用于治疗人骨关节炎的基于腺病毒的生物递送和表达系统的有效剂量以及包含其的组合物
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2020年1月28日提交的美国临时申请号62/966,632和2019年9月18日提交的美国临时申请号62/902,041的权益，将这些申请的内容通过引用以其整体并入本文。通过引用并入序列表
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背景技术：
3.骨关节炎(oa)是在人或哺乳动物关节中发生的退行性关节病，并且构成严重的经济和医学问题(matthews,g.l.和hunter,d.j.(2011).emerging drugs for osteoarthritis.expert opin.emerging drugs 1-13.；brooks pm.impact of osteoarthritis on individuals and society:how much disability？social consequences and health economic implications.curr opin rheumatol 2002；14:573-577)。软骨是覆盖关节中的骨端部的坚韧结缔组织。它提供硬骨之间的相对无摩擦的、高度润滑的表面，并且允许平滑的运动。oa的发展开始于炎症，随后由于异常或过度磨损而部分或完全损失软骨，这导致骨端部暴露并互相摩擦，导致疼痛、肿胀或丧失活动能力。到目前为止，导致oa的初始软骨损失的详细原因尚不清楚，但是在发生率与年龄、肥胖症和关节过度使用如过度体育运动之间存在强相关性。
4.虽然估计有超过100种关节炎，但骨关节炎(oa)是关节炎的最常见形式，影响着3250万美国成人。关节炎的高出现率显现出巨大的社会和个人成本。
5.无论是对于人还是任何其他哺乳动物物种，目前对于oa都没有可用的治愈性治疗。医学治疗大多旨在使用止痛药物减轻症状，而不是重建磨损的软骨。止痛治疗通常涉及施用类固醇和非类固醇抗炎药(nsaid)，其数十年来在oa治疗中已显示出功效。
6.另外的现有oa治疗包括施用透明质酸，其恢复关节的粘弹性和润滑。注射到关节中或肌内注射的多硫酸化糖胺聚糖以及口服施用的葡糖胺和硫酸软骨素也在oa治疗中显示出一定功效。然而，这些各种治疗的作用机制尚未完全了解。因此，这些目前使用的疗法在oa治疗中仅显示出有限的功效，并且治疗的成功常常取决于病例的严重程度。此外，这些药物必须频繁地施用，有时甚至彼此联合施用。这样频繁地向关节中注射药物是费力的，具有感染的风险，对受试者造成压力并且是昂贵的。另外，用于治疗oa的手术通常显示出低功效，并且通常仅在严重的晚期受试者中进行。因此，对于更有效、持续和成本有效的oa治疗存在明确且还未满足的医学需要。本公开文本解决了这种需要。
技术实现要素：
7.本公开文本提供了一种药物组合物，其包含基于腺病毒的生物递送和表达系统，所述基于腺病毒的生物递送和表达系统用于治疗人关节中的骨关节炎或骨关节炎病症或用于预防经鉴定处于患上骨关节炎或骨关节炎病症的风险中的人中的此类病症，其中所述基于腺病毒的生物递送和表达系统包含辅助依赖性腺病毒载体的基因组拷贝(gc)，所述辅助依赖性腺病毒载体包含编码人白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)蛋白的核酸序列、左反向末端重复和右反向末端重复、腺病毒包装信号和非病毒非编码填充核酸序列，其中人il-1ra基因的表达由nf-κb诱导型启动子调节，所述nf-κb诱导型启动子位于编码所述人il-1ra蛋白的核酸序列的阅读框的上游，其中包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7的核酸序列至少95％同源，并且其中基于腺病毒的生物递送和表达系统包含1.4x108至1.4x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体/毫升(gc/ml)。
8.包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7的核酸序列至少99％同源。
9.包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以包含seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7的核酸序列。
10.在一些实施方案中，包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以与seq id no:7的核酸序列至少95％同源。在一些实施方案中，包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以与seq id no:7的核酸序列至少99％同源。在一些实施方案中，包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以包含seq id no:7的核酸序列。
11.所述基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列中编码所述il-1ra的核酸序列可以包含seq id no:4的核酸。
12.根据seq id no:4的核酸表达与seq id no:6至少95％同源的氨基酸序列的人il-1ra蛋白。
13.所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含：a)1.4x109至1.4x10
12
；b)1.4x109至1.4x10
11
；或c)1.4x109至1.4x10
10
个gc/ml。
14.所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含1.4x109至5.6x109个gc/ml。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含1.4x10
10
至5.6x10
10
个gc/ml。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含1.4x10
11
至5.6x10
11
个gc/ml。
15.所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含2.8x109个gc/ml。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含2.8x10
10
个gc/ml。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含2.8x10
11
个gc/ml。
16.所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含至多5ml的剂量体积。
17.所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含7x109至2.8x10
10
个gc的总剂量。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含7x10
10
至2.8x10
11
个gc的总剂量。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含7x10
11
至2.8x10
12
个gc的总剂量。
18.所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含1.4x10
10
个gc的总剂量。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含1.4x10
11
个gc的总剂量。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含1.4x10
12
个gc的总剂量。
19.所述药物组合物可以配制成用于关节内、腱内、肌内或肩峰下注射至人关节。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物可以配制成用于关节内注射至人关节。
20.本公开文本提供了一种用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染患有骨关节炎或骨关节炎病症的人的一个或多个骨关节炎影响的关节的关节细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：a)用如本文公开的包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物感染有需要的人的骨关节炎影响的关节的关节细胞；以及b)在所述骨关节炎影响的关节内的目标区域中表达il-1ra。
21.可以用所述基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞一次。可以用所述基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次。
22.在一个实施方案中，当用所述基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，每次感染包括相同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体。在另一个实施方案中，当用所述基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体。
23.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，每次感染在所述人的同一骨关节炎影响的关节中进行。当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，第二次感染和后续感染中的每一次在所述人的与进行前一次感染的骨关节炎影响的关节不同的骨关节炎影响的关节中进行。
24.在一些实施方案中，所述关节细胞的感染可以包括关节内、腱内、肌内或肩峰下注射。在一个优选的实施方案中，所述关节细胞的感染可以包括关节内注射。
25.所述方法还可以包括以下步骤：c)在所述骨关节炎影响的关节内的目标区域中表达所述il-1ra后，监测所述骨关节炎影响的关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展。
26.所述方法还可以包括以下步骤：(d)如果监测所述骨关节炎影响的关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的步骤显示所述人关节中的骨关节炎或骨关节炎病症未得到管控或治疗，则继续向有需要的人的所述骨关节炎影响的关节施用所述量的基于腺病毒的生物递送和表达系统；或(e)如果监测所述骨关节炎影响的关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的步骤显示所述人关节中的骨关节炎或骨关节炎病症已有进展，则进一步调节所述量的基于腺病毒的生物递送和表达系统中所述辅助依赖性腺病毒载体的基因组拷贝数并且将其施用于有需要的人的骨关节炎影响的关节。
27.本公开文本提供了一种用于制造根据权利要求1所述的药物组合物的方法，其中所述方法包括：a)培养并连续扩增宿主细胞；b)用本发明的辅助依赖性腺病毒(hdad)和辅助病毒感染(a)的连续扩增的宿主细胞；c)培养b)的感染的细胞；d)收获并裂解c)的感染的细胞以产生细胞裂解物；e)消化d)的细胞裂解物中的宿主细胞dna；f)澄清e)的细胞裂解物；g)对f)的澄清的细胞裂解物进行超速离心；h)从(g)的超速离心的细胞裂解物中收集病毒；i)对(h)的病毒样品进行梯度超速离心；j)从(i)的梯度超速离心的病毒样品中收集病毒；k)对(j)的病毒样品进行等密度超速离心；l)从(k)的等密度超速离心的病毒样品中收集病毒；m)对(l)的病毒样品进行等密度超速离心；n)从(m)的等密度超速离心的病毒样品中收集病毒；o)透析(n)的收集的病毒；p)收集并稀释(o)的透析的病毒；q)配制(p)的稀释的病毒；以及r)过滤(o)的配制的病毒。
28.本公开文本提供了一种基于腺病毒的生物递送和表达系统，其用于治疗人关节中的骨关节炎或骨关节炎病症或用于预防经鉴定处于患上骨关节炎或骨关节炎病症的风险中的人中的此类病症，其中所述基于腺病毒的生物递送和表达系统包含辅助依赖性腺病毒载体的基因组拷贝(gc)，所述辅助依赖性腺病毒载体包含编码人白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)的核酸序列、左反向末端重复和右反向末端重复、腺病毒包装信号和非病毒非编码填充核酸序列，其中人il-1ra基因的表达由nf-κb诱导型启动子调节，所述nf-κb诱导型启动子位于编码所述人il-1ra蛋白的核酸序列的阅读框的上游，其中包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7的核酸序列至少95％同源，其中所述基于腺病毒的生物递送和表达系统从用所述辅助依赖性腺病毒载体和辅助病毒感染的宿主细胞中分离，其中所述基于腺病毒的生物递送和表达系统包含：a)1.4x108至1.4x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体/毫升(gc/ml)在人关节中的滑液；b)小于15％的辅助病毒颗粒；c)小于10％的空衣壳；d)不超过100μg/ml的宿主细胞蛋白；e)不超过20ng/ml的宿主细胞核酸；f)不超过35eu/ml的内毒素；以及g)≤300个gc/tcid
50
的病毒颗粒与感染单位比。
29.上述方面中的任何方面可以与任何其他方面组合。
30.除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。在本说明书中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式也包括复数；作为例子，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述”被理解为单数或复数，并且术语“或”被理解为包括性的。举例来说，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。贯穿本说明书，词语“包含(包括)(comprising)”或变型如“包含(包括)(comprises)”或“包含(包括)(comprising)”应当被理解为暗示包括所述要素、整数或步骤或者多个要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤或者多个要素、整数或步骤的组。约可以被理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的范围内。除非从上下文另外清楚，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
31.尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的那些方法和材料可以用于本公开文本的实践或测试，但下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用以其整体并入。本文引用的参考文献不被认为是要求保护的
公开文本的现有技术。在冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而并不意在是限制性的。从以下具体实施方式和权利要求书中，本公开文本的其他特征和优点将变得清楚。
附图说明
32.图1描绘了humantakinogene hadenovec(fx201)的基因组图谱。itr＝反向末端重复(在5'上1-103bp；在3'上29,158-29,260bp)，ψ＝包装信号(240-375bp)，hprt填充物＝人次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(463-16,518bp)，人粘粒插入物＝人粘粒(16,532-27,637bp)，sv40多聚a＝猿猴病毒40多聚a(27,750-28,020bp)，huil-1ra＝人白细胞介素-1受体拮抗剂，目的基因组(28,033-28,566bp)，nf-kb5-elam启动子＝νφκβινδυχιβλε启动子(28,581-28,842bp)。
33.图2描绘了本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体的基础基因图谱。载体骨架由左反向末端重复序列(itr)和右反向末端重复序列、腺病毒包装信号(ψ)和非编码非病毒填充序列(在itr之间的其余未标记序列)组成。将马il-1ra(gq-201)、鼠il-1ra或人il-1ra的cdna克隆到所使用的腺病毒载体的病毒左itr和右itr之间。il-1-ra的基因受炎症敏感性nf-kb5-elam启动子控制。
34.图3a和图3b描绘了hdad和aav载体在鼠关节中的转导效率。图3a描绘了注射了hdad-gfp和aav6-gfp的代表性关节的比较，所述aav6-gfp似乎是具有最强gfp表达的aav血清型(上部图片：荧光照片；下部图片：相应的明视野照片)。
35.图3b描绘了hdad-gfp与所有aav血清型的比较。示出来自每组两只小鼠的单独关节的图像。
36.图4a和图4b描绘了在辅助依赖性腺病毒载体与第一代腺病毒载体之间标记基因表达的水平和时间段的比较。图4a描绘了用辅助依赖性腺病毒载体和第一代腺病毒载体感染的小鼠的生物发光成像，表明两种载体介导相同水平的标记基因表达。示出来自每组两只小鼠的代表性图片。
37.图4b描绘了图4a中描述的小鼠的萤光素酶表达，随后重复的生物发光成像和量化。
38.图5a和图5b描绘了辅助依赖性腺病毒载体低效地感染滑膜细胞和软骨细胞。向小鼠关节内注射108或109个vp的表达lacz的hdad。一天后，处死小鼠，并且在切片的关节上进行lacz染色。
39.图5a和图5b分别描绘了在用108个vp和109个vp的表达lacz的hdad感染的小鼠的切片关节上的lacz表达的图片，其中较低放大倍数照片(上图)和图5b(左图)(5x)中的加框区域是较高放大倍数照片(下图)(40x)。s代表滑膜，c代表软骨细胞，并且箭头所示的粗黑线描绘lacz染色。
40.图6描绘了用hdad-il-1ra感染的细胞产生大量的il-1ra。y轴描绘了通过用人胚肾细胞(hek293)的细胞培养上清液进行的elisa测量的il-1ra水平，所述人胚肾细胞在有或没有lps刺激的情况下用hdad-il-1ra、hdad-gfp或模拟物感染，如所示。x轴描绘了il-1ra测量的时间段。每个数据点指示3个独立实验，并且误差棒指示sd。
41.图7描绘了hdad-ll-1ra在小鼠中阻止oa的发展。y轴描绘了由盲化病理学家根据
oarsi(国际骨关节炎研究会)标准(按1-6的量表指定得分，1：完全没有oa的体征，6：最大oa)评价的oa水平。x轴描绘了三个处理组：hdad-il-1ra、hdad-gfp或模拟物。*指示显著性差异：p＜0.05，通过单因素anova；n＝10个关节/组。
42.图8a-图8c描绘了小鼠中oa的组织病理学评价。图8a描绘在施用了hdad-mil-1ra、hdad-gfp或媒介物的小鼠中的oarsi得分，图8b描绘滑膜炎得分，并且图8c描绘患有骨赘的关节％。示出平均值
±
sd和单独的膝数据。*p＜0.05；单因素anova和tukey多重比较检验。
43.图9a-图9c描绘了hdad-im ra低效地治疗小鼠中的oa。图9a描绘了与对照相比的hdad-il-1ra治疗的关节的oa得分。y轴上描绘关节内注射了hdad-il-1ra、hdad-gfp或模拟物的108个vp的小鼠的oa得分。盲化病理学家根据oarsi(国际骨关节炎研究会)标准(按1-6的量表指定得分，1：完全没有oa的体征，6：最大oa)评价oa水平。*指示显著性差异：p＜0.05，通过单因素anova；n＝8个关节/组。
44.图9b描绘了与对照相比的hdad-il-1ra治疗的关节的软骨体积。*指示显著性差异：p＜0.05，单因素anova，n＝6个关节/组。
45.图9c描绘了与对照相比的hdad-il-1ra治疗的关节的软骨表面积。*指示显著性差异：p＜0.05，单因素anova，n＝6个关节/组。
46.图10a-图10b描绘了使用微型计算机断层摄影对治疗功效的评价。图10a描绘了软骨体积的变化，并且图10b描绘了被软骨覆盖的骨面积的变化，如在术后两周用hdad-mil-1ra、hdad-gfp或媒介物ia给药的患有预建立的oa的小鼠中以及在未经历clt手术的年龄匹配的小鼠中通过微型ct成像所评估。示出平均值
±
sd和单独的关节值。*p＜0.05；单因素anova和tukey多重比较检验。
47.图11描绘了在假手术大鼠和aclt手术大鼠中，按软骨/骨评价组，软骨/骨oarsi得分的综合(总)得分。y轴指示总oarsi合成得分，并且x轴指示不同的处理和剂量。虚线指示平均值；实线指示中值；点指示离群值；方框末端指示第一四分位数(底部)和第三四分位数(顶部)；须线端部指示最小值和最大值。aclt，前交叉韧带横切；min，最小值；max，最大值；vp，病毒颗粒。
48.图12a-图12d描绘了在假手术大鼠和aclt手术大鼠中，(a)结构变化、(b)sofg染色损失、(c)克隆形成和(d)软骨细胞损失的按组的总得分。y轴指示总oarsi子得分，并且x轴指示不同的处理和剂量。虚线指示平均值；实线指示中值；点指示离群值；方框末端指示第一四分位数(底部)和第三四分位数(顶部)；须线端部指示最小值和最大值。aclt，前交叉韧带横切；min，最小值；max，最大值；vp，病毒颗粒。
49.图13描绘了在假手术大鼠和aclt手术大鼠中，按滑膜评价组，通过h&e染色获得的综合(总)得分。y轴指示总得分，并且x轴指示不同的处理和剂量。虚线指示平均值；实线指示中值；点指示离群值；方框末端指示第一四分位数(底部)和第三四分位数(顶部)；须线端部指示最小值和最大值。aclt，前交叉韧带横切；min，最小值；max，最大值；vp，病毒颗粒。
50.图14描绘了在用hdad-eqil-1ra感染后马il-1ra的体外表达。用不同浓度的hdad-eqil-1ra(gq-201)或hdad-gfp感染的细胞培养物的培养基上清液中的马il-1ra浓度。从第3天到第4天，“b”组与100μg/ml lps一起孵育。示出平均值
±
sem值。
51.图15描绘il-1ra的滑液水平。对于在马关节中的辅助依赖性腺病毒递送的马il-1ra的剂量递增试验，测量滑液中的马滑液il-1ra水平。仅在第90天(注射前)和第92天测量
在首次用于试验的关节中的il-1ra。carpj，腕关节；mcpj，掌指关节；mtpj，跖趾关节；lps，脂多糖；nsaid，非类固醇抗炎药。
52.图16描绘了在马骨软骨芯片模型中oa的临床评分。图16在y轴上描绘了注射的关节在第72天的最终评价时间点的平均值
±
sem临床得分，其对应于如x轴上所示的参数。参数“屈曲”表示关节屈曲20秒后的跛行。*p＜0.05；kruskal-wallis检验，与媒介物组成对比较。
53.图17描绘了马骨软骨芯片模型中处理的关节的软骨原纤维显现。左图描绘了注射了hdad-eqil-1ra(gq-201)的关节、注射了pbs(安慰剂)的关节或假手术关节的中间腕骨(ci)、桡侧腕骨(cr)、中间腕骨的第三面(c3if)和桡侧腕骨的第三面(c3rf)区域中的平均值
±
sem软骨原纤维显现得分。右图描绘了平均值
±
sem总软骨原纤维显现得分；单独得分的总和。*p＜0.05；kruskal-wallis检验，与媒介物组成对比较。
54.图18描绘了马骨软骨芯片模型中处理的关节的组织学分析。左图：在注射了hdad-eqil-1ra(gq-201)的关节、注射了pbs(安慰剂)的关节或假手术关节中评价的参数的平均值
±
sem得分。右图：平均值
±
sem总组织学得分；单独组织学得分的总和。*p＜0.05；kruskal-wallis检验，与媒介物组成对比较。
55.图19a-图19b描绘了示出粘附培养中细胞的活细胞密度和阶段结束时(end of stage)的活力的图。图19a描绘了对于三批fx201和一批大鼠直系同源物，在x轴上对应于5次传代(p1-p5)和感染的接种和结束(收获)时，y轴上以细胞/cm2示出的活细胞密度，如所示。图19b描绘了在如x轴上所示的5次传代(p1-p5)中的每一次和感染的结束时测量的y轴上的阶段结束时的活力(活力百分比)。在两个曲线图中示出tox(人)、tox(大鼠)、eng和gmp批次的所有五次传代和感染的数据。在第5次传代后，将细胞扩增物分成两个流，用于一次另外的共感染。示出细胞扩增数据的第一流。在感染前不进行细胞计数。在传代接种时计算活细胞密度(vcd)，并且在每次传代结束时进行量化。
56.图20描绘了下游处理步骤中的产物收率。对于所示的tox(人)、tox(大鼠)、eng和gmp批次，在y轴上描绘针对批次大小归一化的病毒颗粒(vp)产生(纯化前批次生产率)和收率值(纯化后批次收率和纯化后收率％)。每一批次的数据显示为与这四个批次的平均值的差异百分比。
57.图21描绘了不同批次的感染性和基因表达。对于所示的tox(人)、tox(大鼠)、eng和gmp批次，描绘以tcid
50
量度的感染性和基因组拷贝数与感染比以及il-1ra表达。
具体实施方式
58.本公开文本提供了用于改善的递送和表达系统的组合物，所述改善的递送和表达系统允许在人关节处的细胞中长期表达生物活性重组白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)，所述组合物用于骨关节炎的治疗和预防。本文公开了一种用于关节内(ia)施用的新型il-1ra基因疗法(fx201，humantakinogene hadenovec)，其被开发用于治疗患者的骨关节炎或骨关节炎病症。fx201(humantakinogene hadenovec)是一种辅助依赖性腺病毒(hdad)，它递送处于核因子-κb(nf-κb)诱导型启动子的控制下的编码人il-1ra的核酸序列，用于ia施用于患有骨关节炎或骨关节炎病症的患者。在ia注射后，fx201感染关节中的细胞以响应炎症而局部产生il-1ra。fx201是没有病毒编码序列的非复制的、非整合的hdad载体，其已被
recombination.mol ther 5,204-210.)，其产生基因组质粒pa28-mll-1ra和pa28-eqll-1ra。用pmel消化这些质粒以使载体线性化，释放反向末端重复并切除细菌耐药性基因。如前所述，使用辅助病毒adng163r-2和116细胞工厂救援并扩增载体(palmer,d.和ng,p.(2003).improved system for helper-dependent adenoviral vector production.mol ther 8,846-852；suzuki,m.,cela,r.,clarke,c,bertin,t.k.,mourino,s.和lee,b.(2010).large-scale production of high-quality helper-dependent adenoviral vectors using adherent cells in cell factories.hum gene ther 21,120-126.)。
64.本公开文本的组合物
65.本公开文本的组合物可以包含基于辅助依赖性腺病毒载体的基于腺病毒的生物递送和表达系统，其中所述辅助依赖性腺病毒载体包含编码人或哺乳动物白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)的核酸序列、l itr、r itr、腺病毒包装信号和非病毒非编码填充核酸序列。
66.本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体使宿主中的免疫应答最小化，并且赋予人或哺乳动物il-1ra在受骨关节炎影响的关节中的长期基因表达。
67.在一些方面，本公开文本的组合物中编码人或哺乳动物白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)的序列可以由炎症敏感性启动子控制。不希望受理论的束缚，在本公开文本的组合物中使用炎症敏感性启动子提供对骨关节炎病症组织细胞中il-1ra基因表达的特异性控制，因为仅受所述疾病影响的细胞将表达并分泌il-1ra基因产物，而未受影响的细胞将不表达并分泌il-1ra。在一些方面，所述启动子序列可以位于编码人或哺乳动物il-1ra的序列的阅读框的上游。
68.不希望受理论的束缚，本公开文本的组合物中使用的炎症敏感性启动子可以被增加水平的因子特异性地活化，所述因子包括免疫刺激物质和/或细胞因子。在骨关节炎期间，释放多种免疫刺激物质和细胞因子，导致高水平的启动子活化物质。在一个非限制性例子中，免疫刺激物质可以是脂多糖(lps)，其是革兰氏阴性菌的细胞外膜的主要组分。释放的免疫刺激物质和/或细胞因子可以活化转录因子，如调节nf-κb启动子的nf-κb。因此，这种骨关节病症特异性免疫刺激物质和/或细胞因子的释放可以允许控制人或哺乳动物关节中的基因表达，从而治疗或预防骨关节炎病症。
69.在本公开文本的情况下，可以使用导致il-1ra基因产物在骨关节炎病症组织中特异性表达的任何炎症敏感性启动子。用于本公开文本的优选的炎症敏感性启动子包括但不限于可由以下诱导的启动子：nf-κβ、白细胞介素6(ii-6)、白细胞介素-1(il-1)、肿瘤坏死因子(tnf)、环氧合酶2(cox-2)、补体因子3(c3)、血清淀粉样蛋白a3(saa3)、巨噬细胞炎性蛋白-1a(mip-1a)或上述的杂合构建体。
70.在优选的方面，所述炎症敏感性启动子是nf-κb5-elam启动子。由于若干原因，选择nf-κb诱导型启动子来驱动il-1ra的表达，所述nf-κb诱导型启动子由与人内皮白细胞粘附分子(elam)基因的近端启动子区融合的五个物种保守的nf-κb结合基序重复构成。首先，作为转录因子的nf-κb在身体的所有细胞中普遍表达，并且当用炎性信号刺激时，任何转导的细胞原则上都可以表达il-1ra转基因。因此，对于fx201诱导il-1ra表达没有细胞特异性要求。另外，nf-κb是促炎性细胞因子(如白细胞介素-1(il-1)和肿瘤坏死因子-α)的受体和其他免疫细胞受体(如toll样受体)的末端信号传导分子，其中它起作用以启动对许多促炎
性输入的细胞应答。这样，il-1ra产生的活化被设计成在关节中被各种炎性信号刺激。
71.不希望受理论的束缚，在关节内注射后，il-1ra的基因被递送到关节细胞，所述关节细胞包括但不限于滑膜细胞。受炎症影响的滑膜细胞开始在炎症敏感性启动子(例如nf-κb启动子)的控制下产生重组il-1ra蛋白。然后，大量的il-1ra分泌到关节间隙中，其中il-1ra通过阻断滑膜细胞和软骨中包埋的细胞表面上的白细胞介素-1受体来抑制炎症并阻止软骨降解。最重要的是，高局部浓度的重组il-1ra没有显示出任何副作用。
72.如本文所述，使用本公开文本的基于腺病毒的生物递送和表达系统有效抑制了疼痛、炎症和软骨降解。通过施用本公开文本的组合物实现了治疗性蛋白il-1ra的高局部浓度和低全身浓度，导致在oa治疗中的最大功效，而没有副作用或副作用最小。进一步举例说明，含有本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体的细胞能够在至少3个月、至少6个月或至少一年中的任何一者的延长的时间段内产生重组il-1ra。因此，将显著地降低与在已知短期治疗中需要的频繁关节注射相关的医疗和经济负担。由此，使与oa治疗相关的潜在并发症最少化，并且将保持关节健康，导致所治疗动物或人的持续健康改善。
73.另外，本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体的炎症敏感性il-1ra产生允许预防骨关节炎病症的发展，因为用本公开文本的腺病毒载体感染的关节细胞在不存在能够活化nf-κb5-elam启动子或任何其他炎症敏感性启动子的免疫刺激物质的情况下保持沉默。只有当骨关节炎病症开始时，启动子才由于炎症而被活化，并且随后产生并分泌il-1ra。因此，通过使用本公开文本的腺病毒递送和表达系统，此机制允许预防早期骨关节炎的发展。
74.本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体的炎症敏感性il-1ra产生对于施用于受试者也更安全，因为当骨关节炎病症消退或已经消失时将不再产生il-1ra。
75.除了l itr、r itr和腺病毒包装信号，本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体不携带任何病毒序列。将在本公开文本中使用的优选的辅助依赖性腺病毒载体是基于辅助病毒和由palmer和ng(palmer,d.和ng,p.(2003).improved system for helper-dependent adenoviral vector production.mol ther 8,846-852.)以及toietta等人(toietta,g.,pastore,l.,cerullo,v.,finegold,m.,beaudet,a.l.和lee,b.(2002).generation of helper-dependent adenoviral vectors by homologous recombination.mol ther 5,204-210.)开发的辅助依赖性骨架系统的那些。根据本公开文本的优选的腺病毒递送和表达系统可以包含如seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7中所示的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列或其生物学有效部分，所述基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列包含启动子、编码il-1ra的核酸序列、左反向末端重复和右反向末端重复、腺病毒包装信号和非病毒非编码填充核酸序列。seq id no:2的核酸序列描述了鼠辅助依赖性腺病毒载体，seq id no:3中所示的序列描述了马辅助依赖性腺病毒载体，seq id no:7中所示的序列描述了人辅助依赖性腺病毒载体，所有三种载体分别带有鼠il-1ra基因、马il-1ra基因或人il-1ra基因中的任一种。优选地，本公开文本的系统具有与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7中所示的载体的至少96％、97％、98％或99％序列同源性中的任一种。
76.在本公开文本的上下文中，“长期表达”意指腺病毒递送和表达系统的基因产物(即il-1ra)在用本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体感染的一个或多个关节中表达至少3个月、6个月或12个月。在一个优选的方面，il-1ra在用本公开文本的辅助依赖性腺病毒载
体感染的一个或多个关节中表达至少3个月。
77.在本公开文本的上下文中，“生物学有效的”意指腺病毒递送和表达系统的基因产物包含il-1ra的完整或部分多肽序列，其具有关节内(in-joint)活性以中和il-1对关节炎症的影响。
78.本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体优选包含在炎症敏感性启动子的控制下的il-1ra的核酸序列。尽管il-1ra含有物种特异性核酸序列，但腺病毒载体能够表达来自任何哺乳动物物种或人的白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)。优选地，用于克隆的哺乳动物白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)的cdna是选自以下的cdna：人il-1ra、鼠il-1ra、马il-1ra、犬il-1ra、猫ii-1ra、兔il-1ra、仓鼠il-1ra、牛il-1ra、骆驼il-1ra或它们在其他哺乳动物物种中的同系物。
79.为了监测滑膜细胞中基因组载体序列的存在，根据本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体还可以包含编码可通过肉眼或仪器检测的标记基因的序列。优选的标记基因包括但不限于绿色荧光蛋白(gfp)、lacz或萤光素酶。
80.作为一个例子，如本公开文本中所用的鼠il-1ra的核酸序列示于seq id no:1中所示的序列表中。如上所述，在本公开文本的情况下可以使用产生任何哺乳动物或人物种的生物活性il-1ra蛋白的任何核酸序列。此外，编码相同氨基酸、多肽或蛋白质的保守核酸序列落在本公开文本的范围内。优选地，根据本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体含有具有与seq id no:1中所示的核酸序列的至少95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的il-1ra的核酸序列(例如cdna)。本公开文本还包括il-1ra的生物活性核酸序列或其片段。因此，本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体可以包含seq id no:1中所示的核酸序列的生物活性片段。
81.作为一个例子，如本公开文本中所用的人il-1ra的核酸序列示于seq id no:4中所示的序列表中。如上所述，在本公开文本的情况下可以使用产生人的生物活性il-1ra蛋白的任何核酸序列。此外，编码相同氨基酸、多肽或蛋白质的保守核酸序列落在本公开文本的范围内。优选地，根据本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体含有具有与seq id no:4中所示的核酸序列的至少95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的il-1ra的核酸序列(例如cdna)。本公开文本还包括il-1ra的生物活性核酸序列或其片段。因此，本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体可以包含seq id no:4中所示的核酸序列的生物活性片段。
82.作为一个例子，如seq id no:4中所示的如本公开文本中所用的人il-1ra的核酸序列可以表达与seq id no:6至少95％同源的氨基酸序列的人il-1ra蛋白。如seq id no:4中所示的如本公开文本中所用的人il-1ra的核酸序列可以表达与seq id no:6至少96％、97％、98％或99％同源的氨基酸序列的人il-1ra蛋白。如seq id no:4中所示的如本公开文本中所用的人il-1ra的核酸序列可以表达与seq id no:6至少99％同源的氨基酸序列的人il-1ra蛋白。优选地，如seq id no:4中所示的如本公开文本中所用的人il-1ra的核酸序列可以表达根据seq id no:6的氨基酸序列的人il-1ra蛋白。
83.在一些实施方案中，人il-1ra可以具有与野生型人il-1ra蛋白的氨基酸序列至少95％至99％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，人il-1ra可以具有与根据seq id no:6的氨基酸序列的人il-1ra蛋白95％至99％同源的氨基酸序列。
84.本发明提供了一种基于腺病毒的生物递送和表达系统，其用于治疗人关节中的骨
关节炎或骨关节炎病症或用于预防经鉴定处于患上骨关节炎或骨关节炎病症的风险中的人中的此类病症，其中所述基于腺病毒的生物递送和表达系统包含辅助依赖性腺病毒载体的基因组拷贝(gc)，所述辅助依赖性腺病毒载体包含编码人白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)的核酸序列、左反向末端重复和右反向末端重复、腺病毒包装信号和非病毒且非编码填充核酸序列，其中人il-1ra基因的表达由nf-κb诱导型启动子调节，所述nf-κb诱导型启动子位于编码所述人il-1ra的核酸序列的阅读框的上游，其中包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7的核酸序列至少95％同源，其中所述基于腺病毒的生物递送和表达系统从用所述辅助依赖性腺病毒载体和辅助病毒感染的宿主细胞中分离，其中所述基于腺病毒的生物递送和表达系统包含：a)1.4x108至1.4x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体/毫升(gc/ml)；b)小于15％的辅助病毒颗粒；c)小于10％的空衣壳；d)不超过100μg/ml的宿主细胞蛋白；e)不超过20ng/ml的宿主细胞核酸；f)不超过35eu/ml的内毒素；以及g)≤300个gc/tcid
50
的病毒颗粒与感染单位比。
85.在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的辅助病毒颗粒中的任一种。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是1％至2％之间的辅助病毒颗粒。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是2％至3％之间的辅助病毒颗粒。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是3％至4％之间的辅助病毒颗粒。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是4％至5％之间的辅助病毒颗粒。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是5％至6％之间的辅助病毒颗粒。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是6％至7％之间的辅助病毒颗粒。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是7％至8％之间的辅助病毒颗粒。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是8％至9％之间的辅助病毒颗粒。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是9％至10％之间的辅助病毒颗粒。
86.在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是10％至11％之间的辅助病毒颗粒。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是11％至12％之间的辅助病毒颗粒。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是12％至13％之间的辅助病毒颗粒。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是13％至14％之间的辅助病毒颗粒。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中辅助病毒的水平可以是14％至＜15％之间的辅助病毒颗粒。
87.在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中空衣壳的水平可以是小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的空衣壳中的任一种。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中空衣壳的水平可以是1％至2％之间的空衣壳。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中空衣壳的
水平可以是2％至3％之间的空衣壳。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中空衣壳的水平可以是3％至4％之间的空衣壳。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中空衣壳的水平可以是4％至5％之间的空衣壳。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中空衣壳的水平可以是5％至6％之间的空衣壳。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中空衣壳的水平可以是6％至7％之间的空衣壳。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中空衣壳的水平可以是7％至8％之间的空衣壳。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中空衣壳的水平可以是8％至9％之间的空衣壳。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中空衣壳的水平可以是9％至＜10％之间的空衣壳。在本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统中空衣壳和辅助病毒的水平可以相同。
88.在一些实施方案中，术语“空衣壳”和“空颗粒”是指腺病毒载体病毒体，所述腺病毒载体病毒体包括辅助依赖性腺病毒蛋白外壳，但完全或部分地缺乏多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体包含编码人白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)的核酸序列、左反向末端重复和右反向末端重复、腺病毒包装信号和非病毒非编码填充核酸序列，其中人il-1ra基因的表达由nf-kb诱导型启动子调节，所述nf-kb诱导型启动子位于编码人il-1ra的核酸序列的阅读框的上游，并被包括但不限于免疫刺激物质的因子特异性活化，其中包含启动子、编码il-1ra的核酸序列、左反向末端重复和右反向末端重复、腺病毒包装信号和非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7的核酸序列至少95％同源。
89.术语“宿主细胞”表示例如微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其可以或已经被用作本发明的辅助依赖性腺病毒载体构建体和辅助病毒的受体。所述术语包括已经转染的初始细胞的后代。因此，如本文所用的“宿主细胞”通常是指已经用外源dna序列转染的细胞。应理解，由于天然、偶然或刻意突变，单个亲代细胞的后代的形态或基因组或总dna补体可能不一定与初始亲代完全相同。
90.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含7.0
±
1.0的ph。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含6.0至6.5的ph。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含6.5至7.0的ph。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含7.0至7.5的ph。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含7.0至8.0的ph。
91.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含≤600mosm/kg的克分子渗透压浓度。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含100mosm/kg至200mosm/kg中任一种的克分子渗透压浓度。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含200mosm/kg至300mosm/kg中任一种的克分子渗透压浓度。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含300mosm/kg至400mosm/kg中任一种的克分子渗透压浓度。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含400mosm/kg至500mosm/kg中任一种的克分子渗透压浓度。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含500mosm/kg至600mosm/kg中任一种的克分子渗透压浓度。
92.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以：a)1.4x109至1.4x10
12
；b)1.4x109至1.4x10
11
；或c)1.4x109至1.4x10
10
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
93.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以≥1.4x109个gc/ml至＜
5.6x109个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x109个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以≥1.4x10
10
个gc/ml至＜5.6x10
10
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x10
10
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以≥1.4x10
11
个gc/ml至＜5.6x10
11
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x10
11
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
94.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x109至5.6x109个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
10
至5.6x10
10
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
11
至5.6x10
11
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
95.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2x109至5.6x109个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2x10
10
至5.6x10
10
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含2x10
11
至5.6x10
11
个gc/ml。
96.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x109至5.6x109个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x10
10
至5.6x10
10
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x10
11
至5.6x10
11
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
97.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2x109至2.8x109个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2x10
10
至2.8x10
10
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2x10
11
至2.8x10
11
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
98.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x109至2.8x10
10
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
10
至2.8x10
11
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
11
至2.8x10
11
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
99.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x109至1.4x10
12
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x10
10
至1.4x10
12
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x10
11
至1.4x10
12
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
100.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x109至2.8x10
11
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以
包含以2.8x109至1.4x10
10
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x10
10
至2.8x10
11
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
101.所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含1.4x109个gc/ml。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
10
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
11
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含1.4x10
12
个gc/ml。
102.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2x109个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2x10
10
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2x10
11
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
103.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x109个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x10
10
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x10
11
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
104.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以5.6x109个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以5.6x10
10
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以5.6x10
11
个gc/ml的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
105.所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含1ml至5ml的剂量体积。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含2ml至5ml的剂量体积。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含3ml至5ml的剂量体积。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含4ml至5ml的剂量体积。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含5ml的剂量体积。
106.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x109至7x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x109至7x10
11
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x109至7x10
10
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
107.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x109至2.8x10
10
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x10
10
至2.8x10
11
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x10
11
至2.8x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
108.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x10
10
至7x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x10
10
至7x10
11
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x10
11
至7x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
109.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x109至2.8x10
10
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x10
10
至2.8x10
11
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x10
11
至2.8x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
110.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以10
10
至2.8x10
10
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以10
11
至2.8x10
11
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以10
12
至2.8x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
111.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x109至5.6x109个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x10
10
至5.6x10
10
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x10
11
至5.6x10
11
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
112.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以10
10
至1.4x10
10
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以10
11
至1.4x10
11
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以10
12
至1.4x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
113.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x109至5.6x10
11
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x10
10
至5.6x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x10
11
至5.6x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
114.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
10
至7x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
11
至7x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
12
至7x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
115.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
10
至1.4x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
10
至1.4x10
11
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
11
至1.4x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
116.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x109个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x10
10
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x10
11
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发
明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以7x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
117.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
10
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
11
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以1.4x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
118.本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x10
10
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x10
11
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含以2.8x10
12
个gc的总剂量的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
119.药物组合物
120.可以将本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统掺入适合施用的药物组合物中。本公开文本的组合物包括药物组合物，所述药物组合物包含腺病毒辅助依赖性腺病毒载体，所述腺病毒辅助依赖性腺病毒载体包含编码人或哺乳动物白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)的核酸序列、l itr、r itr、包装信号和非病毒非编码填充核酸序列，其中所述人或哺乳动物白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)基因的表达由位于编码人或哺乳动物il-1ra的核酸序列的阅读框的上游的炎症敏感性启动子调节。在一些方面，所述药物组合物可以用于治疗或预防骨关节炎。
121.如本公开文本的情况下所用的优选的炎症敏感性启动子是可由以下诱导的启动子：nf-κβ、白细胞介素6(ii-6)、白细胞介素-1(il-1)、肿瘤坏死因子(tnf)、环氧合酶2(cox-2)、补体因子3(c3)、血清淀粉样蛋白a3(saa3)、巨噬细胞炎性蛋白-1a(mip-1a)或上述的杂合构建体。在优选的方面，所述炎症敏感性启动子是nf-κb5-elam启动子。
122.此类组合物通常包含如本文公开的辅助依赖性腺病毒载体病毒颗粒、辅助腺病毒和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体描述于本领域中的标准参考文本remington's pharmaceutical sciences的最新版本中，将其通过引用并入本文。此类载体或稀释剂的合适例子包括但不限于水、盐水、林格氏溶液(ringer's solution)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性媒介物，如不挥发油。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域是熟知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑其在所述组合物中的使用。也可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
123.配制本发明的药物组合物以与其预期的施用途径相容。施用途径的例子包括肠胃外，例如关节内、静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、透皮(即，局部)、透粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的药剂，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节ph。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、
一次性注射器或多剂量小瓶中。
124.适用于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(在水溶的情况下)或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor el
tm
(basf，新泽西州帕西帕尼)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下必须稳定并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。微生物作用的预防可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
125.无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，随后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文所列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。
126.本公开文本的腺病毒表达和递送系统的化学特性
127.本公开文本的基于腺病毒的生物递送和表达系统(fx201)的衣壳可以是无包膜的，并且可以包含29.3kb双链dna。衣壳的理论分子量可以是103.9兆道尔顿(mda)，并且基因组的理论分子量可以是18.1mda。fx201的衣壳可以具有大约100nm的直径。
128.配制品：fx201可以在由以下构成的缓冲液中配制：约1-20mm tris、约50-100mm nacl、0.01-1％重量/体积(w/v)聚山梨醇酯80、1-10％(w/v)蔗糖、0.1-10mm mgcl2、50-500μm edta、1-5％体积/体积(v/v)乙醇和5-50mm l-组氨酸。在一个优选的方面，fx201可以在由以下构成的缓冲液中配制：10mm tris、75mm nacl、0.02％(重量/体积(w/v)聚山梨醇酯80、5％(w/v)蔗糖、1.0mm mgcl2、100μm edta、0.5％(体积/体积(v/v)乙醇)和10mm l-组氨酸。产物可以是透明至微乳白色的无色悬浮液，没有可见的微粒。
129.储存条件和稳定性：fx201可以作为冷冻液体在≤-65℃下储存。当在≤-65℃下储存时，fx201可以稳定至少3个月、至少6个月或至少12个月。一旦解冻，产品必须在2℃-8℃下储存并在7天内使用。fx201可以在室温(rt)下保持一段时间。一旦小瓶准备好使用，则可以将其在室温下在小瓶中保持不超过7小时(在室温下保持的小瓶不能返回到冷藏以备以后使用)。一旦在注射器中制备fx201剂量，则它必须保持在室温下并在4小时内使用。
130.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以用于治疗人关节中的骨关节炎或骨关节炎病症或用于预防经鉴定处于患上骨关节炎或骨关节炎病症的风险中的人中的此类病症，其中所述基于腺病毒的生物递送和表达系统包含辅助依赖性腺病毒载体的基因组拷贝(gc)，所述辅助依赖性腺病毒载体包含编码人白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)的核酸序列、左反向末端重复和右反向末端重复、腺病毒包装信号和
非病毒且非编码的填充核酸序列，其中人il-1ra基因的表达由炎症敏感性启动子调节，所述炎症敏感性启动子位于编码所述人il-1ra的核酸序列的阅读框的上游，其中包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7的核酸序列至少95％同源，并且其中基于腺病毒的生物递送和表达系统包含1.4x108至1.4x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体/毫升(ml)。所述炎症敏感性启动子可以是可由以下中的任一种诱导的启动子：nf-κβ、白细胞介素6(ii-6)、白细胞介素-1(il-1)、肿瘤坏死因子(tnf)、环氧合酶2(cox-2)、补体因子3(c3)、血清淀粉样蛋白a3(saa3)、巨噬细胞炎性蛋白-1a(mip-1a)或上述的杂合构建体。在一个优选的方面，所述炎症敏感性启动子是nf-κβ诱导型启动子。在优选的方面，所述nf-κβ诱导型启动子是nf-kb5-elam启动子。
131.包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7的核酸序列至少96％、97％、98％或99％同源。包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以与seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7的核酸序列至少99％同源。包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以为seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7。
132.在一些实施方案中，包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以与seq id no:7的核酸序列至少95％同源。在一些实施方案中，包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以与seq id no:7的核酸序列至少96％、97％、98％或99％同源。
133.编码il-1ra的核酸序列可以包含seq id no:1的核酸。编码il-1ra的核酸序列可以包含seq id no:4的核酸。seq id no:4是人il-1ra的初始编码序列(seq id no:5)的密码子优化型式，其中根据seq id no:4的密码子优化序列具有：
134.a)0.96的密码子适应指数(cai)，相比之下，野生型人il-1ra蛋白中的cai为0.78，
135.b)85％的最高使用频率内的密码子，相比之下，野生型人il-1ra蛋白中的最高使用频率为56％，
136.c)60.4的平均gc含量，相比之下，野生型人il-1ra蛋白中平均gc含量为51.98，以及
137.d)与野生型人il-1ra蛋白相比，没有负顺式作用元件，包括：剪接位点(ggtaag)、剪接位点(ggtgat)、多聚a(aataaa)、多聚a(attaaa)、去稳定(attta)、多聚t(tttttt)和多聚a(aaaaaaa)。
138.人il-1ra的氨基酸序列符合seq id no:6。
139.包含所述启动子、编码所述il-1ra的核酸序列、所述左反向末端重复和所述右反向末端重复、所述腺病毒包装信号和所述非病毒非编码填充核酸序列的基于腺病毒的生物递送和表达系统的核酸序列可以包含seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7的核酸序列，可以基本上由其组成或者可以由其组成。
140.所述辅助依赖性腺病毒载体另外可以包含编码蛋白产物的标记基因，所述蛋白产物可通过肉眼或仪器检测，以监测感染的细胞中载体序列的存在。所述标记基因可以是编码荧光蛋白、酶或可检测的细胞表面蛋白中的任一种的基因。所述标记基因可以是编码绿色荧光蛋白lacz或萤光素酶中的任一种的基因。
141.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含：a)1.4x109至1.4x10
12
；b)1.4x109至1.4x10
11
；或c)1.4x109至1.4x10
10
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。
142.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含1.4x10
10
至1.4x10
12
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含1.4x10
10
至1.4x10
11
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含1.4x10
11
至1.4x10
12
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。
143.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含1.4x109至5.6x109个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含1.4x10
10
至5.6x10
10
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含1.4x10
11
至5.6x10
11
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。
144.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2x109至5.6x109个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2x10
10
至5.6x10
10
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2x10
11
至5.6x10
11
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。
145.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2.8x109至5.6x109个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2.8x10
10
至5.6x10
10
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2.8x10
11
至5.6x10
11
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。
146.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2x109至2.8x109个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2x10
10
至2.8x10
10
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2x10
11
至2.8x10
11
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。
147.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含1.4x109至2.8x10
10
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含1.4x10
10
至2.8x10
11
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含1.4x10
11
至2.8x10
11
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。
148.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2.8x109至1.4x10
12
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2.8x10
10
至1.4x10
12
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2.8x10
11
至1.4x10
12
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。
149.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2.8x109至2.8x10
11
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2.8x109至1.4x10
10
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2.8x10
10
至2.8x10
11
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。
150.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含1.4x109个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含1.4x10
10
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含1.4x10
11
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含1.4x10
12
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。
151.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2x109个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2x1010个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物
递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2x1011个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。
152.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2.8x109个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2.8x1010个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2.8x1011个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。
153.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含5.6x109个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含5.6x10
10
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含5.6x10
11
个基因组拷贝(gc)的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)/ml所述药物组合物。
154.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含1ml至5ml的剂量体积。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含2ml至5ml的剂量体积。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含4ml至5ml的剂量体积。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含3ml至5ml的剂量体积。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含至多5ml的剂量体积。
155.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x109至7x0
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x109至7x10
11
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x109至7x10
10
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
156.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x10
10
至7x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x10
10
至7x10
11
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x10
11
至7x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
157.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x109至2.8x10
10
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x10
10
至2.8x10
11
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x10
11
至2.8x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
158.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x109至2.8x10
11
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x109至2.8x10
12
个gc的所
述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x10
10
至2.8x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
159.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为1x10
10
至2.8x10
10
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为1x10
11
至2.8x10
11
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含总剂量为1x10
12
至2.8x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
160.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为2.8x109至5.6x109个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为2.8x10
10
至5.6x10
10
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为2.8x10
11
至5.6x10
11
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
161.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为1x10
10
至1.4x10
10
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为1x10
11
至1.4x10
11
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为1x10
12
至1.4x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
162.所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含总剂量为7x109至5.6x10
11
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含总剂量为7x10
10
至5.6x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。所述基于腺病毒的生物递送和表达系统可以包含总剂量为7x10
11
至5.6x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
163.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为1.4x10
10
至7x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为1.4x10
11
至7x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为1.4x10
12
至7x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
164.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为1.4x10
10
至1.4x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为1.4x10
10
至1.4x10
11
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为1.4x10
11
至1.4x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
165.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x109个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表
达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x10
10
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x10
11
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为7x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
166.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为1.4x10
10
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为1.4x10
11
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为1.4x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
167.包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为2.8x10
10
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为2.8x10
11
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的本公开文本的药物组合物可以包含总剂量为2.8x10
12
个gc的所述辅助依赖性腺病毒载体(hdad)。
168.本公开文本的药物组合物可以配制成用于腱内、肌内、关节内或肩峰下注射至人关节。所述药物组合物配制成用于关节内注射至人关节。
169.本发明的包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含辅助依赖性腺病毒载体的病毒颗粒，所述辅助依赖性腺病毒载体的病毒颗粒量化为基因组拷贝(gc)的辅助依赖性腺病毒载体/毫升(ml)或病毒颗粒(vp)的辅助依赖性腺病毒载体/毫升(ml)，其中1个vp/ml对应于1.4个gc/ml。
170.尽管本公开文本的药物组合物可以包括包含1.4x108至1.4x10
12
个基因组拷贝的辅助依赖性腺病毒载体(gc)/毫升(ml)的基于腺病毒的生物递送和表达系统，但所述药物组合物也可以包含108至10
12
个病毒颗粒(vp)的本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体/毫升(ml)在关节中的滑液。
171.在本发明的一些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含109至10
12
；109至10
11
；或109至10
10
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。优选地，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含109至10
11
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。
172.在本发明的一些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2.8x109至2.8x10
11
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。在本发明的其他方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2.8x109至2.8x10
10
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。在本发明的某些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2.8x10
10
至2.8x10
11
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。
173.在一些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2x109至2x10
11
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。在本发明的其他方面，所述基于腺病毒的生物递送和表达系统包含2x109至2x10
10
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。在本发明的某些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达
系统的药物组合物可以包含2x10
10
至2x10
11
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。
174.在本发明的一些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2.8x109个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。在本发明的其他方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2.8x10
10
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。在本发明的一些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2.8x10
11
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。在本发明的一些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2.8x10
11
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。
175.在本发明的一些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含109至10
12
；109至10
11
；或109至10
10
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。优选地，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含109至1011个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。
176.本发明的用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染患有骨关节炎或骨关节炎病症的人的一个或多个骨关节炎影响的关节的关节细胞的方法可以包括用108至10
12
个病毒颗粒(vp)的本公开文本的辅助依赖性腺病毒载体/毫升(ml)在关节中的滑液感染有需要的人的一个或多个骨关节炎影响的关节。
177.在本发明的一些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含109至10
12
；109至10
11
；或109至10
10
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。优选地，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含109至1011个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。
178.在本发明的一些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2.8x109至2.8x10
11
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。在本发明的其他方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2.8x109至2.8x10
10
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。在本发明的某些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2.8x1010至2.8x1011个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。
179.在本发明的一些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2.8x109个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。在本发明的其他方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2.8x10
10
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。在本发明的一些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2.8x10
11
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。在本发明的一些方面，所述包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物可以包含2.8x10
11
个vp的所述辅助依赖性腺病毒载体/ml在关节中的滑液。在本发明的一些方面，所述关节含有约0.5ml至约20ml的滑液。在本发明的一些方面，所述关节可以含有约0.5ml至10ml的滑液。在本发明的一些方面，所述关节可以含有约0.5ml至5ml的滑液。
180.本公开文本的方法
181.本发明提供了一种用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染患有骨关节炎或骨
关节炎病症的人的一个或多个骨关节炎影响的关节的关节细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：a)用如本文公开的包含基于腺病毒的生物递送和表达系统的药物组合物感染有需要的人的骨关节炎影响的关节的关节细胞；以及b)在所述骨关节炎影响的关节内的目标区域中表达il-1ra。
182.可以用所述基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞一次。可以用所述基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次。
183.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体。当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞至少两次时，第一次感染可以包含小于第二次或任何后续感染的gc数/ml的gc数/ml。
184.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含1.4x109个gc/ml至1.4x10
10
个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含1.4x10
11
至1.4x10
12
个gc/ml。
185.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含1.4x10
10
至1.4x10
11
个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含1.4x10
11
至1.4x10
12
个gc/ml。
186.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含1.4x109至1.4x10
10
个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含1.4x10
10
至1.4x10
11
个gc/ml。
187.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含1.4x109个gc/ml至5.6x109个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含1.4x10
10
至5.6x10
10
个gc/ml。
188.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含1.4x10
10
至5.6x10
10
个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含1.4x10
11
至5.6x10
11
个gc/ml。
189.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含1.4x109至5.6x109个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含1.4x10
11
至5.6x10
11
个gc/ml。
190.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含2.8x109个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含2.8x10
10
个gc/ml。
191.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含2.8x10
10
个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含2.8x10
11
个gc/ml。
192.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含2.8x109个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含2.8x10
11
个gc/ml。
193.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染关节细胞至少两次时，第一次感染可以包含大于第二次或任何后续感染的gc数/ml的gc数/ml。
194.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含1.4x10
11
至1.4x10
12
个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含1.4x109个gc/ml至1.4x10
10
个gc/ml。
195.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含1.4x10
11
至1.4x10
12
个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含1.4x10
10
至1.4x10
11
个gc/ml。
196.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含1.4x10
10
至1.4x10
11
个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含1.4x109至1.4x10
10
个gc/ml。
197.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含1.4x10
10
至5.6x10
10
个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含1.4x109个gc/ml至5.6x109个gc/ml。
198.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含1.4x10
11
至5.6x10
11
个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含1.4x10
10
个gc/ml至5.6x10
10
个gc/ml。
199.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含1.4x10
11
至5.6x10
11
个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含1.4x109至5.6x109个gc/ml。
200.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含2.8x10
10
个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含2.8x109个gc/ml。
201.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含2.8x10
11
个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含2.8x10
10
个gc/ml。
202.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，其中每次感染包括不同基因组拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体，第一次感染可以包含2.8x10
11
个gc/ml，并且第二次或后续感染可以包含2.8x109个gc/ml。
203.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，每次感染可以包含相同基因拷贝数的所述辅助依赖性腺病毒载体。
204.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞至少两次时，每次感染可以包含1.4x109至5.6x109个gc/ml。当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞至少两次时，每次感染可以包含1.4x10
10
至5.6x10
10
个gc/ml。当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞至少两次时，每次感染可以包含1.4x10
11
至5.6x10
11
个gc/ml。
205.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞至少两次时，每次感染可以包含2.8x109个gc/ml。当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞至少两次时，每次感染可以包含2.8x10
10
个gc/ml。当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞至少两次时，每次感染可以包含2.8x10
11
个gc/ml。
206.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，每次感染可以在所述人的同一骨关节炎影响的关节中进行。
207.当用基于腺病毒的生物递送和表达系统感染所述关节细胞两次或更多次时，第二次感染和后续感染中的每一次可以在所述人的与进行前一次感染的骨关节炎影响的关节不同的骨关节炎影响的关节中进行。
208.所述关节细胞的感染可以包括腱内、肌内、关节内或肩峰下注射本公开文本的药物组合物。所述关节细胞的感染可以包括关节内注射本公开文本的药物组合物。如本文所述的“关节细胞的感染”意指将本发明的药物组合物施用于一个或多个受骨关节炎或骨关节炎病症影响的关节，其中所述施用包括将所述药物组合物关节内、腱内、肌内或肩峰下注射至所述一个或多个受骨关节炎或骨关节炎病症影响的关节中。在一个优选的实施方案中，将本发明的药物组合物施用于所述一个或多个受骨关节炎或骨关节炎病症影响的关节通过将所述药物组合物关节内注射至所述一个或多个受骨关节炎或骨关节炎病症影响的关节中来进行。
209.治疗监测
210.本公开文本的方法还可以包括以下步骤：c)在所述骨关节炎影响的关节内的目标区域中表达所述il-1ra后，监测所述骨关节炎影响的关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展。
211.可以通过确定有需要的人的疼痛、身体功能、患者整体评估和关节成像来进行对人关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的监测。对人关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的监测可以包括使用西安大略麦克马斯特大学骨关节炎(western ontario mcmasters universities osteoarthritis)(womac)指数评价骨关节炎的进展。对人关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的监测可以包括使用膝损伤和骨关节炎结局得分(knee injury and osteoarthritis outcome score)(koos)评价骨关节炎的进展。对人关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的监测可以包括使用平均每日疼痛(adp)评分系统评价骨关节炎的进展。对人关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的监测可以包括使用womac、koos和adp评价骨关节炎的进展。
212.对人关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的监测可以包括针对关节疼痛、关节僵直、捻发音(crepitus)、发红、压痛、腘窝囊肿和关节肿胀或其组合中的任一种或全部对有需要的人的关节进行身体检查。对人关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的监测可以包括针对抑郁、睡眠剥夺、痛觉过敏、中枢致敏和小题大做(catastrophization)或其组合对有需要的人进行身体检查。
213.对人关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的监测可以包括使用射线照片成像来确定骨赘形成和关节间隙狭窄(jsn)。对人关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的监测可以包括使用磁共振成像(mri)、超声(us)和光学相干断层成像(oct)中的任一种或组合对有需要的人的关节进行成像。对人关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗
或进展的监测可以包括测量指标膝(index knee)中的白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)和白细胞介素-1β(il-1β)蛋白浓度。对人关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的监测可以包括评价对本发明的辅助依赖性腺病毒载体(hdad)的免疫应答。对人关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的监测可以包括测试用本发明的药物组合物或方法治疗的人的血液样品中抗衣壳和抗il-1ra抗体的存在。对人关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的监测可以包括测试用本发明的药物组合物或方法治疗的人的ia滑液样品中il-1ra和il-1β蛋白浓度。
214.所述方法还可以包括以下步骤：(d)如果监测所述骨关节炎影响的关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的步骤显示所述人关节中的骨关节炎或骨关节炎病症未得到管控或治疗，则继续向有需要的人的所述骨关节炎影响的关节施用所述量的基于腺病毒的生物递送和表达系统；或(e)如果监测所述骨关节炎影响的关节中骨关节炎或骨关节炎病症的治疗或进展的步骤显示所述人关节中的骨关节炎或骨关节炎病症已有进展，则进一步调节所述量的基于腺病毒的生物递送和表达系统中所述辅助依赖性腺病毒载体的基因组拷贝数并且将其施用于有需要的人的骨关节炎影响的关节。
215.受试者、骨关节炎和骨关节炎病症
216.在本公开文本的方法中，所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以是男性或女性。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以是女性。
217.所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以是30-80岁。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以超过80岁。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以患有关节的骨关节炎。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以患有肩、髋、踝、膝、手或脊柱的骨关节炎。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以患有膝骨关节炎(oak)。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以患有指标膝的痛性oa，kellgren-lawrence(k-l)等级为2、3或4级的。所述人可以患有由衰老、性别(女性)相关预先倾向性、肥胖症、代谢疾病、关节损伤、关节反复受力、遗传预先倾向性或骨畸形或其组合引起的骨关节炎或骨关节炎病症。所述人可以患有由导致软骨撕裂的关节损伤、关节脱位或韧带损伤或其组合引起的骨关节炎或骨关节炎病症。所述人可以患有由前交叉韧带(acl)拉伤和撕裂引起的骨关节炎或骨关节炎病症。所述人可以患有由半月板拉伤和撕裂引起的骨关节炎或骨关节炎病症。
218.骨关节炎是最常诊断的关节关节炎疾病类型，其可能影响肩、手、膝、趾、指、腕和髋。已知膝关节炎影响关节功能性，引起膝痛，甚至随着其进展导致残疾。有不同等级的膝骨关节炎(oa)，指定给正常健康的膝的0直至晚期4，即重度oa，如依照kellgren&lawrence,1997所表征的。
219.1级的特征在于可疑的关节间隙狭窄和可能的骨赘性唇状突(osteophytic lipping)。oa患者将在膝关节端部发展非常小的磨损和撕裂以及骨刺生长。然而，在这个阶段，不太可能感觉到疼痛或不适。
220.2级(最低)的特征在于明确的骨赘和可能的关节间隙狭窄。膝关节的诊断图像或x射线将显示更多的骨刺生长，并且尽管骨之间的间隙看起来正常，但是人们将开始经历关节疼痛的症状。通常，膝关节周围的区域将感到僵直和不适，特别是在久坐时、在晨起之后或在锻炼之后。尽管软骨和软组织保持健康大小，但由于酶(如金属蛋白酶)的产生增加，软骨基质发生蛋白水解分解。
221.3级(中度)的特征在于中度多发性骨赘、明确的关节间隙狭窄和一些硬化以及可能的骨端部畸形。骨之间的软骨表面有明显的侵蚀，并且原纤维显现使骨之间的间隙变窄。随着所述疾病的进展，蛋白聚糖和胶原蛋白片段释放到滑液中，其中随着关节变得更粗糙，骨在关节处发展出骨刺。
222.4级(重度)的特征在于大骨赘、明显的关节间隙狭窄、重度硬化和明确的骨端部畸形。骨之间的关节间隙显著减小，引起软骨磨损，使关节僵直。软骨的分解导致慢性炎性反应，伴随着滑液减少，在行走或移动关节时，引起摩擦、更大程度的疼痛和不适。滑液金属蛋白酶、细胞因子和tnf的产生增加，它们可能扩散回到软骨中，破坏膝周围的软组织。所述疾病的晚期显示出更多骨刺的发展，引起剧烈疼痛，这使得即使是日常琐事(包括行走和下楼梯)都成为挑战。
223.随着膝骨关节炎的进展，出现明显的关节炎症，从而引起行走、跑步、下蹲、伸展或跪下时频繁疼痛。除了久坐后或早晨醒来时的关节僵直，在行走时还可能出现爆响或弹响。
224.所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以具有≤40千克/平方米(kg/m2)的体重指数(bmi)。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以具有≥12个月的指标膝的与oa相关的症状。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在用本发明的药物组合物或方法治疗之前的最后一个月内具有＞15天的指标膝疼痛。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以具有依据美国风湿病学会(acr)对于oa的标准(临床的和放射学的)定义的如下特征中的任一种或组合：a)膝痛，b)以下中的至少一种：(i)年龄＞50岁；(ii)晨僵＜30分钟，和(iii)膝运动时有捻发音，以及c)骨赘。
225.所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在对于指标膝骨关节炎的两种或更多种类型的保守疗法中已经失败。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在结构化的基于陆地的锻炼计划中已经失败。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在用局部非类固醇抗炎药(nsaid)的先前治疗中已经失败。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在用局部非类固醇抗炎药(nsaid)的先前治疗中已经失败。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在用非选择性nsaid或cox-2抑制剂的先前治疗中已经失败。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在一种先前类型的保守疗法和至少一种先前指标膝ia治疗(皮质类固醇或透明质酸)中已经失败。
226.所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以基于x射线和身体检查在指标膝中具有2级的kellgren-lawrence(k-l)等级。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以基于x射线和身体检查在指标膝中具有3级的kellgren-lawrence(k-l)等级。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以基于x射线和身体检查在指标膝中具有4级的kellgren-lawrence(k-l)等级。
227.所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以具有指标膝，并且用于注射本发明的药物组合物的预期区域可以没有任何局部或关节感染的体征。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在指标膝中具有在≥4.0和≤9.0之间(0-10数字评定量表[nrs]量表，包括端点在内)的西安大略麦克马斯特大学骨关节炎指数疼痛得分。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以是在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗时或在所述治疗后至少12个月没有怀孕的女性或者可以使用一种或多种避孕方法的女性。
[0228]
所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以没有反应性关节炎、类风湿性关节
炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎或与炎性肠病相关的关节炎的当前或先前诊断。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以没有指标膝的活动性晶体病(包括痛风、焦磷酸钙沉积病)的临床体征和症状。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗前三个月内可以没有活动性晶体病的临床体征和症状。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以不会由于在指标膝中存在手术硬件或其他异物而不能进行磁共振成像(mri)。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以没有不稳定的指标膝关节。
[0229]
所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗的六个月内在指标膝中没有接受用关节内(ia)药物/生物制品使用的任何先前治疗。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗的六个月内没有接受用皮质类固醇、透明质酸、富血小板血浆、干细胞、增生疗法和羊水注射中的任一种或组合的治疗。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗的12个月内没有接受指标膝的冷冻或射频神经消融。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗的12个月内没有对指标膝进行关节镜或开放手术。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗的12个月内没有对指标膝进行计划的或预期的手术。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以没有经历将给予关节内注射的指标膝上的皮肤完整性受损。
[0230]
所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以不展现出人免疫缺陷病毒(hiv)感染、乙型肝炎表面抗原(hbsag)测试呈阳性或丙型肝炎病毒(hcv)的阳性血清学及丙型肝炎病毒核糖核酸(hcv rna)测试呈阳性的任何实验室证据。
[0231]
所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以不展现出任何ecg异常。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗的5年内不接受或使用免疫调节剂、免疫抑制剂或化疗剂。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗的5年内可以不接受任何先前的研究性或已批准的基因疗法治疗没有活动性恶性肿瘤或恶性肿瘤病史，但是切除的基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌或有效管控的原位宫颈癌除外。
[0232]
如果在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗前剂量/方案已经不稳定≥6个月，所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以不接受对抑郁症的积极药理学治疗，包括选择性血清素再摄取抑制剂(ssri)、血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂(snri)以及非选择性血清素再摄取抑制剂(nsri)或三环类。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗前的12个月内没有进行活性物质滥用(药物或酒精)或者没有物质滥用史。在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗前的3个月内可以不向所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人施用任何研究性药物、生物制品或装置。
[0233]
所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗前的4周内没有任何需要静脉内(iv)抗生素或抗病毒剂的全身或局部细菌或病毒感染，或者在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗前的2周内没有任何需要口服抗生素或抗病毒剂的全身或局部细菌或病毒感染。
[0234]
所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗前的1个月内可以患有双侧膝oa，对侧膝中的疼痛不≥4.0(0-10nrs量表)。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以在指标膝中没有经历先前的全膝或部分膝关节成形术。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗时可以没有高于99.5
°
f的体温。
[0235]
所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以没有＞1.5的凝血酶原时间(pt)/国际标准化比(inr)。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以没有高于正常上限(uln)＞5秒的活化部分促凝血酶原激酶时间(aptt)。
[0236]
所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以没有＞1.5x uln的丙氨酸转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)、＞1.5x uln的碱性磷酸酶(alp)和超出正常范围的总胆红素。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以不具有对对乙酰氨基酚的已知的变态反应或敏感性。
[0237]
所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以没有将排除使用ia注射或可能损害人的安全性的任何临床上显著的急性或慢性医学病症。所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人可以没有任何出血障碍。
[0238]
可以每天以81毫克(mg)的最大剂量向所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人施用阿司匹林以保护心脏，条件是在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗前所述剂量已经稳定3个月。可以向所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人施用针对抑郁症的药物疗法，包括ssri、snri和nsri或三环类，条件是在用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗前剂量/方案已经稳定6个月。可以向所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人施用针对与用本发明的药物组合物或通过本发明的方法治疗相关的有害效应的任何治疗或救援药物。
[0239]
可以没有向所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人施用以下中的任一种：口服nsaid；施加于指标膝的局部疗法不能是任何一种局部nsaid、辣椒素、利多卡因贴剂；大麻素类、剂量＞325mg/天的阿司匹林、中枢作用疼痛药物、阿片类物质、肌肉松弛剂、指标膝中的任何ia注射、指标膝的冷冻或射频神经消融、任何研究性药物、装置或生物制品、任何免疫调节剂、免疫抑制剂或化疗剂或其组合。可以没有向所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人施用普瑞巴林或加巴喷丁。可以不向所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人施用羟考酮、氢可酮、可待因、吗啡、曲马多。可以不向所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人施用环苯扎林、四氢西泮、地西泮。可以不向所述患有骨关节炎或骨关节炎病症的人施用局部麻醉剂、皮质类固醇、透明质酸、富血小板血浆、干细胞、增生疗法、羊水注射。
[0240]
制造方法
[0241]
本发明提供一种制造本发明的药物组合物的方法，其中所述方法包括：a)培养并连续扩增宿主细胞；b)用本发明的辅助依赖性腺病毒(hdad)和辅助病毒感染(a)的连续扩增的宿主细胞；c)培养b)的感染的细胞；d)收获并裂解c)的感染的细胞以产生细胞裂解物；e)消化d)的细胞裂解物中的宿主细胞dna；f)澄清e)的细胞裂解物；g)对f)的澄清的细胞裂解物进行超速离心；h)从(g)的超速离心的细胞裂解物中收集病毒；i)对(h)的病毒样品进行梯度超速离心；j)从(i)的梯度超速离心的病毒样品中收集病毒；k)对(j)的病毒样品进行等密度超速离心；l)从(k)的等密度超速离心的病毒样品中收集病毒；m)对(l)的病毒样
l-组氨酸、10mm tris、1.0mm氯化镁、0.02％聚山梨酸酯80v/v和100μmedta。通过0.22μm过滤器进行无菌过滤配制的病毒的步骤。
[0252]
本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统的“治疗有效量”或“有效量”通常是指达到治疗目的需要的量。如上所述，这可以是从有需要的人受试者的关节中的骨关节炎或骨关节炎病症的完全至部分恢复。如上所述，这可以是在有需要的人受试者的关节中的骨关节炎的进展中对骨关节炎或骨关节炎病症的发展的部分或完全阻止。施用所需的量将另外取决于融合蛋白对其特异性靶标的结合亲和力，并且还将取决于所施用的融合蛋白从其所施用的其他受试者的自由体积耗尽的速率。在非限制性例子中，本发明的基于腺病毒的生物递送和表达系统的治疗有效剂量的常见范围可以是约1.4x108至1.4x10
12
个基因组拷贝(gc)/ml。
[0253]
除非上下文另外明确规定，否则如在本公开文本和所附权利要求中所用的，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。任选(optional或optionally)意指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且所述描述包括发生所述事件或情况的情形和不发生所述事件或情况的情形。例如，短语任选地组合物可以包含组合意指组合物可以包含不同分子的组合或可以不包含组合，使得所述描述包括组合和不存在组合(即，组合的单独成员)两者。范围可以在本文中被表述为从约一个特定值和/或至约另一个特定值。当表达这样的范围时，另一方面包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解所述特定值形成另一个方面。应当进一步理解，每个范围的端点相对于其他端点都是重要的，并且独立于其他端点。
[0254]
如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外连续或长时间生长和分裂的细胞群。本领域还已知，在此类克隆群的储存或转移期间，核型方面可以发生自发或诱导的变化。因此，源自所提及的细胞系的细胞可能与祖细胞或培养物不精确相同，并且所提及的细胞系包括此类变体。在一些实施方案中，术语“hek293细胞”、“293细胞”或其语法等同物在此可互换使用，并且是指用于本文公开的方法中的宿主/包装细胞系。
[0255]
通过以下实施例进一步说明本公开文本，不应将所述实施例视为限制。实施例
[0256]
实施例1：辅助依赖性腺病毒载体和腺相关病毒载体在小鼠关节中的转导效率的比较。
[0257]
研究目的：本文描述了用于评价和比较hdad载体和aav载体在鼠关节中的转导效率的研究。
[0258]
方法：本研究中的测试项是hdad(ad5血清型)和用aav2、aav2.5和aav6衣壳假型化的aav载体，它们都编码在巨细胞病毒(cmv)启动子控制下的gfp，以标记转导的细胞。将八周龄雄性fvb/n小鼠分成5组，每组包括2只小鼠。将载体以5μl的剂量体积ia施用于两个膝关节中。组1接受5x109个vp/膝hdad-gfp。组2-4分别接受剂量为5x109个载体基因组(vg)/膝的aav2-gfp、aav2.5-gfp和aav6-gfp。组5接受媒介物，即磷酸盐缓冲盐水(pbs)。一周后，对小鼠实施安乐死，准备膝关节用于组织学(脱钙和石蜡包埋)，将其切片并用荧光标记的抗gfp抗体染色。
[0259]
结果：注射hdad-gfp导致稳健gfp染色，其在组中的单独注射的关节之间略微不同。染色似乎主要定位于滑膜组织(图3a)。与注射hdad的关节相比，在所有注射aav的膝中
gfp表达较弱(图3b)。在aav组中，aav6似乎产生最强的gfp表达。在注射媒介物的关节(组5)中没有观察到染色，未示出。
[0260]
结论：ia注射后hdad(ad5)稳健地转导关节细胞。特定地，滑膜衬里的细胞似乎被转导。相比之下，用血清型2、2.5和6的aav载体转导似乎效率较低。
[0261]
实施例2：hdad介导关节中的长期标记基因表达
[0262]
研究目的：本文描述了用于确定小鼠关节中长达一年的长期基因表达的研究，所述小鼠关节内注射了在cmv启动子的控制下表达萤火虫萤光素酶(luc)的本发明的辅助依赖性腺病毒载体(hdad)和用于比较的第一代腺病毒(ad)载体。
[0263]
方法：向小鼠关节内注射108个病毒颗粒(vp)的表达萤光素酶的辅助依赖性腺病毒载体(hdad-luc)或相应的第一代腺病毒载体(ad-luc)。向每组四只小鼠的两个膝关节注射。三天后，使用ms 200系列成像系统(caliper life sciences，马萨诸塞州霍普金顿)对小鼠成像。在小鼠的萤光素酶表达之后进行重复的生物发光成像，并使用living image 2.5软件(caliper life sciences)量化。
[0264]
结果：在注射了hdad-luc腺病毒载体和ad-luc腺病毒载体两者的关节中检测到强生物发光信号。在注射两种载体后三天检测到强初始luc信号(图4a)。此后两种载体的表达都降低，并且一个月后第一代载体ad-luc的表达是不可检测的(图4b)。然而，hdad-luc萤光素酶表达在第10天稳定，并且在此水平保持380天。
[0265]
结论：辅助依赖性腺病毒载体和第一代腺病毒载体介导相同水平的标记基因表达。辅助依赖性腺病毒载体介导关节中的长期标记基因表达。
[0266]
实施例3：hdad在关节内注射后转导滑膜细胞。
[0267]
本文描述了用于详细评价小鼠关节中hdad转导的研究，其中向小鼠关节内注射108或109个vp的表达lacz的hdad。在用109个vp的表达lacz的hdad感染的关节的滑膜和软骨细胞两者中都看到lacz的强表达(图5b)，而在108个vp感染的关节中的软骨细胞中未能观察到染色(图5a)。分析这些动物的肝脏以评估病毒是否从关节中逃逸或在注射期间溢出。最重要的是，通过定量pcr未能测量到超过背景的可检出载体浓度(数据未示出)。因此，载体特异性地定位在关节中并保留在那里，这在骨关节炎病症的治疗或预防中具有很大的益处，因为它显示最小的副作用。
[0268]
实施例4：hdad-ll-1ra感染的细胞分泌il-1ra。注射。
[0269]
研究目的：本文描述了用于产生和体外测试在炎症敏感性nf-kb5-elam启动子的控制下表达il-1ra的hdad的功能性的研究。
[0270]
方法：用100个vp/细胞的hdad-im ra、hdad-gfp或模拟物感染人胚肾细胞(hek293)。两天后，用细胞培养上清液进行il-1ra elisa。对于hdad-ll-1ra感染的细胞测量到约700pg/ml的浓度，而在hdad-gfp或模拟物感染的细胞的上清液中没有检测到il-1ra。为了诱导炎性反应，将脂多糖(lps，100μg/ml)添加到一半样品中，并且在一天后(第4天)再次确定il-1ra浓度。hdad-il-1ra样品中的水平增加到约1600pg/ml，而与前一天相比未诱导的细胞产生较少的il-1ra。在任何对照样品(hdad-gfp和模拟物)中都没有检测到il-1ra表达。
[0271]
结果：在第3天，在hdad-ll-1ra感染的细胞的上清液中测量到高水平的il-1ra(图6)。与未诱导的样品相比，用脂多糖(lps)诱导炎症导致il-1ra浓度的急剧增加。在未感染
的样品(模拟物)或用对照载体(hdad-gfp)感染的样品中没有检测到il-1ra。在用本发明的辅助依赖性腺病毒载体(hdad)感染的滑膜细胞的上清液中测量到高水平的il-1ra。如图6中所示，与未诱导的样品相比，用脂多糖(lps)诱导炎症导致il-1ra浓度的急剧增加。在未感染的样品(模拟物)或用对照载体(hdad-gfp)感染的样品中没有检测到il-1ra。
[0272]
结论：本文公开的结果证实用hdad-mll-1ra感染的细胞可以产生高水平的ii-1ra。它还表明il-1ra有效地从这些细胞中分泌，并且炎性病症活化nf-kb5-elam启动子，导致il-1ra水平增加。
[0273]
前交叉韧带(acl)急性损伤是人创伤后oa的常见原因，并且大鼠和小鼠中的acl横切(aclt)是已建立的创伤性损伤诱导的oa的动物模型。正在开发fx201作为oa的潜在治疗剂，其是一种基于辅助依赖性腺病毒(hdad)的关节内(ia)基因疗法候选物，设计用于在炎症存在下诱导白细胞介素(il)-1受体拮抗剂(il-1ra)的产生。本文描述了研究证实有那个fx201或其等同物hdad-mil-1ra治疗在oa的预防和治疗中有效性。
[0274]
实施例5：hdad-ll-1ra在小鼠中阻止oa的发展。
[0275]
研究目的：本文描述了用于评价在由炎性刺激上调的nf-κb诱导型启动子的控制下表达鼠il-1ra的hdad载体(hdad-mil-1ra)是否能够在oa疾病的鼠模型中阻止oa的发展的研究。hdad-mil-1ra具有与fx201相同的载体骨架，但编码鼠特异性il-1ra转基因(mil-1ra)。
[0276]
方法：为了评估表达il-1ra的hdad是否能够阻止oa的发展，向小鼠的膝关节关节内注射hdad-il-1ra或表达gfp的对照载体(hdad-gfp)。向小鼠的膝关节中关节内注射108个vp的hdad-il-1ra、hdad-gfp或模拟物。注射后两天，进行交叉韧带横切以诱导oa发展。这个骨关节炎模型由dr.brendan lee的研究团队开发并且在若干实验中得到验证(ruan,z.,dawson,b.,jiang m.m.,gannon,f.,heggeness,m.,lee,b.(2012).quantitative volumetric imaging of murine osteoarthritic condition cartilage by phase contrast micro-computed tomography，已提交)。所述模型涉及膝关节的前交叉韧带和后交叉韧带的横切，这导致重度oa的发展。oa诱导一个月后处死小鼠，并且以组织学方式准备关节并用番红o染色。由盲化病理学家根据oarsi(国际骨关节炎研究会)标准(按1-6的量表指定得分，1：完全没有oa的体征，6：最大oa)对oa的发展进行评分。
[0277]
结果：hdad-il-1ra处理的关节的oa得分明显低于hdad-gfp处理的关节或未处理的关节，表明hdad-il-1ra阻止了oa的发展(图7)。对照载体hdad-gfp似乎对oa的发展没有任何影响，因为平均oa得分与未处理组的得分相当。
[0278]
结论：本文公开的结果证实，用hdad-il-1ra感染小鼠关节阻止了oa的发展。
[0279]
实施例6：在小鼠中局部施用的hdad-mil-1ra预防骨关节炎。
[0280]
研究目的：本文描述了评价在由炎性刺激上调的nf-κb诱导型启动子的控制下表达鼠il-1ra的hdad载体(hdad-mil-1ra)是否能够在oa疾病的鼠模型中阻止oa的进展的研究。hdad-mil-1ra具有与fx201相同的载体骨架，但编码鼠特异性il-1ra转基因(mil-1ra)。
[0281]
方法：将测试项hdad-mil-1ra(组1)或对照载体hdad-gfp(组2)以108个vp/膝的剂量(每组5只)和3μl的剂量体积ia注射到8周龄雄性fvb/n小鼠的双膝中，如表1中所示。对照组3接受媒介物(pbs)。两天后，通过在所有注射的膝上横切交叉韧带诱导oa。三十天后，将小鼠安乐死，并且对处理的关节进行组织学评价。为了评估软骨损伤，根据oarsi组织学分
级系统对来自外侧室的切片进行评分，并且将胫骨和股骨的评分加在一起(评分系统详述于表3中)。为了评估滑膜炎，使用表4中描述的3点量表对切片进行评分；将骨赘评分为在组织学切片中存在或不存在，并且表示为具有骨赘的关节相对于所有分析的关节的百分比。表1：实验组和处理组测试项剂量水平(vp/膝)剂量体积(μl)组大小1hdad-mil-1ra108352hdad-gfp108353媒介物(pbs)-35pbs，磷酸盐缓冲盐水；vp，病毒颗粒。
[0282]
结果：媒介物组(组3)和对照hdad-gfp载体处理的组2的平均oarsi得分都是大约8.5，并且彼此没有显著性差异(图8a)。然而，施用hdad-mil-1ra的组(组1)的平均oa得分为大约6，并且与媒介物组和hdad-gfp组的得分相比明显较低，这表明在hdad-mil-1ra处理的关节中oa的组织学特征明显较少。在媒介物组和hdad-gfp组的滑膜炎得分方面没有观察到差异(图8b)。与媒介物组和hdad-gfp组的平均得分相比，hdad-mil-1ra处理的组1的平均滑膜炎得分较低，但在统计学上不显著。与媒介物处理组相比，在hdad-gfp组中检测到较少的骨赘，如图8c中所示。与组2和组3两者相比，在hdad-mil-1ra处理的组1中看到更少的骨赘。
[0283]
结论：本文所述的结果证实，经历交叉韧带横切的媒介物处理的小鼠在一个月内发展出重度oa，如高oarsi得分以及滑膜炎和骨赘的存在所示。表达gfp的hdad载体没有显著改变oa的组织学特征。这表明hdad载体本身对疾病进展没有任何影响。与媒介物处理的小鼠和hdad-gfp处理的小鼠相比，表达鼠il-1ra的hdad显示改善的oa病理学，如由以下所示：与hdad-gfp处理组和媒介物处理组相比，显著改善的oarsi得分、趋向更低滑膜炎得分的趋势(在统计学上不显著)和关节中的较少骨赘。
[0284]
实施例7：hdad-mll-1ra治疗oa疾病的鼠模型中的oa。
[0285]
研究目的：本文描述了评价hdad-mll-1ra治疗上述鼠疾病模型中的oa的功效的研究。
[0286]
方法：通过交叉韧带横切诱导小鼠膝关节中的oa，并且允许疾病发展。横切后两周，向小鼠关节内注射108个vp的hdad-ll-1ra、hdad-gfp或模拟物。6周后处死小鼠，并且以组织学方式准备关节，将其切片并用番红o染色。盲化病理学家根据oarsi(国际骨关节炎研究会)标准(按1-6的量表指定得分，1：完全没有oa的体征，6：最大oa)评价oa的水平。通过微型计算机断层摄影(μct)分析进一步评价关节。这个技术将高分辨率(低至0.5微米)x射线ct扫描与相差光学结合，使得能够将小动物关节中的软骨可视化。可以使用关节的三维重建和计算组织分析工具来量化若干软骨参数，如体积和表面积。将用与上述相同的方法处理的小鼠的整个膝关节固定在电子显微镜固定剂中并包埋在石蜡中。使用x-radia microxct扫描仪(xradia，美国加利福尼亚州普莱森顿)扫描样品并以4微米分辨率可视化。进行关节的计算3d重建，并使用tri bon软件(ratoc system engineering，日本东京)半自动量化软骨体积和表面积。
[0287]
结果：使用所述模型来评估hdad-il-1ra是否能够有效治疗oa。因此，通过交叉韧带横切诱导oa(除了在未横切组中之外)，并且允许oa发展两周。然后注射hdad-il-1ra、对照载体(hdad-gfp)或媒介物，并且在另外六周后处死小鼠以分析关节。hdad-gfp处理的小
鼠和未注射的小鼠发展出相同程度的oa，平均得分为大约4.5(图9a)。然而，与hdad-gfp处理的小鼠和模拟物处理的小鼠相比，hdad-il-1ra处理的小鼠具有显著更低的oa得分。在hdad-il-1ra小鼠与未横切(无oa)小鼠之间没有见到显著性差异，表明对所述疾病的有效治疗或其预防。与hdad-gfp处理的关节和模拟物处理的关节相比，hdad-il-1ra处理的关节显示显著更高的软骨体积(图9b)。在hdad-il-1ra组和转染(无oa)组之间没有看到显著性差异。此外，与hdad-gfp组和模拟物组相比，hdad-il-1ra处理的小鼠的软骨表面积显著更大(图9c)，而在hdad-il-1ra关节和转染(无oa)关节之间没有看到显著性差异。
[0288]
结论：本文公开的结果表明hdad-il-1ra感染有效治疗小鼠中的oa。本文公开的结果还表明，与未处理的对照小鼠相比，hdad-il-1ra感染阻止了由于诱导oa而导致的软骨表面积和体积的损失。
[0289]
实施例8：局部施用的hdad-mil-1ra用于治疗骨骼成熟小鼠中的骨关节炎。
[0290]
研究目的：本文描述了评价hdad-mil-1ra是否能够延缓骨骼成熟小鼠中oa的进展的研究。hdad-mil-1ra具有与fx201相同的载体骨架，但编码鼠特异性il-1ra转基因。
[0291]
方法：在60只十二周龄雄性fvb/n小鼠的两个膝关节中通过交叉韧带横切诱导oa(第0天)。七十二小时后(第3天)，将测试项hdad-mil-1ra(组1)或对照载体hdad-gfp(组2)以109个vp的剂量和5μl的剂量体积(每组16只小鼠)ia注射到双膝中(表2)。组3接受pbs的ia注射(每组8只小鼠)。组4包含12只对照小鼠，它们进行假手术且未接受任何治疗。在第57天至第59天，在所有小鼠中进行热板伤害感受分析以评估热痛觉过敏。分别记录至后肢轻弹和后肢舔舐或跳跃的潜伏期作为次要反应时间和主要反应时间。在第60天处死小鼠。分别处理每只动物的左膝和右膝用于组织学和相差显微ct分析。
[0292]
为了评估软骨损伤，根据oarsi组织学分级系统以盲化方式对来自外侧室的切片进行评分，并且将胫骨和股骨的评分加在一起(评分系统详述于表3中)。为了评估滑膜炎，使用表4中描述的3点量表对切片进行评分；将骨赘评分为在组织学切片中存在或不存在，并且表示为具有骨赘的关节相对于所有分析的关节的百分比。盲化评价员使用显微ct成像来分析软骨体积和被软骨覆盖的骨面积。
[0293]
表2实验组和处理组测试项剂量水平(vp/膝)剂量体积(μl)acl-t组大小1hdad-mil-1ra1095是162hdad-gfp1095是163媒介物(pbs)-5是164
‑––
否12acl-t，前交叉韧带横切；pbs，磷酸盐缓冲盐水；vp，病毒颗粒。
[0294]
表3：用于小鼠功效研究的oarsi评分系统得分组织学特征0正常0.5番红-o损失，没有结构变化1小原纤维显现，没有软骨损失2垂直裂缝向下至紧接在浅层下方的层，以及一些表面板片损失3钙化软骨的垂直裂缝/侵蚀延伸至关节面的＜25％
mil-1ra处理的小鼠显示趋向降低的热伤害感受反应的趋势，但所述差异在统计学上不显著。这些数据表明，在骨骼成熟小鼠中的此重度oa模型中，ia注射hdad-mil-1ra减缓软骨降解并改善疼痛参数。通过显微ct评价的功效终点在统计学上显著，而组织学评价没有显示出统计学上显著的差异，这一事实可能归因于前一分析方法的灵敏度增加。
[0302]
实施例9：hdad-大鼠il-1ra在大鼠骨关节炎的前交叉韧带横切(aclt)模型中的作用。
[0303]
研究目的：本文描述了评价hdad-大鼠il-1ra(fx201的大鼠替代物)在aclt手术后1周作为单次ia注射施用于大鼠时的作用的研究。本研究的目的是评价hdad-大鼠il-1ra(fx201的大鼠替代物，专利us10,301,647的基于腺病毒的生物递送和表达系统，通过引用并入本文)(编码大鼠白细胞介素-1受体拮抗剂蛋白的辅助依赖性腺病毒)在aclt手术后一周在大鼠中通过单次关节内注射给予时的作用。
[0304]
方法：适用于病理学研究的实验程序汇总在表5中。
[0305]
表5.实验设计
[0306]
在如上所示的表5中，i.a.是关节内注射；ti是测试项。手术日期被认为是第-7天。
[0307]
在手术后第12周终止后，从所有大鼠收获右膝关节，将其用针别在石蜡块上以保持大约110
°
的角度，并固定在10％中性缓冲福尔马林(nbf)中。这些膝用于显微ct成像和组织病理学评价。
[0308]
为了组织病理学评价，将整个右膝关节脱钙，包埋在石蜡中并冠向切片。将三个切片用番红o固绿(sofg)染色，并且将一个切片用h&e染色，使用如附录1中详述的半定量分级系统(oarsi)对它们进行评价，以分别地对软骨/骨和滑膜进行单独评分。在excel电子表格中记录代表性切片的单独得分，并且所有单独得分的总和生成总合成得分。
[0309]
将总共46只sprague dawley大鼠分配到4个研究组中的1个：高剂量hdad-大鼠il-1ra(aclt/hdad-大鼠il-1ra；2.4x108个病毒颗粒[vp]/剂量；n＝12)，低剂量hdad-大鼠il-1ra(aclt/hdad-大鼠il-1ra；3x107个vp/剂量；n＝12)，媒介物(aclt/媒介物；n＝12)，或假手术/未处理(n＝10)。在第-7天，在异氟醚麻醉下对大鼠进行aclt手术(除了假手术动物之外)。手术后七天(第1天)，大鼠在麻醉下在右膝关节中接受hdad-大鼠il-1ra或媒介物的单次ia注射。在第12周，处死动物并且收获整个右膝关节并分析组织病理学。对于组织病理学评价，用番红o固绿(sofg)以及苏木精和伊红对整个右膝关节进行染色，并使用半定量分级系统(oarsi评分)分别对软骨/骨和滑膜进行评分来评估。记录单独得分，并通过所有单独得分的总和产生每个参数的合成得分。
1ra(4.3x10
10
个gc/剂量)或fx201(4.1x10
10
个gc/剂量)的aclt手术大鼠的群组中评估载体生物分布(在每个时间点，n＝12[1:1性别比]/组)。
[0317]
结果：在本文所述的功效研究中，与媒介物相比，hdad-大鼠il-1ra显示oarsi合成得分降低。在安全性研究中，在所研究的任何剂量下，hdad-大鼠il-1ra对死亡率、体重和摄食量或者临床或解剖病理学都没有有害效应。抗ad5滴度随hdad-大鼠il-1ra剂量增加而增加并且从第29天至第92天降低。类似地，如通过使用来自hdad-大鼠il-1ra处理的大鼠的脾细胞的干扰素-γelispot所评估，剂量依赖性抗ad5 t细胞应答从第29天至第92天降低。在生物分布研究中，直至第92天检测到hdad-大鼠il-1ra和fx201，且在注射部位浓度最高。在第8天和第29天，在肝、脾、肺和骨髓中偶尔以低水平检测到二者；然而，在检查的任何时间点，在血浆或器官(如脑、心脏和肾)中没有检测到任一者，证实不存在体循环。
[0318]
结论：本文所述的结果证实，在功效研究中测试的所有剂量下，在术后12周，在大鼠中单次局部ia注射后，hdad-大鼠il-1ra改善了对软骨的oa相关病变。hdad-大鼠il-1ra耐受性良好，并且认为无可见有害效应的水平(noael)为4.3x10
10
个gc，即最高测试剂量，其指示在oa的大鼠aclt模型中在最小有效剂量(3.6x107个gc/剂量)和noael之间的1000倍差异。此外，hdad-大鼠il-1ra和fx201没有进入体循环。本文所述的这些结果支持fx201的进一步开发；对患有膝oa的患者的i期研究目前处于进行中(nct04119687)。
[0319]
实施例11：来自gq-201的il-1ra(hdad-eqil-1ra)的体外表达。
[0320]
研究目的：本文描述了评估由用hdad-eqil-1ra(在研究报告中称为gq-201)感染的hek293(人胚肾)细胞分泌的il-1ra的水平并证实由载体编码的nf-κb诱导型启动子是有功能的，即炎性刺激增加il-1ra的表达的研究。hdad-eqil-1ra是在nf-κb启动子的控制下表达马il-1ra的hdad载体。它与fx201等同，不同的是hdad-eqil-1ra携带il-1ra的马型式，而不是fx201中存在的人型式。用作对照的hdad-gfp载体编码绿色荧光蛋白(gfp)而不是il-1ra，但与hdad-eqil-1ra和fx201共享相同的骨架。
[0321]
方法：将hek293细胞一式三份铺于12孔板上(每孔250,000个细胞)，并且在1ml含有10％胎牛血清的最低必需培养基(mem)(10％mem)中孵育过夜。第二天(第0天)，将培养基替换为200μl的含有如表6中所列的病毒的相应感染培养基。将细胞孵育1小时，然后抽吸出感染培养基或媒介物，并用10％mem替换。在第1天，从孔中取上清液样品，并在-20℃下冷冻。在第2天，将所有孔的培养基换成新鲜的10％mem。在第3天，从孔中取上清液样品，并在-20℃下冷冻。将所有孔的培养基更换为含有100μg/ml lps的10％mem或普通的10％mem，如表6中所示。在第4天，收集上清液并在-20℃下冷冻。通过专用于马il-1ra的酶联免疫吸附测定(elisa)分析样品。
[0322]
表6：实验组和处理
vp，病毒颗粒。
a tris-hcl缓冲液 5％甘油
[0323]
结果：在第1天和第3天，在组1a和组1b中测量到马il-1ra浓度在20ng/ml-40ng/ml之间，其中用100个vp/细胞的hdad-eqil-1ra感染细胞。在第3天添加lps后，il-1ra水平在第4天增加到约90ng/ml(组1b)，而在没有lps的情况下，测量到il-1ra浓度为约20ng/ml(组1a)。在组2a和组2b中，在用1,000个vp/细胞的hdad-eqil-1ra感染细胞的情况下，在第1天和第3天测量到马il-1ra的浓度在130ng/ml-150ng/ml之间。用lps刺激后il-1ra分泌增加在用hdad-eqil-1ra以1,000个vp/细胞感染的细胞中也是明显的，尽管与用100个vp/细胞的hdad-eqil-1ra感染的细胞相比，诱导程度较低。(图14)
[0324]
在用hdad-gfp感染的组或用媒介物处理的组中，无论是否有lps处理，都没有检测到超过基线的显著il-1ra水平。在第4天，组4a(hdad-gfp)中的一次重复具有53.5ng/ml的il-1ra浓度；认为这是技术误差的结果。
[0325]
结论：本文所述的结果证实，用hdad-eqil-1ra感染的细胞将il-1ra分泌到培养基中。与用100个vp/细胞的hdad-eqil-1ra感染的细胞的上清液中的il-1ra水平相比，用1,000个vp/细胞的hdad-eqil-1ra感染的细胞的il-1ra产量更高。在用hdad-eqil-1ra以100个vp/细胞以及1,000个vp/细胞感染的细胞的细胞上清液中，在第3天通过lps诱导炎症导致在第4天il-1ra水平增加。这表明控制il-1ra表达的炎症敏感性启动子系统是有功能的。
[0326]
实施例12.在马关节中辅助依赖性腺病毒递送的马il-1ra的剂量递增试验。
[0327]
研究目的：本文描述了开发hdad-il-1ra至关节的剂量的研究，所述剂量提供具有可接受的滑膜炎性反应的高表达。hdad-eqil-1ra具有与fx201或鼠载体hdad-mil-1ra相同的载体骨架，但编码il-1ra转基因的马特异性变体。
[0328]
方法：对于此研究使用一只6岁的正常成年马。对马进行临床和放射照相检查，以排除前肢中carpj和mcpj中的预先存在的关节炎。在第0天，以3ml的剂量体积对马的单独关节ia注射配制于pbs中的递增剂量的hdad-eqil-1ra，如表7中所示。在第90天，对mcpj(先前注射了2x10
11
个vp hdad-eqil-1ra)、左carpj(先前注射了6x10
12
个vp hdad-eqil-1ra)和右后肢跖趾关节(mtpj)注射每关节1ml体积的pbs中的0.125ng lps。在hdad-eqil-1ra注射后，在第0天、第1天、第2天、第4天、第7天、第14天、第21天、第56天、第90天和第92天，对所有注射了hdad-eqil-1ra的关节的滑液取样。另外，在第56天、第90天和第92天对来自右后mtpj的滑液取样，并且在第90天和第92天对来自左后mtpj的滑液取样。在取样的滑液中确定wbc计数、蛋白质含量和il-1ra水平。
[0329]
表7：实验设计和处理关节剂量水平(vp/关节)第92天的lps前肢-右mcpj2
×
10
11
是前肢-左mcpj6
×
10
11
否前肢-右carpj2
×
10
12
否前肢-左carpj6
×
10
12
是后肢-右mtpj未处理是
后肢-左mtpj未处理未处理lps，脂多糖；vp，病毒颗粒。carpj，腕关节；mcpj，掌指关节；mtpj，跖趾关节。
[0330]
结果：临床体征：本文公开的结果表明，将hdad-eqil-1ra注射到左mcpj和右mcpj中导致中度滑膜积液和表面触诊发热。hdad-eqil-1ra注射后24小时，两个腕都肿胀并且摸起来发热。积液在左腕中严重，并且在右腕中中度严重。注射后持续24小时，影响左前肢和以较低程度影响右前肢的导致不愿负重的疼痛明显。在载体施用后的首个24小时中，马更愿意保持侧卧。在首个36小时中以较高剂量施用nsaid以控制疼痛，然后施用标准剂量直至第5天。在对四个关节注射hdad-eqil-1ra后12小时，肌内给予单剂量的吗啡。在第2天跛行显著减轻，并且在第4天马舒适地行走。
[0331]
滑膜wbc计数：本文公开的结果表明，在以两种剂量水平注射载体后一天，观察到滑液wbc计数显著增加。wbc计数的增加在更高载体剂量下更严重。所有四个注射的关节的平均总wbc计数为35.2x103个细胞/ml；在此范围内的总wbc计数被分类为中度至重度炎性滑膜炎，通常指示脓毒症。第1天的差异性wbc计数指示中性粒细胞浸润，到第2天变成主要为大单核细胞。响应nsaid治疗，wbc计数到第4天下降至正常。在第5天停止nsaid治疗后，在第7天wbc计数的反弹明显。然后到第56天，总wbc计数逐渐下降至正常水平，并且保持正常，直到第90天(平均值：1.0
×
103个细胞/ml)。
[0332]
滑液中的蛋白质含量：所公开的结果表明注射后第1天总蛋白质含量在mcpj中适度升高，而在carpj中显著升高。到第4天，mcpj的滑液蛋白质含量降至正常值，但carpj总蛋白质含量保持升高直到第56天。此结果表明，hdad-eqil-1ra的剂量水平越高，诱导的滑膜炎越明显。
[0333]
滑液il-1ra水平：所公开的结果表明，在注射后第1天，在所有剂量水平下都观察到il-1ra的峰值滑液浓度(图15)。最高剂量的hdad-il-1ra导致il-1ra的更持久升高。在第4天观察到il-1ra水平降低，认为这是对由nsaid治疗引起的炎症减轻的反应。在nsaid治疗停止和炎症反弹后，滑液il-1ra浓度在第7天再次增加。到第56天，除了以6x10
12
个vp/关节的最高剂量处理的carpj，在注射的关节中没有检测到il-1ra。在处理后第90天在滑液中没有检测到il-1ra。在将lps施用于mcpj(先前注射了2x10
11
个vp hdad-eqil-1ra)后，在第92天在左carpj(先前注射了6x10
12
个vp hdad-eqil-1ra)和未处理的右后肢mtpj中检测到il-1ra水平增加。在没有接受lps的右carpj中也存在增加的il-1ra。il-1ra表达的最高再活化在先前注射了hdad-eqil-1ra的关节中是明显的。
[0334]
结论：所公开的结果证实，所有剂量水平的hdad-eqil-1ra在第1天都导致显著的il-1ra产生。最高剂量(6x10
12
个vp)导致在至少56天的时间段内的持续il-1ra产生。尽管il-1ra合成增加，但在较高hdad-eqil-1ra剂量下诱导的滑膜炎更严重，具有短暂但高的总wbc计数以及滑液蛋白质含量的持续升高。滑膜炎与carpj中的显著短期疼痛相关。在此研究中观察到的短暂炎性反应可能由于与功效研究中的单个关节相比，处理四个关节引起每只动物的总载体剂量高而加重。在对关节的lps损伤后，在反弹的il-1ra形成在第92天是明显的。与注射lps的首次用于试验的关节(3.51ng/ml)相比，注射hdad-eqil-1ra的关节中的水平通常更高(6.24ng/ml-15.09ng/ml范围)。未注射lps的右carpj也显示出增加的il-1ra表达。这可能反映了来自因lps注射而发炎的更远端mcpj对carpj的局部旁分泌或淋巴刺激。本发明的结果表明载体可以被邻近的关节损伤再活化。总之，本发明的结果指示il-1ra
转基因的长期(至少3个月)炎症敏感性表达的潜力。
[0335]
实施例13：辅助依赖性腺病毒递送的马il-1ra用于治疗马模型中的创伤性骨关节炎的初步试验。
[0336]
研究目的：本文描述了评价hdad-eqil-1ra在oa疾病的马模型中治疗早期oa的潜力的研究。hdad-eqil-1ra具有与fx201和鼠载体hdad-mil-1ra相同的载体骨架，但编码马特异性il-1ra转基因。
[0337]
方法：在研究的第(-5)天，在12匹骨骼成熟(3至6岁)的纯种赛马的一个随机选择的前肢中的中间腕关节具有手术形成的桡侧腕骨骨软骨片，与踏板运动配对，以诱导早期oa。使用10mm的弯曲圆凿将骨片从桡侧腕骨的背面分离，并且使用电动磨锥将骨折床扩展至15mm。故意将碎片保留在关节中以诱导轻度退行性变化。所有马在入选到本研究中之前都经历了放射照相和临床评价以确认没有预先存在的腕骨疾病。通过关节镜检查对对侧肢中的中间腕关节进行假手术，但没有骨折形成。手术后五天(第0天)，将马分成多个实验组，并且通过向诱导oa的腕关节中进行ia注射来进行处理，如表8中所示。
[0338]
表8：实验组和处理组测试项剂量水平(vp/腕关节)组大小1hdad-eqil-1ra2x10
11
(低剂量)42hdad-eqil-1ra2x10
12
(高剂量)43媒介物(pbs)-4pbs，磷酸盐缓冲盐水；vp，病毒颗粒。
[0339]
然后，每周5天以严格的程序锻炼马。通过检查步态并根据美国马医协会(aaep)方案按0-5量表指定得分来评估马的跛行(0：无跛行至5：重度跛行)。为了评估活动范围，屈曲马腿直至感觉到阻力，并且按0-4量表对范围的减小进行评分(0，未减小；1，减小＜25％；2，减小25％-50％；3，减小50％-75％；4，减小＞75％)。为了评价屈曲后的跛行，屈曲关节20秒，然后根据aaep按0-5量表(0：无跛行至5：重度跛行)进行跛行评估。最后，按0-4量表评定积液(0：无积液至4：明显积液)。在整个实验中每周进行这些临床检查。另外，在第(-5)天和第0天、第4天、第7天、第14天、第21天、第28天、第56天和第72天对滑液(细胞学和il-1ra表达)和外周血(全血计数)进行取样。在研究结束时(第72天)，对马实施安乐死，并且用肉眼评价腕关节。处理滑膜和软骨用于组织学，并且由病理学家以盲化方式评分。
[0340]
结果：临床评分：本文所述的结果表明，在注射后一周内没有马发展出跛行，指示治疗的耐受性良好。在载体施用后，也没有注射部位的局部炎症的证据。与假手术关节相比，在每周临床检查中，oa关节在所有天数里都具有显著更差的积液和运动得分范围。与注射媒介物的马相比，积液、屈曲疼痛、活动范围和跛行的累积数据揭示hdad-eqil-1ra治疗组的所有测试参数都有显著改善(图16)。注射高剂量hdad-eqil-1ra导致临床参数的显著改善，但跛行除外，较高载体剂量的影响不如较低载体剂量深远。血液学和临床化学：本文所述的结果表明，未观察到与施用hdad-eqil-1ra载体相关的变化。滑液细胞学：本文所述的结果表明，与治疗前样品和注射媒介物的对照两者相比，以低剂量(2x10
11
个vp)和高剂量(2x10
12
个vp)施用hdad-eqil-1ra诱导滑液中wbc计数的短暂增加，在注射后第4天达到峰值，到第28天消退。滑液il-1ra：hdad-eqil-1ra治疗的马的滑液中的il-1ra浓度在第4天达到峰值，低剂量组为14ng/ml，而高剂量组为21ng/ml。在实验过程中，滑液il-1ra水平逐渐
下降，直到在第72天，在低剂量组和高剂量组中分别为大约1ng/ml和大约0.1ng/ml。对注射的关节的肉眼检查：本文所述的结果表明，在大多数注射媒介物的oa关节中，滑膜由于出血而变色，并且在注射hdad-eqil-1ra的关节中，滑膜具有正常的棕褐色。未治疗的oa关节具有显著增加的囊厚度和异常着色。与假手术的正常腕相比，hdad-eqil-1ra注射将两个参数降低至相似的水平。与注射媒介物的对照关节相比，关节面的肉眼评价显示注射hdad-eqil-1ra的关节的中间腕骨、桡侧腕骨、中间腕骨的第三面和桡侧腕骨的第三面区域中的原纤维显现更少(得分更低)，并且与注射媒介物的对照相比，hdad-eqil-1ra组中所有区域的总原纤维显现得分显著更低(更好)(图17)。组织学检查：本文所述的结果表明，将来自桡侧腕骨和第三腕骨的骨软骨切片用苏木精和曙红染色，并在偏振光评估下检查软骨原纤维显现、软骨细胞密度、软骨细胞克隆、骨赘形成、潮标(tidemark)复制或缺失、软骨下骨侵蚀和组织化构造。使用甲苯胺蓝组织化学染色检查另外的切片以确立区域性基质蛋白聚糖含量，并通过ii型胶原蛋白免疫组织化学来确定胶原蛋白密度和保存。以盲化方式计算上面列出的每个单独组织学参数的平均严重程度得分，以及合并所有参数的总组织学得分(图18)。与注射媒介物的对照相比，用hdad-eqil-1ra处理的组中的总组织学得分显著更低。与注射媒介物的关节相比，hdad-eqil-1ra处理的关节对于单独参数具有大体上更低的得分；然而，与媒介物对照相比，仅软骨细胞克隆显著降低。与注射hdad-eqil-1ra的oa关节相比，来自注射媒介物的oa关节的滑膜切片具有增加的增厚和纤维化。
[0341]
结论：本文所述的结果证实，桡关节中骨软骨片的手术形成诱导oa，伴有具有早期软骨变化的中度滑膜炎，当与假手术关节相比时，其表现为几个临床参数、滑液细胞学参数和组织学的显著性差异。在研究过程中，在hdad-eqil-1ra处理的关节中，跛行程度、活动范围、屈曲疼痛和积液程度的累积改善是明显的。与在处理的关节中软骨和滑膜相比于未处理的oa的总体改善和组织学改善相结合，本发明结果表明，使用hdad载体直接ia递送il-1ra转基因似乎是安全和有效的。测试两种hdad-eqil-1ra剂量，2x10
11
个vp/关节和2x10
12
个vp/关节，并且两者都具有显著的益处，不存在一种剂量比另一种剂量始终更有效的情况。总之，本发明的结果证实了在oa疾病的大型动物模型中表达马il-1ra的hdad的ia注射对oa的临床和形态表现的实质性益处。
[0342]
实施例14：fx201或相关物种特异性构建体(hdad-eqil-1ra或hdad-大鼠il-1ra)的药代动力学。
[0343]
本文描述了评价fx201或相关物种特异性构建体(hdad-eqil-1ra或hdad-大鼠il-1ra)的药代动力学的研究。本文所述研究的结果表明，作为单次ia注射以比计划的临床起始剂量高多达800倍的剂量施用于膝关节的fx201或相关物种特异性构建体(hdad-eqil-1ra或hdad-大鼠il-1ra)显示在注射的膝外有限的生物分布。在马中，在施用后72天研究结束时没有观察到显著的载体生物分布。另外，在整个研究中没有发生载体脱落，进一步证实了注射的载体的局部化。在大鼠中，在研究期间，载体生物分布主要限于局部注射部位，包括皮肤、滑液灌洗液、股四头肌以及引流髂淋巴结和腘淋巴结。在肝、脾、肺和骨髓中观察到偶发的低水平的载体。重要的是，没有检测到至性腺的载体分布。
[0344]
本发明的结果表明，单次施用fx201或hdad-大鼠il-1ra在acl-t手术后的大鼠中耐受性良好。所有载体处理的大鼠都发展出预期的针对衣壳的免疫应答，由wbc计数增加、脾细胞中的t细胞应答、与增加的淋巴结细胞性相关的局部引流淋巴结(髂和/或腘)肿大以
及关节炎症和退行性关节病轻微增加组成。wbc计数、淋巴结肿大和淋巴结细胞性的增加到第92天全部消退或正在消退，指示此反应的可逆性。在第92天，在用hdad-大鼠il-1ra和fx201两者处理的动物中观察到退行性关节病轻微增加，但在第29天时间点与对照没有差异，并且认为这种增加主要由关节炎症的轻微增加来驱动。
[0345]
预期在计划用于施用至人的较低剂量水平下没有在本文所述的研究中观察到的针对载体的炎性反应，所述炎性反应可能促成治疗的膝中退行性关节病的严重程度的轻微增加。在功效研究中，在oa大鼠模型(给药前一周进行acl-t)中给予的较低剂量(3x107个vp/膝或2.43x108个vp/膝)下，未观察到关节疾病的加重；相反，施用hdad-大鼠il-1ra载体显示对oa进展的明确治疗益处。在glp毒理学研究中，在以2.43x10
10
个vp/膝的高剂量治疗后在第29天观察到退行性关节病的恶化，以及增加的单核细胞浸润至关节周围组织中和滑膜的增生/肥大。然而，在第92天，单核细胞浸润和滑膜增生/肥大完全消退，退行性关节病没有明显增加。在最后处死时间点(第92天)在给予fx201的动物中观察到的治疗的关节的增加的炎症可以通过针对人il-1ra蛋白的免疫应答来解释，因此认为与人安全性无关。与此一致，在用hdad-大鼠il-1ra处理的大鼠中，在第92天没有观察到炎症增加。
[0346]
总之，本发明的结果强烈支持，直至比计划的临床起始剂量高大约1,000倍的剂量下，fx201或物种特异性构建体的单次局部施用都耐受性良好(参见表9)。另外，在两种物种中都观察到在注射的关节外的有限生物分布。注射fx201和hdad-大鼠il-1ra导致针对衣壳的预期的、非不良的免疫应答，所述免疫应答至研究期结束时消退或正在消退。表9：目标和实际安全裕度*假定15μl大鼠滑液(emami 2018)和5ml人滑液(heilmann 1996，hansen 2011)；**通过基于大鼠和人的滑液体积外推剂量水平来计算。vp，病毒颗粒；gc，基因组拷贝
[0347]
实施例15：fx201的大鼠替代物hdad-大鼠il-1ra的毒理学研究。
[0348]
本文描述了在oa的大鼠acl-t模型中在单剂量glp依从性研究中评价fx201的大鼠替代物hdad-大鼠il-1ra的毒性和功效的研究。使用oarsi评分系统评价的退行性关节病(djd)存在于经历acl-t手术的所有指标膝关节中，并且偶发地存在于一些假手术动物中。如所预期的，从第29天到第92天时间点，djd的严重程度有所进展，如通过与第29天相比，在第92天所有acl-t组的中值合成oarsi得分增加所示，证实了oa的诱导。
[0349]
所有三种剂量水平都耐受性良好，在任何时间点都没有注意到全身毒性。这与在glp生物分布研究中观察到的在单次ia施用后在注射的膝外的有限生物分布的发现一致。
[0350]
本文所述的研究表明，预期的针对ad5衣壳的免疫应答存在于大多数动物中，但出现率和量级都既是剂量依赖性的也是时间依赖性的。观察到抗ad5循环抗体的血清阳性率和滴度水平的剂量依赖性增加。与第92天相比，滴度水平在第29天最高，指示循环抗体的水
平逐渐降低。另外，在2.43x109个vp/剂量和2.43x10
10
个vp/剂量的剂量下，在脾细胞中观察到针对ad5载体衣壳的t细胞免疫应答。在最高测试剂量(2.43x10
10
个vp/剂量)下，从第29天到第92天保持t细胞应答，而在第92天时间点，所述应答在中等剂量组(2.43x109个vp/剂量)中减弱。在任何评价时间点，在2.43x108个vp/剂量的最低剂量下没有观察到针对ad5载体的显著t细胞应答。
[0351]
本文所述的研究没有显示在glp毒理学研究中明显的所引发免疫应答的全身作用。在生物分布研究的第29天时间点，在相当于glp毒理学研究中施用的最高剂量的剂量水平下，注意到淋巴结细胞性、白细胞(wbc)和差异计数的非不良最小增加。毒理学研究中没有这些发现进一步强调了它们的非不良性质。
[0352]
本文所述的研究表明，在第29天时间点，与未处理的acl-t大鼠和施用参考项或较低剂量的hdad-大鼠il-1ra的大鼠相比，在最高测试剂量(2.43x10
10
个vp/剂量)下，在处理的股胫关节中，单核细胞浸润和滑膜的肥大/增生的发生率和严重程度增加。单核细胞浸润的特征通常在于关节周围组织中有单核细胞极少，并且通常与滑膜肥大/增生相关。认为单核细胞浸润的这种增加是在与经历acl-t手术并且未经处理或接受参考项的动物相比时，在这个组中在第29天观察到的oarsi得分轻微增加的基础。在glp生物分布研究的第29天时间点，与未处理的对照相比，施用相同的2.43x10
10
个vp/剂量的hdad-大鼠il-1ra的动物显示针对载体的稍微更严重的局部免疫应答。在glp生物分布研究中，关节炎症存在于大多数动物中，所述关节炎症由单核细胞或混合细胞浸润构成，所述浸润通常与关节滑膜和邻近腱鞘的增生/肥大相关。重要的是，并且与glp生物分布研究一致，在第92天，在施用2.43x10
10
个vp/剂量的动物中，单核细胞浸润和滑膜肥大/增生的增加的发生率和严重程度不再存在，指示此发现的可逆性。在两项研究中，认为在滑膜中观察到的这些短暂作用是非不良的。
[0353]
在本文所述的glp毒理学研究中，没有注意到与用hdad-大鼠il-1ra治疗相关的另外的组织病理学发现。glp生物分布研究中的组织病理学评价还证实在用hdad-大鼠il-1ra或fx201处理后不存在全身作用(除了引流淋巴结的细胞性的非不良增加之外)。
[0354]
总之，本文所述的研究强烈支持，fx201的大鼠物种特异性构建体hdad-大鼠il-1ra的单次局部施用耐受性良好，并且没有导致全身毒性发现。基于这些结果，认为noael是2.43x10
10
个vp/剂量的hdad-大鼠il-1ra，即最高测试剂量。为了计算在noael和首次人体研究中的计划剂量之间的安全裕度，已经采用了基于滑液体积的剂量缩放方法。根据emami 2018，10μl-20μl的范围是大鼠中基于体重的适当滑液体积。基于入选到本研究中的大鼠的重量，选择15μl用于在大鼠剂量与人剂量之间进行缩放的目的。如表10中所示，基于vp/ml，人起始剂量具有相对noael超过800倍的安全裕度，并且最大临床剂量具有相对来自glp毒理学研究的noael的估计8.1倍的安全裕度。重要的是，临床给药将基于gc/ml，因为较低的建议剂量水平的浓度低于通过病毒颗粒测定(od260)检测的定量限(bloq)。考虑到这种定量量度，我们在起始剂量上具有1,000倍的安全裕度，并且在最大临床剂量上具有10倍的裕度(参见表11)。
[0355]
表10：临床安全裕度目标
*假定15μl大鼠滑液(emami 2018)和5ml人滑液(heilmann 1996，hansen 2011)；**通过基于大鼠和人的滑液体积外推剂量水平来计算。vp，病毒颗粒
[0356]
表11：实际安全裕度*假定15μl大鼠滑液(emami 2018)和5ml人滑液(heilmann 1996，hansen 2011)；**通过基于大鼠和人的滑液体积外推剂量水平来计算gc，基因组拷贝
[0357]
除了毒理学终点之外，glp毒理学研究中还包括治疗功效的评估。使用oarsi评分系统评价的djd存在于经历acl-t手术的所有指标膝关节中，并且偶发地存在于一些假手术动物中。如所预期的，从第29天到第92天时间点，djd的严重程度有所进展，如通过与第29天相比，在第92天所有acl-t组的中值合成oarsi得分增加所示，证实了oa的诱导。与未处理的acl-t组而非acl-t/参考项组相比，对于用2.43x109个vp/剂量hdad-大鼠il-1ra处理的动物，在第29天观察到中值oarsi得分的适度降低。另外，在第92天，与未处理的acl-t组和参考项acl-t组相比，用2.43x108个vp/剂量处理的动物具有更低的中值oarsi得分。尽管如上所述的oarsi得分的微小降低，但与在大鼠acl-t模型中在药理学研究中观察到的功效相比，hdad-大鼠il-1ra对oa的组织病理学表现的治疗益处在本研究中并不十分明显。这可以由本研究中处理时疾病严重程度增加来解释，其中与药理学研究中在acl-t后1周进行施用相比，在acl-t后4周施用hdad-大鼠il-1ra。应当注意，研究的主要终点是安全性，因此，为了获得安全性概况，选择重度疾病模型用于glp毒理学研究。
[0358]
本发明的结果表明，在使用用fx201的马特异性变体转导的hek293细胞的体外研究中评价hdad载体以炎症敏感性方式表达il-1ra的能力(图6)。使用脂多糖(lps)刺激nf-κb信号传导，并且导致马il-1ra的表达相对于未刺激的对照增加，证实nf-κb诱导型启动子的功能性。
[0359]
本发明的结果证实在单一健康马中进行的剂量递增研究中hdad载体系统在体内的功能性。将四种剂量水平的fx201的马变体hdad-eqil-1ra(2x10
11
个vp/剂量-6x10
12
个vp/剂量)施用于马的单独关节(左腕关节(carpj)和右腕关节以及左掌指关节(mcpj)和右掌指关节)。本发明的结果表明，在自所有剂量水平施用后1天，观察到滑液中的稳健的il-1ra表达。在本研究中，载体的注射与活动性的短暂受损损伤相关，所述受损归因于关节炎症、增加的白细胞(wbc)计数和滑液中的总蛋白水平。由于在任何其他研究中没有观察到局部不耐受性，因此推测在本发明结果中观察到的短暂炎性反应由于与功效研究中的单个关
节(最高测试剂量为2x10
12
)相比，处理四个关节引起每只动物的总载体剂量高(在单只动物中8.8x10
12
个vp的总联合暴露)而加重。
[0360]
在第2天-第5天，il-1ra水平响应全身非类固醇抗炎药(nsaid)施用而降低，在nsaid停止后观察到表达反弹。在注射后56天，在滑液中可检测到il-1ra。在处理后90天，经由将lps注射到先前载体处理的关节中来诱导il-1ra表达的增加。因此，本发明的结果指示il-1ra转基因的长期(至少3个月，研究的总长度)炎症敏感性表达的潜力。
[0361]
本文公开的结果指示，hdad-eqil-1ra在2x10
11
个vp/剂量或2x10
12
个vp/剂量的剂量下，在马骨软骨芯片模型中，在疼痛和功能参数两者以及关节结构保护方面的功效。在施用后72天，两种剂量水平的hdad-eqil-1ra都导致跛行、关节屈曲后跛行、关节积液的减少以及活动范围的改善。另外，在研究结束时，当与媒介物处理的动物相比时，两种剂量水平的hdad-eqil-1ra都导致受损关节的结构改善。这些包括软骨中的总体宏观和微观关节发现的减少以及滑膜衬里的颜色和厚度的改善。
[0362]
在oa的大鼠前交叉韧带横切(acl-t)模型中在3x107个vp/剂量和2.43x108个vp/剂量的hdad-大鼠il-1ra的剂量下进一步证实本发明的结果。在acl-t手术后一周，动物接受hdad-大鼠il-1ra的单次ia注射，并且11周后针对软骨/骨和滑膜的组织病理学来评价关节。本发明的结果公开了经历acl-t手术的动物在膝关节中发展出oa相关的显微变化。本发明的结果公开了hdad-大鼠il-1ra剂量依赖性地降低软骨/骨和滑膜两者中这些变化的发生率和严重程度，证实了此治疗对oa结构进展的治疗益处。
[0363]
在更严重的oa模型中观察到hdad-大鼠il-1ra的功效，其中acl-t手术后4周给予的2.43x108个vp/剂量或2.43x109个vp/剂量的单次ia注射在施用后1个月(在第29天时间点)降低了软骨/骨的中值合成oarsi得分。与acl-t未处理或媒介物处理(参考项)的动物相比，在施用后3个月(在第92天时间点)，2.43x108个vp/剂量的较低剂量也导致oarsi得分降低。
[0364]
总之，来自本文所述的非临床药理学研究的本发明结果证实hdad-il-1ra载体在炎症存在下产生治疗水平的il-1ra的功能性。另外，hdad-il-1ra的单次施用导致马的疼痛和功能丧失的oa样症状减轻，以及小鼠、大鼠和马的关节的结构损伤减轻。
[0365]
对于临床，fx201可以使用droplet digital
tm
聚合酶链式反应(ddpcr)量化载体。下表12确立了最低有效非临床剂量如何与我们的目标临床剂量相关。表12：vp/剂量和gc/剂量的比较表12：vp/剂量和gc/剂量的比较a假定在人中的注射体积为5ml(heilmann 1996，hansen 2011)，并且在大鼠中的注射体积为15μl(emami 2018)；vp，病毒颗粒；gc，基因组拷贝
hadenovec)的安全性和功效的临床研究设计，所述il-1ra基因疗法被开发用于治疗患有膝骨关节炎(oak)的患者。
[0372]
患者和研究程序
[0373]
本文描述了一种开放标记的单一递增剂量研究，以评估fx201在患有膝骨关节炎(oak)的患者中的安全性和耐受性。本文所述的研究的主要目的是评估单次ia注射fx201在患有oak的患者中的安全性和耐受性，如通过由患者自发报告的或由研究者发现的不良事件(ae)和来自以下评估的发现所测量：身体检查、指标膝评估、生命体征、心电图(ecg)和临床实验室评价。另外，将通过x射线评价指标膝，并通过中心成像供应商评估指标膝的软骨溶解、软骨下骨变化、骨坏死和不全性骨折。
[0374]
所有患者都将以低剂量(2.8x109个gc/ml)、中剂量(2.8x10
10
个gc/ml)或高剂量(2.8x10
11
个gc/ml)接受fx201的单次ia注射。将患者按群组分配至剂量，以最低剂量开始，然后递增。将在5-8名患者的群组中测试多达三种递增剂量的fx201。每名患者将仅接受fx201的一次注射，并且将被跟踪104周。所述研究将在30-80岁的男性患者和女性患者中进行，所述患者患有指标膝的痛性oa，kellgren-lawrence(k-l)等级为2、3或4级(仅对于中剂量群组和高剂量群组，k-l等级为4级)。在知情同意后，将选择符合合格标准的患者登记。将在5-8名患者的群组中测试多达三种递增剂量的fx201。所述研究将招募总计最多24名患者。每名患者将仅接受fx201的一次注射，并且将被跟踪104周。
[0375]
根据不良事件通用术语标准(ctcae)v5.0，将不良事件按严重程度进行分级。如果ae严重程度没有被具体分级，则研究者应当应用通用指导方针使用医学判断来确定如ctcae v5.0中所列的1级至5级。剂量递增方案的细节如下：a)低剂量群组(剂量a-2.8x109个gc/ml)：b)中剂量群组(剂量b-2.8x10
10
个gc/ml)：和c)高剂量群组(剂量c-2.8x10
11
个gc/ml)。
[0376]
每个群组将包括5-8名患者。将治疗并监测第一名患者7天以评价安全性。如果在治疗后7天中没有观察到认为与研究药物或研究注射程序相关或可能相关的3级或更高等级的ae，则将治疗并监测第二名患者。如果在治疗后7天中没有观察到认为与研究药物或研究注射程序相关或可能相关的3级或更高等级的ae，则将登记另外3名患者并跟踪最少4周。如果在前5名患者中没有发生认为与研究药物或研究注射程序相关或可能相关的3级或更高等级的ae，则将核对并评审数据以供进一步建议。如果在前5名患者中的任何一名中发生认为与研究药物或研究注射程序相关或可能相关的3级或更高等级的ae，则将在所述群组中登记另外3名患者。如果发生了认为与研究药物或研究注射程序相关或可能相关的另一个3级或更高等级的ae，则将暂停患者的登记，直到数据被评审并且提出继续按计划进行方案、修改方案或停止登记的建议。如果在任何时间发生严重不良事件(sae)，则无论相关性如何，都将暂停患者登记，并且将评审数据以提供继续按计划进行方案、修改方案或停止登记的建议。将在对群组中最后一名患者给药后经过最少4周评审所有患者的安全性数据，以确定a)对于低剂量群组和中剂量群组，是否递增至下一剂量水平将继续至下一剂量研究将发生；或b)在高剂量群组的情况下，用于未来研究的一种或多种水平。
[0377]
研究群体的选择
[0378]
患者数量。将登记最多24名患者(范围为15-24名)并用fx201的单次ia注射进行治疗。
[0379]
入选标准
[0380]
为了在试验中入选，患者必须满足以下标准：1.书面同意参与研究；2.愿意且能够依从研究程序和访问时间表并且能够遵循口头和书面指导；3.男性或女性，在登记日(第1天)年龄为30至80岁(包含端值)；4.在筛选时体重指数(bmi)≤40千克/平方米(kg/m2)；5.在筛选前与指标膝oa相关的症状持续≥12个月(患者报告的是可接受的)；6.在筛选前最后一个月内指标膝疼痛持续＞15天(患者报告的是可接受的)；7.对于oa的美国风湿病学会(acr)标准(临床和放射学)(altman等人，1986)如下：a)膝痛，b)以下中的至少一种：年龄＞50岁、晨僵＜30分钟、膝运动时有捻发音，以及c)骨赘；8.在以下疗法中已经失败：对于指标膝骨关节炎的两种或更多种类型的保守疗法(例如，结构化的基于陆地的锻炼计划(强化和/或心脏和/或平衡训练/神经肌肉锻炼，和/或包括太极或瑜伽的身心锻炼))；局部非类固醇抗炎药(nsaid)；非选择性nsaid或cox-2抑制剂；或者在一种先前类型的保守疗法和至少一种先前指标膝ia治疗(皮质类固醇或透明质酸)中已经失败(bannuru rr等人，2019)；9.在登记前在中心设施，基于在筛选期间进行的x射线并通过训练有素的放射线技师证实，在指标膝中kellgren-lawrence(k-l)等级为2、3或4级(仅对于群组b和群组c，k-l 4级)(2级：明确的骨赘和可能的关节间隙狭窄，3级：中度多发性骨赘、明确的关节间隙狭窄和一些硬化以及可能的骨端部畸形，4级：大骨赘、明显的狭窄、重度硬化和明确的骨端部畸形)；10.在基线时，指标膝检查指示指标膝和预期注射部位区域没有局部或关节感染的任何体征；11.在筛选访问和基线时，指标膝中的西安大略麦克马斯特大学骨关节炎指数疼痛得分≥4.0且≤9.0(0-10数字评定量表[nrs]量表)；12.如主办者所确认的，在21天筛选期内可获得登记名额；13.如主办者所确认，基于筛选x射线的中心读数，在指标膝中具有k-l 4级的患者可获得登记名额(仅在群组b和群组c中每个群组最多两名k-l 4级)；14.有生育能力(定义为未手术绝育或非绝经后[定义为在没有如病史中记录的替代性医学原因的情况下连续12个月没有月经])的性活跃女性在基线时(在登记前)血清妊娠测试必须是阴性，并且必须同意使用以下高效避孕方法中的一种：禁欲；口服、注射或植入激素避孕法；子宫内装置或子宫内系统；避孕套或具有杀精子泡沫/凝胶/薄膜/乳膏/栓剂的封闭帽(隔膜或宫颈帽/穹窿帽)；或与手术绝育的伴侣进行单配性交(必须在输精管切除术后6个月)，在施用研究药物后持续至少12个月。性活跃男性必须同意在与女性的任何性接触期间使用避孕套，在施用研究药物后持续至少12个月。
[0381]
在研究期间，将记录并报告所有现有的(在进入研究之前开始的)的合并用药、新的合并用药或合并用药在研究过程期间的变化以及相关的使用或变化的原因。
[0382]
排除标准
[0383]
疾病相关标准：1.反应性关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎或与炎性肠病相关的关节炎的任何当前或先前诊断，2.在指标膝中的任何当前或先前的感染史，3.在筛选的3个月内指标膝的活动性晶体病(痛风、焦磷酸钙沉积病)的临床体征和症状，4.由于在指标膝中存在手术硬件或其他异物而不能进行磁共振成像(mri)，5.在筛选的12个月内不稳定的指标膝关节(例如，前交叉韧带撕裂等)。
[0384]
先前或联合治疗相关标准：1.在筛选的6个月内在指标膝中使用任何ia药物/生物制品(例如，皮质类固醇、透明质酸、富血小板血浆、干细胞、增生疗法和羊水注射等)，在筛选的12个月内指标膝的冷冻或射频神经消融，3.在筛选的12个月内对指标膝进行关节镜或
开放手术。
[0385]
患者相关标准：1.怀孕或授乳或计划在给药后12个月内怀孕的女性；计划在给药后12个月内受孕的男性，2.将进行注射的指标膝上的皮肤完整性受损，3.预期在给药后12个月内进行大手术，4.人免疫缺陷病毒(hiv)感染、乙型肝炎表面抗原(hbsag)测试呈阳性或丙型肝炎病毒(hcv)的阳性血清学及丙型肝炎病毒核糖核酸(hcv rna)测试呈阳性的实验室证据，5.在筛选或基线访问时由研究者或指定人员判断为临床上显著的ecg异常，6.在筛选的5年内使用免疫调节剂、免疫抑制剂或化疗剂，7.接受任何先前的研究性或已批准的基因疗法治疗，8.在过去5年内有活动性恶性肿瘤或恶性肿瘤病史，切除的基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌或有效管控的原位宫颈癌除外，9.对抑郁症的积极药理学治疗，包括选择性血清素再摄取抑制剂(ssri)、血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂(snri)以及非选择性血清素再摄取抑制剂(nsri)或三环类，条件是在筛选前剂量/方案已经不稳定≥6个月，10.在过去12个月内有活性物质滥用(药物或酒精)或有物质滥用史，11.在筛选的3个月内使用任何其他研究性药物、生物制品或装置，12.在筛选的4周内有任何需要iv抗生素或抗病毒剂的全身或局部细菌或病毒感染，或在筛选的2周内有任何需要口服抗生素或抗病毒剂的全身或局部细菌或病毒感染，13.如果存在双侧膝oa，则在筛选访问前1个月内在对侧膝中的疼痛≥4.0(0-10nrs量表)，14.在指标膝中的先前全膝或部分膝关节成形术，15.在基线时体温高于99.5
°
f，16.凝血酶原时间(pt)/国际标准化比(inr)＞1.5；活化部分促凝血酶原激酶时间(aptt)高于正常上限(uln)＞5秒，17.丙氨酸转氨酶(alt)或天冬氨酸转氨酶(ast)＞1.5xuln；碱性磷酸酶(alp)＞1.5xuln；总胆红素超出正常范围，18.对对乙酰氨基酚具有已知的变态反应或敏感性，以及19.在研究者的判断下将排除使用ia注射或可能损害患者安全性、限制患者完成研究的能力和/或损害研究目的的任何其他临床上显著的急性或慢性医学病症(例如，出血障碍)。
[0386]
研究性药品施用程序
[0387]
fx201：humantakinogene hadenovec；低剂量、中剂量和高剂量将作为单次5ml ia注射施用。三种药品的浓度：剂量水平a：2.8e9个gc/ml(基因组拷贝数/毫升)；剂量水平b：2.8e10个gc/ml；以及剂量水平c：2.8e11个gc/ml。
[0388]
作为合格性的一部分，应当在基线时已经检查了指标膝，以确保所述膝和预期注射部位区域没有局部或关节感染的任何体征。研究药物的关节内注射将由指定的注射者进行。注射者可以基于护理标准选择要使用的膝的位置(例如，伸展或屈曲)、注射路径(例如，内侧或外侧)和麻醉剂(例如，emla乳膏、皮下利多卡因1％等)。应该使用无菌技术。在注射前，应该使用杀菌溶液彻底清洁指标膝。在所有情况下，在施用研究药物之前，将抽吸指标膝，并且将收集滑液用于确定il-1ra和il-1β蛋白浓度。
[0389]
可以使用机械压缩来收集滑液。如果使用超声引导检测到ia积液，则注射者应当在注射之前退回到干燥处附近。在尝试滑液抽吸后，使用超声引导将5ml fx201注射到滑膜间隙中。在抽吸和注射之后，应当用无菌纱布向注射部位施加压力。应当用酒精擦拭注射部位并用吸收垫和敷料覆盖。所有的注射/抽吸用品都应该根据当地机构关于处置生物危害材料的程序进行处置。
[0390]
也可以使用用于滑液抽吸的同一针头进行研究药物的ia注射，从而允许在注射器更换下进行单次注射。注射者将使用21号或更大的针进行注射和滑液的抽吸。注射者将记
录注射程序和与fx201施用相关的任何问题，并且将事件报告给现场监查员。
[0391]
既往及合并用药
[0392]
许可的药物/非药物疗法
[0393]
在整个研究中可以采用或使用以下药物和非药物疗法：a)对ae的任何治疗；b)研究分配的救援药物；c)休息、抬高或局部冰敷指标膝；d)对研究适应症之外未列为限制的预先存在的病症的任何治疗；e)每天以81mg的最大剂量施用阿司匹林以保护心脏，条件是在进入研究前所述剂量已经稳定3个月；f)对抑郁症的药物疗法，包括ssri、snri和nsri或三环类，条件是在筛选前剂量/方案已经稳定6个月；g)在给药后整个52周治疗期期间，应当建议患者在体育活动、物理疗法、针灸、tens或支具方面保持稳定的生活方式。
[0394]
禁止的药物/非药物疗法
[0395]
以下药物和非药物疗法在患者签署知情同意书后不应采用或在给药后的52周治疗期中不应使用：a)口服nsaid；b)施加于指标膝的局部疗法(例如，局部nsaid、辣椒素、利多卡因贴剂、其他局部治疗)；c)大麻素类；d)阿司匹林(＞325mg/天)；e)中枢作用疼痛药物(例如，普瑞巴林、加巴喷丁)；f)阿片类物质(羟考酮、氢可酮、可待因、吗啡、曲马多等)；g)肌肉松弛剂(例如，环苯扎林、四氢西泮、地西泮)；h)在指标膝中的任何ia注射(例如，局部麻醉剂、皮质类固醇、透明质酸、富血小板血浆、干细胞、增生疗法、羊水注射)；i)指标膝的冷冻或射频神经消融；j)任何研究性药物、装置或生物制品；k)任何免疫调节剂、免疫抑制剂或化疗剂。
[0396]
从知情同意直到治疗后60天，禁止口服nsaid、施加于指标膝的局部疗法和局部大麻素类。在治疗后60天之后，根据研究者的慎重考虑，限制使用这些药物。必须在基线访问前至少10天完成清除(至少5个半衰期)。
[0397]
限制性药物
[0398]
在治疗后的首个60天之后，如果指定的救援药物不足，则基于对额外镇痛的临床需要，在研究者的慎重考虑下限制性使用以下药物。然而，在给药后52周治疗期期间，在研究访问前72小时内，患者不应当采用这些药物：口服nsaid、施加于指标膝的局部疗法(例如，局部nsaid、辣椒素、利多卡因贴剂、其他局部治疗)和局部大麻素类。
[0399]
救援药物
[0400]
为了在所有患者之间标准化缓解疼痛的救援药物，在筛选时(在知情同意之后)开始，患者将停用所有禁止的药物。指定的救援药物是对乙酰氨基酚500mg。将根据需要指导患者每6小时服用1-2片，并且将指导患者在24小时内服用不超过6片(3000mg)。在筛选时开始并且在52周治疗期中，将向患者提供救援药物。根据指导，出于救援药物问责，患者将退还救援药物，并被发放新的供给。直到第1天访问、从第1天到第1周访问以及至第52周的后续访问，将向患者提供足量救援药物。对于群组a，患者将记录从筛选至剂量后60天的救援药物使用情况，并且对于群组b和群组c，患者将记录从筛选至剂量后84天(12周)的救援药物使用情况。在长期随访期(第52周-第104周访问)期间不提供救援药物。
[0401]
研究变量
[0402]
安全性变量：将基于患者自发报告的或由研究者发现的ae和来自以下评估的发现来评价安全性和耐受性：身体检查、指标膝评估、生命体征、ecg和临床实验室评价。将通过x射线评价指标膝，并通过中心成像供应商评估指标膝的软骨溶解、软骨下骨变化、骨坏死和
不全性骨折。
[0403]
功效变量：将独立地基于womac 3.1疼痛分量表(0-10nrs量表)和womac3.1僵直分量表(0-10nrs量表)的结果以及koos疼痛、其他症状、日常生活活动(adl)功能(0-100nrs量表)以及运动和娱乐功能和与膝相关的生活质量(qol)(5点likert量表)来评价功效。将通过mri评价指标膝，并通过中心成像供应商评估指标膝的骨形状的定量变化。
[0404]
生物分布变量：将从血浆样品分析血浆暴露。将从尿样和注射部位样品处的皮肤拭子来分析脱落。
[0405]
生物分析变量：将从血液样品分析抗衣壳抗体和抗il-1ra抗体的存在。将从血液样品分析高敏c反应蛋白(hs-crp)水平。将从滑液样品分析il-1ra和il-1β蛋白浓度。滑液和血液样品在研究结束后将被保存最多5年，用于生物标记物的潜在未来分析，所述生物标记物可以促成oa发病和/或与对fx201治疗的反应性相关。将不使用这些样品进行基因组分析(基因测序研究)。患者将能够在整个储存期间撤回同意。一旦分析开始，则将不再能够撤回同意。
[0406]
统计学方法：
[0407]
计划四个分析群体用于研究。安全性群体将包括接受研究药物的所有患者。安全性群体将用于评估安全性和耐受性。生物分布群体将包括接受研究药物并具有至少一个治疗后生物分布样品的患者。生物分布群体将用于评估fx201载体拷贝的生物分布。生物分析群体将包括接受研究药物并具有至少一个治疗后生物分析样品的患者。生物分析群体将用于评估fx201的生物分析效应。全分析集(fas)群体将包括接受完整剂量的研究药物并具有基线评价和至少一次剂量后评价的所有患者。fas群体将用于评估探索性功效终点。
[0408]
将对安全性群体进行安全性分析。将使用监管活动医学词典(meddra)词典对不良事件进行编码，并根据ctcae v5.0针对严重程度进行分级。治疗中出现的不良事件(teae)的发生率(数量和百分比)将按剂量组呈现，这些事件在给药后开始或在给药后严重程度恶化。teae的发生率还将按最大严重程度和与研究药物的关系来呈现。将对于sae、导致死亡的ae、导致从研究退出的ae以及对于与指标膝相关的ae提供类似的呈现。临床实验室、ecg、生命体征信息和筛选x射线数据将被汇总为在每个单独时间点的值和自基线的变化的概括统计量。概括统计量将包括n、平均值、中值、标准差(sd)、最小值和最大值。分类变量将使用频率和百分比来汇总。
[0409]
ctcae基于此通用指导展示1至5级，其具有每个ae的严重程度的独特临床描述：1级：无症状或轻度症状；仅临床或诊断观察；未指示干预；2级：指示最低程度的、局部的或非侵入性的干预，或限制年龄适当的工具性adl；3级：重度或医学上显著但不直接危及生命；指示住院或延长住院；致残；限制自理adl；4级：危及生命的后果或指示紧急干预；以及5级：与ae相关的死亡。
[0410]
在每个时间点对fx201呈阳性的患者的百分比将按剂量组来呈现。将按剂量组以及按样品类型在每个生物分布取样时间点汇总观察到的fx201的载体拷贝数。将报告il-1ra与il-1β的比率。将报告基线时血浆hs-crp的水平。将报告针对腺病毒血清型5(ad5)衣壳和il-1ra的抗药物抗体。另外，将报告每名ad5血清转化患者的中和抗体滴度。
[0411]
在本研究中收集的探索性功效数据将使用汇总表、图和受试者数据列表来呈现。汇总表将按剂量组并且(如果适用)按收集时间呈现数据。连续变量将使用描述性统计，具
体地平均值、中值、标准差、最小值和最大值来汇总。
[0412]
分类变量将按频率和百分比来汇总。还可以提供置信区间。将使用图来支持某些数据的呈现。可以进行灵敏度分析以检查缺失数据的影响以及任何基线不平衡的影响。将仅出于提供信息的目的而提供所有ci、统计检验和所得p值，且将以双向报告。将在α＝0.05水平下评估显著性，并且不会针对多重性调整显著性水平。
[0413]
初始观察-来自临床研究的低剂量群组的初步数据
[0414]
迄今为止，在fx201的初始临床试验(fx201-2019-001；nct04119687)中在施用最低剂量的fx201后观察到的治疗反应[是]强烈支持fx201治疗为患有骨关节炎膝痛的患者提供益处的潜力。使用由临床试验中方法、测量和疼痛评估的倡议(initiative in methods,measurements and pain assessment in clinical trials)(immpact)组织针对疼痛治疗结局在临床上重要的改善定义的阈值来评估经由西安大略麦克马斯特大学骨关节炎指数(womac)a(疼痛)测量的单独患者反应。在患有基线中度-重度骨关节炎膝痛的患者群组中，5名给药患者中有3名(60％)报告womac-a疼痛得分在治疗后8周时降低，这符合关于实质性的immpact标准(自第1天改善＞50％)。
[0415]
考虑到施用至在初始阶段测试的患者的fx201的低剂量(1.4x10
10
个gc/摩尔，总剂量为2.8x109个gc)，如上所述在患有中度至重度骨关节炎的患者中看到的改善是非常令人惊讶且出乎意料的。
[0416]
实施例17：fx201药品规格。
[0417]
本文描述了以对于包含本公开文本的基于腺病毒的生物递送和表达系统的fx201药品的接受标准来评价质量的方法。
[0418]
外观：视觉观察
[0419]
接受标准：透明至微乳白色的无色溶液，没有可见的微粒。
[0420]
视觉评估是用于外观的标准技术。fx201药品含有无色赋形剂，并且由于药品中病毒颗粒的浓度而可能显现微乳白色。
[0421]
靶基因序列的身份：dna测序
[0422]
接受标准：il-1ra序列与参考序列一致。
[0423]
此方法的目的是准确地鉴定fx201。将通过桑格测序获得的dna序列与人il-1ra参考序列进行比较。测序的il-1ra必须与参考序列一致，以确保药品含有目的基因。
[0424]
病毒载体的身份：微滴数字聚合酶链式反应(ddpcr)
[0425]
接受标准：检测到辅助依赖性腺病毒(hdad)
[0426]
fx201 hdad病毒基因组拷贝(gc)数通过ddpcr使用靶向基因组的独特区域的fx201特异性引物来测量。因为所述方法专用于fx201 hdad基因组，所以检测hdad基因组的能力证实了病毒载体的身份。
[0427]
化学/物理特性
[0428]
ph：
[0429]
接受标准：7.0
±
1.0
[0430]
电位滴定法是基于准确度和工业标准而选择的技术。ph使用usp《791》,ph.eur.2.2.3测试以确保fx201药品的稳定性，并且其在生理学上与关节内施用相容。
[0431]
粒度/聚集：动态光散射(dls)
[0432]
累积量：hd和pd(％)
[0433]
一个或多个正则化主峰：hd，强度％，和pd(％)
[0434]
此方法的目的是使用动态光散射仪测量fx201药品中存在的病毒颗粒的大小分布。监测聚集的病毒颗粒的水平，因为聚集具有降低效力和增加免疫原性的可能性。所报告的结果包括粒度、标准差以及平均累积量和所有一个或多个正则化主峰的峰多分散性。
[0435]
克分子渗透压浓度：usp《785》
[0436]
接受标准：≤600mosm/kg
[0437]
克分子渗透压浓度使用usp《785》药典方法来确定。所选的凝固点降低方法是工业标准方法。可注射溶液的克分子渗透压浓度可能影响产品的耐受性或生理相容性。为了确保fx201注射液的耐受性，确立≤600mosm/kg的规格界限(roethlisberger 2017)。fx201的克分子渗透压浓度主要由配制缓冲液驱动(大约450mosm/kg)，≤600mosm/kg的规格确立最终药品的上限。每个剂量水平的范围表示在每个剂量水平下在2.8e x的目标浓度附近允许的两倍误差。由于三种剂量的目标剂量水平表示十倍差异，因此这些范围适合这个开发阶段。
[0438]
感染性测定：半数组织培养感染剂量(tcid
50
)
[0439]
如本文所述，此方法的目的是确定fx201药品在hek293细胞中的感染滴度。fx201是hdad，一种含有人il-1ra序列的复制缺陷型重组病毒载体。hdad需要腺病毒5(ad5)病毒作为辅助进行复制。tcid
50
测定在hek293细胞中进行，其中用fx201药品样品的连续稀释液和饱和浓度的ad5共感染细胞。孵育后，通过靶向重组hdad载体的独特序列的qpcr检测扩增的病毒。基于qpcr的结果，针对病毒的存在或不存在对用hdad样品的连续稀释液接种的孔进行评分，并且通过斯皮尔曼-卡伯法(spearman-karber'smethod)计算tcid
50
(感染单位(tcid
50
)/ml)。
[0440]
病毒颗粒与感染单位比：计算
[0441]
接受标准：≤300个gc/tcid
50
[0442]
这是如以gc/ml表示的病毒颗粒与如以tcid
50
/ml表示的感染单位的比率的计算。在当前开发阶段，将病毒颗粒感染单位比最大值设定为≤300个gc/tcid
50
，以定义最大可接受限度，同时允许进一步分批经历和方法改进。此接受标准基于迄今收集的分批历史数据，考虑用于确定所述比率的总体测定的精确度。将继续收集分批数据，并且在程序开发期间进行方法改进。
[0443]
tcid
50
是每毫升纯fx201药品的感染单位数的测量值。感染单位是一个感染事件，即确定病毒颗粒的感染能力的测量值。在fx201批次中的病毒颗粒具有相同感染能力的情况下，样品中病毒颗粒浓度的变化将影响tcid
50
读数。同时，如果fx201批次具有不同的感染能力但病毒颗粒载量类似，则所述批次将获得不同的tcid
50
值。因此，病毒颗粒的感染能力最终取决于病毒颗粒与感染单位比。
[0444]
il-1ra表达测定：酶联免疫吸附测定(elisa)
[0445]
接受标准：检测到il-1ra
[0446]
用fx201感染不表达il-1ra的hek293细胞。孵育后，收集细胞上清液，浓缩，并分析il-1ra的存在。使用可商购的夹心elisa试剂盒来检测人il-1ra表达。
[0447]
fx201转染后il-1ra的细胞表达需要炎性启动子的存在，导致il-1ra的可变和短
暂产生。由于这种可变表达的可能性和开发的早期阶段，当前的接受标准是检测到il-1ra的表达。所述方法已经以合适的方式进行资格确认以证明能够检测到已用fx201感染的hek293细胞中的il-1ra表达。
[0448]
按照ich q4b附录8(r1)的无菌性
[0449]
接受标准：无菌/不生长
[0450]
使用无菌性测试，使用直接接种法对fx201药品最终小瓶测试无菌性，并且所需样品数量定义于usp《71》/ph.eur.2.6.1/jp 4.06中。这三种药典根据ich q4b附录8(r1)协调使用，并且产品特异性资格确认已经证实药典方法与fx201药品相容。作为无菌产品，fx201药品不得展现出细菌/真菌生长。
[0451]
内毒素
[0452]
接受标准：≤35eu/ml
[0453]
根据usp《85》进行细菌内毒素测定以量化fx201药品中革兰氏阴性细菌内毒素的水平。
[0454]
fx201以5ml给药。35eu/ml的内毒素限度对应于175eu/剂量。对于平均70kg的成人，这表示2.5eu/kg，在≤5eu/kg的肠胃外药品指导内。
[0455]
制造如本文公开的基于腺病毒的生物递送和表达系统的方法是基于使用细胞工厂中的粘附细胞大规模产生高质量的辅助依赖性腺病毒载体的方法，如suzuki等人,human gene therapy 21:120
–
126(2010年1月)中所述。
[0456]
实施例18：制造方法的概述。
[0457]
本文所述的制造方法基于如suzuki,2010所述使用(cs)的粘附细胞生长。用fx201和辅助病毒库共感染来源于hek293细胞的116细胞系。共孵育后，收获并裂解细胞。扩增的fx201通过三轮氯化铯(cscl)梯度超速离心纯化，其中在每个超速离心循环后提取出含有富集的fx201的条带以进一步处理。用配制缓冲液透析在cscl中的所得纯化的fx201，去除cscl，然后将其稀释至目标浓度，过滤并填充。将所得fx201原料药在≤-65℃下冷冻储存并测试放行。上游方法
[0458]
细胞培养方法
[0459]
本文描述了一种细胞培养方法，其始于解冻116主细胞库(mcb)的小瓶。将解冻的细胞扩增并用fx201和辅助病毒库共感染。感染后，饲喂并收获细胞，完成细胞培养过程，然后进行进一步纯化。
[0460]
小瓶解冻：在37℃水浴中解冻116mcb的小瓶。解冻后的细胞活力应≥70％。去除小瓶中的防腐剂(二甲亚砜)，并且将细胞置于具有培养基的培养瓶中，并在37℃下在5％co2孵育箱中孵育，直到细胞达到足以传代至下一细胞扩增步骤的汇合度。用于小瓶解冻和第一次传代的培养基由补充有胎牛血清(fbs)和l-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基(dmem)构成。
[0461]
细胞扩增：在小瓶解冻后，一旦培养物达到足以传代至下一细胞扩增步骤的汇合度，就在37℃下在5％co2孵育箱中在生长培养基(补充有fbs、l-谷氨酰胺和潮霉素b的dmem)中连续扩增细胞培养物。扩增细胞直至生长出足以制备出一个批次的细胞。在开始感染之前，对于每组cs10制备一个另外的10层cellstack(cs10)以测量总的活细胞。每次传代
结束时的细胞活力应≥80％。在细胞扩增步骤期间，使用tryple(重组胰蛋白酶)以从表面脱离细胞。另外，视觉评价培养物的细胞形态、细胞病变效应(cpe)和潜在污染。
[0462]
感染：一旦细胞扩增达到一个批次加一个另外的cs10的规模，通过用含有fx201和辅助病毒种子的新鲜制备的培养基(补充有fbs和l-谷氨酰胺的dmem)更换用过的培养基来感染细胞。在感染前，随机选择cs10之一以测量活细胞密度和活力。将感染的cs10转移到37℃和5％co2的加湿的co2孵育箱中。感染的目标体积是大约600g(或ml)/cs10。fx201和辅助病毒的总量如扩增fx201所需。
[0463]
饲喂：用新鲜培养基(补充有fbs和l-谷氨酰胺的dmem)饲喂cs10中的感染的116细胞，并在收获前进一步孵育。视觉检查培养物的细胞形态、cpe和潜在污染。在37℃下在5％co2中进行孵育大约24小时。用于饲喂的目标体积为大约600g(或ml)/cs10
[0464]
收获：在这个阶段，预期细胞显示cpe的迹象并从培养表面脱离。为了开始收获，通过轻轻敲击以促进从表面脱落来使细胞从cs10上轻轻脱离。收集脱离的细胞(包括用过的培养基)，产生含有fx201的未处理的整体收获物。从未处理的整体收获物中取样用于支原体、生物负荷和体外外来病毒测试。未处理的整体收获物的过程中测试应当显示不可检测的水平的支原体(usp《63》,ph.eur.2.6.7,1993ptc)和不可检测的水平的外来病毒(使用3种细胞系对外来病毒进行体外测定)。使用铺板法的微生物枚举测试(usp《61》,ph.eur.2.6.12)应当检测对于tamc＜10cfu/ml和对于tymc＜10cfu/ml。
[0465]
通过离心澄清未处理的整体收获物，其中弃去所得上清液(包括培养基中的fbs和残留的潮霉素b)，并且将细胞沉淀重悬浮于裂解缓冲液(100mm tris、10％甘油，ph 8.0)中。在进一步纯化前，将重悬浮的细胞沉淀在≤-65℃下保持冷冻。下游方法
[0466]
纯化制造方法
[0467]
本文描述了一种纯化制造方法，其由以下构成：细胞裂解、benzonase消化、澄清、超速离心、透析和配制以及最终过滤，以去除过程和产物相关的杂质。对于每个单元操作，适当的控制已经到位以帮助确保制造过程的一致性。
[0468]
裂解：fx201不具有溶原性，并且需要裂解感染的116细胞以释放病毒颗粒用于进一步处理。通过将容器置于冷冻(在异丙醇中的干冰)浴和温水(37℃)浴中，将裂解缓冲液(100mm tris、10％甘油，ph 8.0)中重悬浮的细胞沉淀冷冻-解冻裂解。在完成两个冷冻-解冻循环后和在第三冷冻循环中，可以将所得过程中间体保持在≤-65℃下，并在第三解冻循环后汇集来自另外组的cs10的收获的细胞，以形成一批原料药。
[0469]
benzonase消化：用benzonase处理含有fx201的细胞裂解物以消化残留的宿主细胞dna。首先将benzonase在含有10mm tris和10mm mgcl2的缓冲液中稀释，然后将其添加到细胞裂解物中进行消化。所述过程在温度受控的23℃水浴中进行，并且记录benzonase消化的时间跨度。
[0470]
澄清：benzonase消化的细胞裂解物通过离心澄清。离心后，收集上清液用于进一步处理，并取样以测量总病毒颗粒，从而监测总过程收率。
[0471]
超速离心：澄清的细胞裂解物通过三轮氯化铯(cscl)超速离心纯化，以基于比重将fx201与杂质分离。fx201和辅助病毒具有不同的基因组大小(29.3kb与36.0kb)，导致不同的比重，它们在超速离心后分离。在每个超速离心循环后，监测每个管中含有富集的
fx201的条带与杂质条带的清晰分离。
[0472]
对于第一个超速离心循环，将benzonase消化且澄清的细胞裂解物在稀释缓冲液(10mm tris和10mm mgcl2)中稀释，并覆盖在含有不同比密度的两层cscl的离心管中。在第一个超速离心循环中显现两个条带，其中通过提取含有fx201的下部条带，同时弃去含有杂质的上部条带，可以收集富集的fx201。将收集的含有fx201的条带汇集，稀释，并通过含有单层cscl的等密度超速离心过程的另外两个循环来纯化。
[0473]
透析：将来自超速离心过程的纯化的fx201装载到透析盒中以进一步去除包括cscl和潜在的残留潮霉素b的杂质。装载后，将透析盒浸入配制缓冲液(5％蔗糖w/v、0.5％乙醇v/v、75mm氯化钠、10mm l-组氨酸、10mm tris、1.0mm氯化镁、0.02％聚山梨醇酯80v/v、100μm edta)的容器中，每次交换更换全部容器内容物。在交换透析缓冲液四次后，从透析盒中移出纯化的fx201，将其汇集，并在配制缓冲液中稀释。取过程中测试样品，并且通过uv光谱测量总病毒颗粒的浓度(od260)。在进一步处理前，将纯化的fx201在≤-65℃下保持冷冻。
[0474]
原料药的配制和最终过滤：为了完成原料药制造过程，将纯化的fx201的冷冻瓶在水浴中解冻。在解冻后，将纯化的fx201在配制缓冲液(5％蔗糖w/v、0.5％乙醇v/v、75mm氯化钠、10mm l-组氨酸、10mm tris、1.0mm氯化镁、0.02％聚山梨酸酯80v/v、100μm edta)中稀释至目标浓度，例如2.3x10
11
个病毒颗粒/ml(vp/ml)。配制的fx201通过0.22μm过滤器过滤。将所得滤液填充到具有高密度聚乙烯(hdpe)盖的二醇改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯共聚物(petg)瓶中，并在≤-65℃下冷冻储存，完成fx201原料药的制造。
[0475]
实施例19：用于fx201(用于治疗骨关节炎的基于辅助依赖性腺病毒的新型基因疗法)的高生产率且可重复的制造方法的开发
[0476]
研究背景：基因疗法是骨关节炎(oa)的有前景的治疗选择，其具有提供长期功效和疾病修正的潜力。fx201(humantakinogene hadenovec)是一种正在开发的用于经由关节内(ia)注射局部递送的治疗oa的基因疗法。fx201是一种新型辅助依赖性腺病毒(hdad)，是一种去除了所有病毒基因的工程化人血清型5腺病毒。将编码在炎症敏感性nf-kb启动子的控制下的人白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)的表达盒插入hdad基因组中。在ia注射fx201后，关节中的细胞被转导并有条件地表达高度有效的炎性抑制剂il-1ra，从而减轻与膝oa相关的炎症。
[0477]
使用适于早期开发的适用制造方法，成功地产生四批药品，使得能够进行药物实验室管理规范(good laboratory practice)毒理学、药理学以及药品生产管理规范(good manufacturing practice，gmp)临床研究。以足够的规模产生四批fx201，包括设计用于表达大鼠il-1ra直系同源物的单一批次和编码人il-1ra直系同源物的三个批次，使得能够进行1期临床研究。本文呈现这四批的制造和产品质量数据，证实了早期制造过程的可重复性。
[0478]
方法：将suzuki等人(hum gene ther.2010；21(1),120-126)中描述的制造方法转移到合同制造机构并针对gmp加以调整。将含有包装细胞系的cgmp细胞库的小瓶解冻并使用粘附细胞培养平台连续扩增。一旦扩增的细胞达到适合生产的规模，就将fx201和hv种子储备引入培养物中。在共感染的包装细胞中，fx201是借用hv基因组和包装细胞中编码的元件反式繁殖的。hv包装信号由重组酶切除，留下绝大多数hv基因组未被衣壳化。仅具有完整
包装信号的扩增的基因组被衣壳化。在共感染步骤的孵育之后，经由离心收获细胞用于下游处理。
[0479]
在倾析收获的上清液之后，在细胞裂解缓冲液中对细胞进行冷冻-解冻循环。然后用benzonase消化细胞裂解物，以允许通过后续离心过程去除片段化的dna。通过多个超速离心循环从benzonase消化的细胞裂解物中除去过程和产物相关的杂质，包括rdna、hcp、空衣壳和残留的hv。然后通过透析将纯化的fx201缓冲液交换到最终的配制缓冲液中。对于最终临床材料，将纯化的fx201稀释至适当的剂量强度，并无菌填充到小瓶中。实施例18中也描述了制造方法的细节。
[0480]
以两种不同的规模产生三批非临床级材料和一批临床级材料。四批中的两批用于大鼠的毒理学和功效研究，其包括一批编码il-1ra的大鼠变体的hdad载体。分析每批的生产率、纯化收率和产物质量，所述产物质量包括物理化学特性、感染性和基因组滴度、产物和过程相关的杂质、转基因的表达以及安全性。
[0481]
结果：以两倍于以下工程化(eng)和gmp批次的规模生产各自编码il-1ra的人变体或大鼠变体的两个非临床批次。这两个非临床批次的规模增加是由于支持动物研究、分析开发、引入稳定性程序和建立参考标准所需的材料需求。
[0482]
粘附培养中的细胞生长：使包装细胞生长至最终扩增和后续共感染所需的目标密度。控制最终扩增阶段的目标细胞接种密度和培养时间，允许在制造的四个批次之间一致的生产。在每次传代结束时达到可接受的活细胞密度(图19a)。从初始解冻恢复细胞活力，并在整个扩增过程中保持高活力(图19b)，证实了用于稳健制造操作的足够细胞生长。感染前活细胞总数在四个批次的相应平均值的20％以内，解释了生产规模的差异。
[0483]
下游处理步骤中的产物收率：
[0484]
对于所有三批fx201和一批大鼠直系同源物，纯化前批次生产率使用收获时总病毒颗粒的测量值计算，并且在平均值的30％以内，指示每个纯化批次类似的vp起始量。纯化后批次收率在平均值的10％以内(图20)。这解释了生产规模的差异。在eng运行中观察到的较高总收率可能是由纯化前批次生产率的低估引起的。在未纯化的中间体中测量的病毒颗粒由于杂质而具有较高的测定可变性，所述杂质之后在所述过程中被去除。
[0485]
感染性和基因表达：使用基于细胞的测定，对三批fx201测量人il-1ra的表达，并且在基于elisa终点测量值的平均值的20％以内(图21)。eng批次的感染性低于其他三个批次，然而eng人il-1ra的表达水平在fx201平均值的20％以内，表明在此开发阶段的测定可变性可能引起观察到的差异。感染性(tcid
50
)和基因组拷贝与感染比(本文也称为病毒颗粒与感染性比、vp/tcid50比或病毒颗粒与感染单位比，这些术语可互换使用)的平均值排除了eng批次数据。tcid
50
方法的测定可变性高，并且在eng批次中观察到的差异在测定可变性内。单独的基于细胞的测定推断一致的载体感染和转基因表达。检测到tox(大鼠)中il-1ra的表达(数据未示出)。
[0486]
原料药中杂质的分析：除rdna外，所有与过程相关的杂质(包括宿主细胞蛋白(hcp))基本上低于检测或量化水平，并满足临床接受标准。毒理学研究中所用的两个非临床批次中残留dna(rdna)的量比eng和gmp批次高大约150倍。将具有升高的rdna(比接受标准大136倍和33倍)的两个tox批次用于确立fx201的功效、安全性和生物分布的非临床研究中(表14)。所建立的纯化方法充分降低了残留hv，证实了所述纯化方法的适用性。纯化的
fx201在最终配制品中表征为主要是单体的。表14：原料药中杂质的分析(*rdna列为合格，或高于合格阈值的倍数，rbenzonase：残留benzonase；r铯：残留铯；rbsa：残留牛血清白蛋白；lod：检测限；loq：定量限)。
[0487]
结论：生产率、纯化收率和产品质量在三批fx201和一批大鼠直系同源物之间大体上一致。这些数据表明，已经显示早期阶段fx201过程在多个批次之间是可重复的，显示出一致的生产率、纯化收率和产品质量属性。单一gmp原料药批次产生足够的材料来进行1期研究，以评价患者中的安全性和耐受性，覆盖了总基因组拷贝数的100倍范围中的三种剂量。鉴于单一批次的原料药足以供应i期研究的全剂量范围的药品需求，这证实了一种通过临床开发进行fx201基因治疗方案的可行的制造方法。
再多了解一些
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