一种菊超氧化物歧化酶及其制备方法和用途与流程

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种菊超氧化物歧化酶及其制备 方法和用途。


背景技术：

2.超氧化物歧化酶是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自 由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶，所以在维护生 物机体内自由基产生与清除的动态平衡中起极其重要的作用。
3.在预防各种疾病，抗衰老防御物质中，sod是最重要的关键酶。科学实践 证实，任何耗氧的有机体如果sod减少，防御机制将减弱，造成养病的发生 增多，氧自由期过剩增加了正常的代谢程序，因而衰老进程加速。
4.经过海量检索，发现现有技术，公开号为：cn106434580a，公开 了一种植物超氧化物歧化酶提取方法，具体的说是在植物鲜果或鲜叶 原料中加入生理盐水、保护剂及溶膜剂冷提细胞内的超氧化物歧化酶， 经预处理后的料液用截留分子量为10万和1万的中空纤维膜浓缩后， 得到超氧化物歧化酶浓缩液，经过有机溶剂除杂、丙酮沉淀、冷冻干 燥，可得到活性在1300～1800u/mg的超氧化物歧化酶产品。该发明可 为植物超氧化物歧化酶资源开发利用提供参考。
5.综上所述，现有的以植物为原材料提取超氧化物歧化酶时，由于植物组 织中含有的纤维质会降低超氧化物歧化酶的溶解析出效率，使得植物为原料 的超氧化物歧化酶提取效率较低，需要大量的植物原料进行提取。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种菊超氧化物歧化酶及其制备方法和用途，以 解决上述背景技术中提出的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种菊超氧化物歧化酶及 其制备方法和用途，菊超氧化物歧化酶制备方法步骤如下：
8.s1：菊花叶片选择和预处理，采用氢氧化钠溶液对叶片进行纤维质分离；
9.s2：原材清洗、研磨，将原材采用蒸馏水冲洗，恢复原材至中性，并进 行研磨细胞破碎；
10.s3：超氧化物歧化酶提取，采用磷酸缓冲液进行处理，并进行研磨搅拌；
11.s4：除杂蛋白，提取液中加入氯仿-乙醇混合溶剂搅拌、离心处理，得到 粗超氧化物歧化酶提取液；
12.s5：沉淀分离，粗超氧化物歧化酶提取液中加入冷丙酮和磷酸缓冲液， 热处理得到超氧化物歧化酶提取液。
13.优选的，基于菊超氧化物歧化酶制备方法的s1中：
14.选取新鲜、无枯萎的菊花叶片，经过清洗和筛分后，得到提取材料，将 清洗筛选后
的提取原材置于2％浓度的氢氧化钠溶液中，氢氧化钠溶液体积与 提取原材比例为1.2:1；
15.浸泡过程中，对容器内进行加热，加热温度至60-80℃，加热时间为60min， 加热过程中进行均匀的搅拌，加热完成后自然降温至40-50℃。
16.优选的，基于菊超氧化物歧化酶制备方法的s2中：
17.原材采用氢氧化钠溶液处理后，自然降温后将蒸馏水注入容器中，采用 蒸馏水对原材进行冲洗和中和，将原材的ph恢复至中性；
18.清洗完成后，将原材水分控制在15-30％范围内，对原材进行研磨，将菊 花花瓣进行细胞破碎。
19.优选的，基于菊超氧化物歧化酶制备方法的s3中：
20.将破碎花瓣组织加入2-3倍体积的磷酸缓冲液，另算缓冲液的浓度为 0.05mol/l，ph为7.8，继续研磨搅拌20min，用于将超氧化物歧化酶充分溶 解至缓冲液中；
21.随后采用离心机进行离心处理，转速为4500-5000r/min，离心处理时间 为15min，得到提取液。
22.优选的，基于菊超氧化物歧化酶制备方法的s4中：
23.在提取液中加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合溶剂，进行搅拌15min，并 在离心机中进行4500-5000r/min离心处理，离心处理时间15min，去除蛋白 沉淀，得到粗超氧化物歧化酶提取液。
24.优选的，基于菊超氧化物歧化酶制备方法的s5中：
25.将粗超氧化物歧化酶提取液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，在 5000r/min条件下进行离心处理，离心时间为15min，得到超氧化物歧化酶沉 淀；
26.并在沉淀液中加入0.05mol/l，ph7.8的磷酸缓冲液，在55-65℃环境下 进行热处理，热处理时间为15min，经过离心处理后，去除沉淀物，得到超氧 化物歧化酶提取液。
27.优选的，菊超氧化物歧化酶中采用菊花花瓣作为原材料，具有极强的抗 炎症、抗辐射、搞衰老及美容作用，消除或减少色素沉着、皱纹；
28.菊超氧化物歧化酶在体内可最大能力的清除氧自由基，在皮肤表层能抑 制氧自由基的强氧化作用。具有长效性的清除作用，使吞噬细胞对色斑的进 攻力增强，提高了清除能力、强化自我防护、自我修复功能，具有防疾病， 防晒、祛斑、退粉刺、减轻面部的氧化的功效。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明在原料处理阶段中，采 用氢氧化钠溶液在加热环境下进行原料处理，可在原材料经过研磨粉碎后， 菊花花瓣组织中的纤维质与细胞进行分离，可加快后续的超氧化物歧化酶提 取效率，可减少原材料的使用量，并且以药用菊花作为原材料，可在超氧化 物歧化酶的基础上，带有药用菊花的功效，可得到使用效果更好的超氧化物 歧化酶。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部 的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性 劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外
”ꢀ“
前端”、“后端”、“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位 置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装 置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为 对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能 理解为指示或暗示相对重要性。
32.在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语
ꢀ“
安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以 是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可 以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个 元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述 术语在本发明中的具体含义。
33.本发明提供的三种实施例：
34.实施例一：
35.一种菊超氧化物歧化酶及其制备方法，菊超氧化物歧化酶制备方法步骤 如下：
36.s1：菊花叶片选择和预处理，采用氢氧化钠溶液对叶片进行纤维质分离；
37.s2：原材清洗、研磨，将原材采用蒸馏水冲洗，恢复原材至中性，并进 行研磨细胞破碎；
38.s3：超氧化物歧化酶提取，采用磷酸缓冲液进行处理，并进行研磨搅拌；
39.s4：除杂蛋白，提取液中加入氯仿-乙醇混合溶剂搅拌、离心处理，得到 粗超氧化物歧化酶提取液；
40.s5：沉淀分离，粗超氧化物歧化酶提取液中加入冷丙酮和磷酸缓冲液， 热处理得到超氧化物歧化酶提取液。
41.基于菊超氧化物歧化酶制备方法的s1中：
42.选取新鲜、无枯萎的菊花叶片，经过清洗和筛分后，得到提取材料，将 清洗筛选后的提取原材置于2％浓度的氢氧化钠溶液中，氢氧化钠溶液体积与 提取原材比例为1.2:1；
43.浸泡过程中，对容器内进行加热，加热温度至60-80℃，加热时间为60min， 加热过程中进行均匀的搅拌，加热完成后自然降温至40-50℃。
44.基于菊超氧化物歧化酶制备方法的s2中：
45.原材采用氢氧化钠溶液处理后，自然降温后将蒸馏水注入容器中，采用 蒸馏水对原材进行冲洗和中和，将原材的ph恢复至中性；
46.清洗完成后，将原材水分控制在15-30％范围内，对原材进行研磨，将菊 花花瓣进行细胞破碎。
47.基于菊超氧化物歧化酶制备方法的s3中：
48.将破碎花瓣组织加入2-3倍体积的磷酸缓冲液，另算缓冲液的浓度为 0.05mol/l，ph为7.8，继续研磨搅拌20min，用于将超氧化物歧化酶充分溶 解至缓冲液中；
49.随后采用离心机进行离心处理，转速为4500-5000r/min，离心处理时间 为15min，得到提取液。
50.基于菊超氧化物歧化酶制备方法的s4中：
51.在提取液中加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合溶剂，进行搅拌15min，并 在离心机中进行4500-5000r/min离心处理，离心处理时间15min，去除蛋白 沉淀，得到粗超氧化物歧
化酶提取液。
52.基于菊超氧化物歧化酶制备方法的s5中：
53.将粗超氧化物歧化酶提取液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，在 5000r/min条件下进行离心处理，离心时间为15min，得到超氧化物歧化酶沉 淀；
54.并在沉淀液中加入0.05mol/l，ph7.8的磷酸缓冲液，在55-65℃环境下 进行热处理，热处理时间为15min，经过离心处理后，去除沉淀物，得到超氧 化物歧化酶提取液。
55.实施例二：
56.菊超氧化物歧化酶的活性测定：
57.选取菊超氧化物歧化酶提取物的样本，滴定至试管中，加入肾上腺素， 充分摇匀后，在30℃的水浴环境下预热5min至恒温；
58.继续保温反应2min，测定试管在480nm处的光密度，对照管和样品管的 光密度数值进行测定，得到提取额、粗酶液和菊超氧化物歧化酶提取液的活 力和体积，计算纯化率和活性。
59.实施例三：
60.菊超氧化物歧化酶的用途：
61.菊超氧化物歧化酶中采用菊花花瓣作为原材料，具有极强的抗炎症、抗 辐射、搞衰老及美容作用，消除或减少色素沉着、皱纹；
62.菊超氧化物歧化酶在体内可最大能力的清除氧自由基，在皮肤表层能抑 制氧自由基的强氧化作用。具有长效性的清除作用，使吞噬细胞对色斑的进 攻力增强，提高了清除能力、强化自我防护、自我修复功能，具有防疾病， 防晒、祛斑、退粉刺、减轻面部的氧化的功效。
63.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节， 而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实 现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且 是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨 在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。