一种抗自身免疫药物细胞靶标筛选系统及其构建方法和应用

1.本发明涉及到一种分别以人il-21和人foxp3双靶点的高效、可靠的抗自身免疫药物筛选细胞系统及其构建方法和应用。


背景技术：

2.免疫系统的主要作用是识别和消除外来抗原。当免疫平衡被破坏时，正常的细胞或组织被身体的免疫系统攻击，就会产生自身免疫。自身免疫性疾病主要包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化病等几十余种疾病。
3.白介素21(il-21)是一种主要由滤泡辅助性t(follicular helper t,tfh)细胞和辅助性t细胞17(t helper 17，th17)分泌的自分泌细胞因子，在免疫系统中发挥重要作用，例如促进tfh和th17细胞的增殖和发育，诱导b细胞生成和分化为浆细胞，促进免疫球蛋白的产生。因此，il-21与自身免疫性疾病有关。事实上，系统性红斑狼疮(sle)、类风湿性关节炎(ra)、1型糖尿病(t1d)、免疫性血小板减少症(itp)、原发性干燥综合征(pss)、自身免疫性甲状腺疾病(aitd)和牛皮癣患者的外周血和组织中il-21水平都会升高。在sle和ra中，il-21的升高甚至与tfh细胞、浆细胞、自身抗体和疾病活动性呈正相关。此外，il-21已被用作多种自身免疫性疾病的治疗靶点。il-21的表达，除了受il-21启动子的调控外，还受几个保守非编码序列(conservative noncoding sequences,cns)的调控，如cns2，cns49等。
4.调节性t(treg)细胞作为免疫抑制的中枢介质，在免疫系统的许多方面发挥着至关重要的作用，treg细胞抑制对包括自身抗原在内的多种抗原的过度免疫。转录因子foxp3被认为是tregs的关键转录因子，其在treg细胞的分化、维持和功能中起着关键作用。在人类和小鼠中，foxp3的缺乏都会导致treg细胞的缺乏，并导致严重的全身炎症性疾病的发展，表现为自身免疫、结肠炎和过敏。
5.目前越来越多的研究者意识到以il-21或foxp3作为抗自身免疫性疾病药物的靶点，但基于以此为靶点的筛药测量所选用的细胞为原代细胞，操作繁琐且培养过程中需要加入抗体和细胞因子，使得培养成本大大提高。探索更高效更稳定更经济的筛药系统具有重要的现实意义及发展前景。


技术实现要素：

6.本发明的首要目的是提供一种抗自身免疫药物的细胞靶标筛选细胞系统，该系统含有两种筛药细胞株，一种筛药细胞株为稳定过表达人il-21cns序列及启动子序列的细胞；另外一种为稳定过表达人foxp3启动子序列的细胞；所述的两种筛药细胞株均含有双荧光素酶报告基因系统。
7.所述的双荧光素酶报告基因系统为含有萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因。
8.所述的两种筛药细胞株均为hek293t细胞。
9.所述的人il-21cns序列及启动子序列包括：人il-21cns2，cns49和promoter的序
72h；
29.3)去除孔内培养液，pbs洗涤后测定两种荧光素酶的活性，评估药效。
30.所述的应用方法，细胞培养板使用侧壁不透明而底部透明的平底96孔细胞培养板，优选使用侧壁白色而底部透明的细胞培养板；每孔含10％fbs的rpmi-1640培养基
31.200μl；加入待筛药物后继续培养48h。
32.本发明的第四个目的是提供两种筛药细胞株在制备所述的抗自身免疫药物的细胞靶标筛选细胞系统中的应用。
33.所述的两种筛药细胞株中：一种筛药细胞株为稳定过表达人il-21cns序列及启动子序列的细胞；另外一种为稳定过表达人foxp3启动子序列的细胞；所述的两种筛药细胞株均含有双荧光素酶报告基因系统。
34.所述的双荧光素酶报告基因系统为含有萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因；所述的两种筛药细胞株均为hek293t细胞。
35.所述的人il-21cns序列及启动子序列包括：人il-21cns2，cns49和promoter的序列，序列分别如seq id no：1-3所示；所述的人foxp3启动子序列如seq id no：4所示。
36.目前基于il-21或foxp3为靶点的筛药测量所选用的细胞为原代细胞，操作繁琐且培养过程中需要加入抗体和细胞因子，使得培养成本大大提高；且志愿者的个体差异也会导致结果不稳定。而本发明应用细胞系，不需要额外加入昂贵的细胞因子和抗体，大大降低了成本，简化了操作，并应用双荧光素酶报告基因系统，放大了检测信号，检测方法灵敏度更高。
附图说明
37.图1为本发明所涉及的三种慢病毒质粒的结构示意图；
38.图2为利用所建细胞靶标筛药系统对三种化合物的筛选；
39.图3为三种化合物对人pbmcs体外培养过程中分泌il-21的影响；
40.图4为化合物plx51107对人cd4

t细胞诱导分化成cd4

foxp3

的treg细胞的影响。
具体实施方式
41.以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
42.实施例1：抗自身免疫药物细胞靶标筛选系统的构建
43.1)构建稳定表达内参海肾荧光素酶(ranilla luciferase，rluci)报告基因的293t细胞：将海肾荧光素酶(ranilla luciferase，rluci)表达慢病毒载体(plv-rluci，inovogen tech.co.)包装成慢病毒，转染293t细胞，并用其抗性抗生素杀稻瘟菌素(20μg/ml)进行已转染该质粒的阳性细胞筛选，连续作用2周后得到整合有rluci的293t(r-293t)细胞。
44.2)筛药细胞株il-21cns produal luci 293t细胞的构建
45.a)提取正常人的基因组dna，并以此为模板，采用高保真酶(诺唯赞公司)用pcr的方法扩增人il-21cns2，cns49及promoter基因片段后，用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳(120v，90min)分离后分别切胶回收对应的特异性片段(天根，琼脂糖凝胶dna回收试剂盒，
dp219)。基因测序确定片段序列正确后按il-21cns2，cns49，promoter的顺序用重组试剂盒(pc2100，inovogen tech.co.)插入plv-pro-luci的慢病毒基因过表达载体(inovogen tech.co.)luciferase基因的上游的克隆位点mlui-bamhi之间(载体用限制性内切酶mlui和bamhi切开后与目的片段连接)，从而获得重组载体plv-cns2-cns49-il-21-pro luci；(也可以在inovogen tech.co.完成连接过程)
46.所述人il-21cns2，cns49和promoter的序列分别为：
47.il-21cns2的序列为：
[0048]5’‑
agaagcctcaatccctcccagtccctacaaaggcaggcctatacgtaacaatattacctgaatcttcttatggacaatcagctgaacacagcatctggcctgctttgcattttccaacccatatgcttacccaatatgaatgtagattaataatatgcatctctaagacacaaacctatcaggtttgctttgcatatatagccacaagccgagaagcagcttatctggtttccttatatcaaggcagattgcctctcataagggcaaggtggtgtcctttccatatgtttgccaaaatgcttatttaatagaaactatttataaatgttcaatatagcacttttttttccttgaaaaccacacgttcatgtttgttgaagttttttcttttctcttctttttgaccacaaccggcttaacttactggaaaaaataatattcatatttaaagaggtaaattttccagctgaaactgaaaatactgactgcttcatccgtgatgatctgaaaaaccagcatttctcacagaggctcattttgctgagttaacatttacatgtgtatgctgaaagaaaattaggttccaaagaagtagaggggccctgccagccaaatgaactcccttgagataatattgccaggaatggtcagtaccggtactcaaagcactgaaattgtaaaactacaatttcagttgtaaaaacaactgaaaatcttttctgaaagcctttgaatggtacctggacactgacgcccatattgatggggctgtgcttcc-3’，见seq id no.1所示。
[0049]
il-21cns49的序列为：
[0050]5’‑
tgcccagttgtcactaagatggaagggagttcacttgattttgcatcttttgtgaagaaaaacttacaagctacacagttatttactttgaactggctaataatttattcataagaacttttttacttatttatttcattaaaaattggaatttgccatttatacactttctgtttttctccatttattgtatgtgtatgtgtgtgtcacatacatatgtgtgtatgtgtgtgtcacatacatatgtgtgtatgtgtgtgtcacatacatgtgtatatgtgtgtgtcacatacatgtgtatatgtgtgtgtgtgatatacacatgtacgtatcttaatatcgtctatttccttttcttgttacatttcctgtgtgctgagctggggtatttattcttctgaatgatgcaatgggttaccaagataatatatcaggaaggaaatctttcaagatataaggacattgacactaccttttgtttcagtttgattaaacagatggaattccacgcaagtggaaagttgtgaaggcggaccctatagtatatacaacatcagtgaacaaaagcagtgggaagtcactgaaaggaaaggcagcagaacggtttctagcatctcactctttaccacggcactctgctgctttaggacttattgttcaaaatccaggttttatatcaataacaaaaagtgatgtttttacttgtgaaatgctaaaactcctaaccatcagagaaaggagtgggtgattgcctggaaaacgactcatacattcctcgaacatttttctcaaaaagtaattattttgtgaacatgtagagggcactggcaactacagtaaatgtgggagtgttttctgaataaaaactgaaatttttgataaggattattcttcattttgtatatagatgctttggagatgtcaaaaatcaaccagaattttgagcgtagtattttagaaagtttggcatgacctaattttagttaactggaaatattcctaattaaagatgaatatatttgatgtgacagaatgcctttaaggattttaatgttacaagaattagttctaattctttgtgtaattaatattacaagaattagaactaattcttgtaacattgaaatgagaattaatgaaaaatagtaatacgaagatccaaatttaactagcttcttcatttttaaaaagaatataagtcttactaatttaactataacctaattttttctccttagttgcatttttacagtacaccaagttggagaaattatcaatactaccgtaaatattttaatgttatattaagtttagatacgttgtttaaaagcagaaaaaacttagtccaatatagtgaacaggaaatatgcttaacgttagtgctgtatgagttatgatc-3’，
[0051]
见seq id no.2所示。
[0052]
il-21promoter的序列为：
[0053]5’‑
tcatgtggcgatcttgaccttgggagcttgatttgtggaccagtgtccccaagaagatgaccatcagacagatgacaatcctctccatgttgccaggactggatctcataagtaccaacagtagagctagaccttggtctcgttttcacttcagcttgactgagaacaggttgtcagttaagctacctatttattcatccttcagggagaggtaaagccctcccattgcagcctggaaatctttgtaaaatggatgaatgtgagtaactcttttttcttttccactggctaggtatacgtgtgcatgtgctaatgtgtgggggcagggattgatggagtcaacgaaatgtgccccatctgcatctttgacaggaaaaagagagaatgggtgaattccaattttcagcatgaatcaagaagtatgtataataaacagtaggtactacaagacttcaaaaaagtaaacaaaaacactttgatctctttttctcggcctcccctggcatcttacctgttctctctgacagtcataagggcactttgataatgagtaagatggcaacatgtgctttcatgcaggactttttcttatggtaataactatgtcttttgactaaaatcatccagtattccatcataaaagtaggaggagaggctaccttttaggaaattttaaataaagaggtattttccaaattagcaagaatattttaggttcttaccaagtttcaagggtttaaaatagaatttgcttccaactgttcaccaaagcatctttactaagcatttattttggcttctgtcatgttatttaacaatctgatttattaatatcacaaatgattctaagggagttgatagaaaatctatccttcccaatcaagatctcactctaccatcattttaaaaattatctaatgtccatctcttctatataatacatcaattaaatgagtcaaacttgctaatgctcattcttgtccaaaccaaaaaatgtttccaaacagcaaaataaaatatacccataaatgattcgttttctcttagggtagtgttacttatttctgttagatactatttcctctgggtgtgagcaacacatttctaactgcatctgtgaccgggtagaggttaattaaagatccaaagcccagaaatggttttatcatcctcctttcttctgcttctcttgtccctgagactcttttaacccatttgagaaagttgaatataatattctagctagagagtcatgtactatataagaccataggtcttataagtgaaactcttgactatagattttattcattcattcattcattcattcatttcattacatactttagaataccatactttattctagactgttacgtagccaacataaattggagttttcacttgatttgctctgaagttgactgtaatctttttattatggaatatctattcaagagtatacaggtttggccttatacagtagataagagttcatacaacatgatcaagaattcctccctgtaatagttaaattctatatgacaagattctgtgcaacttatgaatgcatgtggactaagggttgccacttgg-3’，
[0054]
见seq id no.3所示。
[0055]
所述人il-21cns2，cns49和promoter的序列pcr扩增用的引物分别为：
[0056]
il-21cns2：
[0057]
正向引物：5
’‑
agaagcctcaatccctccca-3’见seq id no.5所示；
[0058]
反向引物：5
’‑
ggaagcacagccccatcaat-3’见seq id no.6所示。
[0059]
il-21cns49：
[0060]
正向引物：5
’‑
tgcccagttgtcactaagatgg-3’，见seq id no.7所示；
[0061]
反向引物：5
’‑
gatcataactcatacagcactaacg-3’，见seq id no.8所示。
[0062]
il-21promoter：
[0063]
正向引物：5
’‑
tcatgtggcgatcttgacctt-3’，见seq id no.9所示；
[0064]
反向引物：5
’‑
ccaagtggcaacccttagtcc-3’见seq id no.10所示。
[0065]
b)将该载体包装成慢病毒，转染1)中的r-293t细胞。用该载体携带的抗性抗生素嘌呤霉素(20ng/ml)进行阳性转染细胞的筛选，作用2周后得到il-21cns pro dual luci 293t的稳转细胞。
[0066]
3)筛药细胞株foxp3 produal luci 293t细胞的构建
[0067]
a)提取正常人的基因组dna，并以此为模板，采用高保真酶(诺唯赞公司)用pcr的
方法扩增人foxp3近端promoter基因片段后，用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳(120v，90min)分离后分别切胶回收对应的特异性片段(天根，琼脂糖凝胶dna回收试剂盒，dp219)。基因测序确定片段序列正确后用重组试剂盒(pc2100，inovogen tech.co.)插入plv-pro-luci的慢病毒基因过表达载体(inovogen tech.co.)luciferase基因的上游的克隆位点ecori-bamhi之间(载体用限制性内切酶ecori和bamhi切开后与目的片段连接),从而获得重组载体plv-foxp3-promoter-luci；(也可以在inovogen tech.co.完成连接过程)
[0068]
所述人foxp3 promoter的序列为：
[0069]5’‑
agctctgtgatcttgggcaagttgcttgactacttatacctccgtttccctcatc
[0070]
tgtataacaggaatacaataatgatgagatggagctcaaggggccatggtgaggattgaacatgatcacttgtgagacatgttcagcactgtatctgacccatggaaaattcaagataaacatcagctactgagatgatggcggatatttggaatcctaaatccttggaaactggggctttttgaagtaaaagaccccaaaggctgagggcctcagaagcatcaggccatgatgttcctgaaacaagagggtcagggtcccaatgggcctctggggttcatcgtgaggatggatgcattaatattggggacctgctagggaccttcccagtgggacagtggctgggtcagggcactcaagccctaaaacgtgatgaggcgagacttttctctctttcctcattcagtaactgtcagtagattctgggagccagggattctccgactcttcaagtccatgaattttaggggatgacagtgggctctccgctttctcctccatgaagtaacttacatgcccctcaccctctgtgggaggggtgttgcagggggtgcagaactcccctcgccgggtagttcaagcaatggggaccatatcaattccatctatagggaaactgaggcctggagtagggcgaggcctctgggaacccagccctattctgtctctttccctggcatttcccatccacacatagagcttcagattctctttctttccccagagaccctcaaatatcctctcactcacagaatggtgtctctgcctgcctcgggttggccctgtgatttattttagttcttttcccttgttttttttttttcaaactctatacacttttgttttaaaaactgtggtttctcatgagccctattatctcattgatacctctcacctctgtggtgaggggaagaaatcatattttcagatgactcgtaaagggcaaagaaaaaaacccaaaatttcaaaatttccgtttaagtctcataatcaagaaaaggagaaacacagagagagagaaaaaaaaaactatgagaacccctccccaccccgtgattatcagcgcacacactcatcgaaaaaaatttggattattagaagagagaggtctgcggcttccacaccgtacag-3’，
[0071]
见seq id no.4所示。
[0072]
所述人foxp3 promoter的序列pcr扩增用的引物为：
[0073]
正向引物：5
’‑
ctgtacggtgtggaagccg-3’见seq id no.11所示；
[0074]
反向引物：5
’‑
agcaccaaagaaagcgggac-3’见seq id no.12所示。
[0075]
b)将该载体包装成慢病毒，转染1)中的r-293t细胞。用该载体携带的抗性抗生素嘌呤霉素(20ng/ml)进行阳性转染细胞的筛选，嘌呤霉素作用2周后得到foxp3 produal luci 293t的稳转细胞。
[0076]
4)利用该筛药细胞系统评价化合物的潜在抗自身免疫效果
[0077]
(1)分别将筛药系统的两种细胞分别种于96孔平底细胞培养板。
[0078]
(2)单孔细胞量为10000个，每孔含10％fbs的rpmi-1640培养基200ul。放于37℃，5％co2培养箱中培养24h。
[0079]
(3)在细胞培养液中分别加入溶媒或待筛化合物(终浓度为200μm)，放于37℃，5％co2培养箱中继续培养48h。
[0080]
(4)去除孔内培养液，pbs洗涤后用双荧光素酶报告基因检测试剂(promega)按说明书分别测定待筛选化合物对两细胞株萤火虫荧光素和海肾荧光素的荧光比值。
[0081]
(5)被筛化合物对il-21cns和promoter表达的影响可通过其下游萤火虫荧光素酶报告基因的相对表达水平(以萤火虫荧光素和海肾荧光素的荧光强度比值计算)来反映，也就是说被筛化合物和il-21cns pro dual luci 293t细胞共同培养后，通过测定该细胞萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平可反应被筛化合物对il-21cns和promoter表达的影响。同理，通过测定foxp3 pro dual luci 293t细胞萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平可反应被筛化合物对foxp3 promoter表达的影响。
[0082]
结果见图2。与对照组相比，化合物y06036和plx51107能够抑制il-21的表达，而bi-9564促进il-21的表达；化合物bi-9564和plx51107促进foxp3的表达，而y06036抑制foxp3的表达。
[0083]
实施例2：验证化合物对il-21分泌的影响
[0084]
分离健康志愿者的pbmc，种于提前一晚包被有抗人cd3的24孔板中，加入抗人cd28。加入溶媒(dmso)或待筛化合物(终浓度为1μm)，37℃培养3天后收取培养上清液，用人il-21elisa检测试剂盒检测il-21的浓度。与对照组相比，化合物y06036和plx51107均能抑制il-21的分泌，而化合物bi-9564促进il-21的分泌，与实施例1的结果一致。结果见图3。
[0085]
实施例3：验证化合物对treg分化的影响
[0086]
分离健康志愿者的pbmc，用分选磁珠分离其中的cd4 t细胞，加入溶媒(dmso)或plx51107(终浓度为1μm)，在加入抗cd3，抗cd28，il-2，tgf-β的10％fbs的rpmi 1640培养基中培养诱导分化成treg，3天后流式检测treg的比例。与对照组相比(dmso)，实验组(plx51107)的treg的分化比例显著增加。结果见图4。