牛奶中总酪蛋白含量的中红外快速批量检测方法与流程

1.本发明属于奶牛性能测定和牛奶品质检测领域，具体涉及牛奶中总酪蛋白的中红外光谱快速批量检测方法。


背景技术：

2.牛奶一直被认为是自然界中天然形成的最完美的食物之一，乳中营养物质含量丰富且种类多样，尤其是牛奶中蛋白质，如酪蛋白、乳清蛋白等对人体健康有重要的影响，目前已成为国人最重要的营养来源之一。
3.酪蛋白是牛奶蛋白质中最主要的构成成分，占牛奶蛋白质含量的70％-80％，其中主要分为五种亚型，即αs1酪蛋白(αs1-cn)，αs2酪蛋白(αs2-cn)，β酪蛋白(β-cn)，γ酪蛋白(γ-cn)与κ酪蛋白(κ-cn)，但由于γ-cn是β-cn水解之后的产物，且含量非常低，一般只作为β-cn的降解程度参考，所以研究者们极少对γ-cn进行深入探讨，更多的是对其他四种酪蛋白进行的相关研究
1.，本发明中使用的总酪蛋白含量即为以上四种酪蛋白含量的总和。
4.酪蛋白与奶酪产量及品质密切相关。总酪蛋白的含量与酪蛋白胶束的多少紧密相关，直接影响奶酪的产量。对于酪蛋白胶束在结构和稳定性中起关键作用的奶酪和其他应用，决定加工性的不仅是酪蛋白含量，还有酪蛋白胶束的特性
2.。多项研究表明，牛奶中的酪蛋白含量对凝乳酶凝固时间(rct)没有影响，与凝固时间(k20)呈负相关，与硬度(a30)和奶酪产量(cy)呈正相关，同时蛋白质胶束的形式比水溶的形式更能抵抗蛋白质水解，胶束相和可溶相酪蛋白的比例对奶酪的制作有很大的影响
3.。
5.关于酪蛋白的测定方法目前暂无国家标准，但常见的方法有高效液相色谱法
[4-5]
、酶联免疫吸附测定法
[6]
等，但都存在成本高和效率低等问题，很难在生产实践中快速批量化使用。中红外光谱mir(mid-infrared spectroscopy)技术是一种非常经济高效的检测工具，通过中红外光对分子中特定化学键吸收所在的频率和对应的波峰的不同，来预测所研究物质和性状的性质或含量，从而可以得知生物的生理状态等信息。在畜牧行业中，通过mir来检测奶牛的营养、生理等指标在国内已经逐渐兴起，现已经可以对蛋白总量和脂肪总量等指标进行检测，但目前暂无精度很高的酪蛋白总量的快速批量检测模型。
[0006]
目前国外开始了基于中红外检测牛奶中物质成份的研究，但都存在精度不高，特征波段不够准确等问题
[7-8]
，国内还没有相关报道。与其它国家相比，中国奶牛因受到国内气候、地理环境和饲养条件等影响，与国外奶牛存在较大差异，牛奶品质也有其特点，国外检测模型并不一定适合于中国奶牛，故需要尽快建立具有我国自主产权的适合于中国奶牛牛奶的总酪蛋白含量检测方法，不仅可用于快速、高效、准确和无创测定奶牛泌乳性状中重要性能指标总酪蛋白含量，为奶牛遗传育种提供表型数据及理论依据，而且可检测分析原料牛奶及奶制品中总酪蛋白含量，为乳业加工业和消费者提供参考。本发明的目的即为解决目前存在的问题，建立总酪蛋白的快速检测技术，为中国奶业的发展提供技术保障。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于提供了牛奶中总酪蛋白含量的中红外快速批量检测方法，方法简单，快速，与真实值相比，准确率高。
[0008]
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0009]
牛奶中总酪蛋白含量的中红外快速批量检测方法，包括下述步骤：
[0010]
1、采集牛奶样本中的红外光谱中特征波段为：952.93cm-1-1666.66cm-1
、1705.24cm-1-1755.39cm-1
、1793.97cm-1-1805.54cm-1
、2735.32cm-1-2754.61cm-1
与3580.22cm-1-3661.24cm-1
中的mir数据；
[0011]
2、将测定所得到的mir数据代入sg(w＝21,p＝3) 标准化 岭回归(α＝0.2245)中，输出总酪蛋白含量的预测结果。
[0012]
与现有技术相比，本发明优点在于：
[0013]
1.在特征波段的选择方面，打破了常用的使用算法筛选特征，而是使用人工手动选择 多次遍历的方法。最终选取用于建模的特征波段，特别是筛选出了包含部分水的吸收区域，并证明了增加部分水吸收波段可以提升模型的准确性。
[0014]
2.选用了同一个牛奶样本测定两次的平均光谱mir进行建模，提升了单次光谱测定数据建模的模型精准性。
[0015]
3.选取了总酪蛋白模型建立的最优预处理与算法组合，确定了最优参数，提高了模型的准确性。
[0016]
4.实现了原料奶中总酪蛋白含量的快速、准确、低成本的检测，实现了快速批量检测，每一个样本的测定时间仅需10-15秒，提高了检测效率，具有较强的实用性，将可广泛应用于奶牛性能测定和牛奶质量品质检测。
附图说明
[0017]
图1为未经处理的牛奶样品中红外光谱图(a)与平均光谱图(b)。
[0018]
图2为sg预处理后的牛奶样品中红外光谱图。
[0019]
图3为选取的五个特征波段光谱总图(a)以及每个特征波段放大图(b)。
[0020]
图4为模型牛奶数据真实值与预测值相关性与拟合直线图。
具体实施方式
[0021]
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
[0022]
1.实验材料
[0023]
试验材料来源于我国四个地区9个奶牛场的277头中国荷斯坦牛，每头牛采集一份奶样，奶样采集利用自动挤奶装置完成，先用消毒后的毛巾擦拭牛奶房，然后用碘甘油混合溶液对乳房消毒，挤掉前三把乳汁后，对挤奶全过程奶样进行采集，每份奶样采集40ml，分装到直径3.5cm，高9cm的圆柱形全新采样瓶里，依次编号，并向每个采样瓶里立即加入溴硝丙二醇防腐剂，缓慢摇晃使其充分溶解，运回途中在奶样周围放置冰袋(2-4℃)防止变质，样本到达实验室后立即进行光谱采集。所有牛奶样品均采集了两次光谱数据。
[0024]
样本信息统计表
[0025][0026]
2.中红外光谱测定与采集
[0027]
将样品倒入直径3.5cm，高9cm的圆柱形样品管中，在42℃水浴锅中水浴15-20min，使用foss公司的milkoscan
tm
7rm乳成分检测仪，将固体光纤探头伸到液体中，对样品进行混匀后扫描。
[0028]
3.牛奶中总酪蛋白的真实(参考)值检测方法
[0029]
3.1仪器、设备和试剂
[0030]
电热恒温水浴锅(武汉一恒苏净科学仪器有限公司)；waters液相色谱仪，包括自动进样器、柱温箱、进样瓶、涡漩振荡器、针管过滤器、0.22μm尼龙滤膜、rp-hplc色谱柱：zorbax 300sb-c18(250mm
×
4.6mm，5μm，孔径：300a)。
[0031]
αs-酪蛋白(lot c-6780，纯度≥70％)、κ-酪蛋白(lot c-0406，纯度≥80％)、β-酪蛋白(lot c-6905，纯度≥90％)等牛奶蛋白标准品购自sigma公司；乙腈(色谱级，纯度
[0032]
≥99.8％)、盐酸胍和三氟乙酸(tfa)购自上海生工公司；其他试剂均为国产分析纯。
[0033]
3.2实验方法
[0034]
3.2.1中红外光谱的采集
[0035]
利用milkoscantm ft 进行光谱采集，具体采集步骤为：将奶样分批放入45℃电热恒温水浴锅内预热5min，预热好的奶样放在检测架上上下摇晃数次使牛奶胶状溶液混合均匀，将检测架放在检测履带上，打开瓶盖，依次进行检测，采集完光谱后的奶样置于-20℃冷冻保存，用于后续αs-酪蛋白、κ-酪蛋白和β-酪蛋白的含量测定。
[0036]
3.2.2总酪蛋白含量的高效液相色谱技术测定
[0037]
(1)标准样品的处理
[0038]
先用去离子水将混合标样充分溶解，直到αs-酪蛋白和κ-酪蛋白的浓度均在10g/l左右，然后往1600μl处理液(6mol/l 盐酸胍溶液)中加入400μl配好的混合标样溶液，充分混匀后于室温下孵育90min，上机前用0.22μm尼龙滤膜过滤。
[0039]
(2)奶样的处理
[0040]
取80μl牛奶加入到320μl处理液中，室温孵育90min，设置离心机转速为14000r/min，离心5min后取上清液。上机前用0.22μm尼龙滤膜过滤。
[0041]
(3)rp-hplc的色谱条件
[0042]
色谱柱：zorbax 300sb-c18；进样量：50μl；柱温：40℃；流速：1ml/min；洗脱时间：42min；检测波长：214nm；a相：纯水；b相；纯乙腈。
[0043]
流动相梯度洗脱条件和流速
[0044][0045]
最后立刻以初始梯度平衡色谱柱1min，预备下一个样品的检测，平均每批次检测样品20-30个。同一批次检测结束后会用10％甲醇 90％去离子水与100％甲醇清洗色谱柱进行维护，以保证下一批次样品的正常检测。
[0046]
4.有效样本的选择
[0047]
277个样本中，剔除掉样本变质、损耗、中红外光谱测定异常、样本参考值测定异常等操作导致的无效数据，共剔除掉了13个异常样本，选择了264个样本进行模型的建立与优化。
[0048]
实施例1：
[0049]
总酪蛋白的预测模型算法的选择：
[0050]
本技术目的为建立总酪蛋白的定量测定模型，所以使用建模算法为回归算法。回归算法种类很多，本实施例主要使用了岭回归(ridge)与偏最小二乘回归(plsr)
[9]
算法进行模型建立与对比，理由如下：
[0051]
岭回归是线性回归的一种。只是在算法建立回归方程时候，岭回归加入了正则化的限制，从而达到解决过拟合的效果。正则化有两种，分别为l1正则化l2正则化，l2正则化相比于l1正则化的优势在于：(1)可以进行交叉验证(2)实现了随机梯度下降。岭回归就是加入了l2正则化后的线性回归模型，保留了线性回归的优点，符合模型建立的要求，而且结果较为稳定，是较常使用的基础算法之一，因此本实施例选择了此算法为待选算法。
[0052]
偏最小二乘回归算法是多特征样本中非常有效的算法之一。中红外光谱数据中，每一个样本对应1060个波点，是多特征样本的代表。同时偏最小二乘回归算法很少出现过拟合情况，所以很多中红外光谱的研究者们会选择使用偏最小二乘回归算法进行模型的建立，因此本实施例选择了此算法为待选算法。
[0053]
实施例2：
[0054]
中红外光谱测定次数及其使用方式的筛选：
[0055]
本技术使用的所有样本均进行了连续两次的光谱采集，目的是通过比较同一样本不同测定次数和所得到三种mir数据(第一次、第二次、二次平均)对建模准确性的影响，筛选出最有效的mir数据进行建模。因有研究者认为两次测定的平均光谱mir可能提升建模准确性，所以本实施例将第一次、第二次、二次平均光谱mir全波段分别建模，比较分析模型的准确度，结果如下表：
[0056]
ridge算法比较结果:
[0057][0058]
plsr算法比较结果：
[0059][0060][0061]
经过两种算法比较结果综合考虑，最终选择两次平均光谱mir进行建模。
[0062]
实施例3：
[0063]
中红外光谱检测牛奶中总酪蛋白含量的方法的建立：
[0064]
1.建模数据集的划分
[0065][0066]
本实施例中的建模数据集划分中，80％为训练集，20％为测试集。训练集与测试集的比例为4：1，同时训练集又叫做交叉验证集，在训练模型的过程中进行10折交叉验证。
[0067]
2.建模mir数据预处理方法的筛选
[0068]
有效特征筛选是对光谱数据进行处理的基本操作，目的是为了消噪，并为提取特征打好基础。有效特征筛选主要有特征抽取、特征预处理与特征降维三种。本实施例主要对光谱数据进行二次特征预处理，首先，采用sg(卷积平滑)、msc(多元散射校正)、snv(标准正态变量变换)、diff1(一阶差分)和diff2(二阶差分)等五种处理方法对光谱数据进行第一次特征预处理，并在第一次预处理之后对样本数据集进行划分；然后，对划分后的数据集再进行第二次预处理，即分别进行标准化(standardization)或归一化(normalization)处理。
[0069]
3.建模特征波段的手动选择过程及确定
[0070]
选取特征波段的方法有很多，主要包括算法选取特征与手动选取特征两种，算法选取特征的原理主要来源于各波点与参考值之间的相关性，优点在于速度快、效率高，但缺点在于忽略了相邻波点之间的协同作用，思路较为单一。手动选取特征的优点在于选择的过程中可以强化波段(即相邻波点)的作用，同时可以在提升模型的过程中更多得保留光谱的原始信息状态，包容性与泛化能力更强，选取波段准确，缺点在于选择速度慢，效率低。
[0071]
本实施例选取特征波段采用手动选取的方法，选取步骤如下：
[0072]
(1)确定基本算法，由实施例2可知偏最小二乘回归算法的效果整体偏低，所以最终选择岭回归算法作为总酪蛋白预测算法。
[0073]
(2)确定最佳预处理组合。将样本中红外光谱全波段进行实施例3中的预处理并进行比较，由结果确定最佳预处理组合为：sg 标准化，结果如表所示：
[0074][0075][0076]
建模特征波段的手动选择过程如下：
[0077]
(1)去掉1593.35cm-1-1709.1cm-1
与3059.39cm-1-3641.95cm-1
两段与水吸收相关的光谱区域，根据预实验，发现，保留部分水吸收相关的光谱区域可提升模型的准确度，因此，在此步骤中，并未完全去掉水吸收相关的光谱区域。
[0078]
(2)去掉4000cm-1-5011.54cm-1
两段光谱区域，因为此区域为非中红外吸收区域。
[0079]
(3)将剩下的区域分为六段，小于1593.35cm-1
的区域为第一段，大于3641.95cm-1
为最后一段，1709.1cm-1
与3059.39cm-1
中间的波段平均分为四段。
[0080]
(4)以50个波点为一组，使用岭回归算法，首先将第一段波段临界处两端波点增加或减少一组波点，寻找最优效果，并以此为基础对第二段波段进行类似操作，最终将六个波
段全部完成一轮操作后算第一次遍历完成。
[0081]
(5)在第一次遍历完成后进行第二次、第三次或更多次的手动遍历，直到所有的波点不再变化为止，即为最优特征波段。
[0082]
最终经过五轮筛选，得到最优结果，如表所示：
[0083][0084]
最终选取的特征波段结果为：952.93cm-1-1666.66cm-1
、1705.24cm-1-1755.39cm-1
、1793.97cm-1-1805.54cm-1
、2735.32cm-1-2754.61cm-1
与3580.22cm-1-3661.24cm-1
，每一段前后允许有两个波点的差距。结果发现模型中添加部分第一段水吸收与部分第二段水吸收区域后，模型可以达到最优效果，说明酪蛋白的特征波段包含部分水吸收区域。
[0085]
4.模型参数的筛选确定
[0086]
模型参数包括预处理方法的参数以及算法的参数；
[0087]
预处理算法中sg卷积平滑预处理的参数选择结果对比如下：
[0088][0089]
根据对比结果，最终选择sg平滑点数为21。
[0090]
岭回归算法的最优参数α(l2正则化力度)确定为；0.2245
[0091]
经过对比分析，总酪蛋白的最佳回归模型为：sg(w＝21,p＝3) 标准化 岭回归(α＝0.2245)模型。训练集和测试集相关系数分别为0.8456和0.8661；训练集和测试集均方根误差分别为4.7953和5.0167。
[0092]
实施例4：
[0093]
牛奶中总酪蛋白的中红外光谱mir的快速批量检测方法的应用：
[0094]
利用建立的总酪蛋白最佳回归模型(sg(w＝21,p＝3) 标准化 岭回归(α＝0.2245))对随机选取的5个牛奶样本(非264份实验材料之一)进行预测，并将预测结果与真实值比较。
[0095]
模型使用方法：
[0096]
1.采集牛奶样本中的红外光谱中特征波段为：952.93cm-1-1666.66cm-1
、1705.24cm-1-1755.39cm-1
、1793.97cm-1-1805.54cm-1
、2735.32cm-1-2754.61cm-1
与3580.22cm-1-3661.24cm-1
中的mir数据；
[0097]
同时利用液相色谱法检测同批次牛奶中的总酪蛋白真实值。
[0098]
2、将测定所得到的mir数据代入实施例3构建的sg(w＝21,p＝3) 标准化 岭回归(α＝0.2245)模型中，即可输出总酪蛋白含量的预测结果。
[0099]
该模型预测的结果与真实结果非常接近(如下表)，故该模型的准确性较高，可用于牛奶的总酪蛋白含量预测。
[0100][0101]
参考文献
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