基于空间位阻进行固定化优化的介孔二氧化硅微胶囊的制备

1.本发明属于微胶囊技术领域，具体合成了一种葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶进行联级反映的纳米胶囊生物反应器。


背景技术：

2.葡萄糖酸钠又名五羟基己酸钠，分子式为c6h
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o7na。由于无毒、热稳定性好等特点，在建筑工业、食品、医药等方面有着广泛的应用。其传统的生产方式主要有黑曲霉生物发酵法、多相催化氧化法、电解氧化法等。随着生物技术的不断发展，利用酶法生产葡萄糖酸钠已经成为可能，并且更具先进性。酶法生产工艺主要是利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶直接将葡萄糖底物转化为葡萄糖酸，经中和制得葡萄糖酸盐系列产品。此方法具有不需要菌种、不受各种辅料浓度影响、节省能源、工艺简化、操作方便、底物浓度高且纯度好、便于提取精制等特点，酶法常用葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶联用来进行生产。
3.现有的常用酶固定化方式，酶以共价键结合于载体上，即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。酶与载体结合牢固，稳定性好，然而条件苛刻，操作复杂，而且采用了比较强烈的反应条件，会引起酶蛋白的高级结构的变化，破坏活性中心，所以往往不能得到比活高的固定化酶，甚至底物的专一性等性质也会发生变化。我们设计一种复合材料在不引入有机固定试剂的同时通过材料的空间结构进行简单的单纯固定，之后在不损害酶活性位点的情况下，引入高分子壳层提升固定化酶的稳定性，以一种方便普适化的方式提高固定化酶的机械强度和稳定性，以用来生产葡萄糖酸钠。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种基于空间位阻进行固定化优化的介孔二氧化硅微胶囊的制备方法即葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶进行联级反映的纳米胶囊生物反应器，制备带正电纳米胶囊的制备方法。
5.本发明合成了一种具有高活性和稳定性的纳米胶囊复合酶材料，通过简单地两步反应，第一步利用介孔二氧化硅固定葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶，随后通过室温聚合在已固定双酶的介孔二氧化硅表面形成一层具有良好渗透性的聚合物网络膜，最终形成带正电酶复合物纳米胶囊polymer@protein@sio2。
6.具体包括以下步骤:
7.(1)负载蛋白的介孔二氧化硅protein@sio2的制备
8.将具有介孔的sio2纳米颗粒加入到含有god和cat两种酶的混合溶液中，于4℃冰箱匀速搅拌3-5h进行酶的固定即使得酶吸附固定到sio2纳米颗粒的介孔中；之后进行离心，将上清液去除，用pbs彻底清洗所得材料，即得负载蛋白的介孔二氧化硅protein@sio2，置于4℃冰箱保存；优选sio2纳米颗粒的粒径为100nm，介孔的尺寸为10nm；
9.(2)蛋白负载胶囊的制备
10.通过单体aam、apm和交联剂bis的原位聚合，在负载蛋白的介孔二氧化硅表面形成
一层具有良好渗透性的聚合物网络膜即包封形成带正电纳米胶囊；
11.具体步骤如下：将负载蛋白的介孔二氧化硅protein@sio2的磷酸盐缓冲液分散液加入试管中，搅拌条件下依次加入含有丙烯酰胺(aam)的磷酸盐缓冲液、含有n-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺(apm)的磷酸盐缓冲液、含甲叉丙烯酰胺(bis)的超干二甲基亚砜，搅拌3-10min，然后加入含过硫酸铵(aps)的磷酸盐缓冲液和含有n，n，n'，n'-四甲基乙二胺(temed)的磷酸盐缓冲液，在负载蛋白的介孔二氧化硅表面形成一层具有良好渗透性的聚合物网络膜，最终形成酶复合物纳米胶囊polymer@protein@sio2。
12.其中本次选用的负载蛋白的介孔二氧化硅(protein@sio2)、丙烯酰胺(aam)、n-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺(apm)、甲叉丙烯酰胺(bis)、过硫酸铵(aps)进行合成制备，其中介孔二氧化硅(protein@sio2)、丙烯酰胺(aam)的质量比可为1：(3-20)，其中可改变丙烯酰胺(aam)与n-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺(apm)两者质量比为(5-15):(1-2)，protein@sio2与甲叉丙烯酰胺(bis)质量比(1-2)：(1-5)，可以通过改变比例调控壳层的厚度大小和材料的电性，protein@sio2与过硫酸铵(aps)质量比控制在(10-2):1之间，该过程中要控制过硫酸铵(aps)与n，n，n'，n'-四甲基乙二胺(temed)的质量比为1:(1-4)之间。
13.本发明所得polymer@protein@sio2为葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶进行联级反映的纳米胶囊生物反应器，用于葡萄糖酸钠制备。
14.polymer@protein@sio2由于存在外层的聚合物壳层，不仅仅保证了酶的稳定性，而且由于聚合物上的apm节点集团的微环境，也保持了酶的高效催化活性，与单纯的单独介孔二氧化硅物理吸附相比，具有更高的酶保留效率和抗逆性，作为一类具有优异活性和稳定性的生物催化复合材料，在葡萄糖酸钠制备，医学检测与以及食品保鲜中的除氧、生物电分析等生物技术领域具有巨大的应用潜力。
附图说明
15.图1为制备前后的材料的热重示意图
16.图2为纳米胶囊的共聚焦图像示意图
17.图3为介孔硅的透射电镜示意图
18.图4为纳米胶囊的透射电镜示意图
19.图5为纳米胶囊和介孔硅的size电位分析
20.图6为纳米胶囊和介孔硅的zeta电位分析
21.图7为纳米胶囊的产率示意图。
具体实施方式
22.下面通过例子对本发明进行进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。
23.实施例1
24.一.蛋白负载硅球的制备
25.将10mg具有10nm介孔的100nm sio2加入到2ml的1.6％质量分数的god和cat(两种酶的质量比为10：1)混合溶液中于4℃冰箱匀速1000r/min搅拌4h进行酶的固定。之后对其进行4000r/mim离心3min，将上清液去除，用pbs彻底清洗所得材料，即得负载蛋白的介孔二氧化硅(protein@sio2)，置于4℃冰箱保存。
26.二.蛋白负载胶囊的制备
27.通过单体(aam、apm)和交联剂(bis)的原位聚合，将第一步负载蛋白的介孔二氧化硅包封形成带正电纳米胶囊。
28.实验前将单体和交联剂aam(丙烯酰胺),apm(n-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺),aps(过硫酸铵),temed(n'-四甲基乙二胺)溶于磷酸盐缓冲液(pbs)制成100mg/ml储备液，bis(甲叉丙烯酰胺)溶于超干dmso(二甲基亚砜)中制成100mg/ml储备液；
29.先将5mg/ml第一步负载蛋白的硅球1ml加入试管中，400r/min搅拌条件下加入200μl aam溶液,45μl apm溶液和32μl bis溶液，搅拌5min，然后通过加入8μl aps和16μl temed，来引发介孔二氧化硅上的自由基聚合，加入699μl pbs补足所需体积，本发明中制备的为2.5mg/ml体系，反应在多种比例范围下均可进行(比例见发明内容均可形成)。聚合在冰浴中进行400r/min反应2小时。之后，对样品进行纯化以除去未反应的游离单体和引发剂和未包裹的负载蛋白介孔二氧化硅(polymer@protein@sio2)。
30.三.热重实验
31.取纯介孔二氧化硅与负载蛋白介孔二氧化硅和最后的包裹胶囊介孔二氧化硅100mg分别进行热重实验(图1)，证明蛋白以及胶囊的壳层结构在polymer@protein@sio2中的成功引入。
32.四.蛋白的共固定证明
33.通过对polymer@protein@sio2进行clsm图像拍摄(图2)，首先对两种蛋白分别利用荧光染料进行标记，罗丹明b(红色)标记cat，利用fitc(绿色)标记god。共聚焦显微镜证明polymer@protein@sio2中蛋白均被成功包裹在纳米胶囊中，同时两种蛋白被良好的固定在很近的位置，有利于整个反应的进行。
34.五.纳米胶囊形貌表征
35.使用200kv透射电子显微镜(tem)来观测纳米胶囊的形貌。纳米胶囊用调ph值为7.0，过0.22μm滤膜待用。取10μl浓度为0.1mg/ml的native sio2(图3)和polymer@protein@sio2(图4)溶液滴在铜网上，3min后，用滤纸将溶液从网格边缘吸走。之后让其在空气中干燥，用于tem观察。结果发现polymer@protein@sio2保留了native sio2良好的球形结构和均匀的粒径分布,同时在外层引入了一层壳层结构，证明我们的纳米胶囊的成功合成。
36.六.纳米胶囊粒径及zeta电位表征
37.dls实验是通过纳米激光粒度电位分析仪来进行的。纳米胶囊样品是在pb缓冲液中(ph7.0,10mm)，浓度为0.5mg/ml条件下进行粒径(图5)和zeta电位(图6)分析的。从粒径图谱上可以看出，native sio2的粒径在100nm左右，而合成的纳米胶囊粒径均在120nm左右，与透射电子显微镜的测定结果一致，证明纳米胶囊具有均一的粒径，native sio2在ph＝7的pb缓冲液中是带负电的。从zeta电位图上可以看出native sio2为负电，而polymer@protein@sio2为负电。以上结果均可以证明polymer@protein@sio2纳米胶囊成功合成。
38.七.最终产率提升示意图
39.在常温25℃条件下将50mg制得protein@sio2和polymer@protein@sio2放于50ml 10mm葡萄糖溶液中，测定其24h后将葡糖糖溶液转化为葡糖糖酸的转化率，反应结束后回收固定化酶进行7次重复试验(图7)。结果发现polymer@protein@sio2在7次循环后依然有超过80％的转化效率，相比未包裹的protein@sio2有较大的提升。