氧化还原酶作为圆柚醇脱氢酶在生物合成圆柚酮中的应用

cid，aba)，作者试图将两者用于催化圆柚醇至圆柚酮的反应中。结果也显示了这两种来源于植物的短链脱氢酶确实能够将圆柚醇转化为圆柚酮，且相较于来源于毕赤酵母的adh-c3效果稍好，圆柚酮的产量分别达到了59.78mg/l和53.48mg/l(meng,x.etal.metabolic engineering saccharomyces cerevisiae for de novo production of the sesquiterpenoid( )-nootkatone[j].microb cell fact,2020,19:21.)。
[0005]
但目前所报道的圆柚醇脱氢酶，其所能催化的圆柚醇浓度仍较低，圆柚酮的生物原位合成产量最高只达到207mg/l，不适宜未来工业化生产。因此，仍需要找到底物耐受性高，特异性转化能力强，转化效率高等性能更加优良的圆柚醇脱氢酶，以满足未来大规模工业生物合成的需求。
[0006]
ncbi收录了一种来源于解脂耶氏酵母yarrowia lipolytica clib122的氧化还原酶yladh_bm6，原名为yali0d05929p(ncbi登录号为xp_502463)，其氨基酸序列如seq id no.2所示，共包含248个氨基酸；其编码基因(ncbi登录号为xm_502463)的核苷酸序列如seq id no.1所示，共包含747个核苷酸。至今，未见有文献报道该醇脱氢酶任何实际的功能和应用。


技术实现要素：

[0007]
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的之一在于提供一种氧化还原酶作为圆柚醇脱氢酶在生物合成圆柚酮中的应用。
[0008]
本发明所要解决的技术问题是针对目前生物合成圆柚酮过程中现有醇脱氢酶所能耐受的底物浓度低，转化率低等导致圆柚酮生物合成产量低这一不适宜未来工业化生产的缺陷，而提供了一种新型的氧化还原酶。其在催化圆柚醇转化圆柚酮的过程中，表现出了底物耐受性高，特异性转化能力强且转化率高等优点；并通过对该酶进行氨基酸修饰，获得了催化性能进一步得以提高的氧化还原酶。
[0009]
本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0010]
本发明提供一种氧化还原酶在生物合成圆柚酮中的应用；同时也提供了一种经修饰的氧化还原酶，其作为圆柚醇脱氢酶，在生物合成圆柚酮的应用中具有更好的催化性能。
[0011]
本发明中，所述氧化还原酶来源于解脂耶氏酵母yarrowia lipolytica clib122的yladh_bm6，其编码基因描述为yali0d05929p，在ncbi的登录号为xp_502463，其氨基酸序列如seq id no.2所示，共包含248个氨基酸。
[0012]
本发明中，所述氧化还原酶yladh_bm6编码基因(ncbi登录号为xm_502463)的核苷酸序列如seq id no.1所示，共包含747个核苷酸。
[0013]
本发明还提供一种经修饰的氧化还原酶，其氨基酸序列如seq id no.3所示，其中，seq id no.3中至少一个标注为“x”的位置与seq id no.2的相应位置的氨基酸残基不同；该经修饰的氧化还原酶具有更高的转化效率和底物耐受性；
[0014]
优选的，所述经修饰的氧化还原酶的氨基酸序列与seq id no.2具有至少55％、至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
[0015]
本发明中，提供了一种含有上述氧化还原酶或经修饰的氧化还原酶编码基因的重组表达载体。
[0016]
本发明中，提供了一种包含本发明所述氧化还原酶或经修饰的氧化还原酶基因重组表达载体的重组表达转化体。
[0017]
本发明中，还涉及用于制备圆柚酮的方法。
[0018]
本发明所述的转化效率，表示为在一定时间内将前体物质圆柚醇转化为目标产物圆柚酮的比例。
[0019]
根据本发明，发现如seq id no.2所示的氧化还原酶，具有良好的对圆柚醇转化至圆柚酮效率，相较已发现的来源于毕赤酵母的adh-c3(ncbi登录号为xm_002492172)或者来源于巨大芽孢杆菌的bmd_2094(ncbi登录号为wp_013082965)这两种圆柚醇脱氢酶的效果明显更优，特别的在大约中性ph或在重组表达细胞中体外催化圆柚醇至圆柚酮的测定中更能体现这样的差异。结果显示在相同条件下，利用本发明所述的氧化还原酶得到的底物目标转化率更高，分别为毕赤酵母的adh-c3或者巨大芽孢杆菌的bmd_2094的近1倍和3倍之多。
[0020]
另外，本发明所提供的经修饰的氧化还原酶，在同等条件下其对圆柚醇转化效率可以是序列表seq id no.2所示的氧化还原酶的至少1.04倍，优选地2至10倍，特别地2至5倍。
[0021]
术语“修饰”或“突变”用来表示在该基因或氨基酸序列中至少一个核苷酸或氨基酸与野生型的序列不同，可以特别地是一个核苷酸或氨基酸分别被一个不同核苷酸或氨基酸替换、缺失、插入。可通过本领域常规方法，如易错pcr(error-prone pcr)、定点突变、诱变等技术手段，来实现对所述酶的修饰或突变。
[0022]
与序列表seq id no.2所示的氧化还原酶相比，本发明所提供的经修饰的氧化还原酶具有更好的对底物耐受性。
[0023]
对底物耐受性，其表示在高浓度底物存在的情况下，酶依然可以保持良好的活性和60％以上的转化效率。本发明所提供经修饰的氧化还原酶，在同等条件下其对圆柚醇底物的耐受性可以是序列表seq id no.2所示的氧化还原酶的至少1.5倍、优选地2至10倍，上不封顶。在一个优选的实施案例中，所提供经修饰的氧化还原酶的底物耐受性提高了5倍。
[0024]
发明人已经发现本发明的经修饰的氧化还原酶，它们与seq id no.2所示的氧化还原酶不同并且具有更高的转化效率和底物耐受性等。本发明的经修饰的氧化还原酶可以不同在于它仅在一个氨基酸位置含有修饰或在于它含有两个或更多个修饰、一个或多个修饰可以特别地是一个或多个置换、也可能是不存在一个或多个氨基酸。例如seq id no.2的位置1-15或为位置1-16的一个或多个氨基酸可以不存在。
[0025]
已经特别的发现在seq id no.2的以下至少一个位置进行突变有利于获得转化效率或底物耐受性等提高的氧化还原酶：88、89、143、152、155、157、159、161、196和210。
[0026]
在一个优选实施方案中，本发明的经修饰的氧化还原酶包含如序列表seq id no.3中所示的氨基酸序列。本文中，以“x”标注的位置原则上可以含有任何氨基酸残基，条件是优选地至少一个氨基酸残基与seq id no.2中的相应氨基酸残基不同。
[0027]
在一个具体实施方案中，转化效率改善的经修饰的氧化还原酶，在与seq id no.2的相比，88、89、143、152、155、157、159、161、196和210对齐的一个或多个位置处包含修饰。
[0028]
在一个优选实施方案中，转化效率增加的经修饰的氧化还原酶，在与seq id no.2的相比，88、89、152、155、157、161、196和210对齐的一个或多个位置处包含修饰。
[0029]
在一个特别优选的实施方案中，该经修饰的氧化还原酶具有选自以下的一个或多个修饰：88a、88c、88t、89g、89v、143v、143l、152a、152v、152m、152p、155m、157g、157l、159c、161y、161r、196s、196n、196g、196y、210r和210l。
[0030]
具体而言，已经用选自以下的一个或多个修饰的氧化还原酶实现了良好结果：88a、88c、88t、89g、89v、143v、143l、152a、152v、152m、152p、155m、157g、157l、159c、161y、161r、196s、196n、196g、196y、210r和210l。
[0031]
已经对具有选自以下至少一个修饰的氧化还原酶观察到特别高的转化效率：88a、88c、89v、152a、152v、152m、155m、196s和196n。
[0032]
与seq id no.2相比，包含至少两个修饰的氧化还原酶的优选例子是具有选自88a、88c、89v、152a、152v、152m、155m、157g、196s、196n和210r的至少两个修饰的那些。具体而言，已经用与seq id no.2相比包含至少两个修饰的氧化还原酶实现良好结果，其中所述至少两个修饰选自与88、89、152、155、157、196、210相对应的至少两个位置处的修饰，这些修饰可以特别地选自上文中指示为优秀的置换。
[0033]
虽然已经用与seq id no.2相比仅具有一个或两个修饰的氧化还原酶获得良好结果，但是本发明的经修饰的氧化还原酶可以包含更多个修饰，特别地3个或更多个。原则上对修饰的数目不存在限制，条件是该酶保留作为圆柚醇脱氢酶足够的催化性能。
[0034]
本文所用的术语“载体”指由经涉及旨在直接转化所靶向细胞的遗传物质组成的结构。载体含有按位置和顺序取向，即与其他必须元件可操作地连接的多个遗传元件，从而，核酸盒中的核酸可以转录并且当需要时，在转化的细胞中翻译。
[0035]
本发明中，提供了包含发明所述核酸的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明所述氧化还原酶或经修饰的氧化还原酶编码基因的核苷酸序列连接于各种合适的载体上构建而成。所述载体可以是本领域的各种常规载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体中。所述醇脱氢酶基因可以与合适的调控序列连接表达，以实现所述醇脱氢酶的组成型或诱导型表达。本发明优选2μ型高拷贝质粒yep352。
[0036]
本发明中，还提供了包含本发明载体的重组表达细胞。其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中来制得所述重组表达细胞。所述宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主细胞，前提是能使所述重组表达载体稳定地被复制传代下去，且其所携带的所述基因能够被有效表达。宿主细胞可以来自任何生物，具体可以选自原核细胞、真核细胞、古细菌、原生生物、植物细胞(包括藻类)、源自动物的细胞。本发明优选酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，更优选酿酒酵母cen.pk2-1 ca菌株。
[0037]
本发明中，提供了两种利用包含本发明所述氧化还原酶基因重组表达载体的重组表达细胞来实现圆柚酮的生物合成。
[0038]
一种为全细胞体外催化方法，即通过外源添加前体物质圆柚醇并利用本发明所述的重组表达细胞进行体外转化以得到圆柚酮。所述反应底物为圆柚醇，圆柚醇其可以是化学合成、植物提取或生物合成得到。具体的反应条件如底物浓度、ph、缓冲液组成、重组表达转化体用量等可按本领域此类反应的常规条件进行选择。所述的生物转化反应可在震荡或搅拌条件下进行。所述生物转化反应的时间优选以转化率》98％为准。所述反应结束后，可按本领域常规方法，从反应混合液中提取圆柚酮产物。在一个具体的实施案例中，可以观察到所述的重组表达细胞具有良好的对圆柚醇转化效率，所得圆柚酮产量高，纯度高。
[0039]
另一种方法中，圆柚酮以生物发酵(即，通过在含有培养基的反应器中培养表达相关酶的重组表达细胞)制备。
[0040]
通过利用宿主细胞自身的甲羟戊酸途径或另一条代谢途径(如脱氧木酮糖-5-磷酸(dxp)途径)，可以获得作为类异戊二烯结构单元的c5异戊烯二磷酸(ipp)及其异构体二甲基烯丙基二磷酸(dmapp)。迄今已知，除非已经敲除特定基因，否则已知的生物均包含这种途径。真核生物通常天然能够经甲羟戊酸途径制备ipp，ipp随后在异戊烯基二磷酸异构酶(idi)的作用下异构化为dmapp。原核生物则依赖于dxp途径，其以5：1的比例供应ipp和dmapp。
[0041]
宿主细胞进一步利用内源性的异戊二烯合成酶(isoprenoidsynthase，ispa)，在活性异戊烯二磷酸ipp单元基础上不断加入ipp/dmapp，形成香叶基焦磷酸(geranyl pyrophosphate，gpp)，法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，fpp)、香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate，ggpp)和香叶基法尼基焦磷酸(geranyl farnesyl pyrophosphate，gfpp)等，从而得到分别单萜、倍半萜、二萜、三萜和四萜等的前体类异戊二烯(isoprenoid)。之后经由异源性或外源性的萜类化合物合成酶(terpenoid synthases，ts)或环化酶催化反应生成主要的萜烯骨架，再经不同功能酶(如羟化酶、脱氢酶还原酶和糖基、甲基和酰基转移酶等)的修饰，产生数千种结构不同的衍生物，共同组成功能各异的数万种萜类化合物。
[0042]
所用宿主细胞可以选自原核生物、真核生物和植物等。原则上只要可以保证相关功能蛋白的正常工作的宿主细胞类型，均可用于圆柚酮的细胞发酵制备。
[0043]
所用反应器原则上选用可以保证宿主细胞的生长和产物生产的各类本领域常用设备，诸如小型摇瓶、发酵罐等设备。
[0044]
所用培养基以本领域常用的适合宿主细胞生长为主。
[0045]
发酵温度原则上选择使相关酶(在细胞中)显示良好活性的温度为优。在一个具体实施例中，优选发酵温度为25℃，以减少圆柚酮前体物质瓦伦西亚烯的挥发。
[0046]
如果需要，本发明方法中所产生的圆柚酮或其前体物质瓦伦西亚烯、圆柚醇等可采用与反应液或发酵液不可混溶的液体-液体提取法。
[0047]
具体而言，适合用液态有机溶剂，如液态烃提取(从含水反应培养基提取)。来自初步结果中，显而易见这种方法也适合从包含用于产物圆柚酮的本发明细胞发酵液中提取圆柚酮(或其他产物)，而不需要裂解细胞来回收圆柚酮(或其他产物)。特别地，有机溶剂可以选自液态链烷、液态长链醇(具有至少12个碳原子的醇)和长链脂肪酸的液态酯(具有至少12个碳原子的酸)。合适的液态链烷特别地包含c
6-c
16
链烷，如己烷、辛烷、癸烷、十二烷、异十二烷和十六烷。合适的长链脂肪醇特别地包括c
12-c
18
脂肪醇，如油醇和棕榈醇。长链脂肪酸的合适酯特别地包括c
12-c
18
脂肪酸的c
1-c4醇酯，如肉豆蔻酸异丙酯和油酸乙酯。
[0048]
在一个有利的实施方案中，圆柚酮(或其他产物)在反应器中产生。所述反应器包含第一液相(反应相)和第二液相(当接触时与第一相保持基本上相分离的有机相)。所述第一液相含有本发明所述宿主细胞，在所述细胞中产生圆柚酮(或其他产物)；所述第二液相是对形成的产物具有更高亲和力的提取相。这种方法有利于在原位回收产物。另外，它有助于防止或至少减少圆柚酮(或其他产物)对细胞的潜在毒性效应，因为在第二液相的萃取作用下，反应相中产物的浓度可以保持在相对较低的水平。同时，圆柚酮(或其他产物)在水中
生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用”中公开。
[0059]
实施例中的氧化还原酶yladh_bm6，原名为yali0d05929p，在ncbi的登录号为xp_502463，其氨基酸序列如seq id no.2所示，共包含248个氨基酸。编码基因(ncbi登录号为xm_502463)的核苷酸序列如seq id no.1所示，共包含747个核苷酸。
[0060]
实施例1：氧化还原酶yladh_bm6基因的获取
[0061]
从atcc(the global bioresource center)购得解脂耶氏酵母yarrowia lipolytica clib122菌株，atcc编号为mya-2613。
[0062]
将解脂耶氏酵母yarrowia lipolytica clib122接种于5ml ypd液体培养基中于30℃培养至对数生长期。使用基因组dna提取试剂盒从解脂耶氏酵母中提取基因组总dna。
[0063]
取前面所述的总dna溶液0.5μl(约10ng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的pcr循环参数进行32个循环pcr，所用pcr酶为kod fx(购自toyobo，日本)，扩增得到目的基因片段，即氧化还原酶yladh_bm6基因片段。
[0064]
设定的pcr循环参数如下：
[0065]
95℃，5min；95℃，30s；55℃，15s；72℃，1min；72℃，5min，32个循环；4℃，2h。
[0066]
引物序列如下(加粗的为同源臂序列)：
[0067]
上游引物f1：5
’‑’‑
[0068]
下游引物r1：5
’‑’‑
[0069]
实施例2：重组表达载体的构建
[0070]
使用yeast dnakit试剂盒(购自omega公司)提取酿酒酵母s.cerevisiae cen.pk2-1 ca的基因组。以基因组为模板，以tdh3-f/tdh3-r引物对扩增tdh3启动子片段，以adh1-f/adh1-r引物对扩增adh1终止子片段。
[0071]
所用引物序列如下：
[0072]
tdh3-f：5
’‑
tacgaattctttaccgtcgacacagtttattcctggcat-3’；
[0073]
tdh3-r：5
’‑
gaagtccaaagctcccgggttgtttgtttatgtgtgtt-3’；
[0074]
adh1-f：5
’‑
aaacacacataaacaaacaacccgggagctttggact-3’；
[0075]
adh1-r：5
’‑
gcaggtcgactctagaggatcccatagggtaggggaa-3’；
[0076]
用352-f/352-r引物对扩增购自invitrogen公司的yep352质粒载体片段。
[0077]
352-f：5
’‑
gatcctctagagtcgacctgc-3’；
[0078]
352-r：5
’‑
gtcgacggtaaagaattcgtaatc-3’；
[0079]
利用clonexpress ii重组克隆试剂盒(购自南京诺唯赞公司)将所获得的tdh3启动子片段、adh1终止子片段和yep352质粒载体片段进行同源重组连接，获得载体yep352-tdh3
promoter-adh1
terminator
，简写为yep352-tdh3
p-adh1
t
。
[0080]
用上游引物f2(5
’‑
tacccgggagctttggactt-3’)和下游引物r2(5
’‑
ccgagctctttgtttgtttatgtgt-3’)扩增yep352-tdh3
p-adh1
t
，然后利用clonexpress ii重组克隆试剂盒(购自南京诺唯赞公司)将上游引物f2/r2扩增得到的载体片段和实施例1所获得的目的基因进行同源重组连接。而后将10μl连接产物加入20μl的e.coli dh5α感受态细
胞中，冰上放置30分钟后，在42℃水浴条件下热激90秒，接着迅速置于冰上2分钟。再加入1ml的无氨苄抗性lb液体培养基，在37℃、220rpm下孵育1小时。取200μl菌液涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养12至16小时后，得到重组菌e.coli(yep352-tdh3
p-yladh_bm6-adh1
t
)。构建图谱见图2。挑取重组菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，在37℃、220rpm下培养12小时，然后利用快速质粒小提试剂盒(购自天根(北京)股份有限公司)提取质粒，得到含所述氧化还原酶基因重组质粒yep352-tdh3
p-yladh_bm6-adh1
t
。
[0081]
实施例3：重组表达细胞的构建
[0082]
利用s.c easycomp transformation kit(购自英潍捷基，美国)，将实施例2中所获得的重组表达载体yep352-tdh3
p-yladh_bm6-adh1
t
转化至酿酒酵母s.cerevisiae cen.pk2-1 ca感受态细胞中。后取200μl转化溶液涂布于单缺尿嘧啶的sd平板上，30℃培养2～3天后，得到重组表达细胞酿酒酵母s.c.cen.pk2-1 ca(yep352-tdh3
p-yladh_bm6-adh1
t
)。
[0083]
实施例4：全细胞体外催化制备圆柚酮
[0084]
挑取实施例3所获得的重组表达细胞酿酒酵母s.c.cen.pk2-1 ca(yep352-tdh3
p-yladh_bm6-adh1
t
)至单缺尿嘧啶的sd液体培养基中，30℃、220rpm下培养24小时。然后按起始od
600
＝0.05的接种量转接至装有50ml新鲜培养液的250ml摇瓶中，30℃、220rpm下培养24小时。随后收集总od
600
为50的菌液，在3000rpm、4℃离心5分钟，弃上清。然后将重组表达细胞用磷酸钾缓冲液(50mm，ph 7.4)重悬定容至1ml，得到50od
600
/ml的反应液。加入20μl 100mm的圆柚醇溶液(含1％(v/v)triton-100，用二甲基亚砜溶解)，使得底物终浓度为2mm，在25℃、220rpm下催化24小时。
[0085]
产物检测方法如下(后续实施例中的产物检测方法和实施例4相同)：
[0086]
反应结束后，将反应液转移至2ml离心管中，并加入1ml乙酸乙酯震荡萃取10分钟，随后在最大转速下离心5分钟，分离有机层和水层后取500μl上层乙酸乙酯至1.5ml离心管中，再加入500μl乙酸乙酯。最后经0.22μm有机滤膜过滤至色谱瓶中待气相检测。所用气相为岛津，色谱柱为5％ph-me硅氧烷柱，规格为30m
×
0.10mm
×
0.10μm；检测器为氢火焰检测器(fid)；载气为n2。
[0087]
检测方法如下：1μl样品分流进样，分流比15：1；进样口温度250℃；检测器温度350℃；柱温100℃保持5分钟，再以20℃/min升温至200℃，200℃保持5分钟，总时间为15分钟。
[0088]
最终，所述氧化还原酶的重组表达细胞s.c.cen.pk2-1 ca(yep352-tdh3
p-yladh_bm6-adh1
t
)对圆柚醇的转化率为100％。
[0089]
同样的，按照实施例1至4所述方法，本发明同时构建了来源于毕赤酵母的圆柚醇脱氢酶adh-c3(ncbi登录号为xm_002492172)的重组表达细胞s.c.cen.pk2-1 ca(yep352-tdh3
p-adh-c3-adh1
t
)和来源于巨大芽孢杆菌的圆柚醇脱氢酶bmd_2094(ncbi登录号为wp_013082965)的重组表达细胞s.c.cen.pk2-1 ca(yep352-tdh3
p-bmd_2094-adh1
t
)，并测试了在上述相同条件下它们的催化能力。结果分别为实施例4所述转化效果的50％和31％。本发明所述氧化还原酶的重组表达细胞s.c.cen.pk2-1 ca(yep352-tdh3
p-yladh_bm6-adh1
t
)在相同条件下的催化效率，分别为adh-c3和bmd_2094对应重组表达细胞的2倍和3.2倍，显示出本发明所述氧化还原酶的良好对圆柚醇转化能力。
[0090]
实施例5：测试经修饰的氧化还原酶催化效率和底物耐受性
[0091]
为测试经修饰的氧化还原酶的催化效率和底物耐受性，采用实施例1至4相同的方法，将编码所述经修饰的氧化还原酶基因克隆至重组表达载体后，转化至酿酒酵母s.c.cen.pk2-1 ca感受态细胞中，得到重组表达细胞。再利用实施例4的全细胞体外催化方法，来测试对应经修饰的氧化还原酶的转化效率和底物耐受性。
[0092]
某些具有单个氨基酸修饰的氧化还原酶的体外试验结果，见表1。
[0093]
表1：与seq id no.2相比具有单一修饰的氧化还原酶的催化能力汇总
[0094][0095]a：修饰的氧化还原酶氨基酸残基的位置；残基编码始于seq id no.2中的n端甲硫氨酸残基(＝met-1)。
[0096]b：测试方法参考实施例3或4，差别在于投入的圆柚醇底物浓度不同。
[0097]c：相对于采用野生型氧化还原酶(＝对照)所获得转化效率的经修饰的氧化还原酶(＝样品)转化效率，即{(nootkatone[样品]/底物浓度[样品])/(nootkatone[对照]/底物浓度[对照])
×
100％。
[0098]d：所述酶在测试条件下仍能保持60％以上转化率的耐受浓度。
[0099]e：氧化还原酶野生型(seq id no.2)。
[0100]f：()括号内表示在突变为对应氨基酸时所使用的密码子。
[0101]
表1中的结果显示，具有单点修饰的氧化还原酶获得了明显改善的体外圆柚醇转化效率和底物耐受性。相对于这个试验体系中用野生型氧化还原酶，这些突变体的氧化还
原酶转化效率为104％(如yladh_bm6：n89a)至260％(如yladh_bm6：t152m)，底物耐受能力从4mm(如yladh_bm6：n89a)至6mm(如yladh_bm6：g88a)。对于许多测试的经修饰的氧化还原酶，这种转化效率的提升往往与底物耐受性提升一起出现，因此指出以下事实：转化效率的提升主要不因这些突变体在酿酒酵母中的表达增加而引起。
[0102]
表2：与seq id no.2相比具有两点修饰的氧化还原酶的催化能力汇总(标题含义见表1)
[0103][0104]
表2中的结果证明，具有至少两个点修饰的氧化还原酶也获得了显著改善的体外圆柚醇转化效率和底物耐受性。相对于用野生型氧化还原酶，这些经修饰的氧化还原酶转化效率为115％(yladh_bm6：n89v-v157g)至312％(yladh_bm6：g88c-t152m)，底物耐受能力从4mm(如yladh_bm6：n89v-v157g)至10mm(yladh_bm6：g88c-t152m)。
[0105]
本发明继续提供几个特别优选的具有多点修饰的氧化还原酶，包括yladh_bm6：g88c-n89v-t152m(转化效率290％、底物耐受8mm)、yladh_bm6：g88c-t152v-t196s(转化效率270％、底物耐受8mm)、yladh_bm6：t152m-l155m-t196s(转化效率310％、底物耐受8mm)、yladh_bm6：g88c-t152m-t196s(转化效率446％、底物耐受10mm)、yladh_bm6：g88c-n89v-t152m-t196s(转化效率431％、底物耐受性10mm)等，相对于用野生型氧化还原酶，这些经修饰的氧化还原酶转化效率为270％(yladh_bm6：g88c-t152v-t196s)至446％(如yladh_bm6：g88c-t152m-t196s)，底物耐受能力从8mm(如yladh_bm6：g88c-n89v-t152m)至10mm(如yladh_bm6：g88c-t152m-t196s)。
[0106]
本发明所述的经修饰的氧化还原酶，通过单点或多点修饰，获得了相较于野生型氧化还原酶更高的转化效率和底物耐受性，具有很好的工业应用前景。
[0107]
实施例6：利用生物发酵的方式以简单碳源制备圆柚酮
[0108]
利用专利申请号201910271558.6所述技术，对宿主细胞s.c.cen.pk2-1 ca进行了基因组改造，即敲除了甲羟戊酸途径的限制因子rox1，并下调了倍半萜类物质前体fpp的下游支路途径相关酶erg9的表达强度，来提高前体物质fpp的供应量，最终获得s.c.pk2-m菌
株。并将国际专利申请号pct/nl2010/050848所述来源于黄扁柏(chamaecyparis nootkatensis)的瓦伦西亚烯合成酶valc基因(ncbi登录号为jx040471)(该基因的表达盒中的启动子为pdc1，终止子为sag1)和经n端调控区域截除的酿酒酵母内源hmg-coa还原酶thmg1(为甲羟戊酸途径限速步骤酶)基因(ncbi登录号为nm_001182434)(该基因的表达盒中的启动子为tef1，终止子为cyc1)导入至实施例2所得的重组表达载体yep352-tdh3
p-yladh_bm6-adh1
t
中，获得重组表达载体yep352-valc-thmg1-yladh_bm6。另外将p414-tef1p-cas9-cyc1t载体(addgene公司的商业化质粒)中的tef1p-cas9-cyc1t替换为来源于专利wo 2006/079020所述的纯天仙子(hyoscyamus muticus)的细胞色素p450单加氧酶hpo基因(ncbi登录号为ef569601)(该基因的表达盒中的启动子为hxt7，终止子为tpi1)和urban,pd等人在1997年文章中描述的来源于拟南芥(arabidopsis thaliana)的细胞色素还原酶atcpr基因(ncbi登录号为nm_118585)(该基因的表达盒中的启动子为hxt7，终止子为tpi1)(urban,p.,et al.cloning,yeast expression,and characterization of the coupling of two distantly related arabidopsis thaliana nadph-cytochrome p450 reductases with p450cyp73a5.j.biol.chem.1997,272,19176
–
19186.)，获得重组表达载体p414-hpo-atcpr。将重组表达载体yep352-valc-thmg1-yladh_bm6和p414-hpo-atcpr一起转化至前面已构建成功的高产fpp工程菌株s.c.pk2-m中，获得重组表达细胞s.c.pk2-m(yep352-valc-thmg1-yladh_bm6和p414-hpo-atcpr)，简称“pk2-6tv-ha”。
[0109]
将pk2-6tv-ha菌株接种于含有5ml sd/δtrp-ura培养基(指缺乏色氨酸(trp)和尿嘧啶(ura)的sd培养基)的试管中，于30℃、220rpm摇床培养20小时左右，待菌液od
600
达到1～3时，转接至含有10ml sd/δtrp-ura培养基的50ml锥形瓶中，并覆盖20％正十二烷(2ml)有机相，于25℃、220rpm摇床发酵96小时。
[0110]
发酵结束后，取上层的正十二烷有机相500μl，与等体积乙酸乙酯混合后，按照实施例4所述气相检测方法进行产物检测。
[0111]
最终发酵结果中，圆柚酮的产量为35mg/l，占总萜(瓦伦西亚烯、圆柚醇和圆柚酮总和)产量的40.1％。而将所用的氧化还原酶换成来源于毕赤酵母的adh-c3后，所获得的圆柚酮产量只有2.5mg/l，占总萜产量的2.6％。即说明了使用本发明所述的氧化还原酶后，可以将圆柚酮的发酵产量提升13倍，纯度提升15倍。而继续换用经修饰的氧化还原酶，如yladh_bm6：g88a，所获得的圆柚酮产量提升至50mg/l，为使用野生型氧化还原酶的1.4倍。证明了本发明所述氧化还原酶的催化性能较以往报道的同工酶更加优良，所能耐受的底物浓度也更高，利用所述的氧化还原酶及其突变体，可以获得更高的圆柚酮发酵产量和纯度更高的产品。
[0112]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。