用于治疗遗传性黄斑变性的组合物和方法与流程

1.本发明部分涉及用于疗法，例如治疗和/或减轻遗传性黄斑变性(imd)的方法、组合物和产品。
2.优先权
3.本技术要求2020年4月29日提交的美国临时专利申请号63/017,442的优先权和权益，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文。
4.以电子方式提交的文本文件的描述
5.本技术含有通过efs-web随此以电子方式提交的ascii格式的序列表。2021年4月28日创建的ascii拷贝名为sal-002pr_sequence_listing_st25.txt且大小为64,498字节。序列表以引用的方式整体并入本文。


背景技术：

6.黄斑变性是在视网膜中央发现的黄斑-位于眼睛后部的感测光的组织-的细胞受损的疾患。视力丧失通常是逐渐发生的，并且通常以不同的速率影响双眼。遗传性黄斑变性(imd)，又称为黄斑营养不良(md)是导致视网膜的检眼镜检查可见异常的一组遗传性病症。
7.最初由德国眼科医生karl stargardt在1909年描述的斯塔加特病(stargardt disease)(stgd)是imd的最常见形式。它通常是视网膜的遗传性隐性病症。所述疾病的其它名称包括斯塔加特氏黄斑营养不良(smd)、幼年期黄斑变性或眼底黄斑病(fundus flavimaculatus)。stgd通常导致儿童期或青少年期期间的视力丧失，尽管有时视力丧失可能直到成年后期才被注意到。stgd导致黄斑的进行性损伤或变性，黄斑是视网膜中央中负责清晰、正前方视觉的小区域。据估计，全球stgd发病率是8,000
–
10,000个体中1人。
8.stgd是导致黄斑变性的几种遗传病症之一，并且其特征在于视网膜中感光光感受器细胞的丧失所致的视力的进行性恶化。中心视觉的丧失极大地降低一个人阅读、写作和周围环境导航的能力，从而显著降低人的生活质量。隐性斯塔加特病(stgd1)是目前为止最常见形式的斯塔加特病，其由atp结合盒亚家族a成员4(abca4)中的突变引起。abca4基因/蛋白在光感受器(pr)细胞中表达。stgd1表现为视网膜色素上皮(rpe)的溶酶体区室中脂褐质(部分消化的蛋白质和脂质的荧光混合物)的沉积，其先于光感受器变性。rpe通过表达与免疫系统的补体部分相关的mrna和蛋白质而在控制免疫应答中发挥作用，其是先天性免疫的关键组分。年龄相关性黄斑变性(amd)是与stgd1具有显著相似性的疾病，并且它也与rpe脂褐质累积和补体失调相关。lenis等人,proc natl acad sci usa.2017年4月11日；114(15):3987-3992。
9.stgd的另一种形式是stgd4，stgd4是prom1基因中的罕见显性缺陷。kniazeva等人am j hum genet.1999；64:1394
–
1399。stgd3，也被称为斯塔加特样营养不良，是stgd的另一种罕见显性形式，由延伸极长链脂肪酸样4基因(elovl4)中的突变引起。agbaga等人invest ophthalmol vis sci.2014；55:3669
–
3680。
10.用于imd的现有疗法包括氘化维生素a、微电流刺激(mcs)、rpe移植、营养补充剂、
干细胞疗法和补体系统的调节。然而，尽管这些努力，目前还没有用于治疗一般的imd、并且特别是stgd的有效疗法。用于imd疾病的基因疗法发展一直具有挑战性，因为常用的腺相关病毒(aav)不具有其编码序列大于5kb的基因的能力，所述基因包括导致stgd和其它视网膜病症的基因abca4(6.8kb)。
11.因此，需要用于有效预防和治疗imd如斯塔加特病以及其它黄斑营养不良的组合物和方法。


技术实现要素：

12.在各个方面，本发明提供了用于治疗和/或减轻遗传性黄斑变性(imd)病症的组合物和方法，所述病症是世界范围内失明的主要原因。imd包括斯塔加特病和其它黄斑营养不良(md)，包括贝斯特疾病(best disease)、x连锁视网膜劈裂症(x-linked retinoschisis)、图形样营养不良(pattern dystrophy)、索斯比眼底营养不良(sorsby fundus dystrophy)和常染色体显性玻璃疣。本发明的组合物和方法利用包含转座子表达载体的基因转移构建体，所述转座子表达载体使用序列或基因座特异性转座(slst)来纠正与这些疾病相关的基因缺陷。所描述的组合物和方法采用非病毒模式的基因转移。因此，克服了与使用病毒载体相关的缺点。
13.在一些方面，提供了一种包含基因转移构建体的组合物，所述组合物包含(a)编码atp结合盒亚家族a成员4(abca4)蛋白或其功能片段的核酸；(b)视网膜特异性启动子；和(c)非病毒载体，所述非病毒载体包含一个或多个转座酶识别位点和一个或多个反向末端重复序列(itr)或末端序列。
14.根据本公开的基因疗法可使用基于转座子的载体系统，在转座酶辅助下进行，所述转座酶与待转移的基因提供在同一载体上(顺式)或不同的载体上(反式)或作为rna提供。基于转座子的载体系统可在视网膜特异性启动子控制下操作。
15.在实施方案中，转座酶，例如来源于家蚕(bombyx mori)、热带爪蟾(xenopus tropicalis)、粉纹夜蛾(trichoplusia ni)、马铁菊头蝠(rhinolophus ferrumequinum)、埃及果蝠(rousettus aegyptiacus)、苍白矛吻蝠(phyllostomus discolor)、大鼠耳蝠(myotis myotis)、小棕蝠(myotis lucifugus)、大狐蝠(pteropus vampyrus)、库氏伏翼(pipistrellus kuhlii)、黑猩猩(pan troglodytes)、獒蝠(molossus molossus)或智人(homo sapiens)的转座酶和/或其工程化型式用于将所述abca4基因或其功能片段插入患者的基因组中。
16.在实施方案中，转座酶是小棕蝠转座酶(mlt，或mlt转座酶)，其包含seq id no:10的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的变体，以及选自l573x、e574x和s2x的一个或多个突变，其中x是任何氨基酸或没有氨基酸，任选地x是a、g或缺失。在实施方案中，所述突变是l573del、e574del和s2a。
17.在实施方案中，所述mlt转座酶包含具有突变l573del、e574del和s2a的氨基酸序列(seq id no:10)，并且另外具有赋予过度活性的一种或多种突变(或过度活跃突变)。在实施方案中，所述过度活跃突变是s8x、c13x和n125x突变中的一者或多者，其中x任选地是任何氨基酸或没有氨基酸，任选地x是p、r或k。在实施方案中，所述突变是s8p、c13r和
n125k。在一些实施方案中，所述mlt转座酶具有s8p和c13r突变。在一些实施方案中，所述mlt转座酶具有n125k突变。在一些实施方案中，所述mlt转座酶具有所有三个s8p、c13r和n125k突变。
18.所描述的组合物可使用脂质纳米颗粒(lnp)递送至宿主细胞。在一些实施方案中，所述lnp包含选自中性或结构脂质(例如dspc)、阳离子脂质(例如mc3)、胆固醇、peg缀合脂质(cdm-peg)和靶向配体(例如n-乙酰半乳糖胺(galnac))的一种或多种分子。在一些实施方案中，所述lnp包含galnac或另一种配体以用于去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)介导的摄取到具有突变的abca4或其它基因(例如，elovl4、prom1、best1或prph2)的细胞中。
19.在一些方面，提供了一种用于预防患者中的光感受器丧失或降低患者中的光感受器丧失速率的方法，所述方法可以是体内或离体方法。因此，在一些实施方案中，提供了一种方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据本公开的实施方案的组合物。在一些实施方案中，提供了一种用于预防患者中的光感受器丧失或降低患者中的光感受器丧失速率的离体方法，所述方法包括(a)使从患者(自体)或其它个体(同种异体)获得的细胞与所描述的组合物接触，以及(b)将所述细胞施用于有需要的患者。
20.在一些实施方案中，提供了一种用于治疗和/或减轻一类imd(也称为黄斑营养不良(md))的方法，所述imd包括stgd、贝斯特疾病、x连锁视网膜劈裂症、图形样营养不良、索斯比眼底营养不良和常染色体显性玻璃疣。
21.在一些实施方案中，提供了一种用于治疗和/或减轻imd的方法，所述方法也可在体内或离体进行。在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的患者施用根据本公开的实施方案的组合物。在一些实施方案中，所述用于治疗和/或减轻imd的方法包括(a)使从患者或另一个体获得的细胞与本公开的组合物接触，以及(b)将所述细胞施用于有需要的患者。
22.imd可以是stgd，并且在一些实施方案中，所述stgd可以是stgd1型(stgd1)。在一些实施方案中，所述stgd可以是stgd3型(stgd3)或stgd4型(stgd4)疾病。所述imd的特征可在于abca4、elovl4、prom1、best1和prph2中的一者或多者中的一个或多个突变。所述abca4突变可以是常染色体隐性或显性突变。根据本公开的方法允许减轻、减少或缓解imd(诸如，例如斯塔加特病)的症状，包括与缺乏治疗相比改善远视力和/或降低光感受器丧失速率。在一些实施方案中，所述方法使得最佳矫正视力(bcva)提高至大于约20/200。
23.根据本公开的实施方案的组合物和方法是基本上非免疫原性的，不会引起任何难处理的副作用，并且在一些情况下，可通过单次施用有效地递送。光感受器丧失的预防或光感受器丧失速率的降低可以是稳健的且持久的。所描述的组合物和方法降低或预防视网膜中(例如，rpe和/或布鲁赫氏膜中)的脂褐质累积，减少或预防视网膜色素上皮(rpe)碎片的形成，改善所述患者的远视力。
24.在本公开的一些方面，提供了一种分离的细胞，所述分离的细胞包含根据本公开的实施方案的组合物。
25.在一些实施方案中，与缺乏治疗相比，所述方法提供改善的远视力和/或降低的光感受器丧失速率。所述方法还可使得最佳矫正视力(bcva)提高至大于约20/200。在一些实施方案中，如通过眼底自发荧光(faf)或谱域光学相干断层扫描(sd-oct)所测量，所述方法使得视网膜或中央凹形态改善。也可使用其它成像技术。
26.所描述的方法改善患者的视力。在一些实施方案中，所述方法使得减少或预防患
者中波状视觉、盲点、模糊、深度知觉丧失、对眩光的敏感性、色觉受损和难以适应暗光(暗适应延迟)中的一者或多者。
27.在一些实施方案中，根据本公开的方法消除对类固醇治疗的需要。另外或可替代地，所述方法可消除对索雷拉赞(soraprazan)、异维甲酸、羟苯磺酸盐、4-甲基吡唑、alk-001 9(c20氘化维生素a)、芬维a胺(fenretinide)(一种合成形式的维生素a)、lbs-500、a1120、依舒司他(emixustat)、非诺贝特(fenofibrate)、培戈-阿伐普他(avacincaptad pegol)和其它治疗剂的需要。然而，在一些实施方案中，本发明的组合物和方法涉及使用选自以下的一种或多种额外治疗剂：索雷拉赞、异维甲酸、羟苯磺酸盐、4-甲基吡唑、alk-001 9(c20氘化维生素a)、芬维a胺(一种合成形式的维生素a)、lbs-500、a1120、依舒司他、非诺贝特、培戈-阿伐普他和其它治疗剂。
28.本发明的其它方面和某些实施方案将根据以下具体实施方式而是显而易见的。
附图说明
29.图1a、1b、1c、1d、1e、1f、1j、1h和1i是可用于视网膜细胞系中的转染、转座功效和表达研究中的载体的示意性图示。
30.图2示出在本公开的一些实施方案中使用的脂质纳米颗粒结构。
31.图3示出与未转染的细胞相比，在不同的脂质转染试剂以及本公开的mlt转座酶1(具有n125k突变的mlt)或mlt转座酶2(具有s8p/c13r突变的mlt)转染后24小时，661w小鼠光感受器细胞中的gfp表达。顶行示出未转染的661w小鼠光感受器细胞、用具有l3(lipofectamine 3000)和mlt1的转座子转染的细胞、以及用具有l3和mlt2的转座子转染的细胞；中间行示出未转染的661w小鼠光感受器细胞、用具有ltx(lipofectamine ltx&plus)和mlt 1的转座子转染的细胞、以及用具有ltx和mlt 2的转座子转染的细胞；并且底行示出未转染的661w小鼠光感受器细胞、用具有max(lipofectamine messengermax)和mlt1的转座子转染的细胞、以及用具有max和mlt 2的转座子转染的细胞。
32.图4示出在15天内4轮分裂后，小鼠光感受器细胞系661w中通过转座，供体dna(gfp)的稳定整合。行示出第3天、第6天、第9天、第12天和第15天的结果；列示出未转染的细胞、用仅供体dna转染的细胞、用供体dna和mlt 1转染的细胞、以及用供体dna和mlt 2转染的细胞的结果。
33.图5是条形图，其示出第15天小鼠光感受器细胞系661w中通过转座，供体dna(gfp)的稳定整合的facs分析的结果。示出未转染的细胞、用仅供体dna转染的细胞(“仅 gfp”)、用供体dna和mlt1转染的细胞(“mlt 1 gfp”)、以及用供体dna和mlt 2转染的细胞(“mlt 2 gfp”)的gfp表达的百分比(％)。
34.图6示出转染后24小时arpe-19细胞中gfp的表达。顶行示出未转染的arpe-19细胞、用仅具有l3的转座子转染的细胞、用具有l3和mlt 1的转座子转染的细胞、以及用具有l3和mlt 2的转座子转染的细胞；中间行示出未转染的arpe-19细胞、用仅具有ltx的转座子转染的细胞、用具有ltx和mlt 1的转座子转染的细胞、以及用具有ltx和mlt 2的转座子转染的细胞；并且底行示出未转染的arpe-19细胞、用仅具有max的转座子转染的细胞、用具有max和mlt1的转座子转染的细胞、以及用具有max和mlt 2的转座子转染的细胞。
35.图7示出mlt转座酶1和mlt转座酶2、转染后24小时的可见gfp表达的较高分辨率图
像。
36.图8示出光感受器细胞系arpe19中的供体dna(gfp)与mlt转座酶2(mlt 2)的稳定整合。行示出第4天、第8天、第12天和第15天的结果；列示出用仅供体dna转染的细胞以及用供体dna和mlt2转染的细胞的结果。
37.图9是条形图，其示出在细胞分裂4代后，arpe19细胞系中通过转座，供体dna(gfp)的稳定整合的facs分析的结果。示出未转染的细胞、用仅供体dna转染的细胞(“仅 gfp”)、用供体dna和mlt 1转染的细胞(“mlt 1 gfp”)、以及用供体dna和mlt 2转染的细胞(“mlt 2 gfp”)的gfp表达的百分比(％)。
38.图10a和10b描绘注射pbs的小鼠1-1l左眼(图10a)和1-1l右眼(图10b)的图像。
39.图11a、11b、11c和11d示出注射仅dna的小鼠3-1l和3-1r右眼(图11a和图11c)以及注射供体dna和mlt 2的3-1和3-1r左眼(图11b和图11d)的图像。
40.图12a和12b描绘注射供体dna(图12a)和mlt 2(图12b)的小鼠4-1r右眼的图像。
41.图13a和13b示出小鼠4-np注射供体仅dna的右眼(图13a)以及注射供体dna和mlt 2两者的左眼(图13b)的图像。
42.图14a和14b描绘小鼠4-1l注射仅供体dna的右眼(图14a)以及注射供体dna和mlt 2两者的左眼(图14b)的图像。
43.图15a和15b描绘小鼠5-bp注射仅供体dna的右眼(图15a)以及注射供体dna和mlt 2两者的左眼(图15b)的图像。
44.图16示出根据本公开的一些实施方案，使用dna供体和rna辅助细胞评估661w小鼠光感受器细胞和视网膜上皮(arpe19)细胞的转座的有效性的实验设计。
45.图17描绘在视网膜下注射后第21天取得的小鼠左眼和右眼(分别顶行和底行)的图像，在转染中使用(“ mlt”)或没有使用(
“‑
mlt”)mlt转座酶。
具体实施方式
46.本发明部分基于以下发现，即非病毒、无衣壳的基因治疗方法和组合物可用于预防患者中的光感受器丧失或降低患者中的光感受器丧失速率。根据本公开的非病毒基因治疗方法可用于遗传性黄斑变性(imd)的视网膜导向性基因疗法中。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于由atp结合盒亚家族a成员4(abca4)中的突变引起的斯塔加特病(stgd)的视网膜导向性基因疗法中。所描述的方法和组合物采用abca4或另一种基因或其功能片段从基因转移构建体转座至宿主基因组。所描述的方法和组合物降低或预防视网膜中(例如，rpe和/或布鲁赫氏膜以及光感受器中)的脂褐质累积并改善患者的远视力(distance visual acuity)。
47.stgd的特征在于黄斑萎缩和视网膜色素上皮(rpe)中的周围斑点。abca4基因编码在视杆细胞光感受器和视锥细胞光感受器中发现的蛋白质(abca4蛋白)，所述蛋白质是参与维生素a中间体的转运，如特异性地将n-亚视黄基-磷脂酰乙醇胺(n-rpe)转运至rpe的跨膜蛋白。abca4负责清除光感受器细胞中的全反式视黄醛(反应性维生素a醛)，并且abca4功能的丧失导致光感受器细胞的外节段膜中双-类视黄醇(如n-rpe)的累积，其进而导致脂褐质的形成。这最终导致rpe中高水平的脂褐质累积(并且因此导致增加的视网膜自发荧光)，并且导致进行性rpe和光感受器细胞丧失。
48.abca4的突变与广泛表型相关，包括视锥-视杆营养不良(stgd疾病中视锥细胞和视杆细胞死亡)和视网膜色素变性(视网膜中细胞的分解和丧失)。参见例如，song等人,jama ophthalmol.2015；133(10):1198-1203。类似地，导致md的其它基因中的突变类似地表现出在患者之间不同的各种表型。
49.如上文所提及，由于abca4的大小(6.8kb)超过aav的4.5kb至5.0kb容量，因此阻止了腺相关病毒(aav)载体用于涉及abca4的基因疗法。因此，马传染性贫血慢病毒(e iav)已通过视网膜下注射用于基因转移。kong等人,gene ther.2008；15(19):1311-1320。另一种解决abca4的相对较大大小的方法是将所述基因分裂到两个aav载体上，使得两个转基因片段在宿主细胞内部组合。dyka等人,hum gene ther.2019年；11月；30(11):1361-1370。
50.本公开的组合物和方法提供替代abca4或其它靶向基因的突变型拷贝的转基因的非病毒递送。因此，本公开的组合物和方法提供靶向abca4或其功能片段的基因转移构建体，以纠正患者基因组中的致病性变体并由此预防患者中的光感受器丧失或降低患者中的光感受器丧失速率。因此，在本公开的一些方面，提供了一种包含基因转移构建体的组合物，所述组合物包含(a)编码abca4蛋白或其功能片段的核酸；(b)视网膜特异性启动子；和(c)非病毒载体，所述非病毒载体包含一个或多个转座酶识别位点和一个或多个反向末端重复序列(i tr)或末端序列。
51.在一些实施方案中，所述abca4蛋白是人abca4蛋白或其功能片段。在实施方案中，编码人abca4的基因是人abca4(genbank登录号nm_000350)。编码人abca4的核酸可包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有seq id no:1的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。在一些实施方案中，编码人abca4的核酸包含seq id no:2的核苷酸序列或与所述核苷酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
52.在一些实施方案中，编码人abca4的核酸包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有seq id no:1的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。在一些实施方案中，编码人abca4的核酸包含seq id no:2的核苷酸序列或与所述核苷酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
53.seq id no:1是
[0054][0055]
(seq id no:1)
[0056]
在实施方案中，人abca4由seq id no:2的核苷酸序列或与所述核苷酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体(包括密码子优化型式)编码。seq id no:2是：
[0057]
[0058]
[0059][0060]
在一些实施方案中，本公开涉及通过双重转座子和转座酶系统进行基因转移的组合物和方法。可转座元件是自然界中普遍存在的非病毒基因递送媒介物。基于转座子的载体具有在细胞中稳定基因组整合和持久表达转基因构建体的能力。一般来说，双重转座子和转座酶系统通过剪切和粘贴机制(cut-and-paste mechanism)起作用，由此含有目标转基因的转座子dna在重复序列位点通过转座酶整合到染色体dna中。
[0061]
如本领域中所了解，转座子通常包含在转座子的中间编码转基因的开放阅读框以及在转座子的5'和3'端的末端重复序列。经翻译的转座酶与转座子的5'和3'序列结合，并执行转座功能。
[0062]
在实施方案中，转座子可与可转座元件互换使用，可转座元件用于指能够将自身的拷贝插入到其它多核苷酸中的多核苷酸。术语转座子是本领域技术人员众所周知的，并且包括可根据序列组构，例如在每个末端的短反向重复序列(itr)和/或在末端的直接重复长末端重复序列(ltr)来区分的转座子类别。在一些实施方案中，如本文所述的转座子可被描述为piggybac样元件，例如特征在于其无踪迹切除的转座子元件，所述元件识别ttaa序列并在除去转座子后使插入位点处的序列恢复回至原始ttaa序列。
[0063]
在一些实施方案中，非病毒载体是由转座酶所识别的itr侧接的转座子介导的基因转移系统(例如，dna质粒转座子系统)。在一些实施方案中，itr位于编码abca4基因的核酸侧翼。非病毒载体以基于转座子的载体系统操作，所述载体系统包含由转座酶所识别的两个末端侧接的异源多核苷酸(也称为转基因)。转座子末端包含itr，所述itr可以是精确或不精确重复序列并且在取向上相对于彼此反向。转座酶作用于转座子末端，以由此从载体“剪切”转座子(连同转座子末端)并将所述转座子“粘贴”或整合到宿主基因组中。在实施方案中，转座酶作为dna表达载体或可表达rna或蛋白质提供，使得在转基因细胞中不发生转座酶的长期表达。
[0064]
在实施方案中，基因转移系统是编码转座子的核酸(dna)，并且被称为“供体dna”。在实施方案中，编码转座酶的核酸是辅助rna(即编码转座酶的mrna)，并且编码转座子的核酸是供体dna(或dna供体转座子)。在实施方案中，供体dna被并入到质粒中。在实施方案中，供体dna是质粒。
[0065]
dna供体转座子(其是使用“剪切和粘贴”机制的移动元件)包括在哺乳动物(例如小棕蝠、大鼠耳蝠、大狐蝠、库氏伏翼和黑猩猩)、包括人(智人)的情况下由两个末端序列侧接的供体dna，或其它活生物体如昆虫(例如粉纹夜蛾)或两栖动物(爪蟾属物种)中的反向末端重复序列(itr)。基因组dna在宿主的供体位点通过双链裂解切割，并且供体dna在此位点整合。使用生物工程化转座子和转座酶的双重系统包含(1)活性转座酶的来源，所述活性
转座酶在特定核苷酸序列如ttaa处“切割”；和(2)dna序列，所述dna序列由通过转座酶动员的识别末端序列或itr侧接。dna序列的动员允许插入核酸或转基因插入在特定核苷酸序列(即ttaa)处而无dna足迹。
[0066]
在实施方案中，转座酶是小棕蝠转座酶(mlt，或mlt转座酶)，其包含seq id no:10的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的变体。在实施方案中，转座酶是小棕蝠转座酶(mlt，或mlt转座酶)，其包含seq id no:9的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的变体和s2x，其中x是任何氨基酸或没有氨基酸，任选地x是a或g。
[0067]
在实施方案中，转座酶是小棕蝠转座酶(mlt，或mlt转座酶)，其包含seq id no:9的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的变体和s2x(其中x是任何氨基酸或没有氨基酸，任选地x是a或g)以及选自l573x和e574x的c末端缺失(其中x是没有氨基酸)。在实施方案中，突变是l573del、e574del和s2a。
[0068]
在实施方案中，mlt转座酶包含seq id no:10的氨基酸序列，具有突变l573del、e574del和s2a：
[0069][0070]
或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列。
[0071]
在一些实施方案中，包含seq id no:10的氨基酸序列的mlt转座酶由以下核苷酸序列：
[0072][0073]
或与所述核苷酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的核苷酸序列编码。
[0074]
在一些实施方案中，mlt转座酶(例如，具有seq id no:10的氨基酸序列或与其具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列的mlt转座酶)包含赋予mlt转座酶过度活性的一个或多个过度活跃突变。在实施方案中，相对于seq id no:10的氨基酸序列或其功能等效物的过度活跃突变是s8x、c13x和n125x突变中的一者或多者，其中x任选地是任何氨基酸或没有氨基酸，任选地x是p、r或k。在实施方案中，突变是s8p、c13r和n125k。在一些实施方案中，mlt转座酶具有s8p和c13r突变。在一些实施方案中，mlt转座酶具有n125k突变。在一些实施方案中，mlt转座酶具有所有三个s8p、c13r和n125k突变。
[0075]
在一些实施方案中，mlt转座酶由核苷酸序列(seq id no:12)编码，所述核苷酸序列对应于相对于seq id no:10的氨基酸序列或其功能等效物具有n125k突变的氨基酸序列(seq id no:13)，其中seq id no:12和seq id no:13是如下：
[0076][0077]
或与其具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的核苷酸序列(对应于n125k突变的密码子加下划线且加粗)。
[0078][0079]
或与其具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列(对应于n125k突变的氨基酸加下划线且加粗)。
[0080]
在一些实施方案中，由seq id no:12的核苷酸序列编码并具有seq id no:13的氨基酸序列的mlt转座酶被称为mlt转座酶1(或mlt 1)。
[0081]
在一些实施方案中，mlt转座酶由核苷酸序列(seq id no:14)编码，所述核苷酸序列对应于相对于seq id no:10的氨基酸序列或其功能等效物具有s8p和c13r突变的氨基酸序列(seq id no:15)，其中seq id no:14和seq id no:15是如下：
j.2018年10月o；13(10):e1700748.doi:10.1002/biot.201700748.epub2018年6月11日)。
[0090]
在一些实施方案中，非病毒载体包含leap-in 1型leapin转座酶(atum,newark,ca)。leapin转座酶系统包含转座酶(例如，转座酶mrna)和载体，所述载体含有由转座子同源反向末端重复序列(itr)和转座识别基序(ttat)侧接的一种或多种目标基因(转座子)、选择标记物、调控元件等。在共转染载体dna和转座酶mrna后，瞬时表达的酶催化转座子盒的单个拷贝(itr之间的所有序列)在跨宿主细胞基因组的一个或多个位点处的高效和精确地整合。hottentot等人in genotyping:methods and protocols.white sj,cantsilieris s,编:185
–
196.(new york,ny:springer):2017.第185
–
196页。leapin转座酶产生具有各种有利特征的稳定转基因整合体，包括在多个基因组基因座处、主要在开放染色质区段中的单拷贝整合；没有有效负荷限制，所以多个独立的转录单元可从单一构建体表达；整合的转基因保持其结构和功能完整性；并且转基因完整性的维持确保每个重组细胞中所需的链比率。
[0091]
在一些实施方案中，abca4可操作地偶联至可影响转基因(例如abca4或其功能片段)的总体表达水平和细胞特异性的启动子。
[0092]
在一些实施方案中，启动子是cag启动子(与鸡β-肌动蛋白启动子和兔β-珠蛋白剪接受体融合的巨细胞病毒(cmv)增强子)(1732bp)，所述cag启动子在体内和体外在rpe和光感受器水平上表达。在一些实施方案中，cag启动子包含以下核苷酸序列(seq id no:16)：
[0093][0094]
或与所述核苷酸序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
[0095]
在一些实施方案中，启动子是cmv增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和兔β-珠蛋白剪接受体位点(cag)，所述cag任选地包含seq id no:16的核酸序列，或与所述核酸序列具有至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或
至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
[0096]
在一些实施方案中，启动子是组织特异性，即视网膜特异性启动子。在转座酶是编码转座酶的dna序列的实施方案中，这种dna序列还可操作地连接至启动子。可使用多种启动子，包括组织特异性启动子、诱导型启动子、组成型启动子等。
[0097]
在一些实施方案中，视网膜特异性启动子是视网膜色素上皮(rpe)启动子，其可以是rpe65(视网膜色素上皮特异性65kda蛋白基因)、irbp(光感受器间类视黄醇结合蛋白)或vmd2(卵黄样黄斑营养不良2)启动子。
[0098]
rpe65、irbp和vmd2启动子描述于例如invest ophthalmol vis sci.2017；58(12):5399
–
5411.doi:10.1167/iovs.17-22978中。可在一些实施方案中使用的rpe65启动子的实例是：
[0099][0100]
或与其具有至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体的功能片段。
[0101]
人光感受器间类视黄醇结合蛋白(irbp)启动子已被证实从进行性变性中挽救光感受器。al-ubaidi和baehr.j.cell biol.1992；119:1681
–
1687。可在一些实施方案中使用的irbp启动子(1325bp)的实例(改编自bobola等人,j.biol.chem.1995；270:1289-1294)是：
[0102][0103]
或与其具有至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体的功能片段。
[0104]
人vmd2启动子显示在单次视网膜下注射(在狗中)后，在体内特异性地且排他性地使转基因表达靶向rpe细胞。参见guziewicz等人,plosone第8卷,10e75666.2013年10月15日,doi:10.1371/journal.pone.0075666。可在一些实施方案中使用的为best1基因的上游区域的vmd2启动子序列(624bp)的实例(参见esumi等人,j.biol.chem.2004；279(18):19064-19073)是：
[0105][0106]
或与其具有至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体的功能片段。
[0107]
在一些实施方案中，视网膜特异性启动子是任选地选自β-磷酸二酯酶(pde)、视紫红质激酶(grk1)、car(视锥抑制蛋白)、视网膜色素变性1(rp1)和l-视蛋白的光感受器启动子。pde和rp1启动子以及视紫红质(rho)启动子显示在体外驱动光感受器特异性表达。kan等人,molecular therapy,第15卷,增刊1,s258,2007年5月1日。可用于一些实施方案中的pde启动子(200bp)的实例(例如，如di polo等人,nucleic acids res.1997；25(19):3863
–
3867中所述)是：
[0108][0109]
或与其具有至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体的功能片段。
[0110]
人视紫红质激酶(grk1)基因启动子显示对视杆细胞光感受器和视锥细胞光感受器具有活性和特异性，并且由于其较小大小和在视锥细胞中证明的活性，它是靶向视杆细胞和视锥细胞的体细胞基因转移和基因疗法的首选启动子。khani等人,investigative ophthalmology&visual science 2007年9月；第48卷:3954-3961。可用于一些实施方案中的grk1启动子(295bp)的实例(参见khani等人,2007；mcdougald等人,mol ther methods clin dev.2019；13:380
–
389.2019年3月28日公开)是：
[0111][0112]
或与其具有至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体的功能片段。
[0113]
car启动子也显示驱动视网膜中的强表达。dyka等人,adv exp med biol.2014；801:695
–
701。在一些实施方案中，car启动子(2026bp)(参见mcdougal d等人,mol ther methods clin dev.2019；13:380
–
389.2019年3月28日公开)是：
[0114][0115]
或与其具有至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体的功能片段。
[0116]
人l-视蛋白启动子显示指导小鼠光感受器中的高水平gfp表达。ye等人,hum gene ther.2016；27(1):72-82。在一些实施方案中，l-视蛋白启动子(1726bp)(参见lee等人,vision res 2008年2月；48(3):332-8)是：
[0117][0118]
或与其具有至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体的功能片段。
[0119]
在实施方案中，视网膜特异性启动子是rpe启动子，所述rpe启动子包含seq id no:3、seq id no:4或seq id no:5的核酸序列，或与所述核酸序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
[0120]
在实施方案中，视网膜特异性启动子是光感受器启动子，所述光感受器启动子包含seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9的核酸序列，或与所述核酸序列具有至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体的功能片段。
[0121]
在实施方案中，本发明的非病毒载体可包含在转座子的5'端和3'端的至少一对反向末端重复序列。在实施方案中，反向末端重复序列是位于载体的一端的序列，所述序列当与位于所述载体的相对端的互补序列组合使用时可形成发夹结构。所述对反向末端重复序列参与本公开的非病毒载体的转座子的转座活性，特别是参与目标dna的dna添加或去除和切除。在一个实施方案中，至少一对反向末端重复序列似乎是质粒中转座活性所需的最小序列。在另一个实施方案中，本公开的载体可包含至少两对、三对或四对反向末端重复序列。如本领域技术人员所了解，为了便于克隆，必要的末端序列可以尽可能短，并且因此含有尽可能少的反向重复序列。因此，在一个实施方案中，本公开的载体可包含不超过1对、不超过2对、不超过3对或不超过4对反向末端重复序列。在一个实施方案中，本公开的载体可
仅包含一个反向末端重复序列。
[0122]
在实施方案中，本发明的反向末端重复序列可形成完全反向末端重复序列(或可互换地称为“完全反向重复序列”)或不完全反向末端重复序列(或可互换地称为“不完全反向重复序列”)。如本文所用，术语“完全反向重复序列”是指以相反方向放置的两个相同dna序列。相比之下，术语“不完全反向重复序列”是指除了含有一些不匹配之外彼此相似的两个dna序列。这些重复序列(即完全反向重复序列和不完全反向重复序列两者)是转座酶的结合位点。
[0123]
在一些实施方案中，非病毒载体的itr是piggybac样转座子的那些，任选地包含ttaa重复序列，并且/或者itr位于abca4的侧翼。piggybac样转座子通过“剪切和粘贴”机制转座，并且piggybac样转座子可包含ttaa重复序列。piggybac转座子是用于基因修饰的常用转座子系统，并且在实际转座事件过程中不需要dna合成。piggybac元件可通过转座酶从供体染色体中切割，并且分裂的供体dna可与dna连接酶重新连接。zhao等人translational lung cancer research,2006；5(1):120
–
125。piggybac转座子显示精确切除，即使序列恢复至其整合前状态。yusa.piggybac transposon.microbiol spectr.2015年4月；3(2)。在一些实施方案中，基因转移构建体包含super piggybac
tm
(spb)转座酶。参见barnett等人blood 2016；128(22):2167。
[0124]
在一些实施方案中，可使用其它非病毒基因转移工具，如例如，睡美人转座子系统。参见，例如aronovi ch等人human molecular genetics,2011；20(r1),r14
–
r20。
[0125]
在一些实施方案中，可对转座子系统的序列进行密码子优化，以在哺乳动物系统中提供改善的mrna稳定性和蛋白质表达。
[0126]
在各种实施方案中，基因转移构建体可以是任何合适的遗传构建体，如核酸构建体、质粒或载体。在各种实施方案中，基因转移构建体是dna。在一些实施方案中，基因转移构建体是rna。在一些实施方案中，基因转移构建体可具有dna序列和rna序列。
[0127]
在实施方案中，本发明的核酸包括聚合形式的任何长度的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或它们的类似物或衍生物。在实施方案中，提供了双链和单链dna，以及双链和单链rna，以及rna-dna杂合体。在实施方案中，提供了转录激活的多核苷酸，如甲基化或加帽多核苷酸。在实施方案中，本发明的组合物是mrna或dna。
[0128]
在实施方案中，本发明的非病毒载体是包含编码多肽的多核苷酸并可操作地连接至控制序列的线性或环状dna分子，其中所述控制序列提供编码所述多肽的多核苷酸的表达。在实施方案中，所述非病毒载体包含启动子序列以及转录和翻译终止信号序列。此类载体可尤其包括染色体和附加型载体，例如，源自细菌质粒、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件的载体，以及源自它们的组合的载体。本发明的构建体可含有调控以及引起表达的控制区。
[0129]
在一些实施方案中，基因转移构建体可以是密码子优化的。在所描述的实施方案中，编码abca4或其功能片段的核酸充当整合到宿主基因组(例如，人基因组)中的转基因，以提供所需的临床结果。转基因密码子优化可用于优化转基因的治疗潜力及其在宿主生物体中的表达。进行密码子优化以使转基因中的密码子使用与宿主生物体或细胞中每个密码子的转移rna(trna)的丰度相匹配。密码子优化方法是本领域中已知的，并在且描述于，例如，wo 2007/142954中，所述专利以引用的方式整体并入本文。优化策略可包括，例如，翻译
起始区的修改、mrna结构元件的改变以及使用不同的密码子偏倚。
[0130]
基因转移构建体包含被选择以确保构建体的稳定表达的若干其它调控元件。因此，在一些实施方案中，非病毒载体是dna质粒，所述dna质粒可包含防止或减轻邻近基因的激活或失活的一个或多个绝缘子序列。在一些实施方案中，一个或多个绝缘子序列包含hs4绝缘子(1.2-kb 5'-hs4鸡β-珠蛋白(chs4)绝缘子元件)和d4z4绝缘子(与面肩肱型营养不良(fshd)相关的串联大卫星重复序列)。在一些实施方案中，hs4绝缘子和d4z4绝缘子的序列如rival-gervier等人mol ther.2013年8月；21(8):1536-50中所述，所述文献以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，基因转移构建体的基因能够在转座酶存在下转座。在一些实施方案中，根据本公开的实施方案的非病毒载体包含编码转座酶的核酸构建体。转座酶可以是rna转座酶质粒。在一些实施方案中，非病毒载体还包含编码dna转座酶质粒的核酸构建体。在一些实施方案中，转座酶是体外转录的mrna转座酶。转座酶能够从基因转移构建体中切除基因和/或使基因从基因转移构建体转座至位点或基因座特异性基因组区域。
[0131]
包含根据本公开的基因转移构建体的组合物可包含一个或多个非病毒载体。此外，转座酶可与具有转基因的转座子设置在同一(顺式)或不同载体(反式)上。因此，在一些实施方案中，转座酶和包含转基因的转座子呈顺式构型，使得它们包含在同一载体中。在一些实施方案中，转座酶和包含转基因的转座子呈反式构型，使得它们包含在不同的载体中。载体是根据本公开的任何非病毒载体。
[0132]
在一些实施方案中，转座酶来源于家蚕、热带爪蟾、粉纹夜蛾、马铁菊头蝠、埃及果蝠、苍白矛吻蝠、大鼠耳蝠、小棕蝠、大狐蝠、库氏伏翼、黑猩猩、獒蝠或智人，和/或是其工程化型式。在一些实施方案中，转座酶特异性地识别itr。转座酶可包含编码家蚕、热带爪蟾或粉纹夜蛾蛋白的dna或rna序列。参见例如，美国专利号10,041,077，所述专利以引用的方式整体并入本文。
[0133]
然而，在一些实施方案中，转座酶可作为蛋白质直接引入细胞中，例如使用细胞穿透肽(例如，如ramsey和flynn.pharmacol.ther.2915；154:78-86中所描述)；使用包括盐加丙烷甜菜碱的小分子(例如，如astolfo等人cell 2015；161:674-690中所述)；或电穿孔(例如，如morgan和day.methods in molecular biology 1995；48:63-71中所述)。
[0134]
在一些实施方案中，转座子系统可如，例如美国专利号10,435,696中所描述来实施，所述专利以引用的方式整体并入本文。
[0135]
在一些实施方案中，所描述的组合物包含特定比例的转基因(例如，abca4或其功能片段)和转座酶。在一些实施方案中，选择转基因与转座酶比例，以提高转座活性的效率。转基因与转座酶比例可取决于经转染的基因转移构建体的浓度和其它因素。在一些实施方案中，编码abca4或其功能片段的核酸与编码转座酶的核酸构建体的比例是约5:1、或约4:1、或约3:1、或约2:1、或约1:1、或约1:2、或约1:3、或约1:4或约1:5。在一些实施方案中，编码abca4蛋白的核酸与编码转座酶的核酸构建体的比例是约2:1。在一些方面，提供了包含基因转移构建体的组合物。在实施方案中，所述组合物包含(a)编码atp结合盒亚家族a成员4(abc)转运体(abca4)蛋白或其功能片段的核酸；(b)cag启动子；和(c)非病毒载体，所述非病毒载体包含一个或多个转座酶识别位点和一个或多个反向末端重复序列(i tr)或末端序列，其中所述abca4蛋白是包含编码蛋白质的核苷酸序列的人abca4蛋白或其功能片段，
(i-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)、n-(i-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、n,n-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(dodma)、1,2-二亚油烯基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1,2-二亚麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、1,2-二亚油烯基氨基甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-c-dap)、1,2-二亚油烯基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(dlin-dac)、1,2-二亚油烯基氧基-3-吗啉代丙烷(dlin-ma)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(dlindap)、1,2-二亚油烯基硫代-3-二甲基氨基丙烷(dlin-s-dma)、1-亚油酰基-2-亚油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-2-dmap)、1,2-二亚油烯基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(dlin-tma.cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(dlin-tap.cl)、1,2-二亚油烯基氧基-3-(n-甲基哌嗪并)丙烷(dlin-mpz)或3-(n,n-二亚油烯基氨基)-1,2-丙二醇(dlinap)、3-(n,n-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(doap)、1,2-二亚油烯基氧代-3-(2-n,n-二甲基氨基)乙氧基丙烷(dlin-eg-dma)、1,2-二亚麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(dlin-k-dma)或其类似物、(3ar,5s,6as)-n,n-二甲基-2,2-二((9z,12z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3ah-环戊[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-胺(aln100)、(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(mc3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(双(2
‑‘
)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)二十二烷-2-醇(tech g1)或它们的混合物。
[0143]
在一些实施方案中，lnp包含选自以下的一种或多种分子：聚乙烯亚胺(pei)和聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)和n-乙酰半乳糖胺(galnac)，所述分子适用于肝脏递送。在一些实施方案中，lnp包含如例如美国专利号5,985,826中所描述的脏脏导向性化合物，所述专利以引用的方式整体并入本文。已知galnac靶向在哺乳动物肝细胞上表达的去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)。参见hu等人protein pept lett.2014；21(10):1025-30。
[0144]
在一些实例中，本公开的基因转移构建体可与pei或其衍生物，如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-n-乙酰半乳糖胺(pei-peg-gal)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-n-乙酰半乳糖胺(pei-peg-trigal)衍生物一起配制或复合。
[0145]
在一些实施方案中，lnp是缀合脂质，所述缀合脂质的非限制性实例包括聚乙二醇(peg)脂质，包括但不限于peg-二酰基甘油(dag)、peg-二烷基氧基丙基(daa)、peg-磷脂、peg-神经酰胺(cer)或它们的混合物。peg-daa缀合物可以是例如，peg-二月桂基氧基丙基(c12)、peg-二肉豆蔻基氧基丙基(c14)、peg-二棕榈基氧基丙基(c16)或peg-二硬脂基氧基丙基(c18)。
[0146]
在实施方案中，纳米颗粒是直径小于约1000nm的颗粒。在一些实施方案中，本公开的纳米颗粒具有约500nm或更小、或400nm或更小、或300nm或更小、或200nm或更小、或100nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒具有介于约50nm与约150nm之间、或介于约70nm与约130nm之间、或介于约80nm与约120nm之间或介于约90nm与约110nm之间的最大尺寸。在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒具有约100nm的最大尺寸(例如，直径)。
[0147]
在一些方面，根据本公开的组合物可通过体内遗传修饰方法递送。在一些实施方案中，根据本公开的基因修饰可通过离体方法进行。
[0148]
因此，在一些实施方案中，提供了一种用于预防患者中的光感受器丧失或降低患
者中的光感受器丧失速率的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据本公开的任何实施方案或实施方案的组合的组合物。所述方法包括通过合适的途径递送组合物，包括通过注射施用。
[0149]
在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可提供光感受器丧失的持久预防或光感受器丧失速率的持久降低，并且因此可减少或消除对额外治疗剂的需要。例如，在一些实施方案中，所述方法在不存在类固醇治疗的情况下进行。所述方法可以是基本上非免疫原性的。
[0150]
在一些方面，本发明提供了一种离体基因治疗方法。因此，在一些方面，提供了一种用于预防患者中的光感受器丧失或降低患者中的光感受器丧失速率的方法，所述方法包括(a)使从患者(自体)或另一个体(同种异体)获得的细胞与根据本公开的实施方案的组合物接触；以及(b)将所述细胞施用于有需要的患者。
[0151]
在一些方面，提供了用于治疗和/或减轻遗传性黄斑变性(i md)的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据本公开的实施方案的组合物。在这种体内方法中，使用本文所述的任何技术施用所述组合物。
[0152]
在一些实施方案中，本文所述的体内和离体方法可治疗各种md和减缓各种md的进展，所述md是以双侧对称中心视觉丧失为特征的一组异质性病症。md包括斯塔加特病、贝斯特疾病、x连锁视网膜劈裂症、图形样营养不良、索斯比眼底营养不良和常染色体显性玻璃疣。贝斯特疾病是与best1中的致病性变体相关的常染色体显性疾患；x连锁视网膜劈裂症(xlrs)是男性青少年中最常见形式的青少年发作型视网膜变性；图形样营养不良(pd)是特征在于在rpe水平下色素沉积的可变分布的一组病症；索斯比眼底营养不良(sfd)是通常在生命的第五个十年导致双侧中心视觉丧失的罕见黄斑营养不良；并且常染色体显性玻璃疣(add)是特征在于黄斑处的玻璃疣样沉积的常染色体显性疾患，其可具有放射状或蜂窝状外观。参见rahman等人,br j ophthalmol.2020；104(4):451
–
460。
[0153]
在一些方面，提供了一种用于治疗和/或减轻imd的离体方法，所述方法包括(a)使从患者或另一个体获得的细胞与根据本公开的实施方案的组合物接触，以及(b)将细胞施用于有需要的患者。在一些实施方案中，imd是stgd。在一些实施方案中，stgd是stgd 1型(stgd1)。在一些实施方案中，stgd疾病可以是stgd 3型(stgd3)或stgd 4型(stgd4)疾病。
[0154]
在一些实施方案中，imd的特征在于abca4、elovl4、prom1、best1和prph2中的一者或多者中的一个或多个突变。在一些实施方案中，abca4突变是常染色体隐性突变。
[0155]
elovl4 (延伸极长链脂肪酸蛋白4)中的突变显示导致以视网膜变性为特征的stgd3。agbaga等人,pnas 2008年9月2日；105(35)12843-12848；还参见zhang等人,nat genet.2001；1月；27(1):89-93。stgd3的临床特征与stgd1非常相似。
[0156]
prom1(凸素1基因)编码五次跨膜(pentaspan)跨膜糖蛋白，其是定位于膜凸起的蛋白质。yang等人,j clin invest.2008；118(8):2908-2916。prom1基因中的突变已显示导致视网膜色素变性和斯塔加特病，并且这种基因由以组织依赖性方式表达的至少五个替代启动子表达。参见，例如等人,int j oncol.2014；45(6):2208-2220。
[0157]
best1基因提供用于制备称为卵黄状黄斑病蛋白-1的蛋白质的指令，所述蛋白质似乎在正常视力中起关键作用。由于邻近rpe细胞中的原发性离子通道病(channelopathy)，所以best1基因中的突变引起视网膜脱离和光感受器(pr)细胞变性。
guziewicz等人,pnas2018年3月20日115(12)e2839-e2848；还参见petrukhin等人,nature genetics 1998；第19卷:241
–
247。best1的致病性变体与贝斯特疾病(bd)有关，贝斯特疾病是第二大最常见的md，影响大约10 000中的1人。rahman等人,br j ophthalmol.2020年4月；104(4):451-460。best1序列变体也导致至少四种其它表型，如成人卵黄样md、常染色体显性玻璃体脉络膜病变、常染色体隐性卵黄状黄斑病蛋白病变(bestrophinopathy)和视网膜色素变性。同上。
[0158]
prph2(外周蛋白-2)基因编码称为外周蛋白-2/慢性视网膜变性(rds)的pr特异性四次跨膜蛋白，并且prph2中的突变已显示导致多种形式的视网膜色素变性和黄斑变性。conley和naash.cold spring harb perspect med.2014年8月28日；4(11):a017376。在患有斯塔加特黄斑变性的患者中已经鉴定了prph2中的突变。
[0159]
abca4、elovl4、prom1、best1和prph2中的一者或多者中的致病性突变可使用所描述的用于治疗和/或减轻相关黄斑营养不良疾患的方法进行纠正。
[0160]
离体基因疗法的优点之一是能够在患者施用前对转导的细胞进行“取样”。这有助于功效，并且允许在将细胞引入患者中之前进行安全性检查。例如，在输注产品之前可评估转导效率和/或整合的克隆性。本公开提供了可有效用于离体基因修饰的组合物和方法。
[0161]
在一些实施方案中，本文所述的体内方法和离体方法中的任一者改善患者的远视力。在一些实施方案中，所述方法是基本上非免疫原性的。
[0162]
在一些实施方案中，所述方法需要单次施用，这简化本发明组合物的递送并改善总体患者体验。许多罹患各种imd病症的患者是儿童，并且作为一次施用递送根据本公开的一些实施方案的持久的、基本上非免疫原性的治疗促进疗法递送过程并减少患者的负担。
[0163]
如上文所提及，rpe中脂褐质的累积一直与stgd、老年性黄斑变性和其它视网膜疾病的发展相关。脂褐质(一种形成斑点的黄色物质)的团块累积在黄斑内和周围，从而损害中心视觉。脂褐质的主要组分是双-类视黄醇n-亚视黄基-n-视黄基乙醇胺(a2e)，尽管脂褐质包含其它双类视黄醇。a2e是随着年龄增长或在一些视网膜病症(如stgd)中在眼睛rpe的溶酶体中累积的荧光物质。rpe脂褐质包括a2e和另外的荧光团-a2e的双键异构体，异-a2e。关于a2e和异-a2e的光化学的研究表明，它们以4 4(a2e):1(异-a2e)的光平衡态(photoequilibrium)存在。参见parish等人,proc natl acad sci usa.1998；95(25):14609
–
13。a2e显示引发rpe中脂褐质样碎片的累积。mihai和washington.cell death&disease 5,e1348(2014)。a2e可导致在人眼睛中发现的rpe碎片，其涵盖脂褐质样体、晚期溶酶体、异常糖原和脂质沉积物以及显示电子密度不均的包涵体。同上。a2e因此驱动视网膜衰老和相关的变性。a2e的化学前体维生素a醛(视黄醛)也在变性过程中发挥作用。同上。
[0164]
因此，降低视黄醛、a2e和异-a2e中的一者或多者的水平可治疗或减轻视网膜中(例如，rpe和/或下面的布鲁赫氏膜中)的脂褐质累积。在一些实施方案中，所述方法减少或预防rpe碎片的形成。在一些实施方案中，降低视黄醛、a2e和异-a2e中的一者或多者的水平可治疗或减轻rpe和布鲁赫氏膜(bm)中维生素a二聚体的累积。
[0165]
因此，在一些实施方案中，相对于在没有施用本发明组合物的情况下视黄醛、a2e和异-a2e中的一者或多者的水平，所述方法提供视黄醛、n-亚视黄基-n-视黄基乙醇胺(a2e)和异-a2e中的一者或多者的降低。在一些实施方案中，视黄醛、a2e和异-a2e中的一者或多者的水平(相对于在没有施用本发明组合物的情况下视黄醛、a2e和异-a2e中的一者或
多者的水平)被降低大于至少约40％。在一些实施方案中，所述方法提供大于约40％、或大于约50％、或大于约60％、或大于约70％、或大于约80％、或大于约90％降低。
[0166]
在一些实施方案中，将编码转座酶的核酸构建体施用于患者。转座酶可来源于家蚕、热带爪蟾、粉纹夜蛾、马铁菊头蝠、埃及果蝠、苍白矛吻蝠、大鼠耳蝠、小棕蝠、大狐蝠、库氏伏翼、黑猩猩、獒蝠或智人，和/或其工程化型式。
[0167]
在一些实施方案中，用于预防患者中的光感受器丧失或降低患者中的光感受器丧失速率的离体方法包括使所述细胞与编码任选地来源于家蚕、热带爪蟾、粉纹夜蛾、马铁菊头蝠、埃及果蝠、苍白矛吻蝠、大鼠耳蝠、小棕蝠、大狐蝠、库氏伏翼、黑猩猩、獒蝠或智人的转座酶和/或其工程化型式的核酸构建体接触。
[0168]
在一些实施方案中，用于预防患者中的光感受器丧失或降低患者中的光感受器丧失速率的方法在不存在类固醇治疗的情况下进行。类固醇，如糖皮质激素类固醇(例如，强的松)已被用于通过减少免疫应答来提高基于aav的基因疗法的有效性。然而，类固醇治疗并非没有副作用。本公开的组合物和方法可以是基本上非免疫原性的，并且因此可消除对类固醇治疗的需要。
[0169]
然而，在一些实施方案中，所述方法与类固醇治疗组合进行。
[0170]
在一些实施方案中，所述方法可用于将所描述的组合物与一种或多种额外治疗剂组合施用。额外治疗剂的非限制性实例包括抗血管内皮生长因子(vegf)治疗剂，包括阿柏西普(eylea)、兰尼单抗(lucentis)和贝伐单抗(avastin)中的一者或多者。额外治疗剂可包括氘化维生素a和/或其它维生素或营养补充剂(例如，β胡萝卜素、叶黄素和玉米黄质)。
[0171]
施用可以是玻璃体内或视网膜内施用。在一些实施方案中，施用是施用至rpe细胞和/或光感受器。根据本公开的用于非病毒基因疗法的组合物可通过各种递送途径施用，包括通过注射施用。在一些实施方案中，注射是玻璃体内或视网膜内注射。在一些实施方案中，注射是玻璃体下或视网膜下注射。在一些实施方案中，注射是rpe下注射。
[0172]
在一些实施方案中，与缺乏治疗相比，用于治疗和/或减轻imd的体外或离体方法提供改善的远视力和/或降低的光感受器丧失速率。在一些实施方案中，所述方法使得最佳矫正视力(bcva)提高至大于约20/200。
[0173]
在一些实施方案中，如通过眼底自发荧光(faf)或谱域光学相干断层扫描(sd-oct)所测量，用于治疗和/或减轻imd的方法使得视网膜或中央凹形态改善。faf是用于提供视网膜色素上皮中脂褐质的密度图的非侵入性视网膜成像模式。参见madeline等人,int j retin vitr2,12(2016)；sepah等人,saudi j ophthalmol.2014；28(2):111
–
116；sparrow等人,investigative ophtha lmology&visual science 2010年9月；第51卷:4351-4357。
[0174]
sd-oct是通过对干涉条纹图案的光谱分析提供在反向散射光的量值和延迟中编码的深度分辨组织结构信息的干涉测量技术。yaqoob等人,biotechniques,第39卷,第6s期；在线公开:2018年5月30日。也可使用其它成像技术，包括例如扫描激光检眼镜检查(slo)、荧光寿命成像检眼镜检查(flio)和双光子显微成像(tpm)。可对使用合适的技术获得的(单眼或双眼)图像进行分析，以评估患者的参数，包括荧光强度。例如，特征在于自发荧光强度的普遍增加的faf表明在疾病早期阶段的斯塔加特病。burke等人,invest ophthalmol vis sci.2014；55:2841
–
2852。
[0175]
在一些实施方案中，所述方法使得减少或预防患者中波状视觉、盲点、模糊、深度
知觉丧失、对眩光的敏感性、色觉受损和难以适应暗光(暗适应延迟)中的一者或多者。
[0176]
在一些实施方案中，所述方法可用于将所描述的组合物与一种或多种额外治疗剂组合施用。额外治疗剂的非限制性实例包括索雷拉赞、异维甲酸、羟苯磺酸盐、4-甲基吡唑、alk-001 9(c20氘化维生素a)、芬维a胺(一种合成形式的维生素a)、lbs-500、a1120、依舒司他、非诺贝特和培戈-阿伐普他中的一者或多者。在一些实施方案中，所述方法消除对额外治疗剂的需要，所述额外治疗剂可以是上述治疗剂中的任一者。
[0177]
在一些实施方案中，所述方法消除对类固醇治疗的需要。
[0178]
在一些实施方案中，根据本公开的组合物包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0179]
配制合适的药物组合物的方法是本领域中已知的，参见例如，remington:the science and practice of pharmacy,第21版,2005；和the booksin the series drugs and the pharmaceutical sciences:a series of textbooks and monographs(dekker,n.y.)。例如，适于可注射使用的药物组合物可包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor el
tm
(basf,parsippany,n.j.)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的，并且流体应易于通过注射器抽取。在制造和储存条件下，所述组合物应该稳定并且必须在贮存中防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可通过不同的抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)、氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的剂(例如单硬脂酸铝和明胶)而使可注射组合物的吸收延长。
[0180]
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物(根据需要)与以上列举的成分中的一种或其组合一起并入适当溶剂中、随后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基本分散介质以及来自以上列举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加来自其先前无菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉末。
[0181]
治疗性化合物可与将保护治疗性化合物免于从身体快速消除的载体一起制备，诸如受控释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如胶原蛋白、乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐(例如聚[1,3-双(羧基苯氧基)丙烷-共-癸二酸](pcpp-sa)基质、脂肪酸二聚体-癸二酸(fad-sa)共聚物、聚(丙交酯-共-乙交酯))、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乙二醇包被的脂质体和聚乳酸。此类制剂可使用标准技术制备，或者例如从alza corporation和nova pharmaceutical s,inc商业上获得。脂质体悬浮液也可用作药物上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法，例如，如美国专利号4,522,811中所述来制备。可使用半固体、胶凝、软凝胶或其它制剂(包括受控释放)，例如当需要施用至手术部位时。制备此类制剂的方法是本领域中已知的，并且可包括使用生物
可降解的、生物相容的聚合物。参见，例如sawyer等人,yale j biol med.2006；79(3-4):141-152。
[0182]
在实施方案中，提供了一种在转座酶存在下使用本文所述的基因转移构建体转化细胞以产生稳定转染的细胞的方法，所述稳定转染的细胞由目标基因稳定整合到细胞中而产生。在实施方案中，稳定整合包括将多核苷酸引入到细胞的染色体或微型染色体中并且因此成为细胞基因组的相对永久部分。
[0183]
在实施方案中，本发明涉及确定目标基因，例如abca4是否转移到宿主的基因组中。在一个实施方案中，所述方法可包括进行与位于目标基因侧翼的引物的聚合酶链反应；确定所获得的经扩增的聚合酶链反应产物的大小；以及将所获得的产物的大小与参考大小进行比较，其中如果所获得的产物的大小与预期大小相匹配，则所述目标基因成功地转移。
[0184]
在实施方案中，提供了一种包含如本文所述的组合物(例如，但不限于包含基因转移构建体和/或转座酶的组合物)的宿主细胞。在各实施方案中，宿主细胞是原核或真核细胞，例如哺乳动物细胞。
[0185]
在实施方案中，提供了一种转基因生物体，所述转基因生物体可包含已经通过本公开的方法转化的细胞。在一个实例中，生物体可以是哺乳动物或昆虫。当生物体是哺乳动物时，所述生物体可包括但不限于小鼠、大鼠、猴、狗、兔等。当生物体是昆虫时，所述生物体可包括但不限于果蝇、蚊子、螟蛉虫等。
[0186]
所述组合物可与施用说明书一起包括在容器、药盒、包装或分配器中。
[0187]
本文还提供了药盒，所述药盒包括：i)本发明的任何上述基因转移构建体，和/或本发明的任何上述细胞，以及ii)容器。在某些实施方案中，药盒还包括其使用说明书。在某些实施方案中，任何上述药盒还可包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含编码转座酶的核酸序列。
[0188]
通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
[0189]
定义
[0190]
如本文所用，“一个/种(a/an)”或“所述(the)”可意指一个或多于一个/种。
[0191]
另外，当与参考数字指示结合使用时，术语“约”意指参考数字指示加上或减去该参考数字指示的多至10％。例如，语言“约50”涵盖了45至55的范围。
[0192]
当与医疗用途结合使用时，“有效量”是有效于提供对目标疾病的可测量治疗、预防或其发病率的降低的量。
[0193]
如本文所提及的，除非另外指定，否则所有组成百分比均按总组合物的重量计。如本文所用的，单词“包括”及其变型意图为非限制性的，以使得列表中的项目的详述不排除也可适用于此技术的组合物和方法的其它类似项目。类似地，术语“可以(can)”和“可(may)”以及其变型意图为非限制性的，以使得实施方案可以或可包括某些要素或特征的详述不排除不包含那些要素或特征的本技术的其它实施方案。
[0194]
尽管作为诸如包括、含有或具有等术语的同义词的开放式术语“包含”在本文中用于描述并要求保护本发明，可替代地可使用诸如“由
…
组成”或“基本上由
…
组成”的替代性术语来描述本发明或其实施方案。
[0195]
如本文所用，单词“优选的”和“优选地”是指本技术在某些情况下提供某些益处的实施方案。然而，在相同或其它情况下，其它实施方案也可以是优选的。此外，一个或多个优
选实施方案的详述并不意味着其它实施方案不是有用的，并且并不意图从本技术的范围内排除其它实施方案。
[0196]
本文描述的实现治疗效果所需要的组合物的量可出于特定目的根据常规程序凭经验确定。通常，对于出于治疗目的而施用治疗剂，以药理学有效剂量给予所述治疗剂。“药理学有效量”、“药理学有效剂量”、“治疗有效量”或“有效量”是指足以产生所需生理效果的量或能够实现所需结果，尤其是治疗病症或疾病的量。如本文所用的有效量包括足以例如延迟病症或疾病的症状的发展、改变病症或疾病的症状的进程(例如，减缓疾病症状的进展)、减少或消除病症或疾病的一个或多个症状或表现并且逆转病症或疾病的症状的量。治疗益处还包括停止或减缓潜在疾病或病症的进展，不论是否实现改善。
[0197]
可通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定有效量、毒性以及治疗效力，所述标准药物程序例如用于测定ld
50
(对约50％群体致死的剂量)和ed
50
(在约50％群体中治疗有效的剂量)。剂量可根据所采用的剂型和使用的施用途径而改变。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，并且可表达为比率ld
50
/ed
50
。在一些实施方案中，表现出大治疗指数的组合物和方法是优选的。可初始地由体外测定，包括例如细胞培养物测定评估治疗有效剂量。另外，可在动物模型中配制剂量，以实现循环血浆浓度范围，所述循环血浆浓度范围包括如在细胞培养物中或在适当的动物模型中测定的ic
50
。可例如通过高效液相色谱测量血浆中所述组合物的水平。可通过合适的生物测定来监测任何特定剂量的效果。可由医师确定剂量，并且必要时进行调整以适合所观察到的治疗作用。
[0198]
如本文所用，“治疗方法”同样适用于治疗本文所述的疾病或病症的组合物的用途和/或用于治疗本文所述的疾病或病症的组合物和/或在制造用于治疗本文所述的疾病或病症的药物中的用途。
[0199]
实施例
[0200]
在下文中，将参考实施例进一步详细地描述本发明。对于本领域的普通技术人员而言将明显的是，这些实施例仅用于说明目的，并且不应被解释为限制本发明的范围。此外，对本领域的技术人员而言将清楚的是，可在不背离本发明的技术范围的情况下进行各种修改和变化。
[0201]
实施例1-转座子表达载体的设计
[0202]
在图1a-1i中示意性地示出的非病毒转座子表达载体经设计和克隆以用于体外、体内和离体转染研究、转座功效和视网膜细胞系中的表达研究。
[0203]
图1a示出具有pgk启动子的磷酸甘油酸激酶(pgk)-gfp转座子构建体，所述构建体用于通过gfp荧光激活细胞分选(facs)测定转座子(tn):转座酶(ts)比率和转座功效。图1b和1c示出转座子构建体，所述转座子构建体用于评估视网膜色素上皮启动子(rpep)(图1b)和光感受器启动子(prp)(图1c)是否选择性地最大化gfp表达(通过facs测定)和拷贝数[使用微滴数字pcr(ddpcr)或定量pcr(qpcr)技术测定]的有效性。
[0204]
图1d示出best-rpep构建体，所述构建体可用于通过流式细胞术和abca4拷贝数(使用例如ddpcr或qpcr)评估abca4的表达。图1e示出best-prp构建体，所述构建体可类似地用于通过流式细胞术和abca4拷贝数(使用例如ddpcr或qpcr)评估abca4的表达。
[0205]
在图1f、1g、1h和1i中示出的转座子构建体用于人ipsc和转基因abca4-/-小鼠研究，所述研究将在下文进行论述。图1f和1h中的构建体包含best-rpep启动子，并且图1g和
1i中的构建体包含best-prp启动子。
[0206]
实施例2-确定不同转座子(tn):转座酶(ts)比率的影响
[0207]
评估了不同转座子(tn):转座酶(ts)比率对视网膜和非视网膜来源的细胞系中稳定绿色荧光蛋白(gfp)表达(》14天)的影响。所述研究涉及建立人视网膜来源的粘附细胞系(arpe-19，rpe-1)和来源的小鼠光感受器细胞系(661w)的培养。hek293(abca4阴性)和hela(abca4阳性)细胞的培养物用作对照。在此实施例中，可使用如图1a中所示的转座子载体。可使用leapin转座酶技术(atum,newark,ca)。
[0208]
用于建立的细胞系的电穿孔的不同条件可使用由组成型启动子驱动的表达gfp的转座子载体，例如如图1a中所示设计的载体进行研究。可用具有两种、三种或大于三种不同tn:ts比率的基因转移构建体转染细胞。产生具有相对较高数量的gfp阳性细胞的培养物的条件可在传代培养中保持14天。在这些研究中，预期14天是允许gfp的瞬时表达丧失的足够时间段。经转染的培养物在14天后通过流式细胞术进行分析，以确定具有保留的gfp表达的细胞的百分比作为稳定表达的量度。gfp表达大于40％的培养物可通过ddpcr或qpcr进行分析，以确定拷贝数。
[0209]
实施例3-选择rpe特异性和光感受器启动子
[0210]
在此研究中，基于启动子在源自视网膜色素上皮(rpe)的视网膜细胞系或光感受器中引起特异性和高水平gfp表达的能力对启动子进行了评估和选择。在此实施例中，可使用如图1b和1c中所示的转座子载体。将rpe(vmd2、irbp、rpe65)、光感受器[pde、视紫红质激酶(rk或grk1)、car(视锥抑制蛋白)、rp1、l-视蛋白]和非特异性启动子(pgk、cag、cmv)克隆到转座子载体中，从而驱动gfp的表达。使用特定条件(所述条件可在实施例2中描述)将所产生的构建体转染到两种人rpe细胞系(arpe-19、rpe-1)、来源的小鼠光感受器细胞系(661w)和两种对照细胞系(hek293、hela)中。(通过肉眼在视觉上或通过流式细胞术)定性地测定相对表达水平，并且在rpe或光感受器细胞系中强烈表达并且在对照细胞中相对较低表达的启动子出于此测定的目的被认为是视网膜特异性的。
[0211]
此外，在此研究中，将用被认为是rpe和光感受器特异性的启动子转染的arpe-19、rpe-1和661w传代培养约14天，并在此时间段后通过流式细胞术进行分析。不同水平的gfp表达被作为这些启动子在所研究细胞系中的相对强度的量度。
[0212]
实施例4
–
确定在视网膜和非视网膜来源的细胞系中，通过视网膜特异性启动子驱动的人abca4的稳定表达
[0213]
内源性abca4阳性和阴性对照使用hek293细胞确认。使用hek293细胞，因为已显示abca4在转染的hek293细胞中具有与它在光感受器中类似的转运功能(参见sabirzhanova等人,j biol chem 2015；290:19743-55；quazi等人,nat commun 2012；3:925)，并且rt-pcr在未转染的hek293中未显示内源性abca4表达(蛋白质图谱)。参见bauwens等人,genet med 2019；21:1761-71。此外，hela细胞表达内源性abca4(蛋白质图谱)。为了确认hek293细胞可用作阴性对照并且hela细胞可用作阳性对照，使用标准方法用针对人abca4的抗体标记细胞。将经标记的细胞通过流式细胞术进行定量，并通过免疫细胞化学技术可视化。此外，内源性abca4的mrna水平通过ddpcr或rt qpcr进行定量。
[0214]
在此研究中，可使用如实施例3中所述选择的rpe特异性启动子和光感受器启动子。将所选择的启动子克隆到转座子载体，例如，如图1d和1e中所示的转座子载体中，从而
驱动人和小鼠abca4两者的表达。使用例如，如实施例2中所述确定的转染条件将转座子构建体转染到人视网膜来源的粘附细胞系(arpe-19、rpe-1)和光感受器细胞系(661w)中。hek293(abca4阴性)和hela(abca4阳性)细胞用作未转染的对照。将细胞传代培养约14天。在此时间段后，使用抗abca4抗体标记细胞，并通过流式细胞术定量表达abca4的细胞的百分比。使用通过流式细胞术分析的荧光细胞的百分比来监测转染效率。
[0215]
此外，使用已知的方法，通过ddpcr或rt qpcr定量abca4转录物的百分比。
[0216]
实施例5
–
产生用于stgd患者ipsc、转基因abca4-/-小鼠和大型动物模型中的研究的转座子(tn)和转座酶(ts)构建体
[0217]
此研究的目的是鉴定用于在患者的个体多能干细胞(ipsc)、转基因abca4-/-小鼠和大型动物模型(例如abcd4突变型拉布拉多寻回犬)中进行体内、体外和离体测试的前导转座子(tn)和转座酶(ts)构建体。可使用如图1f、1g、1h和1i中所示的载体构建体。构建体可包含荧光素酶(pluc)或gfp基因，以及光感受器和rpe特异性启动子。
[0218]
在此研究中，使用经转导细胞的视网膜内递送来进行abca4-/-转基因小鼠或其它动物中的体内研究，以显示转座功效。因此，进行构建体(使用鼠abc4a基因)视网膜内注射到abca4a-/-小鼠中以显示表型的纠正。设计在天然存在的abca4-/-拉布拉多寻回犬中的类似实验(参见makelainen等人,plos genet 2019；15:e1007873)，以显示适当构建体和施用程序的安全性、耐受性和功效。生物分布、剂量反应、药代动力学、药效学、安全性和病理研究在abca4-/-拉布拉多寻回犬(或其它犬模型)或非人灵长类动物(食蟹猴(cynomolgus monkeys；macaca fascicularis))中在glp环境中进行，以逆转视网膜病理。
[0219]
实施例6
–
使用mlt转座酶来转座661w小鼠光感受器细胞
[0220]
此研究的目的是使用由cag-gfp供体构建体驱动的绿色荧光蛋白(gfp)确定使用本公开的mlt转座酶(rna辅助细胞)转座661w光感受器细胞的脂质转染条件。
[0221]
将661w细胞用10ug:5ug比率的供体转座子dna(cag-gfp):mlt转座酶1和mlt转座酶2mrna(供体dna:辅助rna)转染。产生具有相对较高数量的gfp阳性细胞的培养物的条件在传代培养中保持7至14天。预期14天是允许gfp的瞬时表达丧失的足够时间段。在转染后的不同时间点对细胞进行成像，以监测表达并确定哪种条件允许gfp表达至14天。对最佳转染的培养物进行成像并通过流式细胞术进行分析，以确定具有保留的gfp表达的细胞的百分比。gfp表达大于40％的培养物通过qpcr进行分析以确定拷贝数。
[0222]
在本研究中使用了以下剂：供体dna(》1ug/ul，300ul，1xte缓冲液，不含内毒素，无菌)、辅助rna mlt转座酶1(》500ng/ul，100ul，不含核酸酶的水，无菌)和辅助rna mlt转座酶2(》500ng/ul，100ul，不含核酸酶的水，无菌)。表1示出在本研究中使用的试剂。
[0223]
表1.在本研究中使用的试剂。
[0224][0225]
结果
[0226]
图3示出与未转染的细胞相比，在用不同的脂质转染试剂以及本公开的mlt转座酶1或mlt 1(其包含seq id no:13的氨基酸序列)或mlt转座酶2或mlt 2(其包含seq id no:15的氨基酸序列)转染后24小时，661w小鼠光感受器细胞的gfp表达。
[0227]
图4示出在15天内4轮分裂后，小鼠光感受器细胞系661w中通过转座，供体dna(gfp)的稳定整合。
[0228]
图5示出第15天小鼠光感受器细胞系661w中通过转座，供体dna(gfp)的稳定整合的facs分析的结果。
[0229]
如图3所示，所有未转染的细胞均未显示任何gfp表达。使用mlt转座酶1进行转染导致24小时后在661w细胞中存在gfp表达。对于mlt转座酶2观察到同样的结果(图3)。max cag-gfp在mlt转座酶1或mlt转座酶2转染中未表达许多gfp。l3 cag-gfp在转染后24小时表达少量gfp。ltx cag-gfp在转染后24小时表达中等量的gfp。ltx在转染后24小时具有40％-50％表达gfp的细胞。
[0230]
仅在辅助rna(mlt转座酶1或mlt转座酶1)与gfp供体dna长时间共同过表达的条件下，gfp继续在转染的细胞中表达(图4)。细胞在15天时间段内分裂4次，并且仅供体dna条件丧失其表达，而供体dna(gfp)与mlt转座酶1或与mlt转座酶2继续表达gfp。
[0231]
对于所有四种条件在第15天进行facs分析(图5)。facs数据表明，与用gfp供体dna与mlt转座酶2共转染的细胞相比，mlt转座酶1显示更多的gfp表达。与单独供体dna或未转染条件相比，mlt转座酶1和mlt转座酶2两者显示显著更高的gfp表达。
[0232]
总之，这一数据表明，对于lipofectamine，ltx(lipofectamine与plus试剂)是用于用cag-gfp和mlt转座酶1或mlt转座酶2转座661w细胞的有效试剂。mlt转座酶1和mlt转座酶2两者在转染后24小时具有相似的gfp表达，并且由此通过转座产生了供体dna的稳定整合。对于661w细胞类型，与mlt转座酶2相比，mlt转座酶1显示更有效的转座。
[0233]
实施例7
–
用mlt转座酶进行arpe-19人视网膜色素上皮细胞转染
[0234]
此研究的目的是评价使用cag-gfp供体构建体，辅助rna转座酶(ts)与供体dna转座子与两种不同的辅助rna转座酶(mlt转座酶1和mlt转座酶2)对视网膜细胞系中的稳定绿色荧光蛋白(gfp)表达的影响。
[0235]
将arpe-19细胞用10ug:5ug比率的供体转座子dna(cag-gfp):mlt转座酶1和mlt转座酶2mrna(供体dna:辅助rna)转染。产生具有相对较高数量的gfp阳性细胞的培养物的条件在传代培养中保持7至14天。预期14天是允许gfp的瞬时表达丧失的足够时间段。在转染后的不同时间点对细胞进行成像，以监测表达并确定哪种条件允许gfp表达至14天。对最佳转染的培养物进行成像并通过流式细胞术进行分析，以确定具有保留的gfp表达的细胞的百分比。
[0236]
在本研究中使用了以下剂：供体dna(》1ug/ul，300ul，1xte缓冲液，不含内毒素，无菌)、辅助rna mlt转座酶1(》500ng/ul，100ul，不含核酸酶的水，无菌)、辅助rna mlt转座酶2(》500ng/ul，100ul，不含核酸酶的水，无菌)。表2示出在本研究中使用的试剂。
[0237]
表2.在本研究中使用的试剂。
[0238][0239]
图6示出转染后24小时arpe-19细胞中gfp的表达。对于此实验，将arpe-19细胞接种于24孔板中。24小时后，用三种不同的转染系统转染细胞：l3(lipofectamine 3000，thermofisher目录号l3000-001)、ltx(lipofectamine ltx&plus，thermofisher目录号
a12621)和max(lipofectamine messenger max，thermofisher目录号lmrna001)。然后，转染后24小时，针对gfp对细胞进行成像。
[0240]
图7示出mlt转座酶1和mlt转座酶2、转染后24小时的可见gfp表达的较高分辨率图像。
[0241]
图8示出光感受器细胞系arpe19中的供体dna(gfp)与mlt转座酶2(mlt2)的稳定整合。
[0242]
图9示出，facs分析显示在细胞分裂4代后，来自arpe19细胞系的稳定gfp表达。
[0243]
如本研究的结果中所示，所有未转染的细胞均未显示任何gfp表达，这可在图6中观察到。转染后24小时之后，l3和仅cag-gfp表达gfp存在。转染后24小时之后，ltx和仅cag-gfp表达最多的gfp存在。max和cag-gfp也在转染后24小时显示中等水平的gfp表达。在将mlt转座酶1添加至脂质转染试剂和cag-gfp中时，在24小时后细胞中仍存在gfp表达，但表达量不如脂质转染试剂和仅cag-gfp多。mlt转座酶2也是如此(参见图6)。mlt转座酶1和mlt转座酶2的gfp表达效率相似，这可在图7中观察到，其中进行脂质转染试剂 dna与mlt转座酶1(左列)和mlt转座酶2(右列)两者的并排比较。
[0244]
供体dna，gfp被发现仅当它与辅助mlt转座酶1或mlt转座酶2共同过表达时在arpe19细胞系中稳定整合。对gfp的表达进行了15天研究，并在此期间进行4次分裂，以确保可见的信号不是瞬时的。仅供体条件在第2次分裂后失去了其gfp表达(参见图8)。
[0245]
流式细胞术分析揭示，与诸如未转染或仅供体的其它条件相比，mlt转座酶2在供体(gfp)的稳定转座中显著更有效。mlt转座酶1也似乎在gfp的稳定整合中有效(图9)。
[0246]
当仅使用cag-gfp以及使用cag-gfp和mlt转座酶1或mlt转座酶2两者时，lipofectamine&plus是有效的脂质转染试剂。mlt转座酶1和mlt转座酶2两者对于这些arpe-19细胞具有相似的gfp表达率。这些数据表明，mlt转座酶1和mlt转座酶2两者在供体dna稳定转座到基因组中均有效。然而，与mlt转座酶1相比，mlt转座酶2在arpe19细胞系中供体dna的稳定整合中更有效。
[0247]
实施例8
–
使用供体dna(cag-gfp)/mlt转座酶的小鼠体内视网膜下lnp剂量药效学
[0248]
此研究的目的是分析在视网膜下注射两个剂量(高和低)的脂质纳米颗粒(lnp)制剂后小鼠视网膜中gfp表达的水平，所述制剂包含编码供体dna(cag-gfp)的核酸和编码辅助rna(mlt转座酶2或mlt2)的核酸。
[0249]
在本研究中，在视网膜下注射两个剂量的脂质纳米颗粒制剂后测量小鼠视网膜中的gfp表达，所述制剂包含2:1比例的供体dna(cag-gfp)和辅助rna(mlt转座酶2或mlt2)。“高”剂量是500ng/ul(333ng供体dna/166ng辅助rna)，并且“低”剂量是250ng/ul(166ng供体dna/83ng辅助rna)。
[0250]
通过免疫组织化学(ihc)测量光感受器和rpe细胞层中的视网膜gfp表达的结果。
[0251]
左眼注射共同包封在脂质纳米颗粒中的供体dna(cag-gfp)和mlt转座酶2(具有s8p/c13r突变的mlt)。右眼注射被脂质纳米颗粒包封的仅供体dna。目的是证明mlt转座酶2可转染视网膜中的arpe-19细胞而不引起细胞损伤。
[0252]
在本研究中，使用编码cag-gfp(vb200819-1024gzm)的dna和编码mlt转座酶2(vb200926-1055qkq)的rna。lnp制剂具有阳离子脂质、胆固醇、磷脂和peg脂质。表2包括关于本实验中使用的小鼠的信息。
[0253]
表2.试验动物和施用于所述动物的剂的描述。
[0254][0255][0256]
结果
[0257]
使用phoenix micron iv
tm
视网膜成像显微镜，眼底成像捕获小鼠眼睛的图像。
[0258]
图10a和10b示出注射pbs的小鼠1-1l左眼(图10a)和1-1l右眼(图10b)的图像。
[0259]
图11a、11b、11c和11d示出注射仅dna的小鼠3-1l和3-1r右眼(图11a和图11c)以及注射供体dna和mlt 2的小鼠3-1和3-1r左眼(图11b和图11d)的图像。
[0260]
图12a和12b示出注射供体dna(图12a)和mlt 2(图12b)的小鼠4-1r右眼的图像。
[0261]
图13a和13b示出小鼠4-np注射仅供体dna的右眼(图13a)以及注射供体dna和mlt 2两者的左眼(图13b)的图像。
[0262]
图14a和14b示出小鼠4-1l注射仅供体dna的右眼(图14a)以及注射供体dna和mlt 2两者的左眼(图14b)的图像。
[0263]
图15a和15b示出小鼠5-bp注射仅供体dna的右眼(图15a)以及注射供体dna和mlt 2两者的左眼(图15b)的图像。
[0264]
图16示出本研究的总体设置，并且另外示出在视网膜下注射后第21天取得的图像。图17示出在视网膜下注射后第21天取得的小鼠左眼和右眼(分别顶行和底行)的图像，在转染中使用(“ mlt”)或没有使用(
“‑
mlt”)mlt转座酶。在图17中，右眼是对照(仅供体dna)，并且左眼是经处理的眼睛(供体dna mlt 2转座酶)。
[0265]
图10a、10b、11a-11d、12a、12b、13a、13b、14a、14b、15a、15b和17示出用高剂量500ng/ul处理的小鼠眼睛的图像。
[0266]
此研究的结果表明，mlt转座酶2在与供体dna(在此实施例中，cag-gfp)共包封的情况下视网膜下注射时不会不利地影响小鼠眼睛。如图14a和14b所示，视网膜下注射后7天，双眼没有明显损伤并且表现出gfp表达。注意到动物与动物之间以及还有同一动物的左眼与右眼之间的一些手术效率差异。
[0267]
在本研究中，导致来自供体dna的基因的成功转座的mlt转座酶剂量被确定为500ng/ul(333ng dna/166ng rna)。
[0268]
总之，本研究显示在将lnp视网膜下注射到眼睛中后，转基因(绿色荧光蛋白(gfp)，用作转基因的工作实施例)的阳性表达。转基因的表达持续直到21天(参见图17)，从而证明本发明方法用于治疗用途的可行性。
[0269]
等效方案
[0270]
尽管已经结合本发明具体的实施方案描述了本发明，但应理解本发明能够具有另外的修改，并且本技术意图涵盖通常遵循本发明原理的、包括虽然不属于本发明所公开内容范围但属于本发明所属领域的公知技术或常用的技术手段并可以应用于上文中阐述和所附权利要求的范围所列出的必要特征的任何变型、用途或者变更。
[0271]
本领域技术人员仅使用常规实验将会认识到或将能够确定本文中确切描述的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案意图涵盖在所附权利要求书的范围中。
[0272]
以引用的方式并入
[0273]
本文引用的所有专利和公布特此以引用的方式整体并入。
[0274]
本文所论述的公开仅为其在本技术的申请日之前的公开内容而提供。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权凭借先前的发明先于这种公布。
[0275]
如本文所用，所有标题仅用于组织并且不旨在以任何方式限制本公开。任何单独部分的内容可能同样适用于所有部分。