藤仓镰刀菌及其发酵生产赤霉素A的制作方法

1.5、znso4·
7h2o 4-5
×
10-3
，单位为g/l。
11.通过采用上述技术方案，利用本申请中诱导得到的新菌种，在相同条件下的赤霉素a
4 7
产量优于市售传统赤霉素生产菌种，且其适应温度提高到32℃，且只需6天就可以完成发酵过程，大幅减少了生产过程的冷凝水使用并缩短了生产流程，具有出色的经济效应。
具体实施方式
12.以下结合具体实施例对本申请进行进一步阐述。
13.实施例1，藤仓镰刀菌，由市售赤霉素a
4 7
生产菌诱变得到，其菌种名为qj47-9，于2022年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmccno.40179，拉丁名为fusariumfujikuroi。
14.上述藤仓镰刀菌的诱变流程具体包括如下步骤：1、菌丝体富集培养解冻出发菌株冷冻甘油管，用无菌吸管吸取0.5ml至装有30ml富集培养基的250ml锥形瓶中，在30℃，摇床转速200r/min条件下，培养2d。
15.2、原生质体制备将培养好的菌丝体用无菌滤纸过滤转至无菌离心管，用缓冲液洗涤3次后吸干多余水分，按破壁酶终浓度1.5％(w/w)的比例往菌丝体中加入预先配制好的破壁酶酶液，30℃、50r/min保温震荡4h，离心去酶液得到原生质体。
16.3、常压室温等离子体诱变将原生质体悬浮液均匀涂布于载片表面，干燥后待用。诱变仪工作条件：注入气体为氦气，电源功率200w，气流量10l/min，照射距离2mm，样品量10μl。处理时间为100s。将处理后的载片置于装有1ml生理盐水的ep管以洗下菌体，再取0.1ml涂布至至原生质体再生平板，30℃培养48h后观察并纪录菌落数。挑取单菌落至斜面，30℃培养4d后进行发酵实验，筛选得到qj47-9。在该诱变条件下，致死率82％，正突变率4.6％。
17.在步骤3中，原生质体培养基组分如下：蔗糖20g/l、土豆200g/l、mgso4
·
7h2o 0.2g/l、caco
3 0.2g/l、琼脂15g/l，不额外进行ph调节。
18.实施例2，藤仓镰刀菌用于制备赤霉素a
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，具体包括如下步骤：s1、在原生质体培养的培养基中，从斜面挑取1cm2左右大小的带菌琼脂块于种子培养基中，装液量25/250ml，在温度30℃，摇床转速200r/min条件下，培养48h，得到种子液。
19.s2、取2ml种子液接入发酵培养基中，装液量50/500ml，在30℃，摇床转速200r/min条件下，得到发酵液。
20.其中，种子培养基组分如下：蔗糖50g/l，黄豆粉10g/l、nh4no
3 1.2g/l、mgso4·
7h2o 1.2g/l、kh2po
4 1.2g/l；发酵培养基采用如下配比：淀粉100g/l，黄豆饼粉13g/l、玉米浆干粉25g/l、k2so
4 1.6g/l、mgso4·
7h2o 1.2g/l、znso4·
7h2o 4.5
×
10-3
g/l。
21.实施例3，与实施例2的区别在于，在步骤s2中，发酵温度为32℃。
22.另设置对比例如下：对比例1，与实施例2的区别在于，采用市售赤霉素a
4 7
进行发酵。
23.对比例2，与实施例3的区别在于，采用市售赤霉素a
4 7
进行发酵。
24.对上述实施例和对比例制备得到的发酵液，测定其赤霉素
4 7
的含量，具体方法如
下：取0.5ml发酵液，加入9.5ml甲醇，强烈震荡10min，2600r/min离心10min，取上清液hplc分析。hplc条件：hypersil bds c18反相色谱柱(150mm
×
4.6mm)；流动相:甲醇
–
水(60:40，v/v)，流速0.8ml/min；紫外检测器波长203nm；进样体积20μl。测定结果的单位为mg/l。
25.对实施例2～3和对比例1～2中的发酵液，每组进行三次重复实验，得到如下结果。对实施例2～3和对比例1～2中的发酵液，每组进行三次重复实验，得到如下结果。
26.通过上述实施例和对比例之间的对比，可以看到，本申请中诱导得到的藤仓镰刀菌相较于市售的赤霉素a
4 7
生产菌，在30℃和32℃下均有更优的发酵产率。其中。在30℃条件下，实施例中的藤仓镰刀菌发酵水平可以达到1200mg/l以上，而对比例1中，其在7d发酵后，赤霉素a
4 7
在发酵液中的含量仅为850mg/l左右。另外，在升高温度后，实施例的藤仓镰刀菌依旧具有良好的活性，其活性没有下降，且在6d左右的时间基本上可以达到峰值(约1200mg/l)，达峰后赤霉素a
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的含量基本与30℃反应条件下得到的结果一致。而对比例2中可以明显的看到，其活性相较于对比例1有明显的下降，且在d5后峰值没有继续增加，这意味着菌种的活性在高温下已经受到了影响，难以继续进行发酵生产的行为。因此，实施例中经诱导得到的藤仓镰刀菌相较于市售的赤霉素a
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生产菌具有更高的适应温度，因此在运用于实际生产中可以减少冷却水的使用，缩短发酵时间，进而优化生产流程，降低了企业的生产成本，缩短了企业的生产周期，进而具有良好的经济效应和市场价值。
27.另外，对实施例1中的藤仓镰刀菌进行五代传代，并对每代菌种进行发酵水平检验，其中，初代藤仓镰刀菌的发酵水平为1208，后续的5批次稳定性实验平均数据为：1188,1231,1207,1219,1196，单位均为mg/l。其发酵水平没有下降，证明本申请中诱导得到的藤仓镰刀菌具有出色的稳定性。
28.上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。


技术特征：
1.藤仓镰刀菌，其特征在于，于2022年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.40179，菌种名为qj47-9，分类命名为藤仓镰刀菌。2.权利要求1所述的菌种在发酵生产赤霉素a4 7中的运用。3.通过权利要求1所述的藤仓镰刀菌发酵生产赤霉素a4 7的方法，其特征在于，发酵温度不低于30℃。4.根据权利要求3所述的发酵生产赤霉素a4 7的方法，其特征在于，发酵温度不低于32℃。5.根据权利要求4所述的发酵生产赤霉素a4 7的方法，其特征在于，发酵时间为不少于6天。6.根据权利要求3所述的发酵生产赤霉素a4 7的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、配置种子培养基，加入如权利要求1中所述的藤仓镰刀菌菌种，培养得到种子液；s2、将种子液转移到发酵培养基中，对种子液进行发酵，得到发酵液。7.根据权利要求6所述的发酵生产赤霉素a4 7的方法，其特征在于，在发酵培养基和种子培养基中，所含碳源独立地选取淀粉、葡萄糖、蔗糖、糖蜜中的任意数量种。8.根据权利要求6所述的发酵生产赤霉素a4 7的方法，其特征在于，在发酵培养基和种子培养基中，所含氮源独立地选取黄豆饼粉、玉米浆干粉、花生粉、酵母粉、棉籽粉、低温豆粕中的任意数量种。

技术总结
本申请涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种藤仓镰刀菌及其赤霉素A4 7的方法及运用，其中本申请的藤仓镰刀菌于2022年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.40179，菌种名为QJ47-9。本申请中的藤仓镰刀菌经市售藤仓镰刀菌诱导得到，其具有更高的发酵水平，发酵温度高于市售藤仓镰刀菌，且发酵周期缩短，相较于现有的生产菌中具有明显的优势。的生产菌中具有明显的优势。


技术研发人员：陆建卫 吴烨飞 沈波 朱建新 冯佩杰 陆春锋 常宏 俞海燕
受保护的技术使用者：浙江钱江生物化学股份有限公司
技术研发日：2022.08.11
技术公布日：2022/12/12