一种硒半胱氨酸响应的荧光探针的制备方法和应用

1.发明涉及化学医药领域，具体而言，涉及一种速检测硒半胱氨酸活性的方法。


背景技术：

2.1817年，瑞士科学家berzelius首次发现硒元素，硒在人体内的主要组成形式是硒半胱氨酸(sec)，sec在一些功能蛋白中发挥着重要的作用，这些蛋白被统称为硒蛋白。在硒蛋白家族中，不同硒蛋白的氨基酸序列、酶的活性、组织分布以及分子功能有很大差别。在生理活动中，这些硒蛋白酶因参与各种不同的代谢，所以他们发挥的生理功能也不同，其中包括抗氧化防御、生育、肌肉的发育、甲状腺激素调节和免疫功能等。sec目前被定义为第21氨基酸，它是硒蛋白的重要组成部分。目前发现的硒蛋白有很多种，但是对功能研究很清楚的却只有trxr、gpx等。这就要求需要找到一种快速而且响应比较灵敏的方法来检测硒蛋白或者是sec。


技术实现要素：

3.本发明所述的一种能快速、简便且经济的检测硒半胱氨酸活性方法的设计思路为：设计一种能够快速且专一的识别硒半胱氨酸的荧光分子(图1所示)，该分子与硒半胱氨酸快速反应后释放出荧光，利用荧光强度的变化反映体系中硒半胱氨酸的活性。
4.本发明所述的一种硒半胱氨酸响应的荧光探针的制备方法和应用，具体步骤如下：
5.(1)基于以上设计思路，设计合成能够检测硒半胱氨酸的荧光分子。
6.(2)探针分子对硒半胱氨酸的响应考察。
7.(3)建立探针分子检测硒半胱氨酸活性的方法。
8.(4)探针分子检测硒半胱氨酸活性方法的应用(细胞内)。
9.(5)探针分子检测硒半胱氨酸活性方法的应用(斑马鱼体内)。
10.本发明所述的检测硒半胱氨酸活性的方法，具有很好的创新性、经济环保性，在体外硒半胱氨酸、细胞内以及斑马鱼体内硒半胱氨酸活性检测方面具有很好的应用前景。
附图说明
11.图1为荧光探针分子的合成步骤及其结构式
12.图2为探针分子与硒半胱氨酸相应考察，说明本发明所呈现的荧光探针分子可以快速的与硒半胱氨酸响应。
13.图3为探针分子与硒半胱氨酸相应专一性考察，说明该探针分子可以对硒半胱氨酸的检测具有很好的选择性，进一步说明可以利用该发明呈现的探针分子进行复杂体系硒半胱氨酸的检测。
14.图4为利用探针分子检测细胞内的硒半胱氨酸。说明本发明呈现的探针分子具有很要的应用前景。
15.图5为利用探针分子检测斑马鱼体内的硒半胱氨酸。说明本发明呈现的探针分子具有很要的应用前景。
16.实施例1：一种硒半胱氨酸响应的荧光探针的制备方法和应用包括以下步骤：
17.(1)设计合成能够检测硒半胱氨酸的荧光分子
18.实例1具体操作方法：
19.化合物1的合成：将250mg邻氨基苯硫酚、290mg靛红酸酐和123mg乙酸钠混合溶解在50ml冰乙酸中，之后在氩气保护下回流1.5h，反应结束后用碳酸氢钠溶液淬灭。最后利用乙酸乙酯萃取合并有机相，利用柱层析得到目标化合物1.1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.07(dd,j＝8.0,0.8hz,1h),8.02(dd,j＝8.0,0.4hz,1h),7.64(dd,j＝8.0,1.2hz,1h),7.50(m,1h),7.43(m,2h),7.38(s,1h),7.22(m,1h),6.91(dd,j＝8.0,0.8hz,1h),6.66(m,1h)；
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ:169.27,153.63,148.08,132.79,132.19,130.31,126.79,125.48,122.44,122.10,116.94,116.02,113.55.化合物2的合成：将226mg化合物1和2以及当量的三乙胺溶解在10ml的二氯甲烷溶液中，之后缓慢加入398mg 2.4-二硝基苯磺酰氯，待原料全部反应后利用二氯甲烷萃取合并有机相，最后利用柱层析分析化合物，得到目标化合物1(探针分子)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:12.65(s,1h),8.79(d,j＝2.0hz,1h),8.50(dd,j＝8.8,2.4hz,1h),8.36(d,j＝8.4hz,1h),8.17(d,j＝8.0hz,1h),8.10(d,j＝8.0hz,1h),8.02(d,j＝7.6hz,1h),7.69(d,j＝8.4hz,1h),7.63(m,2h),7.53(t,1h),7.39(t,1h)；
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ:167.03 152.21,150.59,147.80,136.33,134.85,133.90,132.80,132.58,131.12,127.79,127.55,126.68,126.22,123.12,122.70,121.46,121.15.
20.实施例2：一种硒半胱氨酸响应的荧光探针的制备方法和应用包括以下步骤：
21.(1)设计合成能够检测硒半胱氨酸的荧光分子
22.(2)探针分子对硒半胱氨酸的响应考察。
23.实例2具体操作方法：
24.将10um探针分子加入荧光比色池，之后加入20um的硒半胱氨酸，设置激发波长为355nm，测定随着时间的变化，荧光强度的变化情况。由图2说明探针与硒半胱氨酸具有很好的响应情况。
25.实施例3：一种硒半胱氨酸响应的荧光探针的制备方法和应用包括以下步骤：
26.(1)设计合成能够检测硒半胱氨酸的荧光分子
27.(2)探针分子对硒半胱氨酸的响应考察。
28.(3)建立探针分子检测硒半胱氨酸活性的方法。
29.实例3具体操作方法：
30.将10um探针分子加入荧光比色池，之后加入20um的硒半胱氨酸或者1mm的其他检测物质，设置激发波长为355nm，测定5分钟之后发射波长为460nm荧光的增强倍数。由图3说明探针对硒半胱氨酸检测具有很好专一性。
31.实施例4：一种硒半胱氨酸响应的荧光探针的制备方法和应用包括以下步骤：
32.(1)设计合成能够检测硒半胱氨酸的荧光分子
33.(2)探针分子对硒半胱氨酸的响应考察。
34.(3)建立探针分子检测硒半胱氨酸活性的方法。
35.(4)探针分子检测硒半胱氨酸活性方法的应用(细胞内)。
36.实例4具体操作方法：
37.首先将hela细胞贴壁在24孔板，之后将10um探针分子孵育细胞，30min之后利用荧光显微镜拍照。由图4说明探针可以很好的检测细胞内硒半胱氨酸。
38.实施例5：一种硒半胱氨酸响应的荧光探针的制备方法和应用包括以下步骤：
39.(1)设计合成能够检测硒半胱氨酸的荧光分子
40.(2)探针分子对硒半胱氨酸的响应考察。
41.(3)建立探针分子检测硒半胱氨酸活性的方法。
42.(4)探针分子检测硒半胱氨酸活性方法的应用(细胞内)。
43.(5)探针分子检测硒半胱氨酸活性方法的应用(斑马鱼体内)。
44.实例5具体操作方法：
45.首先将3天的斑马鱼放置在特定培养皿里面，之后加入硒胱氨酸孵育30min，之后加入10um探针分子孵育，30min之后利用荧光显微镜拍照。由图5说明探针可以很好的响应斑马鱼体内的硒半胱氨酸。