DNaseⅠELISA检测试剂盒及其使用方法与流程

dnase
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elisa检测试剂盒及其使用方法
技术领域
1.本发明涉及g01n33/68领域，具体为dnase
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elisa检测试剂盒及其使用方法。


背景技术：

2.dnase
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是一种可以消化单链或双链dna产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。在mrna疫苗、mrna预防以及治疗药物中，需要添加dnase
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，在药物申报中需要对工艺中添加物进行残留检测，以保证产品的质量。免疫分析法(elisa)是检测dnase
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残留的首选方法。
3.常规的elisa实验操作需要提前一天进行板子包被，以及其他检验试剂的配制，时间周期长，且提前准备工作复杂，工作量大；且elisa检测实验受环境、人员操作影响较大，常规操作，整个物料准备、检测过程复杂，且出错率高，常常会因为样品数量大而出现样品与样品之间混淆，出现加样时孔与孔之间重复或者跳孔等错误操作。
4.基于目前市场无相关dnase
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残留检测试剂盒，本发明目的在于提供一种 dnase
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elisa检测试剂盒，该试剂盒包含已包被好的板子，配置好的试剂，可改善现有实验检测操作中存在的复杂操作，出错率高等不足，解决前期准备工作繁琐的技术问题，便于实验的顺利开展，得到更可靠、准确的数据。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供了一种dnase
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elisa检测试剂盒，至少包括包被酶标板、检测抗体、酶结合物、标准品、样品稀释液、抗体稀释液、酶结合物稀释液、20
×
pbst洗液、显色液、终止液、封板膜、说明书。
6.作为一种优选的技术方案，所述包被酶标板的制备方法，至少包括以下步骤：
7.a包被：使用包被缓冲液cb将包被抗体稀释，进行注孔，之后置于3-5℃下包被过夜；
8.b洗板：弃去各孔内液体，将20xpbst洗液稀释制备1
×
pbst洗涤液后，注满微孔，静置25-35秒后弃去孔内液体；重复2-3次，最后一次洗板完成后在面巾纸上拍干；
9.c封闭：每孔中加入bsa-pbs溶液，恒温静置1-2h；
10.d洗板：弃去各孔内液体，用1
×
pbst洗涤液注满微孔，静置25-35秒后弃去孔内液体；重复1-2次，最后一次洗板完成后在面巾纸上拍干；
11.e保护：每孔中加入蔗糖溶液进行室温温育，之后弃去各孔内液体，在面巾纸上拍干后置于干燥环境进行干燥即得。
12.作为一种优选的技术方案，所述步骤a中缓冲液cb的配制方法为：将 na2co3、nahco3加入纯水中，调节ph至9-10，之后采用滤膜过滤后保存。
13.作为一种优选的技术方案，所述步骤a中包被抗体选自prj-di001-1ab、 prj-di001-2ab、prj-di001-3ab、prj-di001-4ab、prj-di001-6ab、prj-di001-8ab、 prj-di001-11ab，优选的，所述包被抗体为prj-di001-8ab，型号为nbp2-90240，浓度为1mg/ml。
14.作为一种优选的技术方案，所述步骤b中20xpbst洗液的制备方法为：将 nacl、na2hpo4.12h2o、kcl、kh2po4加入容器中，用纯水定容，控制溶液ph 为7.4～7.6，之后加入表面活性剂搅拌混匀并采用滤膜过滤即得，所述20
×
pbst 洗液来源于北京索莱宝科技有限公司。
15.本发明另一方面提供了dnase
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elisa检测试剂盒的使用方法，至少包括以下步骤：
16.(1)进行试剂配制；
17.(2)根据实验孔数量，确定所需的板条数目，剩余板条放回含干燥剂的铝箔袋，密封。
18.(3)将标准品工作液、样品工作液、阴性对照按照加入至相应孔中，采用封板膜封板后置于恒温震荡培养箱中，在200-300rpm的条件下温育50-60分钟；
19.(4)弃去各孔内液体，用1
×
pbst洗涤液注入微孔，静置20-40秒后弃去孔内液体，重复2-4次，每一次洗板完成后在滤纸上拍干；
20.(5)每孔加入检测抗体工作液，用封板膜封板后置于恒温震荡培养箱中在 200-300rpm的条件下温育50-60分钟；
21.(6)弃去各孔内液体，用1
×
pbst洗涤液入微孔，静置20-40秒后弃去孔内液体，重复2-4次，每一次洗板完成后在面巾纸上拍干；
22.(7)每孔中加入酶结合物工作液，用封板膜封板后置于恒温震荡培养箱中在 200-300rpm的条件下温育50-60分钟；
23.(8)弃去各孔内液体，用1
×
pbst洗涤液注入微孔，静置20-40秒后弃去孔内液体，重复2-4次，每一次洗板完成后在面巾纸上拍干；
24.(9)每孔中加入显色液，轻微振荡混匀后用封板膜封板置于20-30℃条件下显色8-12分钟；
25.(10)每孔中加入终止液，轻微混匀，采用酶标仪测定各孔吸光值；
26.(11)采用四参数的拟合方式进行线性拟合及计算，判定检测结果。
27.作为一种优选的技术方案，所述步骤(1)中试剂配制至少包括以下步骤：
28.s1、将所需试剂移到18-25℃室温环境下平衡20-40分钟；
29.s2、配制1
×
pbst洗涤液，按照20
×
pbst洗液与去离子水质量比为1:20 进行稀释制备；配制检测抗体工作液，按照检测抗体与抗体稀释液质量比为 1：(80-120)进行稀释制备；配制酶结合物工作液，按照酶结合物与酶结合物稀释液质量比为1：(80-120)进行稀释制备；
30.s3、标准品及样品采用样品稀释液进行稀释得到标准品工作液及样品工作液。
31.所述步骤s3中标准品稀释方式参见表1。
32.表1
[0033][0034][0035]
作为一种优选的技术方案，所述样品稀释液至少包含有质量分数为3％的 bsa，所述样品稀释液来源于江苏谱新生物医药有限公司。
[0036]
所述1
×
pbs为20
×
pbs与纯水按照1:20稀释制备得到。
[0037]
作为一种优选的技术方案，所述抗体稀释液、酶结合物稀释液至少包括 15-25wt％的动物血清，所述抗体稀释液、酶结合物稀释液均来源于江苏谱新生物医药有限公司。
[0038]
作为一种优选的技术方案，所述终止液至少包含0.1-1wt％的干酪素钠；所述终止液来源于北京索莱宝科技有限公司。
[0039]
作为一种优选的技术方案，所述步骤(11)中检测结果的判定至少包括以下步骤：
[0040]
a、进行标准曲线od处理，计算平均值；
[0041]
b、以标准品理论浓度与对应od值进行四参数拟合，得到标准曲线和线性回归方程；
[0042]
c、将待测样品的od值代入线性回归方程计算出待测样品中dnase
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组分的含量。
[0043]
有益效果：
[0044]
1、本发明采用双抗夹心法检测样本中dnase
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含量，将dnase
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特异性单克隆抗体预包被在微孔板上，将标准品与待测样本加入到已包被的反应孔内进行孵育。存在的dnase
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会定量的与微孔板中的抗体结合，洗涤除去未结合物，加入抗dnase
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的单克隆抗体，最后加入h l二抗形成抗体-抗原-抗体-二抗复合物，通过tmb显色程度指示样品中蛋白含量。
[0045]
2、本发明提供的试剂盒不需要提前一天进行板子包被，以及其他检验试剂的配制操作步骤，试剂盒中有配置好的试剂，可直接用于实验，减少操作者的工作量，节约整个操作时间，只需要3小试即可完成检验；且若是用于连续性检测，可使检测结果更具比较性。
[0046]
3、本发明提供的试剂盒已完成方法学验证，检测快速，专一性强，性能可靠，试剂
盒的检测范围为1-64ng/ml，灵敏度为0.5ng/ml，精密度cv％《10％, re％《
±
15％。
附图说明
[0047]
图1为本发明性能测试中6次实验结果的四参数拟合曲线图，图中：由a-f 依次为第1-6次实验结果的四参数拟合曲线图。
具体实施方式
[0048]
实施例1
[0049]
本发明的实施例1一方面提供了dnase
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elisa检测试剂盒，包括包被酶标板、检测抗体、酶结合物、标准品、样品稀释液、抗体稀释液、酶结合物稀释液、20
×
pbst洗液、显色液、终止液、封板膜、说明书。
[0050]
所述包被酶标板的制备方法，包括以下步骤：
[0051]
a包被：使用包被缓冲液cb将包被抗体稀释至1μg/ml，按照100μl/孔进行注孔，之后置于4℃下包被过夜。
[0052]
b洗板：弃去各孔内液体，将20
×
pbst洗液稀释制备1
×
pbst洗涤液后，按照350μl/孔注满微孔，静置30秒后弃去孔内液体；重复2次，最后一次洗板完成后在面巾纸上拍干。
[0053]
c封闭：每孔中按照200μl/孔的加入量加入3wt％bsa-pbs，在37℃温箱放置1.5h。
[0054]
d洗板：弃去各孔内液体，用1
×
pbst洗涤液按照350μl/孔注满微孔，静置 30秒后弃去孔内液体；重复1次，最后一次洗板完成后在面巾纸上拍干。
[0055]
e保护：每孔中加入10wt％蔗糖溶液200μl/孔，室温温育1h；弃去各孔内液体，在面巾纸上拍干后置于干燥环境进行干燥即得。
[0056]
所述步骤a中缓冲液cb的配制方法为：将na2co3、nahco3加入2l纯水中，用naoh调ph至9.60即得。所述步骤a中包被抗体为nbp2-90240，浓度为1mg/ml。
[0057]
所述步骤b中20
×
pbst洗液的制备方法为：将nacl、na2hpo4.12h2o、kcl、 kh2po4加入容器中，用纯水定容至5l，控制溶液ph为7.5，之后加入tween-20 搅拌混匀并采用0.22μm滤膜过滤即得。所述20
×
pbst洗液来源于北京索莱宝科技有限公司。
[0058]
本发明的实施例1另一方面提供了dnase
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elisa检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0059]
(1)进行试剂配制；
[0060]
(2)根据实验孔数量，确定所需的板条数目，剩余板条放回含干燥剂的铝箔袋，密封。
[0061]
(3)将标准品工作液、样品工作液、阴性对照按照100μl/孔的加入量加入至相应孔中，采用封板膜封板后置于37℃恒温震荡培养箱中，在200-300rpm的条件下温育60分钟；
[0062]
(4)弃去各孔内液体，用1
×
pbst洗涤液按照300μl/孔注满微孔，静置30秒后弃去孔内液体，重复3次，每一次洗板完成后在滤纸上拍干；
[0063]
(5)每孔加检测抗体工作液100μl，用封板膜封板后置于37℃恒温震荡培养箱中在200-300rpm的条件下温育60分钟；
[0064]
(6)弃去各孔内液体，用1
×
pbst洗涤液按照300μl/孔注满微孔，静置30秒后弃去孔内液体，重复3次，每一次洗板完成后在面巾纸上拍干；
[0065]
(7)每孔中按照100μl/孔的加入量加入酶结合物工作液，用封板膜封板后置于 37℃恒温震荡培养箱中在200-300rpm的条件下温育60分钟；
[0066]
(8)弃去各孔内液体，用1
×
pbst洗涤液按照300μl/孔注满微孔，静置30秒后弃去孔内液体，重复3次，每一次洗板完成后在面巾纸上拍干；
[0067]
(9)每孔中按照100μl/孔的加入量加入显色液，轻微振荡混匀后用封板膜封板置于25℃条件下显色10分钟；
[0068]
(10)每孔中按照50μl/孔的加入量加入终止液，轻微混匀，采用酶标仪控制主波长450nm，参考波长630nm，测定各孔吸光值(od值)；
[0069]
(11)采用四参数的拟合方式进行线性拟合及计算，判定检测结果。
[0070]
所述步骤(1)中试剂配制包括以下步骤：
[0071]
s1、将所需试剂移到22℃室温环境下平衡30分钟；
[0072]
s2、配制1
×
pbst洗涤液，按照20
×
pbst洗液与去离子水质量比为1:20进行稀释制备；配制检测抗体工作液，按照检测抗体与抗体稀释液质量比为1:100 进行稀释制备；配制酶结合物工作液，按照酶结合物与酶结合物稀释液质量比为 1:100进行稀释制备；
[0073]
s3、标准品及样品采用样品稀释液进行稀释得到标准品工作液及样品工作液。
[0074]
所述步骤s3中标准品稀释方式参见表1。
[0075]
表1
[0076][0077]
所述样品稀释液来源于江苏谱新生物医药有限公司。
[0078]
所述1
×
pbs为20
×
pbs与纯水按照1:20稀释制备得到。
[0079]
所述抗体稀释液、酶结合物稀释液均来源于江苏谱新生物医药有限公司。
[0080]
所述终止液来源于北京索莱宝科技有限公司。
[0081]
所述步骤(11)中检测结果的判定包括以下步骤：
[0082]
a、进行标准曲线od处理，计算平均值；
[0083]
b、以标准品理论浓度与对应od值进行四参数拟合，得到标准曲线和线性回归方程；
[0084]
c、将待测样品的od值代入线性回归方程计算出待测样品中dnase
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组分的含量。
[0085]
所述检测抗体为santacruz牌sc-376207，产品浓度为200μg/ml。
[0086]
所述标准品为sino biological牌13801-h08h。
[0087]
所述显色液为biopanda牌tmb-s-002。
[0088]
性能测试
[0089]
根据《bioanalytical method validation guidance for industry》对dnase
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残留elisa检测试剂盒进行验证。
[0090]
1、原始数据
[0091]
此方法学验证由3名实验员在不同天完成了6次方法学验证，6次原始数据参见表a。
[0092]
表a：验证原始数据
[0093]
[0094][0095]
2、标准曲线
[0096]
对6次实验结果作四参数拟合曲线(参见附图1)，6次的拟合曲线的r2均大于0.99，结果参见表b。
[0097]
表b：标准曲线r2[0098]
no.实验一实验二实验三实验四实验五实验六
r20.999890.999820.999870.999810.999970.99987
[0099]
3、灵敏度(lod)
[0100]
通过计算灵敏度的cut off值和0.5ng/ml od平均值来判断每次实验的灵敏度，检测结果见表c。cut off值＝0ng/ml od平均值 3*sd，6次实验的cut off 值均小于0.5ng/ml od平均值，说明6次实验的lod都能够达到0.5ng/ml以下。
[0101]
表c：灵敏度检测
[0102][0103]
4、定量范围
[0104]
通过标准品的回收率确定试剂盒的定量范围，结果见表d。回收率(％)＝回算浓度/理论浓度*100％。6次实验的1-64ng/ml范围内标准品的回收率均介于 80-120％之间，试剂盒的定量范围确定为1-64ng/ml
[0105]
表d：定量范围确定
[0106][0107][0108]
5、精密度
[0109]
分别计算6次实验标准品(64、32、16、8、4、2、1ng/ml)和质控品(50、 5ng/ml)的批内和批间精密度，结果见表e、f、g。cv(％)＝sd/平均值*100％。 6次实验批内和批间实验精密度均小于10％。加入同一浓度(16ng/ml)的标准品对包被板进行精密度评价，结果见表h，包被板的cv(％)为9.57％。
[0110]
表e：标准品批内精密度
[0111][0112]
表f：质控品批内精密度
[0113][0114]
表g：质控品批间精密度
[0115][0116]
表h：包被板精密度
[0117][0118]
6、准确度
[0119]
通过质控品的回收率评价检测方法的准确度。分别计算6次实验2个质控品：50ng/ml(qc1)、5ng/ml(qc2)的回算浓度，回收率(％)＝回算浓度/理论浓度*100％，检测结果见表i，6批次质控品的平均准确度介于91.37％-110.18％之间。
[0120]
表i：准确度测试
[0121][0122]
7、加速稳定性
[0123]
将试剂盒各组分放置37℃恒温箱3天、6天，与2-8℃对比测试，结果见表j，37℃3天、6天后信号和灵敏度未下降，试剂盒的稳定性良好，遵循说明书保存各组分，可稳定保存12个月。
[0124]
表j：稳定性测试结果
[0125][0126]
8、结论
[0127]
本试剂盒的定量范围为1-64ng/ml,lod≤0.5ng/ml；经过6次验证，本试剂盒批内、批间和整板cv(％)均小于10％，精密度合格；6批次2个质控品的准确度介于91.37％-110.18％之间，在80-120％范围内，准确度合格，可用于检测样品中dnase i的残留量。