均衡诱导抗病毒细胞与体液免疫的核酸-纳米乳的构建与应用

1.本发明属于制药领域，涉及均衡诱导抗病毒细胞与体液免疫的核酸-纳米乳疫苗的构建与应用，是一类可诱导均衡的抗病毒特异性细胞免疫与体液免疫的纳米乳的构建，以及该纳米乳在制备抗病毒核酸疫苗中的应用。


背景技术：

2.严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)是新型冠状病毒肺炎(covid-19)的病原体，具有强传染性、高致病性和易诱变性，对全球公共卫生健康造成了严重的威胁[nat rev microbiol.19,141
–
154(2021)]。新冠病毒的爆发促进了疫苗平台的开发和应用，以建立针对病毒感染的特异性免疫保护。其中，基于mrna的疫苗具有非基因整合性表达、可快速和规模化生产、生物安全性好等优势，已经成为一种有前景的候选疫苗形式[nat rev drug discov.17,261
–
279(2018)]。然而，mrna分子的负电性、亲水性和易降解性极大地限制了其生物利用率。因此，需要一种递送系统来促进mrna的结构稳定性和位点特异性积累，以有效动员抗病毒免疫[signal transduct target ther.5,237(2020)]。
[0003]
作为适应性免疫的两个主要分支，体液免疫和细胞免疫具有内在相关性，它们的协同作用决定了抗病毒免疫响应的有效性和可持续性[j immunol.172,6265
–
6271(2004)]。具体而言，体液免疫主要依赖抗体介导的中和作用，可中和病毒感染并抑制病毒介导的细胞膜融合[br j pharmacol.178,3359
–
3372(2021)][microbiol mol biol rev.80,989
–
1010(2016)]；而细胞免疫主要由cd8

t细胞介导，后者通过t细胞受体(tcr)识别并清除病毒感染的细胞[emerg microbes infect.1,e23(2012)]。此外，在体液免疫和细胞免疫反应期间可建立免疫记忆，以抵抗特异性病毒的入侵[vaccine.34,2008
–
2014(2016)]。
[0004]
抗病毒体液免疫和细胞免疫在起效时间、作用方式、作用强度和反应持续性等方面不同。最新研究表明，在自然感染或疫苗接种后，cd8

t细胞介导更快速、更强大且更持久的免疫保护[n engl j med.384,1573
–
1576(2021)][med(n y).2,682-688.e4(2021)]。相反，抗体免疫保护窗较窄，其启动时间较晚而免疫响应结束更早[nat microbiol.5,1598
–
1607(2020)]。据报道，在sars-cov-2刺突蛋白mrna疫苗(bnt162b2，pfizer biontec)初次接种后一周即可检测到抗原特异性cd8

t细胞响应，后者可在疫苗再次接种时经历克隆扩增和效应分化。相反，中和抗体只有在二次疫苗免疫后才能被检测到[nature.597,268
–
273(2021)]。此外，一些研究表明，cd8

t细胞活化后可在体内维持较长时间，以提供针对sars-cov-2的长期细胞免疫保护，而抗体免疫会随着时间的推移而逐渐减弱[nat microbiol.12,1598
–
1607(2020)][immunity.54,340-354.e6(2021)]。
[0005]
诱导均衡的抗病毒体液免疫和细胞免疫至关重要。与其他rna病毒相比，sars-cov-2具有相对较高的突变率[biochem biophys res commun.538,88
–
91(2021)]。大多数中和抗体靶向sars-cov-2刺突蛋白的rbd，rbd处的突变会部分降低、甚至完全阻断抗体亲
和力，导致抗体中和能力不足[cell host microbe.29,44-57.e9(2021)][elife.9,e61312(2020)]。此外，随着病毒的遗传变异逐渐积累，这种突变可能会导致病毒的传播性和/或致病性加强[nat commun.8,1735(2017)]。另一方面，sars-cov-2也可能通过病毒主要组织相容性复合物i类(mhc i)表位的点突变来逃避cd8

t细胞介导的免疫攻击[sci.immunol.6,eabg6461(2021)]。因此，同时诱导体液和细胞免疫可以更好地抵抗病毒突变引起的免疫逃逸。
[0006]
脂质纳米粒(lnp，已获附条件批准[n engl j med.384,403
–
416(2021)])和阳离子纳米乳(cne)是常用的mrna递送系统[mol ther.22,2118
–
2129(2014)][gene ther.24,133
–
143(2017)]。然而，目前，对于这些纳米载体在诱导抗病毒体液免疫和细胞免疫中的作用模式仍缺乏系统性的了解。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的之一是提供一种能均衡诱导抗病毒细胞与体液免疫的核酸-纳米乳的构建方法，具体步骤如下：
[0009]
(1)纳米乳的构建与带电性质：本发明所述的纳米载体为水包油型阳离子纳米乳，以磷脂、维生素e和阳离子脂质作为油相，不含核酸酶的水溶液作为水相，得到阳离子纳米乳，其中，阳离子脂质占总脂质质量的10％-80％。
[0010]
油相中的磷脂可以是天然磷脂，如蛋黄卵磷脂或合成磷脂，如氢化大豆磷脂酰胆碱等。
[0011]
油相中的维生素e可以是琥珀酸酯、醋酸酯或α-生育酚。
[0012]
油相中的阳离子脂质可以是(2,3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵(dotap)、二甲基双十八烷基铵(dda)、1,2-二甲基-3-三甲基铵-丙烷(dmtap)、1,2-硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷(dstap)或3β-[n-(n’,n
’‑
二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(dc-chol)等。
[0013]
(2)纳米乳负载核酸分子：将步骤(1)制备的阳离子纳米乳与带负电的编码病毒特异性抗原的核酸分子共孵育，通过静电相互作用得到核酸-纳米乳复合物，其中，核酸与纳米乳的n/p为1:3-1:8。
[0014]
本发明所述的核酸-纳米乳复合物可通过探头超声法、高压均质法或微流控技术制备。
[0015]
本发明所述的带负电的编码病毒特异性抗原的核酸分子可以是信使rna(mrna)或质粒dna(pdna)。
[0016]
本发明目的之二是提供所述核酸-纳米乳复合物在制备抗病毒核酸疫苗中的应用。
[0017]
本发明所述的纳米乳可以递送sars-cov-2 rbd mrna，制备抗新冠病毒疫苗，以诱导均衡的抗病毒细胞免疫与体液免疫。
[0018]
本发明所述的纳米乳还可以递送编码其它病毒特异性抗原，如流感病毒血凝素(influenza ha)、人类免疫缺陷病毒包膜蛋白(hiv env)和埃博拉病毒糖蛋白(ebov gp)等的核酸分子，以制备针对不同病毒的核酸疫苗。
[0019]
本发明所述的纳米乳诱导均衡的抗病毒细胞免疫与体液免疫的分子基础是通过
促进所负载的mrna在dcs中的溶酶体逃逸来实现的。
[0007]
基于以上介绍，本发明构建了一种可均衡诱导抗病毒细胞免疫与体液免疫的阳离子纳米乳，用于负载并递送sars-cov-2 rbd mrna。本发明以lnp作为对照，考察了该纳米乳的组织分布、细胞摄取、胞内分布和诱导抗病毒特异性细胞免疫与体液免疫的能力。结果表明，相比lnp，该纳米乳具有不同的结构特征和生化特征，可通过促进mrna在树突状细胞(dcs)中的溶酶体逃逸来提高细胞免疫的诱导，实现均衡诱导体液和细胞免疫以抗击新冠病毒感染的能力，具有良好的生产和应用前景。
附图说明
[0020]
图1是mrna@lnp和mrna-cne的结构示意图。
[0021]
图2是lnp和cne(负载或不含egfp mrna)的粒径、多分散系数(pdi)(a)和表面电位(b)。
[0022]
图3是负载egfp mrna的lnp和cne在透射电子显微镜(tem)下的形态。
[0023]
图4是琼脂糖凝胶电泳法考察lnp和cne对egfp mrna的包封能力。
[0024]
图5是结构光照显微镜(sim)下lnp和cne(以荧光染料did标记纳米粒)对模式核酸fam-ssdna的负载情况。
[0025]
图6是疫苗免疫小鼠及样品收集分析示意图。
[0026]
图7是各组小鼠初次疫苗免疫后第21天血清中和或sars-cov-2病毒(野生毒株和delta突变株)感染vero e6细胞的能力(n＝15)的考察。lod，检测限。
[0027]
图8是elisa法检测各组小鼠初次疫苗免疫后第7(n＝7)、21(n＝15)和28(n＝15)天血清中抗sars-cov-2(2019-ncov)刺突蛋白rbd igg抗体水平。
[0028]
图9是流式细胞术检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞受s蛋白体外再刺激48h后ifn-γ

cd8

t细胞的频率(a)和ifn-γ

cd4

t细胞的频率(b)，(n＝16)。
[0029]
图10是流式细胞术检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞受s蛋白体外再刺激48h后cd8

t细胞的频率(a)和cd4

t细胞的频率(b)及cd8/cd4的比例(c)，(n＝16)。
[0030]
图11是elisa法检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞受s蛋白体外再刺激48h后细胞培养液上清中ifn-γ(a)和il-4(b)的浓度以及ifn-γ/il-4(c)的比值(n＝16)。
[0031]
图12是流式细胞术检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞受s蛋白体外再刺激48h后cd8

tcm(a，cd44

cd62l

cd8 t细胞)和cd8

tem(b，cd44

cd62l-cd8 t细胞)的频率变化情况(n＝16)。
[0032]
图13是免疫荧光切片检测小鼠二次疫苗免疫后第三天给药位点附近引流淋巴结处b细胞(b220 )和dcs(cd11c )的活化(cd86 )情况。
[0033]
图14是免疫荧光切片检测小鼠二次疫苗免疫后第三天给药位点附近引流淋巴结处cd8 t细胞(cd8 )和cd4 t细胞(cd4 )的效应功能(ifn-γ )。
[0034]
图15是小动物活体成像法观察经荧光染料dir标记的lnp和cne在肌肉注射后3、12、24、48和72h时的组织分布情况(n＝4)。
[0035]
图16是经荧光染料dir标记的lnp和cne在肌肉注射后72h时分离小鼠的引流淋巴结、心、肝、脾、肺和肾，检测并定量纳米粒在各器脏中的分布情况(n＝4)。
[0036]
图17是给药后44h内经荧光染料did标记的lnp(a)和cne(b)在c2c12、dc2.4和raw264.7中44h内的摄取情况(n＝4)。
[0037]
图18是给药12h时c2c12、dc2.4和raw264.7中lnp和cne递送的ssdna逃避溶酶体的情况(n＝3)。
[0038]
图19是给药24h后lnp和cne递送的egfp mrna在c2c12、dc2.4和raw264.7中24h的转染情况(n＝4)，标尺，200μm。
具体实施方式
[0039]
本发明结合附图和实施实例作进一步的说明。
[0040]
实施例1 载rbd mrna的纳米乳的制备与表征
[0041]
表一：mrna纳米粒的处方
[0042]
基于脂质的纳米粒是常用的核酸递送平台，其中，基于lnp和纳米乳的rna疫苗的生物安全性高且个体耐受性良好，受到了广泛的关注和研究。在此，根据辉瑞/生物技术公司(pfizer/biontech)所公开的lnp处方和我们的研究基础制备负载mrna的lnp和cne(表1)(图1)。
[0043]
通过微流控技术将mrna包封在lnp的粒子内部，一步制备mrna@lnp。具体来说，将可电离脂质dlin-mc3-dma，辅助脂质dspc、结构脂质胆固醇(cholesterol)和peg化脂质dmg-peg
2000
按照50:10:38.5:1.5的摩尔比溶解在乙醇中作为脂质相。将获取的脂质相与mrna的柠檬酸盐缓冲液(ph 4.0，10mm)按照体积比1:3、n/p比6:1注入微流控混合装置(zx-ls-32，fluidiclab，上海，中国)，混合流速为1.5ml/min。将所得混合物用磷酸盐缓冲液(pbs；ph 7.4，10mm)中透析16h以除去乙醇，得到mrna@lnp。同时，以同样的方式制备不含mrna的空白lnp作为对照。
[0044]
另一方面，通过乳化超声法制备空白的cne，随后将cne与mrna共孵育，通过静电相互作用在纳米乳表面吸附核酸，制备mrna-cne。具体来说，将15mg dotap、17.5mg蛋黄卵磷脂(lipoid e-80)和17.5mg维生素e醋酸酯溶解在25μl乙醇中作为油相。以1.5ml经depc处理的、不含核酸酶的超纯水作为水相。通过在高速涡旋状态下向油相逐滴加入水相获得初乳，随后将初乳在冰浴上进行超声再分散(功率30％，工作2秒，暂停3秒，5分钟，3-4轮)以产生均一的空白纳米乳。将空白纳米乳cne与mrna的depc水溶液在4℃按照4.5:1的n/p比共孵育30min，获得mrna-cne。
[0045]
接下来，对不同核酸-纳米粒的理化性质进行表征。在pbs(ph 7.4)中，空白lnp粒径约170nm，表面电位约0mv；空白cne粒径约130nm，表面电位约50mv(动态光散射法检测)。以egfp mrna作为模型mrna制备核酸-纳米粒发现，核酸的负载导致lnp和cne的粒径增加约50nm，cne的表面电位降低约40mv，而lnp的表面电位几乎不变(图2)。透射电子显微镜(tem)图像结果和琼脂糖凝胶电泳分析结果表明，这两种制备方式均可以获得具有类球形形态(图3)、高mrna包封率(图4)的核酸-纳米粒。以fam标记的单链dna(fam-ssdna)作为模型核
酸并用荧光染料did标记纳米粒，结构光照显微镜(sim)图像证实单链核酸序列确实可以通过不同的药物包封策略被纳米粒负载，即，被包裹在lnp的内部或被吸附在cne的表面(图5)。
[0046]
实施例2 mrna纳米粒体内诱导抗sars-cov-2体液免疫和细胞免疫的考察
[0047]
刺突蛋白(s蛋白)是sars-cov-2重要的结构蛋白，可与其受体血管紧张素转换酶2(ace2)结合，介导病毒进入宿主细胞。rbd是s蛋白与ace2结合的最小结构域，常被用作诱导新冠病毒特异性抗体响应(阻断病毒入侵)和效应t细胞免疫(消除受感染的细胞)的免疫原。迄今为止，基于rbd的mrna疫苗已在动物模型和人类临床试验中被证实能诱导有效的免疫保护[transduct target ther.6,340(2021)][immunity.52,583
–
589(2020)]。
[0048]
采用核苷修饰的rbd(319-541aa)mrna，并用lnp和cne对其进行负载。将6-8周大小的雌性balb/c小鼠随机分组(n＝16)，在第0天(prime)和第14天(boost)分别向各组小鼠肌内注射(两侧后肢大腿肌肉内分别注射50μl，共100μl)生理盐水(a#)、mrna@lnp(b#)和mrna-cne(c#)，其中，b#组和c#组中每只小鼠给药10μg的rbd mrna。在初次免疫后的第7、21和28天对小鼠进行眼眶采血，用于检测血清中病毒特异性igg抗体滴度和血清中和新冠病毒的能力(即，体液免疫)，并在第28天处死小鼠，分离免疫小鼠的脾脏，用新冠rbd重组蛋白在体外再刺激，用于检测s蛋白特异性t细胞免疫响应(图6)。
[0049]
血清病毒中和试验是评价疫苗接种引发的特异性体液免疫的金标准。结果表明，相比其它给药组，mrna@lnp免疫的小鼠(b#)具有最佳的抗病毒体液免疫响应，该组小鼠的血清在二次疫苗免疫后(day 21)后可中和真病毒sars-cov-2(野生型毒株和δ突变株(b.1.617.2))对vero e6细胞的感染(由浙江省疾控中心p3实验室检测)(图7)。此外，在初次免疫后第7、21和28天，b#组小鼠的血清均显示出最高的抗sars-cov-2 rbd igg水平(图8)，mrna-cne免疫的小鼠(c#)也可以诱导抗新冠病毒体液免疫，虽然其抗体反应强度不及b#组高。
[0050]
在抗病毒特异性细胞免疫方面，mrna@lnp表现较差，而mrna-cne的疫苗免疫可显著促进小鼠脾脏淋巴细胞中ifn-γ

cd8

t细胞的比例(图9)。此外，这些淋巴细胞在体外s蛋白再刺激后，ifn-γ

cd8

t细胞和ifn-γ

cd4

t细胞的比例显著增加(图9)，说明建立起了病毒特异性细胞免疫(ifn-γ为t细胞抗病毒作用中重要的效应分子)。此外，mrna-cne免疫的小鼠在抗原再刺激下，相比cd4

t细胞，cd8

t细胞的响应性更强(图10)；可诱导i型cd4

t辅助细胞(th1)偏向性免疫反应(脾脏淋巴细胞分泌的ifn-γ/il-4更高)(图11)。另外，在抗原再刺激下，所有组小鼠脾脏淋巴细胞中cd8

t细胞经历了从中央记忆(tcm)到效应器记忆(tem)的表型变化，其中，mrna-cne免疫组诱导的cd8

tcm更多，这种免疫记忆的建立有助于快速清除病毒感染的细胞，也反映了c#组小鼠体内抗病毒细胞免疫的有效建立(图12)。
[0051]
在二次免疫后第三天收集给药部位附近的腹股沟引流淋巴结(dlns)，用于分析b细胞(b220 )和dcs(cd11c )的活化(cd86 )情况(图13)，以及cd4

t细胞和cd8

t细胞的效应功能(ifn-γ )(图14)。免疫荧光切片的全扫描图像结果显示，与上述流式结果一致，mrna@lnp有效激活了dlns中的b细胞和cd4效应t细胞，但对cd8效应t细胞的诱导不足，说明这种核酸-纳米粒可以诱导体液免疫但对细胞免疫的刺激不足。相比之下，mrna-cne在部分诱导b细胞和cd4效应t细胞的基础上，还可以促进dcs的活化以及cd8效应t细胞的产生，说明诱导了均衡的体液免疫和细胞免疫。
[0052]
实施例3 不同纳米粒的生物分布
[0053]
为了阐明潜在机制，首先研究了不同脂质纳米粒(即lnp和cne)的生物分布模式。向balb/c小鼠的两侧后肢大腿肌肉内分别注射50μl荧光染料dir标记的lnp或cne，随后考察纳米粒的在体分布情况。结果表明，肌肉注射后72h内，这两种纳米粒均主要滞留在注射部位(即，肌肉)(图15)。72h时处死小鼠，分离其dlns(两侧腋窝淋巴结和腹股沟淋巴结)、心、肝、脾、肺和肾，进行器脏的离体检测。结果表明(图16)，除肌肉组织外，在肝脏(lnp为83.26％；cne为86.64％)、脾脏(lnp为9.34％；cne为4.69％)和dlns(lnp为7.40％；cne 8.67％)中存在大量脂质纳米粒的积聚。说明lnp(16.74％)和cne(13.36％)均具有一定的次级淋巴器官(slos，即lns和脾脏)引流能力，这或许能促进纳米粒递送核酸至淋巴细胞以诱发适应性免疫应答。
[0054]
实施例4 mrna纳米粒的细胞摄取、溶酶体逃逸和细胞转染
[0055]
据报道，在mrna疫苗接种部位的体细胞(包括心肌细胞)可以摄取疫苗纳米粒，随后表达mrna编码的抗原并将抗原传递至附近的抗原呈递细胞(apcs)，从而间接诱导免疫响应，促进适应性免疫的强度和持续性[nano today 41,101326(2021)]。因此，进一步考察了不同纳米粒在心肌细胞(c2c12)和apcs(包括树突状细胞dc2.4和巨噬细胞raw264.7)中的细胞摄取(图17)、胞内转运(图18)和mrna转染(图19)。结果表明，不同纳米粒的结构特征和生化特征决定了其负载mrna后诱导细胞免疫和体液免疫的能力。
[0056]
具体来说：对于lnp，纳米粒在c2c12中的累积摄取与raw264.7相似，并显著高于dc2.4(细胞摄取：肌细胞≈巨噬细胞》树突状细胞)。在胞内，lnp在c2c12中的溶酶体逃逸强于在dc2.4和raw264.7中的情况(溶酶体逃逸：肌细胞》巨噬细胞≈树突状细胞)，这可能部分解释lnp在c2c12中mrna的高表达(egfp mrna的转染：肌细胞》巨噬细胞》树突状细胞)。我们推测，肌细胞摄取并翻译mrna，随后将产生的目的蛋白主动分泌或被动释放(例如，细胞经历凋亡，释放含抗原蛋白的凋亡小体)至胞外，这些抗原蛋白被局部招募的apcs捕获，或进入淋巴引流和/或血液循环，以激活slos中的apcs。在这种情况下，抗原以外源性物质的形式被apcs摄取，这有利于抗原的mhc ii类限制性呈递，可激活特异性cd4

t细胞和b细胞以引发体液免疫。
[0057]
对于cne，纳米粒在c2c12和dc2.4中的摄取显著优于raw264.7(细胞摄取：树突状细胞≈肌细胞》巨噬细胞)，而纳米粒在dc2.4中的溶酶体逃逸优于其他细胞(溶酶体逃逸：树突状细胞》肌细胞≈巨噬细胞)。在c2c12和dc2.4中mrna-cne的转染效率高于raw264.7(egfp mrna的转染：树突状细胞》肌细胞》巨噬细胞)。实验证明，cne除了能通过以上所述的肌细胞摄取mrna所引发的体液免疫，还可以减少mrna在dcs中的溶酶体降解，从而促进mrna的内源性合成，有利于抗原的mhc i类限制性呈递以激活特异性cd8

t细胞，促进细胞免疫应答，并最终实现均衡诱导体液免疫和细胞免疫的能力。