锦灯笼的UPLC特征图谱构建方法及质量控制方法与流程

锦灯笼的uplc特征图谱构建方法及质量控制方法
技术领域
1.本发明属于中药检测技术领域，具体涉及锦灯笼的uplc特征图谱构建方法及质量控制方法。


背景技术：

2.锦灯笼为茄科植物酸浆(physalis alkekengi l.var.franchetii(mast.)makino)的干燥宿存萼或带果实的宿存萼，始载于《神农本草经》。锦灯笼性味甘、酸、寒，具有清凉、消肿、止咳、化痰、利尿、强心及解热之功效，是常用的清热解毒中药。
3.对于中药材而言，由于复杂的自然环境、社会状况、人文因素等多种原因，造成了中药材在应用方面的复杂性，比如同一名称的中药材可能来自不同基源的植物，同一基源的中药材因产地、采收季节、生长年限等的不同，使得其化学组成有可能不同，这必然会影响中药的质量和临床疗效。因此，建立准确有效的鉴别中药材的方法—中药特征图谱，是当前解决上述问题的主要技术手段之一。
4.现有技术公开了一种针对不同产地锦灯笼果实化学成分的指纹图谱构建方法，该方法采用agilent tc-18(4.6mm
×
1.5mm,5μm)色谱柱，以0.2％磷酸水(a)-乙腈(b)为流动相梯度洗脱，柱温25℃，检测波长220nm，流速1.0ml
·
min-1
，获得不同产地的锦灯笼果实hplc色谱图，最终得到对照图谱，见图105。虽然该现有技术提供的指纹图谱建立了11个共有峰，但这些色谱峰主要集中在前20分钟，其中峰1-峰5的出峰时间接近溶剂峰，峰8-峰11面积过小，且所有峰对称性不好，分离度差，仅指认了木樨草苷、酸浆苦味素a，在实际操作中存在色谱峰定位困难，积分偏差较大的缺陷，另外该指纹图谱以相似度进行结果评价，意义不大。更重要的是，该现有技术的研究对象是锦灯笼果实(不含宿萼)，并非《中国药典》中锦灯笼药材，其所建立的指纹图谱最多只能作为锦灯笼果实的质量评价，而不能用于锦灯笼的质量评价。
5.目前中国药典对锦灯笼的定性鉴别只采用了薄层色谱的方法，很难对锦灯笼的质量进行整体评价，因此需要建立一种全新的检测锦灯笼质量的方法，以能够更加可信、准确地对锦灯笼进行质量控制。


技术实现要素：

6.鉴于此，本发明的目的在于建立一种能够快速、准确地鉴别和检测锦灯笼的方法，从而提供一种锦灯笼的uplc特征图谱构建方法及质量控制方法。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一方面，本发明提供了一种锦灯笼的uplc特征图谱构建方法，包括以下步骤：
9.(1)取锦灯笼制备供试品溶液；
10.(2)取供试品溶液采用超超高校液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.2％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0
→
7分钟
→
15分钟
→
30分钟
→
32分钟
→
40分钟，流动相中乙腈的体积百分比为15％
→
17％
→
25％
→
28％
→
38％
→
42％。
11.可选地，步骤(1)中包括采用溶剂对锦灯笼依次进行水提、乙酸乙酯萃取、甲醇提取的步骤，所述锦灯笼为锦灯笼药材、锦灯笼饮片、锦灯笼标准汤剂冻干粉或锦灯笼配方颗粒。
12.可选地，步骤(1)满足如下a-e中的任意一项或多项：
13.a、当所述锦灯笼为锦灯笼药材或锦灯笼饮片时，所述水提为回流提取；或者当所述锦灯笼为锦灯笼标准汤剂冻干粉或锦灯笼配方颗粒时，所述水提为加水溶解；
14.b、所述锦灯笼的质量与水的体积比为1:25，比例关系为g/ml；
15.c、采用乙酸乙酯萃取水提液至少2次，每次至少10ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣采用甲醇提取；
16.d、采用体积百分含量为30％以上的甲醇水溶液或纯甲醇对乙酸乙酯萃取物进行提取；
17.e、甲醇提取的方式为超声提取，优选地，超声处理的功率250w，频率40khz，时间为30min。
18.可选地，步骤(2)中超超高校液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为220nm，流速为0.3ml/min，柱温为25℃，进样量为3μl，理论板数按木犀草苷计算应不低于5000。
19.可选地，所述的构建方法还包括采用木犀草苷作为对照品制备对照品溶液的步骤，以及将步骤(2)中的供试品溶液替换为对照品溶液，得到对照品特征图谱的步骤。
20.可选地，所述的构建方法还包括采用锦灯笼作为对照药材制备对照药材参照物溶液的步骤，以及将步骤(2)中的供试品溶液替换为对照药材参照物溶液，得到对照药材特征图谱的步骤。
21.由本发明所述的构建方法构建得到的锦灯笼uplc特征图谱。
22.一种锦灯笼的uplc对照特征图谱，选自如下(1)-(4)中的任意一项：
23.(1)其具有11个共有特征峰，以木犀草苷峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的
±
10％范围之内，规定值为：2.23(峰2)、2.75(峰3)、3.52(峰4)、3.69(峰5)、4.07(峰6)、4.26(峰7)、4.46(峰8)、4.61(峰9)、5.45(峰10)、6.32(峰11)；
24.(2)其具有11个共有特征峰，以木犀草苷峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的
±
10％范围之内，规定值为：2.23(峰2)、2.75(峰3)、3.52(峰4)、3.69(峰5)、4.07(峰6)、4.26(峰7)、4.46(峰8)、4.61(峰9)、5.45(峰10)、6.32(峰11)；且峰4与参比峰的相对峰面积不低于0.16；
25.(3)使用单批次或者多批次锦灯笼按照权利要求1-4中任一所述的构建方法得到的特征图谱；
26.(4)使用多批次锦灯笼按照权利要求1-4中任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
27.另一方面，本发明还提供了一种锦灯笼的鉴别方法，包括将待测产品的特征图谱与锦灯笼对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测产品的特征图谱为使用待测产品按照本发明所述的构建方法得到，所述锦灯笼对照特征图谱为本发明所述的锦灯笼uplc对照特征图谱。
28.本发明还提供了一种锦灯笼的质量控制方法，包括将待测锦灯笼产品的特征图谱
与锦灯笼对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测锦灯笼产品的特征图谱为使用待测产品按照本发明所述的构建方法得到，所述锦灯笼对照特征图谱为本发明所述的锦灯笼uplc对照特征图谱。
29.本发明中，峰1表示1号峰，峰2表示2号峰，以此类推。参比峰即s峰。
30.本发明中，所述待测产品可以是锦灯笼产品，也可以是除锦灯笼之外的其他产品。若待测产品的特征图谱与锦灯笼对照特征图谱相一致，则为锦灯笼；若待测产品的特征图谱与锦灯笼对照特征图谱不一致，则不是锦灯笼。
31.本发明中，所述待测锦灯笼产品可以是药材、饮片或者制剂，例如选自锦灯笼药材、锦灯笼饮片、锦灯笼标准汤剂冻干粉、锦灯笼配方颗粒中的至少一种。若待测锦灯笼产品的特征图谱与锦灯笼对照特征图谱不能匹配，即峰4与s峰的相对峰面积低于0.16，则可认为质量不合格。
32.本发明中，至少采用2批次的锦灯笼得到对照特征谱图，例如采用3批次的锦灯笼配方颗粒、15批锦灯笼标准汤剂冻干粉、15批锦灯笼药材、15批锦灯笼饮片。
33.锦灯笼中主要含有甾体类、黄酮类、苯丙素类、生物碱类及多糖类化合物，其中甾体类、黄酮类为其主要成分，具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用。甾体类化合物是近十年来在锦灯笼植物中发现最多的一类化学成分,主要包括酸浆苦味素类、新酸浆苦味素类和甾醇类化合物。通过结合特征图谱峰指认信息，峰1为木犀草苷，峰3为木犀草素，二者皆为黄酮类化合物，具有抗糖尿病、抗炎和抗肿瘤活性；峰4为酸浆苦味素a，峰6为酸浆苦味素l，锦灯笼中的酸浆苦味素类化合物居多，且为其特征性化学成分，具有抗糖尿病、抗炎和抗肿瘤活性。故分析峰1、峰3、峰4和峰6的相对峰面积数据，峰1为木犀草苷，同时作为《中国药典》项下锦灯笼的含量测定指标，较为适合作为s峰计算其余各特征峰的相对峰面积进行控制；峰3、峰6与参照峰的相对峰面积多批次范围较宽，且无明显变化规律，若以多批次相对峰面积的实测上显现或均值
±
30％来制定范围，又会显得相对峰面积比过低，使得体现在最终成品标准中的意义不大；而峰4与参照峰的相对峰面积多批次范围适中，能过稳定传递，故以多批次、相对峰面积的实测最小值-30％来制定范围，即规定范围为不低于0.16。
34.锦灯笼药材经简单净制后制备为锦灯笼饮片，炮制过程对特征峰数量及峰面积基本无影响，故锦灯笼饮片相对峰面积值参照药材执行。锦灯笼饮片经提取、浓缩、干燥制备为锦灯笼配方颗粒，其基本属性与锦灯笼标准汤剂基本一致，故锦灯笼配方颗粒相对峰面积值参照标准汤剂冻干粉执行，即规定峰4与s峰的相对峰面积不低于0.16。
35.与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：
36.1.本发明提供的锦灯笼uplc特征图谱构建方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.2％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序包括0
→
7分钟
→
15分钟
→
30分钟
→
32分钟
→
40分钟，流动相中乙腈的体积百分比为15％
→
17％
→
25％
→
28％
→
38％
→
42％，由此得到的锦灯笼特征图谱中色谱峰保留时间分布均匀，峰对称性好，分离度符合要求，基线平稳，噪音干扰小。同时，本发明指认了木犀草苷、木犀草素、酸浆苦味素a、酸浆苦味素l、4,7二脱氢新酸浆苦素b等5个共有峰，各峰响应较好，规定各特征峰的相对保留时间，特征峰容易定位，并结合多批次研究结果，规定峰4(酸浆苦味素a)的相对峰面积以进行质量控制。本发明有效解决了现有技术判定锦灯笼质量时存在不准确的缺陷，且本发明的构建方法重现良好，准确可靠。
37.2.本发明提供的锦灯笼uplc特征图谱构建方法，以带果实的锦灯笼宿萼为研究对象，符合《中国药典》收载药材的要求，因此所建立的特征图谱可用于解决《中国药典》锦灯笼药材、锦灯笼饮片、锦灯笼标准汤剂冻干粉、锦灯笼配方颗粒或锦灯笼相关制剂的质量评价。
附图说明
38.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
39.图1为本发明实施例1中梯度1条件下的色谱图；图2为本发明实施例1中梯度2条件下的色谱图；图3为本发明实施例1中梯度3条件下的色谱图；图4为本发明实施例1中梯度4条件下的色谱图；图5为本发明实施例1中梯度5条件下的色谱图；图6为本发明实施例1中梯度6条件下的色谱图；图7为本发明实施例1中梯度7条件下的色谱图；图8为本发明实施例1中采用agilent 1290ⅱ仪器的色谱图；图9为本发明实施例1中采用thermo fisher仪器的色谱图；图10为本发明实施例1中采用水提取的色谱图；图11为本发明实施例1中采用30％甲醇提取的色谱图；图12为本发明实施例1中采用50％甲醇提取的色谱图；图13为本发明实施例1中采用70％甲醇提取的色谱图；图14为本发明实施例1中采用纯甲醇提取的色谱图；图15为本发明实施例1中采用50％乙醇提取的色谱图；图16为本发明实施例1中采用乙酸乙酯萃取2次的色谱图；图17为本发明实施例1中采用正丁醇萃取2次的色谱图；图18为本发明实施例1中采用三氯甲烷萃取2次的色谱图；图19为本发明实施例1中采用乙醚萃取2次的色谱图；图20为本发明实施例1中采用乙酸乙酯萃取3次的色谱图；图21为本发明实施例1中称样量0.2g的色谱图；图22为本发明实施例1中称样量0.4g的色谱图；图23为本发明实施例1中称样量0.6g的色谱图；图24为本发明实施例1中称样量0.8g的色谱图；图25为本发明实施例1中进样量3μl的色谱图；图26为本发明实施例1中进样量5μl的色谱图；图27为本发明实施例1中进样量7μl的色谱图；图28为本发明实施例1中锦灯笼配方颗粒的特征图谱；图29为本发明实施例1中对照品定位色谱图1；图30为本发明实施例1中对照品定位色谱图2；图31为本发明实施例1中木犀草苷对照品色谱图；图32为本发明实施例1中木犀草苷对照品紫外吸收光谱图；图33为本发明实施例1的样品中木犀草苷紫外吸收光谱图；图34为本发明实施例1中木犀草素对照品色谱图；图35为本发明实施例1中木犀草素对照品紫外吸收光谱图；图36为本发明实施例1的样品中木犀草素紫外吸收光谱图；图37为本发明实施例1中酸浆苦味素a对照品色谱图；图38为本发明实施例1中酸浆苦味素a对照品紫外吸收光谱图；图39为本发明实施例1的样品中酸浆苦味素a紫外吸收光谱图；图40为本发明实施例1中酸浆苦味素l对照品色谱图；图41为本发明实施例1中酸浆苦味素l对照品紫外吸收光谱图；图42为本发明实施例1的样品中酸浆苦味素l紫外吸收光谱图；图43为本发明实施例1中4,7二脱氢新酸浆苦素b对照品紫外吸收光谱图；图44为本发明实施例1的样品中4,7二脱氢新酸浆苦素b紫外吸收光谱图；图45为本发明实施例1中锦灯笼配方颗粒供试品的特征图谱；图46为本发明实施例1中仪器精密度共有模式图(自上至下为精密度1-6)；图47为本发明实施例1中重复性共有模式图(自上至下为重复性1-6)；图48为本发明实施例1中不同人员中间精密度共
有模式图(自上至下为人员甲、乙、丙)；图49为本发明实施例1中采用cortecs uplc t3色谱柱01213131419407批号的色谱图；图50为本发明实施例1中采用cortecs uplc t3色谱柱01183110315331批号的色谱图；图51为本发明实施例1中采用cortecs uplc t3色谱柱01213130815310批号的色谱图；图52为本发明实施例1中阴性空白供试品特征图谱；图53为本发明实施例1中锦灯笼配方颗粒供试品特征图谱；图54为本发明实施例1中稳定性共有模式图；图55为本发明实施例1中在流速0.28ml/min条件下的色谱图；图56为本发明实施例1中在流速0.3ml/min条件下的色谱图；图57为本发明实施例1中在流速0.32ml/min条件下的色谱图；图58为本发明实施例1中在柱温23℃条件下的色谱图；图59为本发明实施例1中在柱温25℃条件下的色谱图；图60为本发明实施例1中在柱温28℃条件下的色谱图；图61为本发明实施例2中3批次锦灯笼配方颗粒特征图谱的共有模式图；图62为本发明实施例2中锦灯笼配方颗粒的对照特征图谱；图63为本发明实施例3中木犀草苷对照品色谱图；图64为本发明实施例3中锦灯笼冻干粉供试品色谱图；图65为本发明实施例3中仪器精密度共有模式图(自上至下为精密度1-6)；图66为本发明实施例3中重复性共有模式图(自上至下为重复性1-6)；图67为本发明实施例3中不同人员中间精密度共有模式图(自上至下为人员甲、乙、丙)；图68为本发明实施例3中采用cortecs uplc t3色谱柱01213131419407批号的色谱图；图69为本发明实施例3中采用cortecs uplc t3色谱柱01183110315331批号的色谱图；图70为本发明实施例3中采用cortecs uplc t3色谱柱01213130815310批号的色谱图；图71为本发明实施例3中阴性空白供试品特征图谱；图72为本发明实施例3中锦灯笼冻干粉供试品特征图谱；图73为本发明实施例3中稳定性共有模式图；图74为本发明实施例3中在流速0.28ml/min条件下的色谱图；图75为本发明实施例3中在流速0.3ml/min条件下的色谱图；图76为本发明实施例3中在流速0.32ml/min条件下的色谱图；图77为本发明实施例3中在柱温23℃条件下的色谱图；图78为本发明实施例3中在柱温25℃条件下的色谱图；图79为本发明实施例3中在柱温28℃条件下的色谱图；图80为本发明实施例4中15批次锦灯笼冻干粉特征图谱的共有模式图；图81为本发明实施例4中锦灯笼冻干粉的对照特征图谱；图82为本发明实施例5中木犀草苷对照品色谱图；图83为本发明实施例5中锦灯笼药材供试品色谱图；图84为本发明实施例5中仪器精密度共有模式图(自上至下为精密度1-6)；图85为本发明实施例5中重复性共有模式图(自上至下为重复性1-6)；图86为本发明实施例5中不同人员中间精密度共有模式图(自上至下为人员甲、乙、丙)；图87为本发明实施例5中采用cortecs uplc t3色谱柱01213131419407批号的色谱图；图88为本发明实施例3中采用cortecs uplc t3色谱柱01183110315331批号的色谱图；图89为本发明实施例5中采用cortecs uplc t3色谱柱01213130815310批号的色谱图；图90为本发明实施例5中阴性空白供试品特征图谱；图91为本发明实施例5中锦灯笼药材供试品特征图谱；图92为本发明实施例5中稳定性共有模式图；图93为本发明实施例5中在流速0.28ml/min条件下的色谱图；图94为本发明实施例5中在流速0.3ml/min条件下的色谱图；图95为本发明实施例5中在流速0.32ml/min条件下的色谱图；图96为本发明实施例5中在柱温23℃条件下的色谱图；图97为本发明实施例5中在柱温25℃条件下的色谱图；图98为本发明实施例5中在柱温28℃条件下的色谱图；图99为本发明实施例6中15批次锦灯笼药材特征图谱的共有模式图；图100为本发明实施例6中锦灯笼药材的对照特征图谱；图101为本发明实施例7中木犀草苷对照品色谱图；图102为本发明实施例7中锦灯笼饮片供试品色谱图；图103为本发明实施例8中15批次锦灯笼饮片特征图
谱的共有模式图；图104为本发明实施例8中锦灯笼饮片的对照特征图谱；图105为现有技术中锦灯笼果实的对照指纹图谱。
具体实施方式
40.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
41.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
42.实施例1：锦灯笼配方颗粒uplc特征图谱的构建方法
43.1.1仪器
44.超高校液相色谱仪1：thermo fisher vanquish uplc色谱系统，包括四元溶剂管理器(pμmp)、自动进样器(autosampler)、原装进口色谱柱温箱(colμmn compartment)、二极管阵列紫外检测器(detector)、chromeleon色谱管理系统；
45.超高校液相色谱仪2：agilent 1290infinity ii，包括g7104a型四元泵、132位自动进样器、g7116b型柱温箱、二极管阵列检测器；
46.mettler toledo(瑞士梅特勒)me36s、xs204、xs205、xse205(十万分之一)；
47.sk5200h上海科导超声仪器有限公司
48.色谱柱：waters cortecs uplc t3 2.1
×
100nm 1.6μm
49.agilent sb rrhd c18 2.1
×
100nm 1.8μm
50.waters acquity beh shield rp18 2.1
×
100nm 1.7μm
51.waters cortecs uplc t3 2.1
×
150nm 1.7μm
52.试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水；磷酸、甲醇等其他试剂均为分析纯。
53.1.2试剂试药
54.木犀草苷对照品(批号：111720-202111，购于中国食品药品检定研究院)
55.木犀草素对照品(批号：111520-202006，购于中国食品药品检定研究院)
56.酸浆苦味素a对照品(批号：cfs202002，购于chemfaces)
57.酸浆苦味素l对照品(批号：111831-201001，购于中国食品药品检定研究院)
58.4,7二脱氢新酸浆苦素b对照品(批号：cfs202102，购于chemfaces)
59.1.3色谱条件优化
60.参照物溶液的制备取锦灯笼对照药材约1g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流40分钟，取出，滤过，滤液蒸干，放冷，残渣加70％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。另取木犀草苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
61.供试品溶液的制备取锦灯笼配方颗粒约0.2g，加70％甲醇20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，滤过，作为供试品溶液。
62.色谱条件：乙腈为流动相a，以0.2％磷酸溶液为流动相b。
63.1.3.1梯度优化
64.首先对色谱柱进行筛选，以及对梯度进行优化考察，具体如表1-8及图1-7所示。
65.表1色谱条件
[0066][0067]
表2梯度1
[0068][0069]
表3梯度2
[0070][0071][0072]
表4梯度3
[0073][0074]
表5梯度4
uplc和agilent 1290ⅱ)上进样，考察不同仪器耐用性，结果如图8-9所示，结果表明不同仪器耐用性较好。
[0086]
通过上述考察，暂定色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.2％磷酸溶液为流动相b，按表9中的规定进行梯度洗脱；波长为220nm；柱温为25℃；流速为每分钟0.3ml；理论板数按木犀草苷计算应不低于5000。
[0087]
表9洗脱梯度
[0088][0089]
1.4供试品处理方法考察
[0090]
1.4.1提取溶剂种类考察
[0091]
通过上述优化后的梯度，各特征峰分离较好，但发现色谱峰响应较小，且基线不平稳，故继续对供试品不同提取溶剂进行考察，以期能够在保留主要特征峰的情况下增大响应，减缓基线波动。
[0092]
考察了水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇、50％乙醇对标准汤剂冻干粉的提取效果。结果如表10-15和图10-15所示。结果表明，乙醇提取色谱图基线波动较大，不同比例甲醇提取溶剂现出的色谱峰分离效果和系统适应性参数相对较好，但特征峰响应值并没有呈现提升趋势，且基线波动较大的情况并未改善，暂定提取溶剂为70％甲醇。
[0093]
表10水提取系统适应性参数
[0094][0095]
表1130％甲醇提取系统适应性参数
[0096]
[0097][0098]
表12 50％甲醇提取系统适应性参数
[0099][0100]
表1370％甲醇提取系统适应性参数
[0101][0102]
表14纯甲醇提取系统适应性参数
[0103][0104]
表15 50％乙醇提取系统适应性参数
[0105][0106][0107]
1.4.2萃取溶剂种类及次数考察
[0108]
由上可知，通过采用不同种类及比例的提取溶剂，各特征峰基本一致，分离较好，但特征峰响应仍较低，基线不平整问题未得到解决。下一步考察不同极性的有机溶剂萃取后对特征峰响应的影响，结果见表16-21及图16-20。结果表明，当萃取溶剂为正丁醇时，基线不平的情况依然存在，当萃取溶剂为三氯甲烷、乙醚时，虽然基线平稳，但峰面积整体过小，且峰的数量有所减少；当萃取溶剂为乙酸乙酯时，基线平稳的同时，目标峰的数量增加1个，各特征峰峰面积合适，故暂定萃取溶剂为乙酸乙酯，并对萃取2次和3次进行考察，结果显示对特征峰并未产生明显影响。因此，确定萃取溶剂为乙酸乙酯，次数为2次。
[0109]
表16萃取溶剂考察供试品处理方法
[0110][0111]
表17乙酸乙酯萃取2次系统适应性参数
[0112][0113]
表18正丁醇萃取2次系统适应性参数
[0114][0115]
表19三氯甲烷萃取2次系统适应性参数
[0116][0117]
表20乙醚萃取2次系统适应性参数
[0118][0119]
表21乙酸乙酯萃取3次系统适应性参数
[0120][0121]
1.4.3称样量考察
[0122]
基线问题得到解决后，继续对称样量进行考察，分别考察0.2g、0.4g、0.6g、0.8g的称样量对色谱峰的影响，结果如表22-25和图21-24所示。由结果可知，随着称样量的增加，目标峰的峰面积呈整体增加的趋势，因此综合基线、峰形和分离度，最后确定样品称样量为0.4g。
[0123]
表22称样量0.2g系统适应性参数
[0124][0125][0126]
表23称样量0.4g系统适应性参数
[0127][0128]
表24称样量0.6g系统适应性参数
[0129][0130]
表25称样量0.8g系统适应性参数
[0131][0132][0133]
1.4.4进样体积考察
[0134]
按照上述确定的方法，考察不同进样量3μl、5μl、7μl对色谱峰的影响，结果如表26-28和图25-27所示。由此可知，当进样体积为5μl、7μl时，峰1均出现裂峰现象，峰1为木犀草苷，在整个图谱中的响应最高，所用的色谱柱为粒径1.6μm色谱柱，粒径较小，故推测裂峰
是因为样品量过载导致的，因此暂定进样量为3μl。
[0135]
表26进样量3μl系统适应性参数
[0136][0137]
表27进样量5μl系统适应性参数
[0138][0139]
表28进样量7μl系统适应性参数
[0140][0141]
综上，暂定供试品处理方法：取本品适量，研细，取约0.4g，加水10ml使溶解，用乙酸乙酯萃取两次，每次10ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加70％甲醇10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，滤过，作为供试品溶液。
[0142]
1.5特征图谱中特征峰的进一步指认
[0143]
通过上述确定的特征图谱方法，结合多批次测定结果，对特征峰重新进行选定，对特征峰指认进行了深入研究，通过lc/ms/ms进行分子结构分析，并采用对照品定位和光谱研究，确认峰1为木犀草苷，峰3为木犀草素，峰4为酸浆苦味素a，峰6为酸浆苦味素l，峰10为4,7二脱氢新酸浆苦素b。因峰2、峰7、峰8、峰9暂未采购到对照品，故暂不在本发明中进行规定。lc/ms/ms分析结构见表29和图28-44。
[0144]
表29锦灯笼配方颗粒lc/ms/ms分析检测结果
[0145][0146]
1.6色谱条件的确定
[0147]
通过对色谱条件的优化，暂定uplc特征图谱色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.2％磷酸溶液为流动相b，按表30中的规定进行梯度洗脱；检测波长为220nm；流速为每分钟0.3ml，柱温25℃。理论板数按木犀草苷计算应不低于5000。结果如图45和表31所示。
[0148]
表30
[0149][0150]
表31供试品系统适应性参数
[0151]
[0152]
1.7方法学验证
[0153]
1.7.1精密度
[0154]
取锦灯笼配方颗粒0.4g，精密称定，按1.4.4中供试品处理方法制备供试品，连续进样6次，记录色谱图，见图46，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果见表32-33。
[0155]
表32仪器精密度相对保留时间试验结果
[0156][0157][0158]
表33仪器精密度相对峰面积试验结果
[0159][0160]
结果表明：11个特征峰的相对保留时间rsd％小于2％、相对峰面积rsd％小于3％。综合判断，方法的精密度良好，符合特征图谱的要求。
[0161]
1.7.2方法重复性试验
[0162]
取同一批锦灯笼配方颗粒0.4g，平行称取6份，精密称定，按1.4.4中供试品处理方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果见表34-35和图47。
[0163]
表34方法重复性相对保留时间试验结果(n＝6)
[0164][0165][0166]
表35方法重复性相对峰面积试验结果(n＝6)
[0167][0168]
结果表明：11个特征峰的相对保留时间rsd％小于2％，相对峰面积rsd％均小于2％，综合判断，该方法的重复性较好，符合要求。
[0169]
1.7.3中间精密度(不同操作人员)
[0170]
取同一批锦灯笼配方颗粒，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，按供试品制备方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果如表36-37及图48。
[0171]
表36中间精密度相对保留时间试验结果(不同操作人员)
[0172][0173]
表37中间精密度相对峰面积试验结果(不同操作人员)
[0174][0175][0176]
结果表明：11个特征峰的相对保留时间rsd％小于2％，相对峰面积rsd％小于3％。综合判断，方法的中间精密度(不同人员)好，符合特征图谱的要求。
[0177]
1.7.4中间精密度(不同色谱柱批号)
[0178]
通过色谱条件优化及色谱柱选择结果可知，该色谱条件重现需固定cortecs uplc t3，100*2.1mm；1.6μm色谱柱，因此，取同一供试品溶液，分别用不同生产批次(批号012131419407；批号01183110315331；批号01213130815310)色谱柱进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果如表38-39及图49-51。
[0179]
表38中间精密度相对保留时间试验结果(不同批次色谱柱)
[0180][0181]
表39中间精密度相对峰面积试验结果(不同批次色谱柱)
[0182][0183]
结果表明：11个特征峰的相对保留时间rsd％小于2％，相对峰面积rsd％,小于3.5％。综合判断，方法的中间精密度(不同批次色谱柱)较好，符合特征图谱的要求。
[0184]
1.7.5专属性
[0185]
按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并考察锦灯笼配方颗粒阴性样品是否会造成干扰。按前述的色谱条件进行hplc分析，记录色谱图，如图52-53所示。结果表明，阴性无干扰，方法专属性好。
[0186]
1.7.6耐用性
[0187]
1.7.6.1稳定性考察
[0188]
取同一份供试品溶液，配制后在第0、4、8、12、16、24小时进样。记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，以考察供试品溶液的稳定性。结果如表40-41和图52。
[0189]
表40稳定性相对保留时间试验结果
[0190][0191][0192]
表41稳定性相对峰面积试验结果
[0193][0194]
结果表明：11个特征峰的相对保留时间小于2％，相对峰面积rsd％小于3％。说明供试品溶液在24小时内稳定。
[0195]
1.7.6.2不同流速的考察
[0196]
取同一供试品溶液，分别在不同流速0.28ml/min、0.30ml/min和0.32ml/min下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果如表42-43和图55-57。
[0197]
表42不同流速相对保留时间结果
[0198][0199]
表43不同流速相对峰面积结果
[0200][0201][0202]
结果表明，11个特征峰的相对保留时间rsd％为0％～5％，11个特征峰的相对峰面积rsd％在0％～8％之间，由图可知，不同流速对特征峰的分离度有一定影响，为保证特征图谱的分离重现，选定0.30ml/min作为锦灯笼配方颗粒特征图谱测定方法的流速。
[0203]
1.7.6.3不同柱温的考察
[0204]
取同一供试品溶液分别在23℃﹑25℃和28℃下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果如表44-45和图58-60。
[0205]
表44不同柱温测定相对保留时间结果
[0206][0207]
表45不同柱温相对峰面积结果
[0208][0209]
结果表明，11个特征峰的相对保留时间rsd％小于5％，7个特征峰的相对峰面积rsd％在0％～25％之间，由图可知，不同柱温条件下对特征峰的分离度有一定影响，为保证特征图谱的分离重现，故建议固定柱温为25℃。
[0210]
由上述方法学考察结果可知，建立的锦灯笼配方颗粒特征图谱的11个共有峰中，各色谱峰受不同色谱柱、不同柱温和不同流速均有一定程度上的影响，其余色谱条件影响变化不大。相对保留时间值处在
±
10％范围内，为适应其耐用性，建议将规定值范围控制在
±
10％以内。
[0211]
实施例2：锦灯笼配方颗粒uplc对照特征图谱的构建方法
[0212]
取3批锦灯笼配方颗粒(批号:1902001y、1902002y、1902003y；生产厂家：华润三九医药股份有限公司)按拟定的上述锦灯笼配方颗粒特征图谱测定方法操作，结果如表46-47和图61。测定结果表明3批锦灯笼配方颗粒特征图谱各个特征峰规定的相对保留时间均在规定值的
±
10％范围之内，相对峰面积符合要求。
[0213]
参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，对所得图谱进行拟合。并对如图61所示的3批锦灯笼配方颗粒的共有峰信息进行分析，选择分离度好、色谱峰较纯的共有峰作为锦灯笼配方颗粒特征图谱共有峰，建立锦灯笼配方颗粒uplc对照特征图谱，见图62。
[0214]
表46 3批锦灯笼配方颗粒相对保留时间
[0215][0216]
表47 3批锦灯笼配方颗粒相对峰面积
[0217][0218]
相对保留时间规定值：根据3批锦灯笼配方颗粒特征图谱测定结果确定供试品色谱中应呈现11个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的11个特征峰相对应，其中峰1的保留时间应与相应的对照品参照峰的保留时间相对应；与木犀草苷参照峰相应的峰为s峰，计算特征峰2-11与s峰的相对保留时间应在规定值的
±
10％之内，规定值为：2.23(峰2)、2.75(峰3)、3.52(峰4)、3.69(峰5)、4.07(峰6)、4.26(峰7)、4.46(峰8)、4.61(峰9)、5.45(峰10)、6.32(峰11)。
[0219]
相对峰面积规定值：从结果来看，3批试生产配方颗粒相对峰面积均在实施例4提供的多批次标准汤剂范围，传递性良好，但峰3、峰6与参照峰的相对峰面积多批次范围较宽，且无明显变化规律，若以多批次标准汤剂相对峰面积的实测上显现或均值
±
30％来制定范围，又会显得相对峰面积比过低，使得体现在最终成品标准中的意义不大；而峰4与参照峰的相对峰面积多批次范围适中，故以多批次标准汤剂相对峰面积的实测下限-30％来制定范围，即规定范围为不低于0.16。锦灯笼饮片经提取、浓缩、干燥制备为锦灯笼配方颗粒，其基本属性与锦灯笼标准汤剂基本一致，故锦灯笼配方颗粒相对峰面积值参照实施例4中标准汤剂冻干粉执行。即规定峰4与s峰的相对峰面积不低于0.16。
[0220]
实施例3：锦灯笼标准汤剂冻干粉的uplc特征图谱构建方法
[0221]
1.色谱条件与系统适用性试验
[0222]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.2％磷酸溶液为流动相b，按表48中的规定进行梯度洗脱；波长为220nm；柱温为25℃；流速为每分钟0.3ml；理论板数按木犀草苷计算应不低于5000。
[0223]
表48
[0224][0225]
参照物溶液的制备取锦灯笼对照药材约1g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流40分钟，取出，滤过，用乙酸乙酯萃取两次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，放冷，残渣精密加入70％甲醇10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。另取木犀草苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
[0226]
供试品溶液的制备取本品约0.4g，加水10ml使溶解，用乙酸乙酯萃取两次，每次10ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加70％甲醇10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，滤过，作为供试品溶液。
[0227]
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各3μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，见图63-64和表49。
[0228]
表49系统适应性参数
[0229][0230]
2.方法学验证
[0231]
2.1精密度
[0232]
取锦灯笼冻干粉0.4g，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，连续进样6次，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果见表50-51和图65。
[0233]
表50仪器精密度相对保留时间试验结果
[0234][0235]
表51仪器精密度相对峰面积试验结果
[0236][0237][0238]
结果表明：11个特征峰的相对保留时间rsd％小于2％、相对峰面积rsd％小于2％。综合判断，方法的精密度良好，符合特征图谱的要求。
[0239]
2.2方法重复性试验
[0240]
取同一批锦灯笼冻干粉0.4g，平行称取6份，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果见表52-53和图66。
[0241]
表52方法重复性相对保留时间试验结果(n＝6)
[0242][0243]
表53方法重复性相对峰面积试验结果(n＝6)
[0244][0245]
结果表明：11个特征峰的相对保留时间rsd％小于2％，相对峰面积rsd％均小于3％，综合判断，该方法的重复性较好，符合要求。
[0246]
2.3中间精密度(不同操作人员)
[0247]
取同一批锦灯笼冻干粉，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，按供试品制备方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果如表54-55和图67。
[0248]
表54中间精密度相对保留时间试验结果(不同操作人员)
[0249][0250]
表55中间精密度相对峰面积试验结果(不同操作人员)
[0251][0252]
结果表明：11个特征峰的相对保留时间rsd％小于2％，相对峰面积rsd％小于3％。综合判断，方法的中间精密度(不同人员)好，符合特征图谱的要求。
[0253]
2.4中间精密度(不同色谱柱批号)
[0254]
通过色谱条件优化及色谱柱选择结果可知，该色谱条件重现需固定cortecs uplc t3，100*2.1mm；1.6μm色谱柱，因此，取同一供试品溶液，分别用不同生产批次(批号012131419407；批号01183110315331；批号01213130815310)色谱柱进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果如表56-57和图68-70。
[0255]
表56中间精密度相对保留时间试验结果(不同批次色谱柱)
[0256][0257]
表57中间精密度相对峰面积试验结果(不同批次色谱柱)
[0258]
[0259][0260]
结果表明：11个特征峰的相对保留时间rsd％小于2％，相对峰面积rsd％,小于4％。综合判断，方法的中间精密度(不同批次色谱柱)较好，符合特征图谱的要求。
[0261]
2.5专属性
[0262]
按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并考察锦灯笼冻干粉阴性样品是否会造成干扰。按【特征图谱】项下所述的色谱条件进行hplc分析，记录色谱图，见图71-72。结果表明，阴性无干扰，方法专属性好。
[0263]
2.6耐用性
[0264]
2.6.1稳定性考察
[0265]
取同一份供试品溶液，配制后在第0、4、8、12、16、24小时进样。记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，以考察供试品溶液的稳定性。结果如表58-59和图73。
[0266]
表58稳定性相对保留时间试验结果
[0267][0268]
表59稳定性相对峰面积试验结果
[0269][0270][0271]
结果表明：11个特征峰的相对保留时间小于2％，相对峰面积rsd％小于4％。说明供试品溶液在24小时内稳定。
[0272]
2.6.2不同流速的考察
[0273]
取同一供试品溶液，分别在不同流速0.28ml/min、0.30ml/min和0.32ml/min下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果如表60-61和图74-76。
[0274]
表60不同流速相对保留时间结果
[0275][0276]
表61不同流速相对峰面积结果
[0277][0278]
结果表明，11个特征峰的相对保留时间rsd％为0％～5％，11个特征峰的相对峰面
积rsd％在0％～23％之间，由图可知，不同流速对特征峰的分离度有一定影响，为保证特征图谱的分离重现，选定0.30ml/min作为锦灯笼冻干粉特征图谱测定方法的流速。
[0279]
2.6.3不同柱温的考察
[0280]
取同一供试品溶液分别在23℃﹑25℃和28℃下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果如表62-63和图77-79。
[0281]
表62不同柱温测定相对保留时间结果
[0282][0283]
表63不同柱温相对峰面积结果
[0284][0285]
结果表明，11个特征峰的相对保留时间rsd％小于7％，7个特征峰的相对峰面积rsd％在0％～60％之间，由图可知，不同柱温条件下对特征峰的分离度有一定影响，为保证特征图谱的分离重现，故建议固定柱温为25℃。
[0286]
由上述方法学考察结果可知，建立的锦灯笼冻干粉特征图谱的11个共有峰中，各色谱峰受不同色谱柱、不同柱温和不同流速均有一定程度上的影响，其余色谱条件影响变化不大。为适应其耐用性，建议将规定值范围控制在
±
10％以内。
[0287]
实施例4：锦灯笼标准汤剂冻干粉的uplc对照特征图谱的构建方法
[0288]
取15批锦灯笼标准汤剂冻干粉(批号:1808001y、1808002y、1808003y、1808004y、1808005y、1808006y、1808007y、1808008y、1808009y、1808010y、1808011y、1808012y、1808013y、1808014y、1808015y；自行研制)，按实施例3提供的锦灯笼冻干粉特征图谱测定方法操作，结果如表64-65和图80。测定结果表明15批锦灯笼冻干粉特征图谱各个特征峰的相对保留时间均在锦灯笼冻干粉对照图谱规定值的
±
10％范围之内。
[0289]
参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，对所得图谱进行拟合，并对如图80所示的15批锦灯笼冻干粉的共有峰信息进行分析，选择分离度好，色谱峰较纯的共有峰作为锦
灯笼配方颗粒特征图谱共有峰，建立锦灯笼配方颗粒uplc对照特征图谱，见图81。
[0290]
表6415批锦灯笼标准汤剂冻干粉相对保留时间
[0291][0292][0293]
表6515批锦灯笼标准汤剂冻干粉相对峰面积
[0294][0295][0296]
相对保留时间规定值：根据15批锦灯笼标准汤剂冻干粉特征图谱测定结果确定：供试品色谱中应呈现11个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的11个特征峰相对应，其中峰1的保留时间应与相应的对照品参照峰的保留时间相对应；与木犀草苷参照峰相应的峰为s峰，计算特征峰2～11与s峰的相对保留时间应在规定值的
±
10％之内，规定值为：2.23(峰2)、2.75(峰3)、3.52(峰4)、3.69(峰5)、4.07(峰6)、4.26(峰7)、4.46(峰8)、4.61(峰9)、5.45(峰10)、6.32(峰11)。
[0297]
相对峰面积比规定值：锦灯笼中主要含有甾体类、黄酮类、苯丙素类、生物碱类及多糖类化合物等，其中甾体类、黄酮类为其主要成分，具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用。甾体类化合物是近十年来在锦灯笼植物中发现最多的一类化学成分,主要包括酸浆苦味素类、新酸浆苦味素类和甾醇类化合物；黄酮类化合物也是锦灯笼中发现比较多的成分之一。通过结合特征图谱峰指认信息，峰1为木犀草苷，峰3为木犀草素，二者皆为黄酮类化合物，具有抗糖尿病、抗炎和抗肿瘤活性；峰4为酸浆苦味素a，峰6为酸浆苦味素l，锦灯
笼中的酸浆苦味素类化合物居多，且为其特征性化学成分，具有抗糖尿病、抗炎和抗肿瘤活性。故分析峰1、峰3、峰4和峰6的相对峰面积数据，峰1为木犀草苷，同时作为含量测定指标，较为适合作为s峰计算其余各特征峰的相对峰面积，进行控制。分析峰3的相对峰面积范围0.07-1.21，峰4的相对峰面积范围0.23-1.18，峰6的相对峰面积范围0.04-0.58，峰3、峰6与参照峰的相对峰面积多批次范围较宽，且无明显变化规律，若以多批次标准汤剂相对峰面积的实测上显现或均值
±
30％来制定范围，又会显得相对峰面积比过低，使得体现在最终成品标准中的意义不大；而峰4与参照峰的相对峰面积多批次范围适中，能过稳定传递，故以多批次药材相对峰面积的实测最小值-30％来制定范围，即规定范围为：不低于0.16。
[0298]
为明确整个研究过程中量值传递情况，参照实施例1-4提供的uplc特征图谱测定方法，需要重新对原料进行分析方法验证及多批次检验，具体如下。验证结果表明该方法操作简便、结果准确，方法重现性较好。
[0299]
实施例5：锦灯笼药材uplc特征图谱构建方法
[0300]
1.色谱条件与系统适用性试验
[0301]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.2％磷酸溶液为流动相b，按表66中的规定进行梯度洗脱；波长为220nm；柱温为25℃；流速为每分钟0.3ml；理论板数按木犀草苷计算应不低于5000。
[0302]
表66
[0303][0304]
参照物溶液的制备取锦灯笼对照药材约1g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流40分钟，取出，滤过，用乙酸乙酯萃取两次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，放冷，残渣精密加入70％甲醇10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。另取木犀草苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
[0305]
供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流40分钟，取出，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取两次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，放冷，残渣精密加入70％甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0306]
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各3μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，见图82-83和表67。
[0307]
表67系统适应性参数
[0308][0309][0310]
2.方法学验证
[0311]
2.1精密度
[0312]
取锦灯笼药材1.0g，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，连续进样6次，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果见表68-69和图84。
[0313]
表68仪器精密度相对保留时间试验结果
[0314][0315]
表69仪器精密度相对峰面积试验结果
[0316][0317]
结果表明：11个特征峰的相对保留时间rsd％小于2％、相对峰面积rsd％小于2％。综合判断，方法的精密度良好，符合特征图谱的要求。
[0318]
2.2方法重复性试验
[0319]
取同一批锦灯笼药材1.0g，，平行称取6份，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果见表70-71和图85。
[0320]
表70方法重复性相对保留时间试验结果(n＝6)
[0321][0322][0323]
表71方法重复性相对峰面积试验结果(n＝6)
t3，100*2.1mm；1.6μm色谱柱，因此，取同一供试品溶液，分别用不同生产批次(批号01213131419407；批号01183110315331；批号01213130815310)色谱柱进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果如表74-75和图87-89。
[0335]
表74中间精密度相对保留时间试验结果(不同批次色谱柱)
[0336][0337]
表75中间精密度相对峰面积试验结果(不同批次色谱柱)
[0338][0339]
结果表明：11个特征峰的相对保留时间rsd％小于2％，相对峰面积rsd％,小于12％。综合判断，方法的中间精密度(不同批次色谱柱)较好，符合特征图谱的要求。
[0340]
2.5专属性
[0341]
按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并考察锦灯笼药材阴性样品是否会造成干扰。按前述色谱条件进行hplc分析，记录色谱图，见图90-91。结果表明，阴性无干扰，方法专属性好。
[0342]
2.6耐用性
[0343]
2.6.1稳定性考察
[0344]
取同一份供试品溶液，配制后在第0、4、8、12、16、24小时进样。记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，以考察供试品溶液的稳定性。结果如表76-77和图92。
[0345]
表76稳定性相对保留时间试验结果
[0346][0347]
表77稳定性相对峰面积试验结果
[0348][0349]
结果表明：11个特征峰的相对保留时间小于2％，相对峰面积rsd％小于20％。说明供试品溶液在24小时内稳定。
[0350]
2.6.2不同流速的考察
[0351]
取同一供试品溶液，分别在不同流速0.28ml/min、0.30ml/min和0.32ml/min下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果如表78-79和图93-95。
[0352]
表78不同流速相对保留时间结果
[0353]
[0354][0355]
表79不同流速相对峰面积结果
[0356][0357]
结果表明，11个特征峰的相对保留时间rsd％为0％～3.1％，11个特征峰的相对峰面积rsd％在0％～14.2％之间，由图可知，不同流速对特征峰的分离度有一定影响，为保证特征图谱的分离重现，选定0.30ml/min作为锦灯笼药材特征图谱测定方法的流速。
[0358]
2.6.3不同柱温的考察
[0359]
取同一供试品溶液分别在23℃﹑25℃和28℃下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd％，结果如表80-81和图96-98。
[0360]
表80不同柱温测定相对保留时间结果
[0361][0362]
表81不同柱温相对峰面积结果
[0363][0364]
结果表明，11个特征峰的相对保留时间rsd％小于2％，11个特征峰的相对峰面积
rsd％在0％～26％之间，由图可知，不同柱温条件下对特征峰的分离度有一定影响，为保证特征图谱的分离重现，故建议固定柱温为25℃。
[0365]
由上述方法学考察结果可知，建立的锦灯笼药材特征图谱的11个共有峰中，各色谱峰受不同色谱柱、不同柱温和不同流速均有一定程度上的影响，其余色谱条件影响变化不大。相对保留时间值处在
±
10％范围内，为适应其耐用性，建议将规定值范围控制在
±
10％以内。
[0366]
实施例6：锦灯笼药材uplc对照特征图谱的构建方法
[0367]
取15批锦灯笼药材(批号:1806001、1806002、1806003、1806004、1806005、1806006、1806007、1806008、1806009、1806012、1806016、1806017、1806018、1806019、1806020)按实施例5提供的锦灯笼药材特征图谱测定方法操作，结果见表82-83和图99。测定结果表明15批锦灯笼药材特征图谱各个特征峰规定的相对保留时间均在锦灯笼药材对照图谱规定值的
±
10％范围之内。
[0368]
参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，对所得图谱进行拟合，并对如图99所示的15批锦灯笼药材的共有峰信息进行分析，选择分离度好，色谱峰较纯的共有峰作为锦灯笼药材特征图谱共有峰，建立锦灯笼药材uplc对照特征图谱，见图100。
[0369]
表82批锦灯笼药材相对保留时间
[0370][0371]
表83批锦灯笼药材相对峰面积
[0372]
[0373][0374]
相对保留时间规定值：根据15批锦灯笼标药材特征图谱测定结果确定：供试品色谱中应呈现11个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的11个特征峰相对应，其中峰1的保留时间应与相应的对照品参照峰的保留时间相对应；与木犀草苷参照峰相应的峰为s峰，计算特征峰2-11与s峰的相对保留时间应在规定值的
±
10％之内，规定值为：2.23(峰2)、2.75(峰3)、3.52(峰4)、3.69(峰5)、4.07(峰6)、4.26(峰7)、4.46(峰8)、4.61(峰9)、5.45(峰10)、6.32(峰11)。
[0375]
相对峰面积比规定值：锦灯笼中主要含有甾体类、黄酮类、苯丙素类、生物碱类及多糖类化合物等，其中甾体类、黄酮类为其主要成分，具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用。甾体类化合物是近十年来在锦灯笼植物中发现最多的一类化学成分,主要包括酸浆苦味素类、新酸浆苦味素类和甾醇类化合物；黄酮类化合物也是锦灯笼中发现比较多的成分之一。通过结合特征图谱峰指认信息，峰1为木犀草苷，峰3为木犀草素，二者皆为黄酮类化合物，具有抗糖尿病、抗炎和抗肿瘤活性；峰4为酸浆苦味素a，峰6为酸浆苦味素l，锦灯笼中的酸浆苦味素类化合物居多，且为其特征性化学成分，具有抗糖尿病、抗炎和抗肿瘤活性。故分析峰1、峰3、峰4和峰6的相对峰面积数据，峰1为木犀草苷，同时作为含量测定指标，
较为适合作为s峰计算其余各特征峰的相对峰面积，进行控制。分析峰3的相对峰面积范围0.07-1.15，峰4的相对峰面积范围0.24-1.13，峰6的相对峰面积范围0.04-0.58，峰3、峰6与参照峰的相对峰面积多批次范围较宽，且无明显变化规律，若以多批次标准汤剂相对峰面积的实测上显现或均值
±
30％来制定范围，又会显得相对峰面积比过低，使得体现在最终成品标准中的意义不大；而峰4与参照峰的相对峰面积多批次范围适中，能过稳定传递，故以多批次药材相对峰面积的实测最小值-30％来制定范围，即规定范围为：不低于0.16。
[0376]
实施例7：锦灯笼饮片uplc特征图谱的构建方法
[0377]
1.色谱条件与系统适用性试验
[0378]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.2％磷酸溶液为流动相b，按表84中的规定进行梯度洗脱；波长为220nm；柱温为25℃；流速为每分钟0.3ml；理论板数按木犀草苷计算应不低于5000。
[0379]
表84
[0380][0381]
参照物溶液的制备取锦灯笼对照药材约1g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流40分钟，取出，滤过，用乙酸乙酯萃取两次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，放冷，残渣精密加入70％甲醇10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。另取木犀草苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
[0382]
供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流40分钟，取出，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取两次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，放冷，残渣精密加入70％甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0383]
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各3μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，见图101-102。
[0384]
表85系统适应性参数
[0385][0386]
实施例8：锦灯笼饮片uplc对照特征图谱的构建方法
[0387]
取15批锦灯笼饮片(批号:1808001y、1808002y、1808003y、1808004y、1808005y、1808006y、1808007y、1808008y、1808009y、1808010y、1808011y、1808012y、1808013y、1808014y、1808015y；锦灯笼药材为原产地自行收集，锦灯笼饮片为自行炮制)，按实施例7提供的锦灯笼饮片特征图谱测定方法操作，结果见表86-87和图103。测定结果表明15批锦灯笼饮片特征图谱各个特征峰规定的相对保留时间均在锦灯笼饮片对照图谱规定值的
±
10％范围之内。
[0388]
参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，对所得图谱进行拟合，并对如图103所示的15批锦灯笼饮片的共有峰信息进行分析，选择分离度好，色谱峰较纯的共有峰作为锦灯笼饮片特征图谱共有峰，建立锦灯笼饮片uplc对照特征图谱，见图104。
[0389]
表8615批锦灯笼饮片特征图谱测定相对保留时间结果
[0390][0391][0392]
表8715批锦灯笼饮片特征图谱测定相对峰面积结果
[0393][0394][0395]
相对保留时间规定值：根据15批锦灯笼饮片特征图谱测定结果确定：供试品色谱中应呈现11个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的11个特征峰相对应，其中峰1的保留时间应与相应的对照品参照峰的保留时间相对应；与木犀草苷参照峰相应的峰为s峰，计算特征峰2-11与s峰的相对保留时间应在规定值的
±
10％之内，规定值为：2.23(峰2)、2.75(峰3)、3.52(峰4)、3.69(峰5)、4.07(峰6)、4.26(峰7)、4.46(峰8)、4.61(峰9)、5.45(峰10)、6.32(峰11)。
[0396]
相对峰面积规定值：锦灯笼药材经简单净制后制备为锦灯笼饮片，炮制过程对特征峰数量及峰面积基本无影响，故锦灯笼饮片相对峰面积值参照药材执行。即规定峰4与s峰的相对峰面积不低于0.16。
[0397]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。