射而使信号图像衰减。[0832]通过将子区域中的每个像素的信号强度相加来确定20个子区域中的每一个的中值强度。生成每个子区域的归一化的中值强度值的曲线，并且对绘制子区域9-13的归一化的中值强度值的曲线部分进行线性回归。将从该操作获得的斜率值用作以任意单位(a.u.)表示的得分。预计optoselect装置的总共3500个nanopen室中的选定数目的单个nanopen室具有大于200-250a.u.的得分，并被选择为输出用于扩增和进一步开发。[0833]虽然结合各种实施方案描述了本教导，但是并不意味着本教导限于这些实施方案。相反，如本领域技术人员将理解的，本教导包含各种替代、修改和等同技术方案。[0834]此外，在描述各种实施方案时，说明书可能已经将方法和/或过程呈现为特定的步骤顺序。然而，在方法或过程不依赖于本文所述的特定步骤顺序的程度上，方法或过程不应限于所描述的特定步骤顺序。如本领域普通技术人员将理解的，其他步骤顺序也是可能的。因此，说明书中提供的特定步骤顺序不应被解释为对权利要求的限制。此外，针对方法和/或过程的权利要求不应限于以写出的顺序执行其步骤，并且本领域技术人员可以容易地理解，顺序可以变化并且仍然保持在各种实施方案的精神和范围内。[0835]本文描述的实施方案可以用其他计算机系统配置来实施，包括手持设备、微处理器系统、基于微处理器或可编程的消费性电子产品、小型计算机、大型计算机等。实施方案还可以在分布式计算环境中实施，其中任务由通过网络链接的远程处理设备执行。[0836]还应当理解，本文描述的实施方案可以采用涉及存储在计算机系统中的数据的各种计算机执行的操作。这些操作是需要物理操纵物理量的操作。通常(尽管不是必须的)，这些量采取能够被存储、传输、组合、比较和以其他方式操纵的电信号或磁信号的形式。此外，所执行的操作通常用术语来表示，例如产生、识别、确定或比较。[0837]形成本文所述的实施方案的一部分的任何操作都是有用的机器操作。本文描述的实施方案还涉及用于执行这些操作的设备或装置。本文描述的系统和方法可以为所需目的而专门构造，或者它可以是由存储在计算机中的计算机程序选择性地激活或配置的通用计算机。特别地，各种通用机器可以与根据本文的教导编写的计算机程序一起使用，或者构造更专用的装置来执行所需的操作可以是更方便的。[0838]某些实施方案还可以体现为计算机可读介质上的计算机可读代码。计算机可读介质是任何可以存储数据的数据存储设备，其后该数据可以由计算机系统读取。计算机可读介质的实例包括硬盘驱动器、网络附加存储器(nas)、只读存储器、随机存取存储器、cd-rom、cd-r、cd-rw、磁带和其他光学、flash存储器和非光学数据存储设备。计算机可读介质还可以分布在网络耦接的计算机系统上，使得计算机可读代码以分布式方式存储和执行。[0839]所选实施方案的列举[0840]实施方案1.一种用于测定生物微物体所产生的被分析物的量的系统，包括：图像获取单元，包括：能够固定微流体装置的微流体装置支撑物，其中所述微流体装置包括流动区域和多个与流动区域流体连接的室，其中多个室中的每一个可以容纳一个或多个生物微物体，和成像元件，其被配置为捕捉微流体装置的多个室和流动区域的一个或多个测定图像；和与图像获取单元通信连接的图像处理单元，包括：受关注区域确定引擎，其被配置为接收每个捕捉的测定图像并对测定图像中描绘的每个室定义受关注区域，其中受关注区域包括图像区域，该图像区域对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中生物微物体的位置最不敏感，并且沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸，和评分引擎，其被配置为分析每个室的受关注区域内的图像区域的至少一部分，以确定指示每个室中的被分析物的量的得分。[0841]实施方案2.根据实施方案1所述的系统，还包括：校准引擎，其被配置为至少针对由背景噪声引起的和/或在测定图像捕捉期间引入的图像失真来对每个室的受关注区域的图像区域进行归一化。[0842]实施方案3.根据实施方案1或2所述的系统，其中成像元件被进一步配置为捕捉一个或多个相应的背景图像和一个或多个相应的信号参比图像。[0843]实施方案4.根据实施方案3所述的系统，其中校准引擎被配置为通过从测定图像中减去相应的背景图像来至少对每个室的受关注区域的图像区域进行归一化以用于图像失真；和/或其中校准引擎被配置为通过考虑在相应的信号参比图像中捕捉的图像获取失真，从而至少针对图像失真来对每个室的受关注区域的图像区域进行归一化。[0844]实施方案5.根据实施方案2至4中任一项所述的系统，其中评分引擎被配置为分析每个室的受关注区域的归一化的图像区域的至少一部分，以确定指示每个室中的被分析物的量的得分。[0845]实施方案6.根据实施方案5所述的系统，其中评分引擎被配置为对每个室的受关注区域的归一化的图像区域的一部分上的光强度值应用线性回归分析，以确定指示每个室中的被分析物的量的得分。[0846]实施方案7.根据实施方案5所述的系统，其中评分引擎被配置为对每个室的归一化的受关注区域的一部分上的光强度值进行积分，以确定指示每个室中的被分析物的量的得分。[0847]实施方案8.根据实施方案1至7中任一项所述的系统，其中图像获取单元和图像处理单元是分别定位的。[0848]实施方案9.根据实施方案1至7中任一项所述的系统，其中图像获取单元和图像处理单元被集成在单个单元中。[0849]实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的系统，其中受关注区域由图像处理单元自动地定义。[0850]实施方案11.根据实施方案1至10中任一项所述的系统，其中微流体装置被配置为接收结合剂的流，所述结合剂与由生物微物体所产生的被分析物结合并且包含可检测的标记物，并且其中评分引擎被配置为基于由测定图像所确定的结合剂的可检测的标记物所发射的光量来确定每个室中的被分析物量。[0851]实施方案12.一种用于测定由生物微物体所产生的被分析物的量的方法，包括：接收微流体装置的成像数据，该微流体装置包括流动区域和多个与流动区域流体连接的室，其中成像数据包括被分析物测定图像以及背景噪声图像和信号参比图像中的一种或两种；对每个室定义受关注区域，其中受关注区域包括室内的图像区域，该图像区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对在室中生物微物体的位置最不敏感，并且沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸，以及通过分析每个室的受关注区域的图像区域的至少一部分来确定指示每个室中的被分析物的量的得分。[0852]实施方案13.根据实施方案12所述的方法，其中成像数据包括从由报道分子发射的光确定的发光数据，所述报道分子与由生物微物体所产生的被分析物结合。[0853]实施方案14.根据实施方案12或13所述的方法，还包括：通过减去在背景噪声图像中捕捉的背景噪声，至少对被分析物测定图像中的每个室的受关注区域的图像区域进行归一化；和/或通过考虑在信号参比图像中捕捉的图像获取失真，至少对被分析物测定图像中的每个室的受关注区域的图像区域进行归一化。[0854]实施方案15.根据实施方案14所述的方法，其中确定指示每个室中的被分析物的量的得分还包括分析每个室的受关注区域的归一化的图像区域的至少一部分。[0855]实施方案16.根据实施方案14所述的方法，其中确定指示每个室中的被分析物的量的得分还包括对每个室的受关注区域的归一化的图像区域的至少一部分上的发光数据应用线性回归分析。[0856]实施方案17.根据实施方案14所述的方法，其中确定指示每个室中的被分析物的量的得分还包括对每个室的受关注区域的归一化的图像区域的至少一部分上的发光数据进行积分。[0857]实施方案18.根据实施方案12至17中任一项所述的方法，其中被分析物包含蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。[0858]实施方案19.一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机执行用于测定由生物微物体所产生的被分析物的量的图像处理方法，该方法包括：接收微流体装置的成像数据，该微流体装置包括流动区域和多个与流动区域流体连接的室，其中成像数据包括被分析物测定图像以及背景噪声图像和信号参比图像中的一种或两种；对每个室定义受关注区域，其中受关注区域包括室内的图像区域，该图像区域对测量分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中生物微物体的位置最不敏感，并且沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸，以及通过分析每个室的受关注区域的图像区域的至少一部分来确定指示每个室中的被分析物的量的得分。[0859]实施方案20.根据实施方案19所述的方法，其中成像数据包括从由报道分子发射的光确定的发光数据，该报道分子与由生物微物体所产生的被分析物结合。[0860]实施方案21.根据实施方案19或20所述的方法，还包括：通过减去在背景噪声图像中捕捉的背景噪声，至少对被分析物测定图像中的每个室的受关注区域的图像区域进行归一化；和/或通过考虑在信号参比图像中捕捉的图像获取失真，至少对被分析物测定图像中的每个室的受关注区域的图像区域进行归一化。[0861]实施方案22.根据实施方案21所述的方法，其中确定指示每个室中的被分析物的量的得分还包括分析每个室的受关注区域的归一化的图像区域的至少一部分。[0862]实施方案23.根据实施方案21所述的方法，其中确定指示每个室中的被分析物的量的得分还包括对来自每个室的受关注区域的归一化的图像区域的至少一部分的发光数据应用线性回归分析。[0863]实施方案24.根据实施方案21所述的方法，其中确定指示每个室中的被分析物的量的得分还包括对每个室的受关注区域的归一化的图像区域的至少一部分上的发光数据进行积分。[0864]实施方案25.根据实施方案19至24中任一项所述的方法，其中被分析物包含蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。[0865]实施方案26.一种评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的方法，该方法包括：将生物微物体引入到微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室含有第一流体介质；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群向室内的第一流体介质中分泌被分析物；在第一时间段将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包含多个报道分子，并且其中每个报道分子包含被配置为与分泌的被分析物结合的结合组分和可检测的标记物；允许多个报道分子中的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的报道分子，其中受关注区域包括室的至少一部分。[0866]实施方案27.根据实施方案26所述的方法，其中可检测的标记物包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。[0867]实施方案28.根据实施方案27所述的方法，其中报道分子的可检测的标记物是荧光标记物，并且其中所述检测报道分子包括检测来自受关注区域内报道分子的荧光标记物的荧光发射。[0868]实施方案29.根据实施方案26或27所述的方法，其进一步包括：在第二时间段将包括室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发报道分子的荧光标记物的波长。[0869]实施方案30.根据实施方案29所述的方法，其中：在第二时间段后对受关注区域内的荧光发射进行检测；在第三时间段内对受关注区域内的荧光发射进行两次或更多次检测；和/或在第三时间段内基本上连续地对受关注区域内的荧光发射进行检测。[0870]实施方案31.根据实施方案30所述的方法，其进一步包括：在第四时间段将包含室的至少一部分的微流体装置的一部分但不是流动区域暴露于电磁辐射，其中第四时间段足以对室的部分中存在的任何报道分子的荧光标记物进行光漂白；和检测室的光漂白部分内的荧光发射。[0871]实施方案32.根据实施方案31所述的方法，其中：在第四时间段后对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测；在第五时间段内对室的光漂白部分内的荧光发射进行两次或更多次检测；和/或在第五时间段内基本上连续地对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测。[0872]实施方案33.根据实施方案31所述的方法，其中检测室的光漂白部分内的荧光发射发生在所述暴露第四时间段后(例如，在包含非光漂白荧光标记物的报道分子已扩散到所述室中后)约5秒至约20秒。[0873]实施方案34.根据实施方案31至33中任一项所述的方法，其中室的光漂白部分由受关注区域包含。[0874]实施方案35.根据实施方案31至34中任一项所述的方法，其中所述暴露第四时间段和检测室的光漂白部分中的荧光发射的步骤重复一次或多次(例如，1、2、3、4、5次或更多次)。[0875]实施方案36.根据实施方案27至35中任一项所述的方法，其中室具有分离区域和将分离区域流体连接到流动区域的连接区域，并且其中分离区域和连接区域被配置为使得分离区域中流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域中流体介质的组分进行交换。[0876]实施方案37.根据实施方案27至36中任一项所述的方法，其中生物微物体是生物细胞，并且其中所述方法还包括将室内的生物细胞扩增为生物细胞的克隆群。[0877]实施方案38.根据实施方案27至37中任一项所述的方法，其进一步包括用培养基灌注流动区域，其中灌注发生在将生物微物体引入室中之后并且在将第二流体介质引入流动区域中之前。[0878]实施方案39.根据实施方案38所述的方法，其中培养基包括可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。[0879]实施方案40.根据实施方案27至39中任一项所述的方法，其中第一时间段为约30分钟至约60分钟。[0880]实施方案41.根据实施方案27至40中任一项所述的方法，进一步包括：将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含任何报道分子，并且允许至少一部分未结合的报道分子扩散出室，其中对位于受关注区域内的报道分子的检测发生在选定的时间，使得已扩散出室的未结合的报道分子的量比已扩散出室的rmsa复合物的量至少多2倍。[0881]实施方案42.根据实施方案41所述的方法，其中将第三流体介质引入流动区域包括使第三流体介质流经流动区域一个额外时间段。[0882]实施方案43.根据实施方案42所述的方法，其中额外时间段基于对未结合的报道分子和rmsa复合物的扩散谱的模拟来选择。[0883]实施方案44.根据实施方案42所述的方法，其中额外时间段为约20分钟至约50分钟。[0884]实施方案45.根据实施方案27至44中任一项所述的方法，其中受关注区域包括室的至少一部分，所述室的至少一部分沿从室内向外进入流动区域的扩散的轴对齐。[0885]实施方案46.根据实施方案27至45中任一项所述的方法，其中检测位于受关注区域内的报道分子包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中至少一些可检测信号从位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出。[0886]实施方案47.根据实施方案46所述的方法，其中检测位于受关注区域内的报道分子进一步包括通过从可检测信号的测量强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。[0887]实施方案48.根据实施方案46或47所述的方法，其进一步包括在将生物微物体引入室之前测量受关注区域内的背景信号的强度。[0888]实施方案49.根据实施方案46至48中任一项所述的方法，其中针对在室内观察到的多个细胞对测量的可检测信号强度或减去背景的信号强度进行归一化。[0889]实施方案50.根据实施方案27至49中任一项所述的方法，其进一步包括量化被分析物的分泌水平。[0890]实施方案51.根据实施方案27至50中任一项所述的方法，其进一步包括对室提供分泌得分。[0891]实施方案52.根据实施方案51所述的方法，其中根据实施方案12至25中任一项所述的方法确定分泌得分。[0892]实施方案53.根据实施方案27至52中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量是报道分子的分子量的至少两倍。[0893]实施方案54.根据实施方案27至52中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量比报道分子的分子量大至少四倍。[0894]实施方案55.根据实施方案27至52中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量比报道分子的分子量大至少十倍。[0895]实施方案56.根据实施方案27至55中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包含至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。[0896]实施方案57.根据实施方案27至55中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包括肽或蛋白。[0897]实施方案58.根据实施方案57所述的方法，其中报道分子的结合组分包含具有seqidno:1至10中任一项的序列的肽。[0898]实施方案59.根据实施方案57所述的方法，其中报道分子的结合组分包括蛋白a、蛋白g或蛋白a或蛋白g的igg结合片段。[0899]实施方案60.根据实施方案27至55中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包括适体。[0900]实施方案61.根据实施方案27至60中任一项所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物包括蛋白，糖，核酸，除蛋白、糖或核酸以外的有机分子，囊泡或病毒。[0901]实施方案62.根据实施方案27至61中任一项所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物是抗体，或任选地是糖基化抗体。[0902]实施方案63.根据实施方案27至61中任一项所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物是除抗体以外的蛋白，所述蛋白任选地是糖基化蛋白。[0903]实施方案64.根据实施方案27至63中任一项所述的方法，其中所述微流体装置包括多个室，其中生物微物体被引入多个室中的至少两个室中，并且其中所述方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每一个室进行的。[0904]实施方案65.根据实施方案64所述的方法，其进一步包括比较多个室中至少两个室的室的分泌水平。[0905]实施方案66.根据实施方案64所述的方法，其进一步包括比较多个室中多于一个室的分泌得分。[0906]实施方案67.根据实施方案64至66中任一项所述的方法，其进一步包括：选择至少两个室中的一个或多个室；以及从每个选择的室输出一个或多个生物微物体。[0907]实施方案68.根据实施方案67所述的方法，其中来自每个选择的室的一个或多个生物微物体进一步从微流体装置中输出。[0908]实施方案69.根据实施方案68所述的方法，其中单独输出选择的室。[0909]实施方案70.根据实施方案27至69中任一项所述的方法，其中受关注区域包括图像区域，其对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，并沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。[0910]实施方案71.根据实施方案70所述的方法，其中受关注区域基本上由图像区域组成。[0911]实施方案72.根据实施方案28至71中任一项所述的方法，其中所述方法是自动化的。[0912]实施方案73.一种评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物的水平的方法，该方法包括：将生物微物体引入到微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室含有第一流体介质；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群向室内的第一流体介质中分泌包含外源标签的被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包含多个报道分子，并且其中每个报道分子包含被配置为结合分泌的被分析物的外源标签的结合组分和可检测的标记物；允许多个报道分子中的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的报道分子，其中受关注区域包括室的至少一部分。[0913]实施方案74.根据实施方案73所述的方法，其中室具有分离区域和将分离区域流体连接到流动区域的连接区域，并且其中分离区域和连接区域被配置为使得分离区域中流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域中流体介质的组分进行交换。[0914]实施方案75.根据实施方案73或74所述的方法，其中生物微物体是生物细胞，并且其中所述方法还包括将室内的生物细胞扩增为生物细胞的克隆群。[0915]实施方案76.根据实施方案73至75中任一项所述的方法，其进一步包括用培养基灌注流动区域，其中灌注发生在将生物微物体引入室中之后并且在将第二流体介质引入流动区域中之前。[0916]实施方案77.根据实施方案76所述的方法，其中培养基包括可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。[0917]实施方案78.根据实施方案73至77中任一项所述的方法，其中将第二流体介质引入流动区域包括在第一时间段使第二流体介质流经流动区域。[0918]实施方案79.根据实施方案78所述的方法，其中第一时间段为约30分钟至约60分钟。[0919]实施方案80.根据实施方案73至79中任一项所述的方法，其中可检测的标记物包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。[0920]实施方案81.根据实施方案80所述的方法，其中报道分子的可检测的标记物是荧光标记物，并且其中所述检测报道分子包括检测来自受关注区域内报道分子的荧光标记物的荧光发射。[0921]实施方案82.根据实施方案81所述的方法，其进一步包括：在第二时间段将包括室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发报道分子的荧光标记物的波长。[0922]实施方案83.根据实施方案82所述的方法，其中：在第二时间段后对受关注区域内的荧光发射进行检测；在第三时间段内对受关注区域内的荧光发射进行两次或更多次检测；和/或在第三时间段内基本上连续地对受关注区域内的荧光发射进行检测。[0923]实施方案84.根据实施方案83所述的方法，其进一步包括：在第四时间段将包含室的至少一部分的微流体装置的一部分但不是流动区域暴露于电磁辐射，其中第四时间段足以对室的部分中存在的任何报道分子的荧光标记物进行光漂白，所述室的部分任选地由受关注区域包含；和检测室的光漂白部分内的荧光发射。[0924]实施方案85.根据实施方案84所述的方法，其中：在第四时间段后对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测；在第五时间段内对室的光漂白部分内的荧光发射进行两次或更多次检测；和/或在第五时间段内基本上连续地对室的光漂白部分内的荧光发射进行检测。[0925]实施方案86.根据实施方案85所述的方法，其中所述检测室的光漂白部分内的荧光发射发生在所述暴露第四时间段后(例如，在包含非光漂白荧光标记物的报道分子已扩散到所述室中后)约5秒至约20秒。[0926]实施方案87.根据实施方案84至86中任一项所述的方法，其中所述暴露第四时间段和检测室的光漂白部分中的荧光发射的步骤重复一次或多次(例如，1、2、3、4、5次或更多次)。[0927]实施方案88.根据实施方案73至87中任一项所述的方法，其进一步包括：将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含任何报道分子；和允许至少一部分未结合的报道分子扩散出室，其中对位于受关注区域内的报道分子的检测发生在选定的时间，使得已扩散出室的未结合的报道分子的量比已扩散出室的rmsa复合物的量至少多2倍。[0928]实施方案89.根据实施方案77所述的方法，其中将第三流体介质引入流动区域包括使第三流体介质流经流动区域一个额外时间段。[0929]实施方案90.根据实施方案89所述的方法，其中额外时间段基于对未结合的报道分子和rmsa复合物的扩散谱的模拟来选择。[0930]实施方案91.根据实施方案89所述的方法，其中额外时间段为约20分钟至约50分钟。[0931]实施方案92.根据实施方案73至91中任一项所述的方法，其中受关注区域包括室的至少一部分，所述室的至少一部分沿从室内向外进入流动区域的扩散的轴对齐。[0932]实施方案93.根据实施方案73至92中任一项所述的方法，其中检测位于受关注区域内的报道分子包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中至少一些可检测信号从位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出。[0933]实施方案94.根据实施方案93所述的方法，其中检测位于受关注区域内的报道分子进一步包括通过从可检测信号的测量强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。[0934]实施方案95.根据实施方案93或94所述的方法，其进一步包括在将生物微物体引入室之前的时间测量受关注区域内的背景信号的强度。[0935]实施方案96.根据实施方案93至95中任一项所述的方法，其中针对在室内观察到的多个细胞对测量的可检测信号强度或减去背景的信号强度进行归一化。[0936]实施方案97.根据实施方案73至96中任一项所述的方法，其进一步包括量化被分析物的分泌水平。[0937]实施方案98.根据实施方案73至97中任一项所述的方法，其进一步包括对室提供分泌得分。[0938]实施方案99.根据实施方案98所述的方法，其中根据实施方案12至25中任一项所述的方法确定分泌得分。[0939]实施方案100.根据实施方案73至99中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量是报道分子的分子量的至少两倍。[0940]实施方案101.根据实施方案73至99中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量比报道分子的分子量大至少四倍。[0941]实施方案102.根据实施方案73至99中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量比报道分子的分子量大至少十倍[0942]实施方案103.根据实施方案73至102中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的外源标签包括肽序列。[0943]实施方案104.根据实施方案103所述的方法，其中肽序列包括flag表位、多聚组氨酸序列、血凝素(ha)表位或myc表位。[0944]实施方案105.根据实施方案103所述的方法，其中肽序列包含氨基酸序列(从n端到c端)dykddddk(seqidno:12)。[0945]实施方案106.根据实施方案103所述的方法，其中肽序列包含氨基酸序列(从n端到c端)hhhhhh(seqidno:13)。[0946]实施方案107.根据实施方案103至106中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包括蛋白。[0947]实施方案108.根据实施方案107所述的方法，其中结合组分的蛋白是抗体。[0948]实施方案109.根据实施方案108所述的方法，其中抗体识别flag表位。[0949]实施方案110.根据实施方案106所述的方法，其中报道分子的结合组分包括螯合剂。[0950]实施方案111.根据实施方案110所述的方法，其中螯合剂包括次氮基三乙酸(nta)。[0951]实施方案112.根据实施方案73至111中任一项所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物包括蛋白。[0952]实施方案113.根据实施方案112所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物是抗体，或任选地是糖基化抗体。[0953]实施方案114.根据实施方案112所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物是除抗体以外的蛋白，其任选地是糖基化蛋白。[0954]实施方案115.根据实施方案73至114中任一项所述的方法，其中所述微流体装置包括多个室，其中生物微物体被引入多个室中的至少两个室中，并且其中所述方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每一个室进行的。[0955]实施方案116.根据实施方案115所述的方法，其进一步包括比较多个室中至少两个室的室的分泌水平。[0956]实施方案117.根据实施方案115所述的方法，其进一步包括比较多个室中多于一个室的分泌得分。[0957]实施方案118.根据实施方案115至117中任一项所述的方法，其进一步包括：选择至少两个室中的一个或多个室；以及从每个选择的室输出一个或多个生物微物体。[0958]实施方案119.根据实施方案118所述的方法，其中来自每个选择的室的一个或多个生物微物体进一步从微流体装置中输出。[0959]实施方案120.根据实施方案119所述的方法，其中单独输出选择的室。[0960]实施方案121.根据实施方案73至120中任一项所述的方法，其中受关注区域包括图像区域，其对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，并沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。[0961]实施方案122.根据实施方案121所述的方法，其中受关注区域基本上由图像区域组成。[0962]实施方案123.根据实施方案73至122中任一项所述的方法，其中所述方法是自动化的。[0963]实施方案124.一种评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物的水平的方法，该方法包括：将生物微物体引入到微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室含有第一流体介质；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群向室内的第一流体介质中分泌被分析物；在第一时间段将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包含多个报道复合物，并且其中每个报道复合物包括被配置成结合分泌的被分析物的第一复合物组分和结合第一复合物的第二复合物组分，其中第二复合物组分包含可检测的标签物，并且其中第一复合物组分与分泌的被分析物的结合减少或消除了第二复合物组分与第一复合物组分的结合；允许多个报道复合物的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个第一复合物组分:分泌的被分析物(fccsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的第二复合物组分，其中受关注区域包括室的至少一部分。[0964]实施方案125.根据实施方案124所述的方法，其中可检测的标记物包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。[0965]实施方案126.根据实施方案124所述的方法，其中第二复合物组分的可检测的标记物是荧光标记物，并且其中所述检测第二复合物组分包括检测来自受关注区域内第二复合物组分的荧光标记物的荧光发射。[0966]实施方案127.根据实施方案124至126中任一项所述的方法，其进一步包括：在第二时间段将包括室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发第二复合物组分的荧光标记物的波长。[0967]实施方案128.根据实施方案127所述的方法，其中：在第二时间段后对受关注区域内的荧光发射进行检测；在第三时间段内对荧光发射进行两次或更多次检测；和/或在第三时间段内基本上连续地对荧光发射进行检测。[0968]实施方案129.根据实施方案124至128中任一项所述的方法，其中室具有分离区域和将分离区域流体连接到流动区域的连接区域，并且其中分离区域和连接区域被配置为使得分离区域中流体介质的组分基本上仅通过扩散与流动区域中流体介质的组分进行交换。[0969]实施方案130.根据实施方案124至129中任一项所述的方法，其中生物微物体是生物细胞，并且其中所述方法还包括将室内的生物细胞扩增为生物细胞的克隆群。[0970]实施方案131.根据实施方案124至130中任一项所述的方法，其进一步包括用培养基灌注流动区域，其中灌注发生在将生物微物体引入室中之后并且在将第二流体介质引入流动区域中之前。[0971]实施方案132.根据实施方案131所述的方法，其中培养基包括可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。[0972]实施方案133.根据实施方案124至132中任一项所述的方法，其中将第二流体介质引入流动区域包括在第一时间段使第二流体介质流经流动区域。[0973]实施方案134.根据实施方案133所述的方法，其中第一时间段为约30分钟至约60分钟。[0974]实施方案135.根据实施方案124至134中任一项所述的方法，其中受关注区域包括室的至少一部分，所述室的至少一部分沿从室内向外进入流动区域的扩散的轴对齐。[0975]实施方案136.根据实施方案124至135中任一项所述的方法，其中检测位于受关注区域内的第二复合物组分包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中至少一些可检测信号从位于受关注区域内的第二复合物组分的可检测的标记物发出。[0976]实施方案137.根据实施方案136所述的方法，其中检测位于受关注区域内的第二复合物组分进一步包括通过从可检测信号的测量强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。[0977]实施方案138.根据实施方案136或137所述的方法，其进一步包括在将生物微物体引入室之前的时间测量受关注区域内的背景信号的强度。[0978]实施方案139.根据实施方案136至138中任一项所述的方法，其中针对在室内观察到的多个细胞对测量的可检测信号强度或减去背景的信号强度进行归一化。[0979]实施方案140.根据实施方案124至139中任一项所述的方法，其进一步包括量化被分析物的分泌水平。[0980]实施方案141.根据实施方案124至139中任一项所述的方法，其进一步包括对室提供分泌得分。[0981]实施方案142.根据实施方案141所述的方法，其中根据实施方案12至25(即，来自所选实施方案的列举)中任一项所述的方法确定分泌得分。[0982]实施方案143.根据实施方案124至142中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量小于5kd。[0983]实施方案144.根据实施方案124至142中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量小于2kd。[0984]实施方案145.根据实施方案124至142中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物的分子量小于1kd。[0985]实施方案146.根据实施方案124至145中任一项所述的方法，其中报道复合物的第一复合物组分包含至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。[0986]实施方案147.根据实施方案124至145中任一项所述的方法，其中报道复合物的第一复合物组分包括肽或蛋白。[0987]实施方案148.根据实施方案124至147中任一项所述的方法，其中报道复合物的第二复合物组分包含具有seqidno:1至10中任一项的序列的肽。[0988]实施方案149.根据实施方案124至147中任一项所述的方法，其中报道复合物的第二复合物组分包括蛋白a、蛋白g或蛋白a或蛋白g的igg结合片段。[0989]实施方案150.根据实施方案124至147中任一项所述的方法，其中报道分子的第二复合物组分包括适体。[0990]实施方案151.根据实施方案124至147中任一项所述的方法，其中报道复合物的第二复合物组分包括分泌的被分析物的全部或部分(例如，分泌的被分析物与第一复合物组分结合所需的部分)。[0991]实施方案152.根据实施方案124至151中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物竞争性地抑制第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[0992]实施方案153.根据实施方案124至151中任一项所述的方法，其中分泌的被分析物非竞争性地抑制第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[0993]实施方案154.根据实施方案153所述的方法，其中分泌的被分析物通过变构机制抑制第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[0994]实施方案155.根据实施方案124至154中任一项所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物包括肽、糖、寡核苷酸或寡核苷。[0995]实施方案156.根据实施方案124至154中任一项所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物是代谢物或除蛋白、糖或核酸以外的有机分子。[0996]实施方案157.根据实施方案124至156中任一项所述的方法，其中微流体装置包括多个室，其中生物微物体被引入多个室中的至少两个室中，并且其中所述方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每一个室进行的。[0997]实施方案158.根据实施方案157所述的方法，其进一步包括比较多个室中至少两个室的室的分泌水平。[0998]实施方案159.根据实施方案157所述的方法，其进一步包括比较多个室中多于一个室的分泌得分。[0999]实施方案160.根据实施方案157至159中任一项所述的方法，其进一步包括：选择至少两个室中的一个或多个室；以及从每个选择的室输出一个或多个生物微物体。[1000]实施方案161.根据实施方案160所述的方法，其中来自每个选择的室的一个或多个生物微物体进一步从微流体装置中输出。[1001]实施方案162.根据实施方案161所述的方法，其中单独输出选择的室。[1002]实施方案163.根据实施方案124至162中任一项所述的方法，其中受关注区域包括图像区域，其对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，并沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。[1003]实施方案164.根据实施方案163所述的方法，其中受关注区域基本上由图像区域组成。[1004]实施方案165.根据实施方案124至164中任一项所述的方法，其中所述方法是自动化的。[1005]实施方案166.一种克隆系发育方法，所述方法包括：执行实施方案66、117和159中任一项所述的方法；从多个室中选择一组室，其中该组室的每个室具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分；从微流体装置输出包含在选择的一组室的每个室中的一个或多个生物微物体；在相应的反应容器中扩增从选择的一组室的每个室中输出的一个或多个生物微物体；以及测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而对每个生物微物体或克隆群确定分泌水平。[1006]实施方案167.根据实施方案166所述的方法，其中受关注区域包括图像区域，其对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，并沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。[1007]实施方案168.根据实施方案167所述的方法，其中受关注区域基本上由图像区域组成。[1008]实施方案169.根据实施方案166至168中任一项所述的方法，其中所述方法是自动化的。[1009]实施方案170.一种用于评估生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的试剂盒，所述试剂盒包括：微流体装置，其包括具有流动区域的外壳和多个室，其中每个室与流动区域流体连接，并且其中流动区域和室被配置为包含流体介质；和报道复合物，其包括被配置为与分泌的被分析物结合的第一复合物组分，以及与第一复合物组分结合并包含可检测的标记物的第二复合物组分，其中分泌的被分析物与第一复合物组分的结合抑制或阻止第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[1010]实施方案171.根据实施方案170所述的试剂盒，其中报道复合物的第一复合物组分包含至少一种氨基酸和/或至少一种核酸。[1011]实施方案172.根据实施方案170所述的试剂盒，其中报道复合物的第一复合物组分包括肽或蛋白。[1012]实施方案173.根据实施方案170至172中任一项所述的试剂盒，其中报道复合物的第二复合物组分包含具有seqidno:1至10中任一项的序列的肽。[1013]实施方案174.根据实施方案170至172中任一项所述的试剂盒，其中报道复合物的第二复合物组分包括蛋白a、蛋白g或蛋白a或蛋白g的igg结合片段。[1014]实施方案175.根据实施方案170至172中任一项所述的试剂盒，其中报道分子的第二复合物组分包括适体。[1015]实施方案176.根据实施方案170至172中任一项所述的试剂盒，其中报道复合物的第二复合物组分包括分泌的被分析物的全部或部分(例如，分泌的被分析物与第一复合物组分结合所需的部分)。[1016]实施方案177.根据实施方案170至176中任一项所述的试剂盒，其中分泌的被分析物竞争性地抑制第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[1017]实施方案178.根据实施方案170至176中任一项所述的试剂盒，其中分泌的被分析物非竞争性地抑制第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[1018]实施方案179.根据实施方案178所述的试剂盒，其中分泌的被分析物通过变构机制抑制第二复合物组分与第一复合物组分的结合。[1019]实施方案180.一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机执行用于测定由生物微物体所产生的被分析物的量的方法，其中所述方法是权利要求45至47、96至98和138至140中任一项所述的方法。[1020]实施方案181.根据实施方案180所述的非暂态计算机可读介质，其中系统是实施方案1至11中任一项所述的系统。[1021]实施方案182.一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统执行用于克隆系发育的方法的至少一部分，其中所述方法是实施方案166至169中任一项所述的方法，并且其中系统至少执行步骤直到并且包括从微流体装置输出包含在选择的一组室中的每个室中的一个或多个生物微物体为止。[1022]实施方案183.根据实施方案182所述的非暂态计算机可读介质，其中系统是实施方案1至11中任一项所述的系统。[1023]实施方案184.一种评估由生物微物体或由其生成的生物微物体的群分泌的被分析物水平的方法，该方法包括：将生物微物体引入到微流体装置的室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中室与流动区域流体连接，并且其中室含有第一流体介质；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群向室内的第一流体介质中分泌被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包含多个报道分子，并且其中每个报道分子包含被配置为结合分泌的被分析物的结合组分和可检测的标记物；允许多个报道分子中的一部分扩散到室中并与其中分泌的被分析物结合，从而产生多个报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的报道分子。[1024]实施方案185.根据实施方案184所述的方法，其进一步包括：将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含任何报道分子；以及允许至少一部分未结合的报道分子扩散出室。[1025]实施方案186.根据实施方案185所述的方法，其中检测位于受关注区域内的报道分子在选择的时间发生，使得已经从室中扩散出来的未结合的报道分子的量比已经从室中扩散出来的rmsa复合物的量至少大2倍。。[1026]实施方案187.根据实施方案185或186中任一项所述的方法，其中将第三流体介质引入流动区域包括在第一时间段使第三流体介质流经流动区域。[1027]实施方案188.根据实施方案185至187中任一项所述的方法，其中第一时间段为约30分钟至约60分钟。[1028]实施方案189.根据实施方案187或188中任一项所述的方法，其中检测位于微流体装置内的受关注区域内的报道分子按照以下进行：在第二时间段之后进行；在第二时间段内进行两次或更多次；或在第二时间段内基本上连续进行。[1029]实施方案190.根据实施方案184至189中任一项所述的方法，其进一步包括量化被分析物的分泌水平。[1030]实施方案191.根据实施方案184至190中任一项所述的方法，其中由生物微物体分泌的被分析物是抗体，或任选地是糖基化抗体。[1031]实施方案192.根据实施方案184至191中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分与抗体或糖基化抗体的fc区结合。[1032]实施方案193.根据实施方案184至192中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分结合抗体重链(例如，包含重链肽的一个或多个氨基酸残基的表位)。[1033]实施方案194.根据实施方案184至193中任一项所述的方法，其中生物微物体是生物细胞。[1034]实施方案195.根据实施方案184至194中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包含至少一种核酸。[1035]实施方案196.根据实施方案184至195中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包含至少一种氨基酸。[1036]实施方案197.根据实施方案184至196中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包含适体。[1037]实施方案198.根据实施方案184至197中任一项所述的方法，其中报道分子的结合组分包括肽或蛋白。[1038]实施方案199.根据实施方案198所述的方法，其中报道分子的结合组分包含具有seqidno:1至10中任一项的序列的肽。[1039]实施方案200.根据实施方案198所述的方法，其中报道分子的结合组分包括蛋白a、蛋白g或蛋白a或蛋白g的igg结合片段。[1040]实施方案201.根据实施方案184至200中任一项所述的方法，其中可检测的标记物包括可见标记物、发光标记物、磷光标记物或荧光标记物。[1041]实施方案202.根据实施方案201所述的方法，其中报道分子的可检测的标记物是荧光标记物，并且其中所述检测报道分子包括检测来自受关注区域内报道分子的荧光标记物的荧光发射。[1042]实施方案203.根据实施方案202所述的方法，其进一步包括：在第三时间段将包括室的微流体装置的一部分暴露于电磁辐射，所述电磁辐射包含能够激发报道分子的荧光标记物的波长。[1043]实施方案204.根据实施方案203所述的方法，其进一步包括：在第四时间段将包含室但不是流动区域的微流体装置的一部分暴露，其中第四时间段足以对室中存在的任何报道分子的荧光标记物进行光漂白。[1044]实施方案205.根据实施方案204所述的方法，其中在所述检测受关注区域内的荧光发射之前进行所述暴露第四时间段。[1045]实施方案206.根据实施方案204或205中任一项所述的方法，其中所述检测受关注区域内的荧光发射在所述暴露第四时间段后(例如，在包含非光漂白荧光标记物的报道分子已扩散到所述室中后)约5秒至约20秒发生。[1046]实施方案207.根据实施方案204至206中任一项所述的方法，其中所述暴露第四时间段和检测荧光发射的步骤重复一次或多次(例如，1、2、3、4、5次或更多次)。[1047]实施方案208.根据实施方案194至206中任一项所述的方法，其进一步包括用培养基灌注流动区域，其中灌注发生在将生物微物体引入室中之后并且在将第二流体介质引入流动区域中之前。[1048]实施方案209.根据实施方案208所述的方法，其中培养基包括可溶性饲养细胞组分、明确的溶解氧组分、明确的ph组分、耗尽的生长培养基组分和/或可溶性刺激性组分中的一种或多种。[1049]实施方案210.根据实施方案184至209中任一项所述的方法，其中检测位于受关注区域内的报道分子包括测量来自受关注区域的可检测信号的强度，其中至少一些可检测信号从位于受关注区域内的报道分子的可检测的标记物发出。[1050]实施方案211.根据实施方案210所述的方法，其中检测位于受关注区域内的报道分子进一步包括通过从可检测信号的测量强度中减去背景信号的强度来确定减去背景的信号强度。[1051]实施方案212.根据实施方案211所述的方法，其中在将生物微物体引入微流体装置的室之前，通过将第四流体介质引入流动区域来确定背景信号，其中第四流体介质包含多个报道分子，以及允许报道分子在流动区域和室之间达到平衡。[1052]实施方案213.根据实施方案184至212中任一项所述的方法，其中针对在室内观察到的多个细胞对测量的可检测信号强度或减去背景的信号强度进行归一化。[1053]实施方案214.根据实施方案184至213中任一项所述的方法，其进一步包括对室提供分泌得分。[1054]实施方案215.根据实施方案214所述的方法，其中根据实施方案12至25(即，来自所选实施方案的列举)中任一项所述的方法确定分泌得分。[1055]实施方案216.根据实施方案184至215中任一项所述的方法，其中将生物微物体引入微流体装置的室包括选择生物微物体并选择性地将选择的生物微物体移动到室中。[1056]实施方案217.根据实施方案216所述的方法，其中选择是正选择(例如，对生物微物体进行指示健康细胞或表达构建体在细胞基因组中成功/靶向整合的标志物的染色，并且选择阳性染色的生物微物体)。[1057]实施方案218.根据实施方案216所述的方法，其中选择是负选择(例如，对生物微物体进行指示不健康细胞或表达构建体在细胞基因组中未成功整合的标志物的染色，并且选择未被染色的生物微物体)。[1058]实施方案219.根据实施方案218所述的方法，其中对生物微物体进行膜联蛋白v染色。[1059]实施方案220.根据实施方案184至219中任一项所述的方法，其中微流体装置包括多个室，其中生物微物体被引入多个室中的至少两个室中，并且其中所述方法的剩余部分是针对所述至少两个室中的每一个室进行的。[1060]实施方案221.根据实施方案220所述的方法，其进一步包括：选择至少两个室中的一个或多个室；以及从每个选择的室输出一个或多个生物微物体。[1061]实施方案222.根据实施方案221所述的方法，其中来自每个选择的室的一个或多个生物微物体进一步从微流体装置中输出。[1062]实施方案223.根据实施方案222所述的方法，其中单独输出选择的室。[1063]实施方案224.根据实施方案222或223中任一项所述的方法，其中将来自每个选择的室的一个或多个生物微物体中的每一个均输出到被优化为支持克隆活力的培养基中。[1064]实施方案225.根据实施方案184至224中任一项所述的方法，其中所述方法是自动化的。[1065]实施方案226.一种克隆系发育方法，所述方法包括：执行实施方案184至225中任一项所述的方法；从多个室中选择一组室，其中该组室的每个室具有指示其中含有的生物微物体或克隆群是最高的被分析物生产者的得分；从微流体装置输出包含在选择的一组室的每个室中的一个或多个生物微物体；在相应的反应容器中扩增从选择的一组室的每个室中输出的一个或多个生物微物体；以及测定每个相应的反应容器中分泌的被分析物的水平，从而对每个生物微物体或克隆群确定分泌水平。[1066]实施方案227.根据实施方案226所述的方法，其中受关注区域包括图像区域，其对应于室内的区域，该区域对测量被分析物浓度波动最敏感，在测量被分析物波动时对室中的生物微物体的位置最不敏感，并沿着在室和流动区域之间扩散的轴延伸。[1067]实施方案228.根据实施方案227所述的方法，其中受关注区域基本上由图像区域组成。[1068]实施方案229.根据实施方案226至228中任一项所述的方法，其中所述方法是自动化的。[1069]实施方案230.一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统执行用于测定由生物微物体所产生的被分析物的量的方法，其中所述方法是权利要求184至229中任一项所述的方法。[1070]实施方案231.根据实施方案230所述的非暂态计算机可读介质，其中系统是实施方案1所述的系统。[1071]实施方案232.一种非暂态计算机可读介质，其中存储有程序，用于使计算机指示系统执行用于克隆系发育的方法的至少一部分，其中所述方法是实施方案230至231中任一项所述的方法，并且其中系统至少执行步骤直到并且包括从微流体装置输出包含在选择的一组室中的每个室中的一个或多个生物微物体为止。[1072]实施方案233.根据实施方案232所述的非暂态计算机可读介质，其中系统是实施方案1所述的系统。[1073]实施例234.一种评估多个生物微物体或多个由其生成的生物微物体的群间的可溶性被分析物的相对分泌水平的方法，该方法包括：将多个生物微物体引入到微流体装置的多个室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳，其中多个室中的每个室与流动区域流体连接并且含有第一流体介质；允许多个生物微物体中的每一个生物微物体或由其生成的生物微物体的群向室内的第一流体介质中分泌可溶性被分析物；将第二流体介质引入到流动区域中，其中第二流体介质包含多个可溶性报道分子，并且其中每个报道分子均包含：被配置为与分泌的被分析物结合的结合组分；和可检测的标记物；允许多个可溶性报道分子中的一部分扩散到多个室中并与其中分泌的可溶性被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质不包含报道分子；允许未结合的可溶性报道分子扩散出室；以及检测位于微流体装置内的受关注区域内的可溶性报道分子。[1074]实施方案235.根据实施方案234所述的方法，其中室包括分离区域，其中分离区域与二次流动分离。[1075]实施方案236.根据实施方案234或235中任一项所述的方法，其中室包括连接区域，该连接区域与流动区域中的流体介质的直接流动分离。[1076]实施方案237.根据实施方案234至236中任一项所述的方法，其中将多个生物微物体中的单个生物微物体布置在多个室中的单个室中。[1077]实施方案238.根据实施方案234至237中任一项所述的方法，其中可溶性报道分子的浓度为可溶性报道分子对被分析物的kd的约1-10倍。[1078]实施方案239.根据实施方案234至238中任一项所述的方法，其中流动区域中的第二流体介质以约0.1-10秒的刷新率刷新，并且刷新率是替换流动区域中全部流体体积的时间段。[1079]实施方案240.根据实施方案234至239中任一项所述的方法，其中受关注区域位于室的钩区域内。[1080]实施方案241.根据实施方案234至240中任一项所述的方法，其进一步包括：对多个室中的每个室获得相对分泌水平或分泌得分；并基于所获得的分泌得分对多个室进行评级；以及基于评级对多个室进行排序。[1081]实施方案242.根据实施方案234至241中任一项所述的方法，其中多个报道分子包括至少两个不同的报道分子，每个报道分子具有不同的标记物。[1082]实施方案243.一种评估多个生物微物体或由其生成的生物微物体的群的可溶性被分析物的相对分泌水平的方法，该方法包括：将第一流体介质引入微流体装置的多个室中，其中微流体装置包括具有流体连接到多个室的流动区域的外壳，其中第一流体介质包括第一批多个可溶性报道分子；获取微流体装置的图像；将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质不包含可溶性报道分子；将多个生物微物体的子集引入多个室的子集中；允许多个生物微物体或由其生成的生物微物体的群在室内分泌可溶性被分析物；将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质包含第二批多个可溶性报道分子，其中每个报道分子均包含：被配置为结合可溶性分泌的被分析物的结合组分；和可检测的标记物；允许第二批多个可溶性报道分子的一部分扩散到室中并与其中分泌的可溶性被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；以及检测位于微流体装置内的一个或多个受关注区域内的可溶性报道分子。[1083]实施方案244.根据实施方案243所述的方法，其中室包括分离区域，其中分离区域与二次流动分离。[1084]实施方案245.根据实施方案243或244中任一项所述的方法，其中室包括连接区域，该连接区域与流动区域中的流体介质的直接流动分离。[1085]实施方案246.根据实施方案243至245中任一项所述的方法，其中将多个生物微物体中的单个生物微物体布置在多个室中的单个室中。[1086]实施方案247.根据实施方案243至246中任一项所述的方法，其中可溶性报道分子的浓度为可溶性报道分子对被分析物的kd的约1-10倍。[1087]实施方案248.根据实施方案243至247中任一项所述的方法，其中流动区域中的第二流体介质以约0.1-10秒的刷新率刷新，并且刷新率是替换流动区域中全部流体体积的时间段。[1088]实施方案249.根据实施方案243至248中任一项所述的方法，其中图像是在t＝0时获取的第一图像，可溶性报道分子的检测包括在t＝1时获取第二图像，其中在t＝l时，流动区域和多个室之间的未结合的可溶性报道分子的扩散已接近稳态。[1089]实施方案250.根据实施方案243至249中任一项所述的方法，其中受关注区域包括多个室中每个室的连接区域的至少一部分，所述方法进一步包括：从第二图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室的至少一部分确定包含每个连接区域的至少一部分的受关注区域中的可溶性rmsa复合物的相对量，其中受关注区域中的可溶性rmsa复合物的相对量用于生成可溶性rmsa复合物量的变化的线性近似值，并且线性近似值的斜率用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。[1090]实施方案251.根据实施方案250所述的方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第二图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[1091]实施方案252.根据实施方案243至249中任一项所述的方法，其中微流体装置包含多个室，并且其中受关注区域是多个室中每个室的钩区域，所述方法进一步包括：从第二图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室中的至少一部分量化钩区域中的可溶性rmsa复合物的相对量，其中钩区域中可溶性rmsa复合物的相对量用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。[1092]实施方案253.根据实施方案252所述的方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第二图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[1093]实施方案254.根据实施方案243至253中任一项所述的方法，其进一步包括：在引入第四流体介质之前获取背景图像；和通过从第二图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[1094]实施方案255.根据实施方案243至254中任一项所述的方法，其中第一批多个和第二批多个可溶性报道分子包含相同的标记物。[1095]实施方案256.根据实施方案243至254中任一项所述的方法，其中第一批多个和第二批多个可溶性报道分子包括两种不同的报道分子，每种报道分子具有不同的标记物。[1096]实施方案257.一种评估跨多个生物微物体或由其生成的生物微物体的群的可溶性被分析物的相对分泌水平的方法，该方法包括：将第一流体介质引入微流体装置的多个室中，其中微流体装置包括具有流动区域的外壳和流体连接到流动区域的室，其中第一流体介质包括第一批多个报道分子；获取微流体装置的第一图像；将第二流体介质引入流动区域，其中第二流体介质不包含报道分子；将生物微物体引入室中；允许生物微物体或由其生成的生物微物体的群在室内分泌可溶性被分析物；将第三流体介质引入流动区域，其中第三流体介质包含第二批多个报道分子，其中每个报道分子均包含：被配置为结合分泌的被分析物的结合组分；和可检测的标记物；允许第二批多个报道分子的一部分扩散到室中并与其中分泌的可溶性被分析物结合，从而产生多个可溶性报道分子:分泌的被分析物(rmsa)复合物；获取微流体装置的第二图像；将第四流体介质引入流动区域，其中第四流体介质不包含报道分子；以及检测位于微流体装置内的一个或多个受关注区域内的报道分子。[1097]实施方案258.根据实施方案257所述的方法，其中室包括分离区域，其中分离区域与二次流动分离。[1098]实施方案259.根据实施方案257或258中任一项所述的方法，其中室包括连接区域，该连接区域与流动区域中的流体介质的直接流动分离。[1099]实施方案260.根据实施方案257至259中任一项所述的方法，其中将多个生物微物体中的单个生物微物体布置在多个室中的单个室中。[1100]实施方案261.根据实施方案257至260中任一项所述的方法，其中可溶性报道分子的浓度为可溶性报道分子对被分析物的kd的1-10倍。[1101]实施方案262.根据实施方案257至261中任一项所述的方法，其中流动区域中的第二流体介质以约0.1-10秒的刷新率刷新，并且刷新率是替换流动区域中全部流体体积的时间段。[1102]实施方案263.根据实施方案257至262中任一项所述的方法，其中检测报道分子包括获取微流体装置的第三图像。[1103]实施方案264.根据实施方案263所述的方法，其中受关注区域包括多个室中每个室的连接区域的至少一部分，所述方法进一步包括：从第三图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室的至少一部分量化每个连接区域的多个子区域中每个子区域中的可溶性rmsa复合物的量，其中多个子区域的一部分中的可溶性rmsa复合物的量用于生成线性近似值，并且线性近似值的斜率用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。[1104]实施方案265.根据实施方案264所述的方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[1105]实施方案266.根据实施方案264所述的方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像、第二图像和背景图像来获得校正图像。[1106]实施方案267.根据实施方案263所述的方法，其中受关注区域是多个室中每个室的钩区域，所述方法进一步包括：从第三图像减去至少第一图像以产生校正图像；和分析校正图像，以对多个室中的至少一部分量化钩区域中的rmsa复合物的量，其中钩区域中rmsa复合物的量用于比较各个室之间分泌的被分析物的产生。[1107]实施方案268.根据实施方案267所述的方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像和背景图像来获得校正图像。[1108]实施方案269.根据实施方案268所述的方法，其进一步包括：在引入第一流体介质之前获取背景图像；和通过从第三图像中减去至少第一图像、第二图像和背景图像来获得校正图像。[1109]实施方案270.根据实施方案257至262中任一项所述的方法，其中第二图像用于确定未结合的报道分子在流动区域和室之间的扩散是否已达到稳态。[1110]实施方案271.根据实施方案257至270中任一项所述的方法，其进一步包括：获得多个室中每个室的相对分泌水平或分泌得分；并基于所获得的分泌得分对多个室进行评级；以及基于评级对多个室进行排序。[1111]实施方案272.根据实施方案257至271中任一项所述的方法，其中第一批多个和第二批多个可溶性报道分子包含相同的标记物。[1112]实施方案273.根据实施方案257至271中任一项所述的方法，其中第一批多个和第二批多个可溶性报道分子包括两种不同的报道分子，每种报道分子具有不同的标记物。当前第1页12当前第1页12
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