包含乳香水溶液的用于防止脱发及促进生发的化妆品组合物的制作方法

1.本发明涉及用于防止脱发及促进生发的化妆品组合物，更详细地，涉及包含乳香水溶液而表现出更优异的防止脱发及促进生发效果的化妆品组合物。


背景技术：

2.秃顶是指毛发的生长部分不足或完全不足的现象，是称为“毛发稀疏(hair thinning)”的上位概念中的一种。早在五千年前，有关脱发治疗的处方就记录在埃及的纸莎草纸上，之后直至现代，开发了利用多种治疗方法的脱发治疗及生发的技术，但至今仍未实现其明确病因的查明及正确治疗方法的开发。
3.尤其，在注重美观的当今社会，脱发现象在美容层面成为一大难题，由于遗传、男性荷尔蒙、老化、压力、营养不良及其他病理因素使人体受到渐进性的损伤，由此引起的毛发脱落正成为一个很大的社会问题。尤其已知压力和营养不良等引起末端血流不畅，由此引起生成毛发的毛囊的功能下降，从而发展为脱发。因此，开发了用于促进末端血液循环以强化毛囊功能的防止脱发药物，代表例有获得美国食品药品监督管理局(fda)认证的外用米诺地尔(minoxidil)。
4.米诺地尔是1950年左右开发的溃疡治疗剂，但其在扩血管方面很有效，查明其降血压的功效，经改良后被批准作为高血压治疗剂。但在临床实验过程中作为副作用出现了预想不到的多毛症，通过后续研究，于1988年在美国食品药品监督管理局批准用作脱发治疗剂(drug design,development and therapy.2019.5(2))。已知上述米诺地尔通过由开放钾离子通道的血管扩张效果向毛囊提供生长因子等营养成分，通过使免疫功能正常化来具有防止脱发及生发的效果，在临床上也表现出确实的效果。但是，由于尚未查明明确的脱发机制，而且由于血管扩张功能，导致患有心血管系统疾病，尤其是患有低血压的患者无法使用，具有头痛、眩晕、心率过快等副作用，因此具有尽可能在医生的处方下规定适量来使用的局限性。
5.近来，比起治疗层面的防止脱发及促进生发，希望在日常生活管理上防止脱发及促进生发的消费者正日益增加，随之出现除以清洁为目的的洗发水等组合物以外，还在能够装扮外貌的发蜡、发胶等以及为提供营养而使用的发膜、头发营养霜等组合物中包含防止脱发及促进生发的成分的倾向。并且，与包含化学合成物质的护发产品相比，包含毒性更低、使用时排斥反应少的天然物质或者天然提取物的护发产品的需求大大增长。
6.另一方面，乳香是一种可以从仅生长在地中海沿岸的希腊希俄斯岛的乳香树上获得的树脂性树液，其抗菌效果卓越，在二十世纪八十年代就已知其对胃及十二指肠溃疡具有突出的疗效，到了二十世纪九十年代，报道了其抑制作为胃及十二指肠溃疡的病因的幽门螺杆菌的生长的机制，之后，查明其抑制牙龈病原菌及龋齿病原菌的发育从而具有预防龋齿的功能，不仅如此，还因高抗炎效果而对神经性胃炎、反流性食管炎等现代人中常见的胃肠疾病具有很高的功效(in vivo(athens,greece).26(5))。如上所述，尽管已知乳香的多种效果，但至今仍无有关防止脱发及促进生发效果的报道，对此的研究也处于空白状态。


技术实现要素：

7.技术问题
8.本发明的目的在于开发并提供如下化妆品组合物：包含乳香水溶液而具有优异的安全性及稳定性，提高毛发生长因子的表达并抑制脱发基因的表达，从而使毛发的生长效果非常突出。
9.解决问题的方法
10.本发明提供包含乳香水溶液的用于防止脱发及促进生发的化妆品组合物。
11.另一方面，本发明的化妆品组合物可以通过包括如下步骤的过程来制备：步骤(a)，将乳香粉碎至粒子大小约为10μm～50μm；步骤(b)，将纯化水、食用甘油、作为添加剂的选自阿拉伯胶(gum arabic)、黄芪胶(gum traganth)、刺梧桐树胶(gum karaya)、刺槐豆胶(locust bean gum)、瓜尔豆胶(gum guar)、黄原胶(gum xanthan)、茄替胶(gum ghatti)、果胶(pectin)及环糊精(cyclodextrin)中的一种以上与上述粉碎的乳香混合来制备混合液并搅拌；以及步骤(c)，对上述搅拌的混合液进行纳米粒子化并分散，使最终分散粒子的大小为600nm～1000nm。
12.发明的效果
13.本发明通过提供包含源自天然物质的乳香水溶液的化妆品组合物来实现既环保又具有防止脱发及促进生发活性的功能。并且，在人毛乳头细胞中表现出低毒性及高增殖率，通过增加wnt5a、血管内皮生长因子(vegf，vascular endothelial growth factor)等毛发生长因子的表达来抑制作为脱发基因的ii型5α-还原酶(5-alpha reductase type 2)的表达，从而可以实际上诱导毛发的生长，并在防止脱发及促进生发方面发挥突出的功效。
附图说明
14.图1为测量本发明乳香水溶液在人毛乳头细胞中的毒性的结果柱状图。
15.图2为测量通过本发明乳香水溶液的人毛乳头细胞的增生能力的结果柱状图。
16.图3为测量通过本发明的乳香水溶液的人毛乳头细胞中的毛发生长因子活性的结果柱状图。图3的(a)部分示出wnt5a的表达量，图3的(b)部分示出血管内皮生长因子的表达量。
17.图4为测量通过本发明乳香水溶液的人毛乳头细胞中的脱发基因ii型5α-还原酶的表达量的结果柱状图。
具体实施方式
18.在注重美观的当今社会，脱发现象在美容层面成为一大难题，用于治疗脱发的代表例有外用米诺地尔治疗剂。但是，由于尚未查明明确的脱发机制，而且由于血管扩张会给患有心血管系统疾病的患者带来头痛、眩晕、心率过快等副作用，因此具有使用受限的问题。并且，比起治疗层面的防止脱发及促进生发，人们更希望在日常生活中进行管理，比起化学方法，人们对安全且使用时排斥反应少的天然方法的需求日益增加。
19.因此，本发明提供包含乳香水溶液的用于防止脱发及促进生发的化妆品组合物。乳香是一种可以从仅生长在地中海沿岸的希腊希俄斯岛的乳香树上获得的树脂性树液，已知其具有抗菌效果、预防龋齿的效果、高抗炎效果等功效。
20.在现有的授权专利第10-1865712号(授权日期：2018年06月01日)中，使用乳香原料并使其纳米粒子化来制备分散水溶液，通过完成该发明来以差别化的方法解决了乳香的不溶性。优选地，使用通过包括如下步骤的过程制备的乳香水溶液：步骤(a)，将乳香粉碎至粒子大小约为10μm～50μm；步骤(b)，将纯化水、食用甘油、作为添加剂的选自阿拉伯胶、黄芪胶、刺梧桐树胶、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、黄原胶、茄替胶、果胶及环糊精中的一种以上与上述粉碎的乳香混合来制备混合液并搅拌；以及步骤(c)，对上述搅拌的混合液进行纳米粒子化并分散，使最终分散粒子的大小为600nm～1000nm。通过包含上述乳香水溶液可以提供安全且实际上在人毛乳头细胞中表现出比现有的治疗剂更卓越的防止脱发及促进生发功效的化妆品组合物。
21.另一方面，本发明的用于防止脱发及促进生发的化妆品组合物在人毛乳头细胞中表现出低毒性及高增殖率，确认在使用上具有安全性。并且，在增加wnt5a、血管内皮生长因子等毛发生长因子的表达的同时抑制作为脱发基因的ii型5α-还原酶的表达，从而可以实际上诱导毛发生长，并在防止脱发及促进生发方面发挥突出的功效。
22.另一方面，本发明的用于防止脱发及促进生发的化妆品组合物可以制备为本发明所属技术领域中通常制备的任意剂型，作为一例，可以配制为洗发水、护发素、护发精、焗油膏、生发水、头皮护理素、发露、发乳、毛发营养化妆水或者普通软膏剂。
23.以下，通过下述实施例及实验例更为详细地说明本发明的内容。但本发明的权利范围不限于下述实施例及实验例，还包括与之等同的技术思想的变形。
24.实施例1：水溶性乳香水溶液及其毒性测量
25.通过肉眼检查乳香粉末来实施颜色确认及杂质检查。然后使用盘式磨粉机在40℃的温度下第一次粉碎被筛选的乳香粉末，使其粒子大小达到约35μm。为了分散水溶液，依次加入68重量百分比的纯化水、8重量百分比的食用甘油、4重量百分比的添加剂(茄替胶)，加入20重量百分比的上述步骤(2)的第一次粉碎的乳香粉末，以110rpm的搅拌速度搅拌30分钟。为了乳香的纳米水溶性加工，使用珠磨机在30℃的温度下研磨5小时以使最终分散粒子的平均大小为950nm。然后，使用50μm外壳过滤器过滤来获得水溶性乳香分散水溶液。测量上述制备的乳香分散水溶液在人毛乳头细胞中的毒性。
26.首先，从promocell公司(海德堡，德国)购入经第二次传代培养并冷冻在冷冻小瓶(cryovial)的人毛乳头细胞。将其水浴熔化后在添加青霉素(100u/ml)、链霉素(100ug/ml)及10％热失活血清的改良杜氏伊戈尔培养基(dmem，dulbecco'smodified eagle's medium)中并在95％空气、5％co2及37℃温度的条件下培养。当毛乳头细胞附着于培养皿并开始生长时，使用0.25％的胰蛋白酶/10mm的乙二胺四乙酸(edta)收集细胞，以1∶3的比例分离后留在10％的改良杜氏伊戈尔培养基(dmem)中培养人毛乳头细胞。
27.实验中所使用的试剂cck-8是从(株)donginbio公司(首尔，韩国)购入来使用的。使用人毛乳头细胞以1
×
103cells/well的浓度在96孔板(96-well plates)的各孔处理100ul后培养24小时。当细胞附着于底面时，分别使用直至2000ppm的不同浓度的乳香分散水溶液及作为阳性对照组的米诺地尔处理24小时。之后，在10ul的cck-8试剂和100ul的人毛乳头细胞培养基的条件下培养4小时后，在540nm的波长下使用分光光度计(spectrophotometer)测量吸光度。
28.其结果如图1所示，可以确认乳香水溶液在直至1000ppm浓度的条件下不显出毒
性，可以安全地使用。
29.实施例2：在人毛乳头细胞中测量乳香水溶液的细胞增殖
30.在本实施例中，测量了上述实施例1中制备的乳香水溶液对人毛乳头细胞的增殖。
31.实验中所使用的试剂cck-8是从donginoptical公司购入来使用的。使用人毛乳头细胞以1
×
103cells/well的浓度在96孔板(96-well plates)的各孔处理100ul后培养24小时。当细胞附着于底面时，分别使用直至500ppm的不同浓度的乳香分散水溶液及作为阳性对照组的米诺地尔处理96小时。之后，在10ul的cck-8试剂和100ul的人毛乳头细胞培养基的条件下培养4小时后，在540nm的波长下使用分光光度计测量吸光度。
32.其结果如图2所示，乳香水溶液在500ppm的浓度下表现出人毛乳头细胞的增殖，这是与作为阳性对照组的米诺地尔相似的高水平。
33.实施例3：在人毛乳头细胞中测量乳香水溶液的毛发生长因子活性
34.在本实施例中，测量了上述实施例1中制备的乳香水溶液的毛发生长因子活性。
35.使用人毛乳头细胞以1
×
105cells/well的浓度在96孔板(96-well plates)的各孔处理1ml后培养24小时。当细胞附着于底面时，分别使用不显出细胞毒性的100ppm、500ppm浓度的乳香分散水溶液及作为阳性对照组的米诺地尔处理人毛乳头细胞48小时后分离总核糖核酸(total rna)。更具体地，利用superscriptii reverse transcriptase(invitrogen公司)和oligo(dt)通过3μg的总nra(total rna)合成互补脱氧核糖核酸(cdna)。利用合成的互补dna及与有关碱性磷酸酶的引物通过sybr green method方法进行实时聚合酶链式反应(pcr)(real-time pcr)。sybr green i是通过与双链dna结合来显出荧光的试剂(interchelator)。interchelator与通过聚合酶链式反应合成的双链dna结合来发出荧光，可以通过检测该荧光的强度来测量扩增产物的生成量。
36.利用实时聚合酶链式反应确认了已知为促进毛发生长的生长因子的wnt5a及血管内皮生长因子的表达量。在此情况下，数据基于各不同条件下的三次独立的实验结果以平均值 /-标准偏差来表示。各因子的引物序列如下表1所示。
37.表1
38.wnt5a-正向(forward)atgaacctgcacaacaacgawnt5a-反向(reverse)cttctccttcagggcatcac血管内皮生长因子-正向atccaatcgagaccctggtg血管内皮生长因子-反向tggtgatgttggactcctca
39.其结果如图3所示，确认到当使用乳香水溶液处理人毛乳头细胞时，wnt5a及血管内皮生长因子(vegf)的表达随浓度的提高而提高。已知作为阳性对照组的米诺地尔增进血管内皮生长因子的表达，通过结果可以确认，当使用本发明的乳香水溶液处理时，在人毛乳头细胞中显出比米诺地尔高出很多的表达。
40.实施例4：在人毛乳头细胞中测量乳香水溶液的脱发基因表达量
41.在本实施例中，测量了上述实施例1中制备的乳香水溶液的脱发基因的表达量。
42.以与上述实施例3相同的方法使用乳香树至水溶液处理人毛乳头细胞或者不处理后，利用聚合酶链式反应确认已知为脱发基因的ii型5α-还原酶的表达量。在此情况下，数据基于各不同条件下的三次独立的实验结果以平均值 /-标准偏差表示。ii型5α-还原酶的引物序列如下表2所示。
43.表2
[0044][0045]
其结果如图4所示，可以确认当使用500ppm的乳香水溶液处理人毛乳头细胞时，5α-还原酶的表达被显著抑制。尤其可以确认，当与用作脱发治疗剂的阳性对照组的米诺地尔相比时，其抑制能力也非常高。
[0046]
剂型例1：制备包含乳香水溶液的洗发水
[0047]
制备了包含本发明的乳香水溶液的洗发水，其组成如下表3所示。
[0048]
表3
[0049]
原料名称重量(％)乳香水溶液5.0聚季铵盐-100.1丙二醇2.0二甲苯磺酸钠2.0透明质酸钠2.0乙二醇二硬脂酸酯3.0椰油酰胺a1.0月桂酰胺a1.0水杨酸0.15香料适量纯化水剩余量
[0050]
剂型例2：制备包含乳香水溶液的生发水
[0051]
制备了包含本发明的乳香水溶液的生发水，其组成如下述表4所示。
[0052]
表4
[0053]
原料名称重量(％)乳香水溶液5.0聚季铵盐-100.1丙二醇1.5丁二醇2.0乙二胺四乙酸二钠0.21,2-己二醇0.5柠檬酸0.1甘油3.0水杨酸0.15香料适量纯化水剩余量