一种基于共轭微聚合物材料富集检测人工麝香的方法与流程

1.本发明属于分析检测领域，特别涉及一种基于共轭微聚合物材料富集检测人工麝香的方法。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.合成麝香化合物(smc)的新污染因其对人类的潜在风险而引起了人们的极大关注。合成麝香具有生物毒性，其中一些被认为是潜在的内分泌干扰物，而且由于其高脂溶性，生物降解缓慢，它们会沿食物链进行生物放大，对人类的健康存在潜在隐患。一些法律法规已经明确限制甚至禁止使用某些合成麝香化合物，这在一定程度上阻止了合成麝香在环境中含量的提高。不幸的是，因为合成麝香化合物合成容易、价格低廉的特点，仍存在非法使用的问题。目前已在河水、湖水、沉积物、海洋鱼类中检测到了合成麝香。因此，对于合成麝香的检测对于评估人类暴露于污染物的风险，特别是对食品中合成麝香的测定，变得越来越重要。
4.考虑到实际样品中smc的痕量和基质干扰，仪器分析前须进行适当的样品预处理，以去除基质效应和对目标物进行富集。固相萃取(spe)是最常用的预处理技术之一。该方法操作简单，富集因子高，溶剂消耗少，适用于复杂样品中痕量污染物的分离富集。一些常见的商用固相萃取柱，如c
18
、oasis hlb和alumina n，已用于smc的富集。spe是基于目标物在吸附剂和样品溶液之间的平衡分布，吸附剂的萃取能力和选择性起着重要作用。许多新开发的吸附剂，如碳纳米材料、石墨烯、金属有机框架(mof)和共价有机框架，已被应用于spe中，以弥补商用固相萃取柱的低选择性和短寿命问题。因此，从成本和效率的角度来看，开发高富集效率、高选择性和可重复使用的吸附剂材料一直是spe的研究重点。
5.共轭微孔聚合物(cmps)是一类由完全共轭的分子链形成的多孔有机聚合物，自2007年由cooper的团队提出以来，受到了广泛关注。它具有孔径可调、分子可设计和大共轭体系的特性。与传统的无机多孔材料和mof等类似物相比，cmps具有更轻的重量、更大的比表面积，并且克服了由于共价键牢固而导致的mof在水中稳定性不足的问题。由于其特性，这类化合物已被用于气体分离、多相催化、生化传感。更重要的是，这些优势赋予了cmps作为样品预处理吸附剂的优越潜力，据报道，几种基于cmp的吸附剂可用于富集化学污染物，如农药残留、羟基化多环芳烃、环境激素、苯氧羧酸。然而，迄今为止，基于cmps吸附剂捕获smc的报道很少。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，本发明提供一种基于共轭微聚合物材料富集检测人工麝香的方法。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一个方面，提供了一种用于富集检测人工麝香的共轭微聚合物材料的制备方法，包括：
9.将1,3,5-三(4-咔唑基-9-基苯基)胺溶解在溶剂中，得到tcb溶液；
10.将所述tcb溶液分散于含fecl3的悬浮液中，在惰性气体保护下，进行反应，反应完成后，再加入甲醇，进行反应，固液分离，收集固体产物；
11.将所述固体产物洗涤后，用甲醇和四氢呋喃索氏提取，干燥，即得。
12.本发明合成了一种富含氮原子的咔唑基cmp，并首次探索将其做成spe柱来富集五种硝基麝香。所开发的固相萃取柱比大多数商业spe柱具有更高的萃取效率，并结合模拟计算讨论了可能的吸附机理。在优化的固相萃取条件下，用cmps制作了新型固相萃取柱结合气相色谱-质谱(gc-ms)分析用于检测食品和水样中痕量硝基麝香。
13.本发明的第二个方面，提供了上述的方法制备的共轭微聚合物材料tcb-cmp。
14.本发明的第三个方面，提供了一种固相萃取小柱，所述固相萃取小柱的萃取材料采用上述的共轭微聚合物材料tcb-cmp。
15.本发明的第四个方面，提供了一种基于共轭微聚合物材料富集检测人工麝香的方法，包括：
16.采用上述的固相萃取小柱对样品溶液中的人工麝香进行富集，得到洗脱液；
17.将洗脱液进行氮气吹干、采用环己烷重新溶解，过滤，得到待测液；
18.将所述待测液采用gc-ms进行检测，即得。
19.本发明的有益效果
20.(1)本发明将一种富含n原子的咔唑基cmps(tcb-cmps)作为吸附剂制作成固相萃取小柱，用于富集硝基麝香污染物，并结合gc-ms进行分析检测。用该材料制备的固相萃取小柱相比与商业固相萃取小柱具有良好的富集能力和重复使用性，与其他富集检测人工麝香的方法相比具有良好的富集倍数和更低的检测限。还探讨了tcb-cmp对硝基麝香的作用机理。在优化的条件下，tcb-cmps作为吸附剂制作的固相萃取小柱，成功地实现了水和牛奶样品中硝基麝香的富集并进行分析检测。这项工作扩展了基于cmps的spe在监测复杂基质样品中痕量硝基麝香污染物方面的应用。
21.(2)本发明检测方法简单、实用性强，易于推广。
附图说明
22.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示例性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
23.图1为(a)
13
c cp/mas nmr谱(b)不同条件处理下tcb-cmp的ft-ir(c)n2吸脱附曲线及孔径(d)eds；
24.图2为(a)吸附剂用量(b)溶液ph(c)样品体积(d)样品流速(e)解吸液种类(f)解吸液体积；
25.图3为(a)基于tcb-cmps的spe柱和五种商用柱的萃取回收率(1.sax,2.silica,3.pep,4.alumina-n,5.c
18
)(b)基于tcb-cmps的spe柱重复使用性；
26.图4为实际样品典型色谱图:(a)空白(b)加标10ng
·
l-1
(c)加标500ng
·
l-1
(d)加
标1500ng
·
l-1
。
具体实施方式
27.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
28.一种基于共轭微聚合物材料富集检测人工麝香的方法，包括：
29.采用上述的固相萃取小柱对样品溶液中的人工麝香进行富集，得到洗脱液；
30.将洗脱液进行氮气吹干、采用环己烷重新溶解，过滤，得到待测液；
31.将所述待测液采用gc-ms进行检测，即得。
32.在一些实施例中，所述人工麝香为人工硝基麝香，包括：葵子麝香、酮麝香、伞花麝香、二甲苯麝香、西藏麝香。
33.在一些实施例中，固相萃取前，使用甲醇、乙酸乙酯和超纯水活化固相萃取小柱。
34.在一些实施例中，所述富集的具体条件为：使样品溶液流经活化后的固相萃取小柱，溶液通过固相萃取柱后，将萃取柱干燥；然后，用乙酸乙酯洗脱液洗脱富集在固相萃取小柱中的smc，收集洗脱液，即得。
35.在一些实施例中，样品溶液的ph＝4～4.5；
36.在一些实施例中，流速为2～2.5ml
·
min-1
。
37.在一些实施例中，gc-ms检测的条件为：采用hp-5ms柱，柱温箱温度如下：60℃持续1分钟，20℃
·
min-1
至190℃，保持6分钟，20℃
·
min-1
至290℃，保持10分钟；进样体积为1.0μl，碰撞气体为氦气，恒定流速设定为2.25ml/min，质量由电子碰撞离子源和离子检测模式确定。
38.在一些实施例中，样品溶液来自于雪水、池塘水或牛奶。
39.下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
40.以下实施例中，材料与试剂的来源如下：
41.1,3,5-三(4-咔唑基-9-基苯基)胺(tcb)购自阿拉丁(中国上海)。五种硝基麝香标准品包括葵子麝香(ma)、酮麝香(mk)、伞花麝香(mm)、二甲苯麝香(mx)和西藏麝香(mt)，均来自中国郑州阿尔法化工有限公司。无水氯化铁(fecl3)、氯化钠(nacl)、盐酸(hcl)和氢氧化钠(naoh)由国药集团化学试剂有限公司(中国上海)供应。乙酸乙酯来自kermeo(中国天津)。乙腈、环己烷、氯仿、甲醇、四氢呋喃购自tedia(美国)。agela technologies(中国上海)获得了cleanert sax、c
18
、pep、sio2、sax、alumina-n的商业spe柱。
42.smc标准储备溶液和标准工作溶液的配制方法如下：
43.smc标准储备溶液：准确量取浓度为100mg/l的5种smcs混合标液母液各1ml，置于10ml棕色容量瓶中。用环己烷定容至刻度，得到浓度均为10mg/l的5种smcs混合标准溶液，置于4℃保存。
44.smc标准工作溶液：将标准储备溶液用环己烷逐级稀释成所需不同浓度的标准溶液，标准溶液须现用现配。
45.实验仪器及设备如下：
46.bruker avance
ⅲ‑
400光谱仪(德国bruker)获得13c cp/mas nmr数据，以检测目标材料是否已成功合成。红外光谱在nicolet 710光谱仪(美国thermo)上收集，范围为4000至400cm-1
。检测材料中的特征峰及材料的稳定性。用swpratm 55仪器(德国蔡司)进行能量色散x射线光谱(eds)分析，用于材料的元素分析。n2吸附-脱附等温线由asap 2460分析仪(美国micromeritics)测量，以此得知材料的比表面积及孔径。安捷伦gc-ms/ms(7890b-7000d)用于色谱实验，采用离子检测(sim)模式。
47.实施例1 tcb-cmp材料的合成
48.将tcb(200mg，0.37mmol)溶解在30ml无水氯仿中，将其转移到分散于10ml无水氯仿中的fecl3(477mg，2.94mmol)悬浮液中。反应在氮气气氛下室温搅拌24小时。之后，向反应溶液中添加100ml甲醇并搅拌1小时，过滤收集黄色固体。所得固体与盐酸溶液(37％)混合搅拌2小时，过滤得到固体用水和甲醇洗涤后，分别用甲醇和四氢呋喃索氏提取24小时，真空干燥后得到tcb-cmp，为黄色固体粉末。
49.实施例2 spe柱的制作和spe程序
50.spe柱的制作如下：称量40mg tcb-cmps粉末，并将其装入3ml空柱中，在空柱的两端各放置一个筛板，以防止材料流失。固相萃取前，使用甲醇(6ml)、乙酸乙酯(6ml)和超纯水(6ml)活化固相萃取小柱。
51.spe过程如下：100ml ph＝4的样品溶液以2ml
·
min-1
的流速流经活化后的小柱，溶液通过固相萃取柱后，将萃取柱干燥5分钟。然后，用9ml乙酸乙酯洗脱液洗脱富集在固相萃取小柱中的smc。收集洗脱液，并在30℃的温和氮气流下吹干，用1ml环己烷重新溶解，通过0.22μm膜过滤后进行gc-ms检测。
52.实施例3固相萃取结合gc-ms检测smc的方法
53.1)gc-ms检测
54.安捷伦gc-ms/ms(7890b-7000d)用于gc-ms检测，用hp-5ms柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)分离5种硝基麝香。柱温箱温度如下：60℃持续1分钟，20℃
·
min-1
至190℃(保持6分钟)，20℃
·
min-1
至290℃(保持10分钟)。进样体积为1.0μl，不分流模式。碰撞气体为氦气，恒定流速设定为2.25ml/min。质量由电子碰撞(ei)离子源和离子检测(sim)模式确定。sim模式参数如表1所示。
55.表1：gc-ms检测smc的sim模式参数
[0056][0057][0058]
2)实际样品的采集和预处理
[0059]
选取雪水、池塘水、两种不同品牌牛奶作为实际样品。雪水和池塘水收集于当地(中国，济南)，将收集的水样经过0.22μm滤膜过滤后，收集于棕色瓶子中在4℃下保存备用。牛奶样品，购买于当地超市(中国，济南)。
[0060]
牛奶样品的处理方式为：称取1.00g牛奶，加入1.0ml合成麝香标准溶液，加入20ml乙腈以破坏蛋白质，涡旋均匀后超声20min。离心取上清液，下层沉淀加入10ml环己烷以提取目标物，合并上清液，在温和的氮气流下35℃吹干，加入100ml、ph＝4的超纯水复溶后进行固相萃取。
[0061]
3)方法验证
[0062]
该方法在线性、检测限(lods)、定量限(loqs)和精密度方面得到验证。通过分析一系列加标浓度下的硝基麝香来评估线性。lod和loq分别在信噪比为3和10时用基线噪声法进行估计。精密度由加标回收实验的日内和日内相对标准偏差(rsd)确定。
[0063]
实验例1 tcb-cmps的表征
[0064]
tcb-cmp的特征是13c cp/mas nmr谱，典型的信号峰如图1中(a)所示。140.07和124.87ppm的信号峰归因于取代苯基碳，140.07处的低场峰归因于氮原子的存在。位于119.54和109.27ppm处的峰对应于未取代苯基碳的信号峰。核磁表征表明从分子水平上成功制备了该材料。tcb-cmp的红外吸收峰如图1中(b)所示。1504cm-1
处的吸收带和1226cm-1
分别为c＝c和c-n振动，这是此材料的特征峰。此外，在不同的处理条件(有机溶剂、酸性和碱性溶液)下浸泡24h，材料的特征峰得到了适当的保留，证明其具有良好的化学稳定性。氮气吸附和脱附实验表明图1中(c)，所制备的材料具有的大比表面积(1109.9m2/g)和0.5nm的孔径。通过eds分析tcb-cmp的元素组成，图1中(d)氮的原子百分数为38.6％，说明tcb-cmps是一种富氮材料。
[0065]
实验例2固相萃取检测合成麝香方法优化、方法验证及实际样品分析
[0066]
本实验以tcb-cmps作为固相萃取吸附剂，考察其富集检测环境水样和牛奶中的合成麝香化合物的可行性，选择了ma、mx、mm、mt、mk五种硝基类人工麝香作为目标化合物，开发出了固相萃取富集后结合gc-ms检测人工麝香化合物的方法，并运用到实际水样和牛奶的分析中。为了实现对硝基合成麝香的最佳富集效率，分别对spe萃取过程中的影响结果的几个重要参数，萃取条件(ph，上样流速，吸附剂用量)和解吸条件(解吸液种类和洗脱液体积)逐一进行了优化。
[0067]
1)固相萃取实验条件的优化
[0068]
固相萃取柱中吸附剂tcb-cmp的用量是一个需要优化的重要参数。吸附剂用量少，吸附不彻底，萃取富集效率低；吸附剂用量过大，可能造成材料浪费。图2中a显示，当吸附剂用量从25mg增加到40mg时，萃取效率不断提高。相比之下，增加吸附剂用量(45mg)对萃取效率的提高没有显著影响。为了达到更好的吸附效果并节省吸附剂的用量，选择40mg吸附剂用量进行实验。
[0069]
溶液ph值对目标分析物的存在形式有影响，因此会极大地影响萃取效率。在2至10(2、4、6、8、10)范围内，研究了样品ph值对spe富集人工麝香富集效率的影响。图2中b显示，在ph值为4时，可获得较高的萃取效率。这种现象主要是由吸附剂的电位电离引起的。当ph值为4时，tcb-cmp中存在nh

。tcb-cmp的吸电子基团(nh

)与硝基麝香的π电子之间存在电子-给体-受体(eda)相互作用。为了获得较高的富集效率，样品溶液的ph值均调整为4，以便
进一步研究。
[0070]
样品体积也是一个重要因素，它直接关系到可靠的分析结果和高富集系数。在本研究中，研究了样品体积(100
–
500ml)对回收率的影响。如图2中c所示，五种硝基麝香的回收率在100
–
300ml的样品体积内保持不变，当体积大于300ml时，回收率降低。为了保持高富集效率和节省spe时间，选择100ml作为以下实验的样品体积。
[0071]
在spe过程中，影响提取富集效率的一个因素是样品流速。在1-5ml
·
min-1
(即1、2、3、4、5ml
·
min-1
)范围内考察了样品流速对回收率的影响。如图2中d所示，在1
–
3ml
·
min-1
范围内，样品流速对smc的回收率没有明显影响。样品流速为4-5ml
·
min-1
不利于硝基麝香在tcb-cmp上的充分吸附。为了在不妨碍充分吸附的情况下缩短操作时间，样品流速以2ml
·
min-1
为宜。
[0072]
解吸液对萃取富集效率有显著影响。本实验选用甲醇(ma)、乙腈(acn)、乙酸乙酯(ea)、二氯甲烷(dcm)和环己烷五种有机溶剂作为洗脱液。图2中e显示了这五种溶剂的洗脱效果。ea对目标化合物的解吸效果最好，表现出一种可以用“相似溶解”原理解释的现象。
[0073]
洗脱液体积的优化是非常必要的。解吸液体积过少，会导致解吸不完全，致使富集效率低。而使用过多的解吸液则可能造成有机试剂的污染。在此实验中，测试了3-11ml(3、5、7、9、11)洗脱液体积，如图2中f所示，当洗脱液体积从3ml增加到9ml时，萃取效率不断提高，当体积超过9ml时，对回收率没有明显影响。为了获得更好的效率和更少的溶剂消耗，在接下来的实验中使用9ml洗脱液体积。
[0074]
因此，tcb-cmp对五种硝基类人工麝香化合物的固相萃取富集最佳实验条件如下：吸附剂用量为40mg，样品p h＝4，样品流速2ml
·
min-1
，以ea为解吸液，解吸液体积9ml，样品体积100ml。
[0075]
2)固相萃取富集检测smc的方法验证
[0076]
在优化条件下考察了该方法的线性范围、精密度、lod和loq。表2列出了获得的分析数据。该方法具有良好的线性(r≥0.998)，五种硝基麝香化合物的浓度范围为5-2000ng
·
l-1
、lod范围为0.13ng
·
l-1
至0.57ng
·
l-1
、定量限为0.40ng
·
l-1
至1.89ng
·
l-1
、日内和日间(n＝6)rsd分别为1.1
–
2.2％和1.4
–
4.0％。结果表明，该方法线性范围宽，灵敏度高，重复性好。
[0077]
表2：方法验证
[0078][0079][0080]
3)萃取富集能力和可能的吸附机理
[0081]
考察了tcb-cmp柱的萃取富集能力和柱的重复使用性。将开发的色谱柱与其他五
种商用色谱柱进行对比分析，从加标水样中提取硝基麝香(加入麝香标液浓度为100μg
·
l-1
)。所有实验均在最佳条件下进行，每个色谱柱进行三次平行考察。用萃取回收率评估色谱柱的富集能力，如图3中a所示，tcb-cmps柱对每种硝基麝香的富集回收率均明显高于五种商业柱，且tcb-cmps柱仅使用40mg材料，其余商业柱材料填充均高于100mg。所使用商业柱的既有用极性大无键合硅胶填充的silica柱，也有硅胶键合卤化季铵盐的sax柱，还有官能化聚苯乙烯/二乙烯苯填充的pep柱，但他们对于硝基麝香的选择吸附能力均不如tcb-cmps。此外，通过吸附-脱附循环次数考察了tcb-cmps柱的可重复使用性，单个色谱柱可重复使用20多次，而不会显著降低萃取富集性能(图3中b)。而一般商业固相萃取柱的重复使用次数远低于本实验中制作的tcb-cmps小柱。由此表明，合成材料制备的固相萃取柱富集性能良好且重复使用性好。
[0082]
探究了tcb-cmp对smc的作用机理。首先，高比表面积(1109.9m2·
g-1
)tcb-cmp能为smc提供丰富的吸附位点。其次，tcb-cmp单元有一个大的共轭体系，tcb-cmp与smc苯环之间的π-π相互作用可以提高亲和力。第三，tcb-cmp的富氮特性被赋予了较高的电学性质，因富氮导致的局部电子因素大大提高了碳基质的结合亲和力。另外，tcb-cmp对硝基麝香的吸附亲和力是由于在硝基麝香的吸电子基团(-no2)和tcb-cmp的富π电子区之间建立了电子给体-受体(eda)相互作用。此外，硝基可被视为路易斯酸位点，它们往往更接近tcb-cmp上的氮原子(路易斯碱位点)，从而促进竞争吸附。
[0083]
4)方法比较
[0084]
将所开发的方法与之前的固相萃取法测定食品和其他复杂基质中smc的方法进行了比较。表3总结了这些方法的吸附剂量、富集因子和lod。所提议的方法显示出更高或类似的富集因子。与这些固相萃取方法相比，吸附剂用量越少，吸附效果越好。在类似的gc
–
ms分析条件下，其lod较低。所建立的方法的优点主要集中在提取效率和灵敏度上。
[0085]
表3.smc分析的方法比较
[0086]
[0087][0088]
a:spe管装有900mg mgso4,150mg c
18
和150mg psa或者900mg mgso4和150mg psa.；b:mdl即方法的检测限；c:ng/g.
[0089]
5)实际样品分析
[0090]
建立了一种基于tcb-cmps的固相萃取富集合成麝香与gc-ms检测相结合的方法，用于测定水和牛奶样品中的五种硝基麝香。在四个实际样品中未发现硝基麝香残留，在10、500和1500ng
·
l-1
的加标水平下进行回收率实验，用峰面积计算加标回收率，以考察该方法的准确性。如表4所示，回收率在86.94％～115.01％之间，rsd小于8.68％。这些数据证明了所提出的方法对复杂样品中痕量硝基麝香的定量分析的适用性和可靠性。图4显示了牛奶样品中五种硝基麝香的典型gc-ms色谱图，色谱图中未发现与目标物具有相同数量离子和保留时间的干扰化合物，进一步表明所建立的方法具有良好的特异性。
[0091]
表4.水样和牛奶中五种smc的回收率
[0092]
[0093][0094]
a:未检测到；b:回收率
±
标准偏差(n＝3)
[0095]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。