一种用于预测胃癌恶病质的微生物标记物及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于预测胃癌恶病质的微生物特异组合物及其应用。


背景技术：

2.胃癌居全球癌症发病谱的第5位，死因谱的第4位，而我国是世界上胃癌发病率最高的国家之一。恶病质作为一种破坏性的多因素代谢综合征，以摄食减少、骨骼肌萎缩、代谢紊乱、炎症反应和肠道微生物群失衡组合驱动的负氮平衡及负能量平衡为病理特征，是仅此于感染的导致癌症患者死亡的第二原因。化学疗法作为肿瘤的标准一线治疗方法，具有显著的副作用，现有研究证明化疗会诱导恶病质乃至促进恶病质进展，特别是处于进展期胃癌患者更易发生癌症恶病质，同时，恶病质状态也会增加化疗的毒副作用，导致机体对化疗的敏感性和耐受性降低并严重影响患者生活质量，预后不佳。
3.尽管目前对于以高死亡率和疗效不佳为特点的癌症恶病质已经受到越来越多的学者关注，但鉴于恶病质复杂的发病机制，前期临床症状缺乏特异性，容易被临床医生所忽略，故难以早期明确诊断，同时常规的营养支持不能有效逆转恶病质状态，缺乏高效的检测靶点及干预措施使针对恶病质的管理处于瓶颈状态。值得关注的是，当肿瘤患者处于疾病的早期阶段，采取干预措施防止进展至不可逆转的恶病质状态是更有意义的治疗目标，目前尚没有明确的生物标志物来有效识别这些可能进一步进展至恶病质状态的肿瘤患者。因此，迫切需要特异性的生物标志物以早期甄别癌症相关恶病质事件。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明对胃癌恶病质组与非恶病质组肠道微生物群组成进行深入研究，利用16srdna测序在属水平上，筛选出了一组可准确预测化疗相关胃癌恶病质的菌群组合：bacteroides、ruminococcus_torques_group、lachnospiraceae_fcs020_group、granulicatella、eubacterium_siraeum_group、paraclostridium、coriobacteriaceae_ucg-002。并且本发明基于该菌群组合，建立了随机森林预测模型。结果显示，测试集曲线下面积(auc)为73.3％[95％ci,43.3％-100％]，验证集auc面积为96.8％[95％ci,92.3％-100％]，两个队列的敏感性为94,4％，特异性为78.6％，准确性为80.4％，表明基于粪便微生物群的菌属组合可以较好的预测化疗相关胃癌恶病质的发生。这组新的生物标志物为未来防治化疗相关胃癌恶病质的早期发现和早期采取干预措施具有重要意义。
[0005]
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
[0006]
一种用于预测胃癌恶病质的微生物，微生物包括bacteroides、ruminococcus_torques_group、lachnospiraceae_fcs020_group、granulicatella、eubacterium_siraeum_group、paraclostridium或coriobacteriaceae_ucg-002中的至少一种。
[0007]
一种用于预测化疗相关的胃癌恶病质的微生物，微生物标志物包括bacteroides、ruminococcus_torques_group、lachnospiraceae_fcs020_group、granulicatella、
eubacterium_siraeum_group、paraclostridium或coriobacteriaceae_ucg-002中的至少一种，所述的化疗药为含氟尿嘧啶类或含铂类药物。
[0008]
本发明提供的微生物可用于制备预测胃癌恶病质或化疗相关的胃癌恶病质的微生物标记物或试剂盒。
[0009]
本发明筛选发现，这些特异性的微生物bacteroides、ruminococcus_torques_group、granulicatella、paraclostridium、coriobacteriaceae_ucg-002在化疗后明显增高，微生物分类群lachnospiraceae_fcs020_group、eubacterium_siraeum_group在化疗后减少。
[0010]
一种预测胃癌恶病质的试剂盒，它包括bacteroides、ruminococcus_torques_group、lachnospiraceae_fcs020_group、granulicatella、eubacterium_siraeum_group、paraclostridium或coriobacteriaceae_ucg-002中的至少一种。
[0011]
有益效果：
[0012]
本发明对胃癌恶病质组与非恶病质组肠道微生物群组成进行深入研究，利用16srdna测序在属水平上，筛选出了一组可准确预测化疗相关胃癌恶病质的菌群组合：bacteroides、ruminococcus_torques_group、lachnospiraceae_fcs020_group、granulicatella、eubacterium_siraeum_group、paraclostridium、coriobacteriaceae_ucg-002的七种菌群。然后本发明基于logistic回归进行随机森林建模，预测该差异菌属预测化疗相关胃癌恶病质的特异性及敏感性。rf模型显示这7中微生物差异菌属组合曲线下面积(auc)93.5％[95％ci,86.6％-100％]，敏感性为94,4％，特异性为78.6％，准确性为80.4％，表明差异菌属组合的rf模型灵敏度高且误判率低，证明基于粪便微生物群的菌属组合可以较好的预测临床化疗相关胃癌恶病质的发生。可以早期甄别化疗相关恶液质的发生，及时采取干预措施预防症状的恶化，对临床有重要的参考意义。
附图说明
[0013]
图1是优质序列长度分布图。
[0014]
图2图2out分布venn图。
[0015]
图3是alpha多样性指数及pls-da分析图(hc:gc)。
[0016]
图4是化疗前后恶病质组(c)与非恶病质组(nc)血浆炎症因子水平图。
[0017]
图5是化疗前后c组和nc组恶病质相关临床指标图(weight、bmi、wbc、白蛋白、前白蛋白、nrs2002、sga)。
[0018]
图6alpha多样性指数及pls-da分析图(ca:nca)。
[0019]
图7metastats分析及gini分析图。
[0020]
图8基于logistic回归的7个差异菌属组合建模图。
[0021]
图9基于logistic回归的7个差异单菌建模图。
具体实施方式
[0022]
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定的范围。
[0023]
以下实施例所用到的实验材料和实验仪器如下：
[0024][0025]
1、实验方法
[0026]
2.1患者招募
[0027]
参照ajcc第八版胃癌病理分期标准，纳入46名原发iii-iv期无恶病质胃癌患者。遵循nccn(national comprehensive cancer network)指南推荐的含氟尿嘧啶类或含铂类治疗方案进行化疗。依据国际癌症恶病质定义与分类共识，将胃癌患者化疗后分为恶病质组和非恶病质组。同时招募30名健康个体作为对照，控制受试群体生活方式和饮食习惯等混杂因素对肠道菌群结果的影响。
[0028]
2.2样本采集
[0029]
粪便样本的采集办法参照《人类微生物组项目议定书程序手册》(#07-001)，所有研究对象在接受化疗前及化学治疗3周期后均使用无菌冻存管留取中段粪便1次，3g以上，30个健康个体以同样的方法采集一份粪便样本，冻存于-80℃冰箱。取0.5g粪便，使用细菌dna提取试剂盒提取粪便dna。对大便菌群dna进行16srdna定量分析。
[0030]
2.3总dna提取和检测
[0031]
2.3.1总dna提取：参照stool dna kit说明书。
[0032]
称取200mg粪便样品放置于装有200mg x号玻璃珠的2ml微量离心管中，并置于冰上。
[0033]
加入540μl slx-mlus buffer，涡旋10分钟充分混匀。
[0034]
加入60μl ds buffer和20μl proteinase k solution，并涡旋或上下翻转混匀。
[0035]
70℃孵育13分钟，期间混匀两次。
[0036]
95℃孵育5分钟。
[0037]
加入200μl sp2 buffer，最大速度涡旋混匀30秒。
[0038]
冰上静置5分钟，13,000g离心5分钟。
[0039]
吸取400μl上清于新的1.5ml离心管中(勿吸取沉淀)。
[0040]
加入200μl chtr试剂，最大速度涡旋10秒。
[0041]
室温静置2分钟，13,000g离心2分钟。
[0042]
吸取250μl上清于新的1.5ml离心管中。
[0043]
加入250μl bl buffer和250μl 100％乙醇，最大速度涡旋10秒。
[0044]
将dna离心住插入2ml收集管中。
[0045]
将步骤12中的全部样本转移至离心柱中，13,000g离心1分钟。
[0046]
弃掉收集管中废液，将离心柱转移至新的收集管中。
[0047]
加入500μl vhb buffer，13,000g离心30秒，倒掉收集管中废液并重新放回。
[0048]
加入700μl dna wash buffer，13,000g离心1分钟，倒掉收集管中废液并重新放回。
[0049]
重复16-17步骤，13,000g室温离心2分钟。
[0050]
将离心柱转移至新的1.5ml离心管中。
[0051]
加入100-200μl elution buffer于收集柱中央65℃热击溶解dna，室温放置2分钟。
[0052]
13,000g室温离心1分钟，收集dna至于-20℃冰箱保存。
[0053]
2.3.2 dna检测：
[0054]
dna纯度和浓度检测：nanodrop2000
[0055]
dna完整性检测方法：1％琼脂糖凝胶电泳，电压5v/cm，时间为20min。
[0056]
2.4 pcr扩增
[0057]
引物对应区域：16s v3-v4区
[0058]
上游引物338f：cctaygggrbgcascag-3
[0059]
下游引物806r：ggactacnngggtatctaat
[0060]
(反应体系(30μl)如下：
[0061]
试剂体积phusion master mix(2x)15μl2um forward primer1.5μl2um reverse primer 2um1.5μldna30ng(根据具体浓度核算)dd h2o补足至30μl
[0062]
反应条件如下：
[0063][0064]
2.5 pcr产物鉴定、纯化及定量
[0065]
2.5.1 pcr产物鉴定：
[0066]
(1)每个样本3个pcr重复，将3个重复的pcr产物混合；
[0067]
(2)使用2％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
[0068]
2.5.2 pcr产物纯化使用axyprep dnagel extraction kit，具体流程如下：
[0069]
(1)在紫外灯下切下含有目的dna的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(100mg＝100μl体积)；
[0070]
(2)加入3个凝胶体积的buffer de-a，混合后与75℃加热，间断混合，直至凝胶完全融化；
[0071]
(3)加0.5个buffer de-b，混合均匀；
[0072]
(4)吸取步骤3中的混合液，转移到dna制备管中，10000rpm离心1min，弃滤液；
[0073]
(5)将制备管置回2ml离心管，加500μl buffer w1，12000rpm离心30sec，弃滤液；
[0074]
(6)将制备管置回2ml离心管，加700μl buffer w2，12000rpm离心30sec，弃滤液，以同样的方法用700μl buffer w2洗涤一次，12000rpm离心1min；
[0075]
(7)将制备管置回2ml离心管，12000rpm离心1min；
[0076]
(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管，在制备膜中央加25-30μl去离子水，室温静置1min，12000rpm离心1min洗脱dna。
[0077]
2.5.3 pcr产物定量与均一化
[0078]
将pcr产物用quantus
tm
fluorometer进行检测定量。按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。
[0079]
2.6构建pe文库及illumina测序
[0080]
2.6.1 miseq文库构建：使用nextflex rapid dna-seq kit进行建库，具体流程如下：
[0081]
(1)接头链接；
[0082]
(2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；
[0083]
(3)利用pcr扩增进行文库模板的富集；
[0084]
(4)磁珠回收pcr产物得到最终的文库。
[0085]
2.6.2 illumina测序：利用illumina公司的miseq pe300平台进行测序，具体流程如下：
[0086]
(1)dna片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；
[0087]
(2)另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”；
[0088]
(3)pcr扩增，产生dna簇；
[0089]
(4)dna扩增子线性化成为单链。
[0090]
(5)加入改造过的dna聚合酶和带有4种荧光标记的dntp，每次循环只合成一个碱基；
[0091]
(6)用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；
[0092]
(7)将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；
[0093]
(8)统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板dna片段的序列。
[0094]
2.7分析方法
[0095]
2.7.1数据优化：使用fastp(https://github.com/opengene/fastp，version 0.20.0)软件对原始测序序列进行质控，使用flash(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7)软件进行拼接：
[0096]
(1)过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含n碱基的reads；
[0097]
(2)根据pe reads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10bp；
[0098]
(3)拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；
[0099]
(4)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。
[0100]
2.7.2 otu聚类：使用uparse软件(http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根据97％的相似度对序列进行otu聚类，具体流程如下：
[0101]
(1)对优化序列提取非重复序列，去除没有重复的单序列；
[0102]
(2)按照97％相似性对非重复序列(不含单序列)进行otu聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到otu代表序列；
[0103]
(3)将所有优化序列map至otu代表序列，选出与otu代表序列相似性在97％以上的序列，生成otu表格。
[0104]
2.7.3分类学分析：利用rdp classifier(http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)对每条序列进行物种分类注释，比对silva 16s rrna数据库(v138)，设置比对阈值为70％。
[0105]
2.8统计与分析方法
[0106]
对临床定量资料描述其均数与标准差(中位数与四分位数)，符合正态分布或近似正态分布的数据采用t检验，非正态分布的数据采用非参数秩和检验。定性资料描述其例数或百分比，采用卡方检验或fisher精确概率法。所有患者临床数据录入采用excel2021软件，统计分析采用graphpad prism 8及spss 25.0统计软件完成，p《0.05认为具有统计学差异。
[0107]
对粪便样本通过16srdna测序得到的数据利用qiimei(v1.8.0)软件进行alpha多
样指数分析(chao1、simpson、goods-coverage和shannon指数)和beta多样性分析(pca、pcoa和nmds分析)。利用mothur对基于out聚类的结果进行rarefaction曲线、shannon-wiener曲线、rank-abundance曲线和specaccum物种累计曲线等分析。最后利用phython(v2.7)进行lefse分析寻找组间差异标志物，其中kruskal-wallis阈值设置0.05，wilcoxon阈值设置0.05，stamp阈值设置0.05，线性判别分析(lda)阈值设置为3。优质序列长度分布图、物种组成柱状图、out venn图等均由r语言工具绘制。
[0108]
2、实验结果
[0109]
3.1入组患者人口统计学信息，详见表1。
[0110]
表1：人口统计学信息表
[0111][0112][0113]
3.2肠道菌群数据质控及out基础分析
[0114]
在采集的122份样本中，经数据预处理得到优质序列长度分布于400-440bp，共定位到2455个otus，利用otu丰度的稀疏曲线达到平台期，表明本次测序深度已经基本覆盖到样本中所有的物种。shannon-winner曲线表明测序数据量足够，可反映样本中绝大多数微
生物物种信息。rank-abundance曲线表明本次采集样本的物种组成丰富且均匀，见图1-2。
[0115]
3.3胃癌(gc)患者的肠道微生物组与健康个体(hc)显著不同
[0116]
通过测序分析gc患者与hc的菌群样本。在基于chao 1的alpha多样性指数中，观察到与hc组相比较，未接受化疗的胃癌患者(cb-b)菌群多样性更高(p＝0.0001)。值得注意的是，基于otu聚类结果进行partial least squarjes discrimination analysis(pls-da)分析中，hc组和gc组的样本明显分类聚集，两组间有显著差异(p＝0.001)，见图3。
[0117]
样本物种组成分析中，hc组和gc组在门水平上显示优势菌门为firmicutes、bacteroidota、proteobacteria，两组间相对丰度具有差异，较之hc组，gc患者firmicutes水平降低，bacteroidota、fusobacteriota水平增高，在属水平上，观察到hc组以blautia、bacteroides、faecalibacterium为优势菌群，而gc患者物种组成中blautia、faecalibacterium水平显著减低，以bacteroides、streptococcus、prevotella增加为特点。对比健康个体，中晚期胃癌患者的肠道微生物群呈现失调状态，部分潜在致病菌丰度增高。采用lefse分析寻找有显著差异的标志性物种，在属水平上与健康人相比，gc患者样本中微生物群富集以streptococcus、lactobacillus、prevotella、bacteroide、fusobacterium、roseburia、veillonella、akkermansia、parabacteroides、phascolarctobacterium、lachnoclostridium、megasphaera、alistipes、ucg_002、nk4a214_group为主，而差异菌blautia、faecalibacterium、romboutsia、eubacterium__hallii_group、fusicatenibacter、collinsella、erysipelotrichaceae_ucg_003、subdoligranulum、dorea、ruminococcus、clostridium_sensu_stricto_1、clostridium_sensu_stricto_1则更多的富集在健康个体的粪便样本中，表明两组间微生物群有显著差异。
[0118]
3.4胃癌患者化疗后恶病质组(cb)与非恶病质组(ncb)组肠道微生物群组成特征基于临床治疗过程中观察到部分接受化疗的gc患者伴有明显的消瘦、乏力、厌食等症状，依据国际癌症恶病质定义与分类共识(癌症恶病质的诊断标准为：既往6个月非自主意愿的体重减轻》5％；或者bmi《20且任何程度的体重减轻》2％)，将患者化疗相关恶病质组(cachexia,ca)和非恶病质组(non-cachexia,nca)，两组患者治疗前基本信息详见表1。进一步通过体重、bmi指数、wbc、白蛋白、前白蛋白水平及nrs2002、sga量表对两组患者营养状态进行评估，结果表明：化疗后恶液质组患者体重、bmi明显降低，差异具有统计学意义(p《0.05)，恶液质组患者血清指标白蛋白、前白蛋白及白细胞水平降低，但不具有统计学差异，结合nrs2002量表及sga量表评估表明治疗后恶液质组患者营养不良严重程度显著加重，而非恶液质组各项指标均优于恶液质组，差异具有显著统计学差异(p《0.01)，详见表2。进而检测两组患者化疗前后血清中恶液质相关炎症因子白细胞介素-6(il-6)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)，结果表明：与非恶液质组相比，化疗相关恶病质组患者il-6、tnf-α水平增高，两组间具有统计学差异(p《0.05)，见图4和5。综上，可证实化疗后部分胃癌患者表现出明显分解代谢及炎症反应增强的特征，符合恶液质的各项临床及实验室诊断标准。
[0119]
表2：治疗前后c组和nc组临床信息表
[0120][0121]
为明确肠道菌群与化疗相关恶液质的联系，本发明将ca患者与nca两组患者治疗后的粪便进行肠道菌群16s测序，观察两组菌群的构成改变。在ca患者与nca患者的微生物互作网络中显示：两组间存在差异，ca患者以厚壁菌门为优势菌群，变形菌门丰度增高且微生物簇内在联系减弱为特点，而nca患者微生物群丰富且彼此关联，菌群分布均匀，肠道共生菌可以调节肠道屏障的完整性，通过抵御病原体的入侵和帮助宿主免疫系统的发育来促进肠道防御体系。同时，肠道细菌内部通过竞争结肠黏膜表面的营养物质和附着位点来维持对致病菌定殖的抵。由上可知，胃癌恶病质患者微生物群多样性较低，且肠道微环境紊乱，与未发生恶病质的患者微生物群相比具有差异，见图6。
[0122]
并且本发明通过使用metastats分析ca组与nca组在属水平上的差异微生物分类群，共发现9个差异微生物分类群(p《0.05)，分别为bacteroides、ruminococcus_torques_group、lachnospiraceae_fcs020_group、granulicatella、eubacterium_siraeum_group、paraclostridium、coriobacteriaceae_ucg-002、vagococcus、stomatobaculum。其中，bacteroides、ruminococcus_torques_group、granulicatella、paraclostridium、coriobacteriaceae_ucg-002、stomatobaculum在化疗后恶液质组中明显增高，而微生物分类群lachnospiraceae_fcs020_group、eubacterium_siraeum_group、vagococcus在化疗相关的胃癌恶液质组中则减少，见图7。
[0123]
3.5随机森林预测模型的建立
[0124]
为实现研究结果向临床应用转化，开发肠道微生物群作为简易有效的生物标志物具有应用潜力，本发明基于前期筛选的差异微生物群组合，使用随机森林算法构建潜在化疗相关胃癌恶病质患者的预测模型。申请人从上述9个差异微生物分类群中，排除测序随机误差混杂因素(排除标准为粪便样本测序单菌丰度》1.18555e-05)，筛选出7个候选差异微生物变量使用随机森林(rf)模型，分别为bacteroides、ruminococcus_torques_group、lachnospiraceae_fcs020_group、granulicatella、eubacterium_siraeum_group、paraclostridium、coriobacteriaceae_ucg-002。基于logistic回归进行随机森林建模，预测该差异菌属预测化疗相关胃癌恶病质的特异性及敏感性。如图8，rf模型显示7个差异菌属组合曲线下面积(auc)93.5％[95％ci,86.6％-100％]，敏感性为94,4％，特异性为78.6％，准确性为80.4％，表明差异菌属组合的随机森林模型(rf)灵敏度高且误判率低，证明基于粪便微生物群的菌属组合可以较好的预测临床化疗相关胃癌恶病质的发生。
[0125]
同时，本发明构建差异单个菌的rf模型，分析单菌的预测能力，如图9结果显示，bacteroide的auc面积为65.3％[95％ci,49％-81.5％]，敏感性(se)为83.3％，特异性(sp)为42.9％；ruminococcus_torques_group的auc面积为65.5％[95％ci,49.5％-81.4％]，se
为94.4％，sp为42.9％；lachnospiraceae_fcs020_group的auc面积为67.8％[95％ci,50.2％-85.3％]，se为72.2％，sp为67.9％；granulicatella的auc面积为69.6％[95％ci,54％-85.3％]，se为50％，sp为85.7％；eubacterium_siraeum_group的auc面积为76.4％[95％ci,60.9％-91.9％]，se为72.2％，sp为82.1％；coriobacteriaceae_ucg-002的auc面积为74.2％[95％ci,60.9％-87.5％]，se为72.2％，sp为71.4％；paraclostridium的auc面积为34.2％[95％ci,22.9％-45.5％]，se为100％，sp为0％。综上7个差异菌对胃癌化疗相关恶液质也有一定的预测作用。
[0126]
综上所述，本发明基于肠道菌群测序分析和构建随机森林预测模型发现一组预测化疗相关胃癌恶病质的菌属组合，通过检测简便易行的菌群变化来早期预测胃癌恶病质人群，这组新的生物标志物亦为将来靶向肠道菌群的个性化治疗及胃癌恶病质相关研究提供参考。
[0127]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。