柠檬酸代谢轴在制备治疗脱发的药物中的应用

1.本发明涉及医院化工技术领域，涉及以柠檬酸代谢通路为靶点用于治疗脱发疾病的用途。具体地涉及以柠檬酸合酶-柠檬酸代谢轴为靶点的降低柠檬酸合酶活力、减少柠檬酸产生的试剂在制备治疗脱发疾病中的用途。


背景技术：

2.脱发(alopecia)，是一种发生于青春期和青春期后的毛发进行性减少性疾病，是皮肤科常见病、多发病、难治病[1,2]。本病病因尚未完全明确，遗传、激素水平、心理等多种因素均与疾病的发生发展密切相关[3]。常见的脱发类型包括雄激素性秃发 (androgenic alopecia，aga)、斑秃、遗传性秃发、瘢痕性脱发等。有的脱发，如aga等，是一种永久性脱发，不具有自主恢复性，会随时间推移逐渐加重。据统计，亚洲成年男性平均脱发率在20-30％之间。亚洲有着4.02亿的脱发人群，其中中国的脱发患者近2亿。我国最新流行病学调查显示，本病在我国男性的患病率为21.3％，女性患病率为6.0％；而且伴随年龄增长，脱发发病率逐年增加，另一显著特点是其发病愈发年轻化[4,5]。尽管脱发并不直接引起死亡，但抑郁、自卑、厌恶等负面情绪严重影响个人社交活动及生活质量。本病不仅影响美观，更会造成患者严重的精神压力和心理负担，而随着人民生活水平的提高，对本病治疗的要求更为迫切。
[0003]
毛囊(hair follicles,hfs)是人类为数不多的、具有惊人再生能力的器官之一。hfs 的整个周期可分为四个阶段，分别为休止期(telogen)、生长期(anagen)和退化期 (catagen)。hf由毛干、内根鞘(irs)、外根鞘(ors)、突起、基质和真皮乳头(dp)组成。毛乳头细胞(dermal papilla cells,dpcs)位于hfs的基部，在毛囊周期和形态发生中起重要作用。虽然不同类型的脱发的发病机制是复杂的，但它们都有共同的表型和途径。hfs 和dpcs的生长抑制、大量凋亡和损伤是脱发发生的关键。各种途径参与这些异常，特别是炎症和凋亡途径。
[0004]
一些证据表明，代谢途径参与了毛发生长的发育过程，这为确定治疗靶点和开发新的治疗策略提供了线索。例如，flores aimee等证明了毛囊干细胞(hfscs)在毛发生长过程中可以被糖酵解代谢终产物乳酸所激活。而乳酸脱氢酶的缺失通过减少乳酸的产生来阻止 hfscs的激活和头发生长。christine s.kim等进一步揭示，hfscs在hfs中的分化命运是由mtor-akt信号依赖介导的谷氨酰胺代谢决定的。wilhelm stoffel等人发现硬脂酰辅酶a去饱和酶-1缺陷小鼠(scd1-、-mouse)表现出代谢综合征和皮肤损伤，包括脱发、表皮屏障破坏和皮脂腺变性。此外，研究甚至揭示了代谢综合征在脱发患者中普遍存在，如血浆中脂质成分升高。因此，几种代谢干预药物正在成为诱导毛发生长的候选药物。这些报告表明，代谢在头发生长过程中起着重要作用。
[0005]
目前国内经国家食品药品监督管理局(shda)批准的用于治疗脱发的口服药物只有米诺地尔和非那雄胺两种。米诺地尔是一种血管扩张剂和钾通道打开剂。非那雄胺是一种ⅱ型5α-还原酶抑制剂，能够阻断t转变为活性更强的dht，从而减弱雄激素对毛囊的抑制
作用。这两种药虽然广泛应用于临床，但不能完全阻断病程进展，且存在不同程度的不良反应。进一步探索脱发产生的机制，并探索治疗药物及手段具有重要意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明要解决的技术问题是提供柠檬酸代谢轴的新用途。
[0007]
本发明要解决的另一个技术问题是提供柠檬酸/柠檬酸合成酶在制备治疗脱发药剂中的应用。
[0008]
柠檬酸(citric acid,ca)是三羧酸循环(tca cycle)中的关键一员，被认为是脂类、葡萄糖、氨基酸和核酸代谢的中心。此外，ca被广泛用于食品添加剂和美容皮肤科。然而，人们仍不清楚它对头发生长的安全性如何。柠檬酸合成酶(citrate synthase,cs)是催化底物草酰乙酸和乙酰辅酶a(acetyl-coa)产生ca的唯一酶，cs功能障碍通常伴有ca水平异常。cs-ca代谢除在细胞代谢中起重要作用外，还参与多种疾病，包括癌症、瘙痒、自身免疫紊乱等。我们证实了cs-ca代谢中断对c57bl/6小鼠、培养的人毛囊和人真皮乳头细胞的毛发生长抑制作用。本发明在此研究基础上完成，提供了以柠檬酸代谢轴为靶点的降低柠檬酸合酶表达或降低柠檬酸产生的试剂，及其在制备治疗脱发疾病药物中的用途。
[0009]
本发明提供了柠檬酸代谢轴在制备治疗脱发的药物中的应用，包括柠檬酸/柠檬酸合成酶在制备治疗脱发疾病的药物中的应用。
[0010]
在一个或多个实施方案中，所述脱发疾病选自：雄激素性秃发、斑秃、瘢痕性秃发。本发明尤其适合由于柠檬酸合成酶过表达或者cs-ca代谢轴过于活跃导致的脱发疾病。
[0011]
较好的，柠檬酸或者柠檬酸合成酶作为治疗脱发疾病的药物的靶标。
[0012]
柠檬酸又名枸橼酸，无色晶体，常含一分子结晶水，无臭，有很强的酸味，易溶于水。其钙盐在冷水中比热水中易溶解，此性质常用来鉴定和分离柠檬酸。柠檬酸是生理学中将脂肪、蛋白质和糖转化为二氧化碳的过程中的重要化合物，是三羧酸循环的中间产物。细胞中柠檬酸的含量与柠檬酸合成酶的活性密切相关。柠檬酸合成酶的组氨酸残基作为亲核试剂使乙酰辅酶a中甲基去质子化而形成碳负离子，后者亲核攻击草酰乙酸的羰基碳，从而羟醛缩合生成柠檬酰辅酶a，将高能硫酯键水解后即得到柠檬酸。
[0013]
本发明中，柠檬酸代谢轴(cs-ca代谢轴)至少包括柠檬酸、柠檬酸合成酶，还包括柠檬酸合成酶合成柠檬酸过程中各相关的原料和代谢产物，尤其是合成路线上重要的基因或者蛋白。
[0014]
柠檬酸或者柠檬酸合成酶可以作为治疗脱发疾病的药物的筛选靶标。其应用方法包括以下步骤：
[0015]
s1，测定样本毛发细胞中柠檬酸或者柠檬酸合成酶的含量；
[0016]
s2，使用治疗脱发疾病的药物候选物处理样本毛发细胞；
[0017]
s3，测定处理后的样本毛发细胞中柠檬酸或者柠檬酸合成酶的含量。
[0018]
进一步的，所述的应用方法还可以包括：
[0019]
s4，比较治疗脱发疾病的药物候选物处理前后样本毛发细胞中柠檬酸或者柠檬酸合成酶的含量；或者
[0020]
s5，当治疗脱发疾病的药物候选物处理后样本毛发细胞中柠檬酸或者柠檬酸合成酶的含量不变或者升高，则停止该药物候选物的进一步筛选；当治疗脱发疾病的药物候选
物处理后样本毛发细胞中柠檬酸或者柠檬酸合成酶的含量降低，则继续该药物候选物的进一步筛选或者改进。
[0021]
相应的，本发明还包括一种筛选治疗脱发疾病药物的试剂盒，所述的试剂盒含有：
[0022]
检测柠檬酸或者柠檬酸合成酶活性的试剂。
[0023]
较好的，所述的试剂盒中还含有减少柠檬酸或者柠檬酸合成酶含量，或者抑制柠檬酸、柠檬酸合成酶、柠檬酸合成酶-柠檬酸代谢轴活性的制剂。
[0024]
例如，所述的试剂盒中还含有阳性对照，例如柠檬酸或者柠檬酸合成酶。
[0025]
所述的试剂盒中还含有阴性对照、分子量标记、检测用小型耗材、说明书、缓冲液、扩增试剂或者其他常规检测用试剂和用品。
[0026]
使用该试剂盒的方法包括：
[0027]
使用待测的、作为脱发药物活性成分的样品与含有cs-ca代谢轴的物质孵育/反应；
[0028]
检测孵育/反应后cs-ca代谢轴或者其中成分的活性。
[0029]
另一方面，本发明提供了一种促进体外培养的毛发细胞生长的方法，适用于毛发细胞，例如毛乳头细胞、毛囊干细胞，等等，还可以用于包括毛干、内根鞘、外根鞘、突起、基质和真皮乳头的hf。
[0030]
该方法包括在毛发细胞的培养介质中添加：
[0031]
抑制柠檬酸的活性成分；或者
[0032]
降低柠檬酸合成酶-柠檬酸代谢轴活性的制剂。
[0033]
再一方面，本发明还提供了一种治疗脱发疾病的药物，所述的药物含有：
[0034]
抑制柠檬酸的活性成分；或者
[0035]
降低柠檬酸合成酶-柠檬酸代谢轴活性的制剂。
[0036]
较好的，降低柠檬酸合成酶-柠檬酸代谢轴活性的制剂选自：
[0037]
抑制柠檬酸合酶表达和/或其活性的试剂；
[0038]
抗柠檬酸合酶抗体、小分子抑制剂l-酪氨酸；
[0039]
含有编码突变的无活性或活性减弱的柠檬酸合酶的核苷酸序列的同源重组载体；
[0040]
抑制线粒体丙酮酸转运载体功能的制剂。
[0041]
较好的，抑制柠檬酸合酶表达和/或其活性的试剂包括抑制柠檬酸合酶表达和/或其活性的sirna、反义rna、核酶和基因编辑载体。
[0042]
在一个或多个实施方案中，所述降低cs-ca代谢轴的制剂，选自：
[0043]
(1)抑制柠檬酸合酶表达和/或其活性的试剂，如sirna、反义rna、核酶和基因编辑载体，如crispr-cas9基因编辑载体或talen基因编辑载体；
[0044]
(2)抗柠檬酸合酶抗体、小分子抑制剂l-酪氨酸等；
[0045]
(3)含有编码突变的无活性或活性减弱的cs的核苷酸序列的同源重组载体。
[0046]
(4)上述三种抑制线粒体丙酮酸转运载体(mpc1/2)功能的制剂，降低丙酮酸线粒体内转运，减少柠檬酸代谢底物来源。
[0047]
在本发明的一个优选实施例中，cs-ca代谢轴的抑制剂或者降低cs-ca代谢轴的制剂是序列如seq id no 1所示的核酸。
[0048]
柠檬酸(citric acid,ca)是三羧酸循环(tca cycle)中的关键一员，被认为是脂
1005023)，本文将其全文以引用的方式纳入本文在一些实施方案中。
[0055]
在本发明特别优选的实施方案中，同时给予靶向cs和mpc1/2的抑制策略，理论上将更有效地抑制柠檬酸的产生。本发明将同时给予靶向cs和mpc1/2的抑制方案，以预防和治疗毛发生长障碍。
[0056]
因此，本发明提供以cs
–
ca代谢轴为靶点的抑制cs表达和/或抑制cs蛋白活性的试剂在制备治疗或预防受益于毛囊和/或毛乳头细胞凋亡和炎症受到抑制、和/或毛囊周期运转受到抑制的疾病。这类疾病包括但不限于脱发、毛囊炎、无毛/少毛症、毛发畸形、甚至是头皮相关疾病等。
[0057]
本发明还提供以cs
–
ca代谢轴为靶点的抑制cs表达和/或抑制cs蛋白活性的试剂在制备抑制毛囊细胞凋亡和/或毛囊细胞炎症的药物中的用途。
[0058]
本发明还提供一种受益于毛囊细胞凋亡和/或毛囊细胞炎症受到抑制的疾病的治疗或预防方法，该方法包括给予需要的对象治疗有效量的以cs
–
ca代谢轴为靶点的抑制cs表达和/或其他抑制柠檬酸产生的试剂。
[0059]
本发明首次提供了cs-ca代谢轴在制备治疗脱发的药物中的用途。目前对柠檬酸和柠檬酸合成酶的研究非常丰富，其抑制剂的研究也具有广泛的理论基础。本发明为制备新型的脱发药物提供新的靶标，经济有效，简便明确。本发明抑制毛发细胞生长的方法，操作简便，成本低廉，卓有成效。
[0060]
为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
附图说明
[0061]
图1：ca对小鼠毛发生长的影响，其中，
[0062]
(a1-a3)ca和生理盐水处理18天后小鼠裸露皮肤面积和毛干长度的形态学定量分析， (b1-b3)ca和生理盐水组小鼠皮肤厚度和毛囊球直径的动态变化，(c1-c2)ca和生理盐水处理后第5天和第12天毛发形态发生指标定量分析，(d1-d2)ca和生理盐水处理后第 5天和第12天，通过毛囊百分比评价毛囊周期分布特征，(e1-e4)小鼠皮肤组织中cd200、 tshr、krt5和alpl的mrna表达水平。scale bar＝20μm，每组n＝6；*p《0.05，**p 《0.01，***p《0.001,means
±
sem。
[0063]
图2：小鼠炎症和细胞凋亡检测，其中，(a)ca处理后小鼠皮肤炎症细胞因子的mrna 表达水平，(b)western blot检测ca和生理盐水处理小鼠皮肤中p-p65蛋白水平，(c-d) tunel染色及小鼠皮肤中cleaved caspase 3水平检测。scale bar＝20μm，每组n＝6；*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001,means
±
sem。
[0064]
图3：ca对人毛囊生长的影响，其中，
[0065]
(a)ca和生理盐水处理后毛干长度比较，(b)ca和生理盐水处理组的毛囊周期分布， (c-d)ca和生理盐水处理后的毛囊中ki67和tunel阳性细胞免疫荧光染色，scale bar＝ 50μm，(e)western blot分析ca处理后的毛囊中p-p65和cleaved-caspase 3水平，p-p65 和cleaved-casp3分别用β-actin和casp3归一化处理，每组n＝6；*p《0.05，**p《 0.01，***p
《0.001,means
±
sem。
[0066]
图4：ca处理后毛乳头细胞dpcs的增殖能力检测，其中，
[0067]
(a)rtca法检测ca对毛乳头细胞增殖影响，(b)流式细胞仪分析细胞周期分布，(c-d) 流式细胞术检测毛乳头细胞凋亡水平和western检测cleaved caspase-3水平，(e) western blot检测p-p65蛋白表达，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001,means
±
sem。
[0068]
图5：nlrp3抑制剂mcc590对ca诱导的炎症和凋亡影响，其中，
[0069]
(a)elisa检测培养48小时后的毛囊培养基中il1β和il18蛋白水平，(b)westernblot检测毛囊组织中p-p65和cleaved-caspase-3水平，(c)elisa检测毛乳头细胞ca 刺激48小时后细胞培养基中il1β和il18蛋白水平，(d)western blot检测毛乳头细胞中p-p65和cleaved-caspase-3水平，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001,means
ꢀ±
sem。
[0070]
图6：cs抑制后对人毛囊和dpcs的生长速率影响，其中，
[0071]
(a-b)dpc细胞si-cs处理后cs的mrna和蛋白水平检测，(c)dpcs培养上清中柠檬酸的浓度变化，(d)rtca法检测dpcs增殖，(e-f)毛囊组织si-cs处理后cs的mrna和蛋白水平检测，(g)毛囊组织培养上清中ca的浓度变化，(h)测量cs敲除后的毛囊周期分布和毛干长度，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001,means
±
sem。
具体实施方式
[0072]
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
[0073]
一、材料与方法
[0074]
本发明实验使用到以下材料和实验方法。对于未提及的其他材料和方法，均为本领域常规的实验材料和方法，可从市售途径获得，或可参照周知的实验方法进行。
[0075]
1、实验方法
[0076]
1.1小鼠模型
[0077]
本研究选用8周龄小鼠，按照复旦大学动物保护与使用委员会批准的指导方针进行操作。用蜜蜡脱毛诱导小鼠毛发再生。分别于脱毛后第0天(休止期)、第3天(生长期ii)、第5天(生长期iv)、第12天(生长期vi)和第18天(退行期)采集小鼠样本和毛发生长数据。每周皮下注射100μl柠檬酸(10mm)或生理盐水对照。在毛发生长评估时，用数码相机以均匀的角度和方式记录基线和后续的毛发生长情况，以保证比较的可靠性。
[0078]
1.2人hfs和dpcs的分离和培养
[0079]
非脱发区域的头皮hfs来自于植发手术患者。患者给予知情同意，该研究获得了伦理上的批准。本研究使用了处于生长期的hfs。hfs培养在williams e培养基(gibco brl, grand island,ny,usa)中，该培养基中含有100u/ml青霉素，100mg/ml链霉素，2mm 谷氨酰胺和10ng/ml氢化可的松，37℃，5％co2气体的恒温培养箱中培养。为了分离和培养dpcs，将分离的生长期hf鳞茎区域与i型胶原酶(sigma)在37℃下孵育2小时。使用含有青霉素、链霉素和20％fbs的dmem原代培养dpcs。本实验采用第三至第六代的dpcs。
[0080]
1.3组织学、免疫组织化学和免疫荧光分析
[0081]
收集的皮肤和hf样品首先用4％多聚甲醛固定，然后用石蜡包埋，后续进行苏木精
和伊红(h&e)染色和免疫荧光染色(if)。在定量组织形态测定方面，根据paus等定义的分期法评估hf形态发生，根据muller-rover分类评估毛发周期。用image j软件进行染色定量。 anti-cs(1:50；abcam)和ki67(1:30 00,ab39012；abcam)用于免疫组化和if检测。
[0082]
1.4tunel染色
[0083]
为了标记凋亡细胞的细胞核，根据说明书，使用荧光素原位细胞死亡检测试剂盒(roche, indianapolis,in)，用tunel法对皮肤和hf切片进行染色。
[0084]
1.5流式细胞术
[0085]
用柠檬酸或转染cs sirna处理后的dpcs接种于6孔板中。72h后，收集细胞，用pbs 洗涤。凋亡实验中，细胞重悬于500μl含5μl annexin v/fitc和10μl碘化丙啶 (annexin v/fitc kit；beyotime)的缓冲液中。细胞周期分析实验中，细胞重悬于500μl 含5μl碘化丙啶(yeasen)的结合缓冲液中进行细胞周期分析。在黑暗中室温(rt)孵育30 分钟后，立即用流式细胞仪检测荧光值。
[0086]
1.6基因表达分析
[0087]
采用trizol试剂(invitrogen)提取hfs、dpcs和皮肤组织总rna。随后，采用cdna 逆转录酶试剂盒(application biosystems)进行cdna合成。real-time qrt-pcr在rochelc480 real-time pcr系统(applied biosystems)和sybr green i pcr试剂盒(takara) 上进行。内源性对照为gadph或β-actin。引物序列见表格。
[0088]
1.7细胞增殖实验
[0089]
如前所述，使用xcelligence系统(瑞士baselot和美国加州圣地亚哥acea生物科学公司)监测细胞增殖。简而言之，在16孔的金属电极板子(罗氏，东苏塞克斯，英国)中每孔播种5000个细胞。12小时后，用ca刺激细胞或转染cs sirna，连续72-96小时检测细胞指数。
[0090]
1.8rna干扰
[0091]
人dpc细胞或hfs培养于12孔板上，密度为1
×
105细胞/孔。24h后，进行敲除实验。由中国上海的genomeditech公司合成了cs和nc的小干扰rna(sirna)。序列如下:
[0092]
si-cs:5'-caggtatcttggctctcaa-3'(seq id no 1)
[0093]
nc:5'-uucuccgaacgugucacgutt-3'(seq id no 2)
[0094]
分别于24小时和48小时后采集细胞和hfs样本，进行rna和蛋白检测。
[0095]
1.9western blot分析
[0096]
皮肤、hf和dpcs细胞裂解液的总蛋白通过sds-page电泳系统分离，并转移到pvdf 膜(millipore,billerica,ma,usa)。5％牛血清白蛋白(bsa)室温封闭膜1h,4℃一抗孵育过夜，酶标二抗室温孵育2h。最后，用ecl试剂盒(pierce,rockford,il,usa)观察蛋白条带。将单个蛋白的相对表达归一化为gapdh或β-actin。本研究使用的抗体有:抗 cs(ab129095,abcam)、抗caspase-3(sc-271759,santa cruz)、抗p-p65(人:ab86299，小鼠:abcam,3033,cst)、抗β-actin(ab6276,abcam)、抗gapdh(ab8245,abcam)。每个实验独立重复三次。
[0097]
1.10elisa分析
[0098]
小鼠样品中的il1β和il18蛋白水平使用elisa试剂盒(r&d systems,minneapolis, mn)按照制造商的说明进行测量。
[0099]
1.11统计分析
[0100]
所有数据均采用spss软件进行分析。组间比较采用单因素方差分析和t检验。p《
0.05 为差异有统计学意义。
[0101]
表1引物序列
[0102]
[0103][0104]
实施例1柠檬酸抑制小鼠毛发生长
[0105]
为了检测ca对毛发生长的作用，将c57bl/6j小鼠脱毛后随机分为两组。然后分别
皮下注射10mm ca或生理盐水，分别在注射3天、5天、12天、18天后采集样本及数据。照片显示，第18天，ca组小鼠的毛发裸露区域明显大于对照组(图1a1-a2)，而且与生理盐水处理的小鼠相比，ca处理的小鼠的毛干更短、更薄(图1a3)。苏木精-伊红(he)染色显示，与生理盐水处理的小鼠相比，ca处理的小鼠皮肤更薄，毛囊球茎直径更小(图 1b1-b3)。在第5天，与对照组小鼠相比，ca处理小鼠的毛发形态发生评分明显较低 (301.3
±
4.6比410.7
±
23.1,p＝0.0013)(图1c1)。第12天，这种差异减小，但仍具有显著性(799.0
±
1vs 778.3
±
2.9,p＝0.0003)(图1c2)。生理盐水处理的hfs在第0、3、 5、12、18天表现为正常的hf周期，分别处于休止期、生长期ii期、生长期iv期、生长期vi期和退行期。结果显示，到第5天，生理盐水组所有的hfs均已进入生长期，而ca 组约30％的hfs仍处于休止期(图1d1)。第12天，ca组30％的hfs表现出休止期表型，而对照组几乎所有的hfs仍停留在生长期(图1d2)。总的来说，ca通过缩短毛发生长期来抑制毛发生长，其方式是延缓毛发生长期的进入，但促进退行期的进入。
[0106]
接下来，检测毛发形态形成过程中不同hf细胞标记物的水平，结果显示，ca处理小鼠的cd200(hf干细胞的标记物)、tshr(角蛋白调节因子)、krt5(外根鞘ors标记物)和 alpl(真皮乳头标记物)的mrna表达水平低于对照组(图1e1-e4)。结果表明，ca处理小鼠的毛发形态发生受损可能与ors和hf终末分化中断有关。
[0107]
实施例2柠檬酸在体内诱导炎症反应和细胞凋亡
[0108]
鉴于ca对毛发生长的抑制作用，进一步探讨其潜在机制。炎症是一种典型的抑制毛发生长的因素，所以本实施例检测了实验小鼠的皮肤炎症水平。qpcr显示，在ca处理的小鼠皮肤中，炎症因子ccl2、il-6、il-17β、il-1β、il18和nlrp3的mrna水平较高(图 2a)。western blot检测到p-p65水平升高，表明炎症通路被ca激活(图2b)。
[0109]
考虑到过度的细胞凋亡会迫使hfs从生长期阶段进入休止期，研究结果表明，ca诱导的细胞凋亡在很大程度上导致了毛发生长的衰减。因此，采用荧光tunel染色法测定小鼠皮肤中caspase 3的活性。如图2c所示，在第5天的代表性免疫荧光图像中，tunel阳性细胞在ca处理的小鼠中显著增加。相反，tunel阳性细胞在生理盐水处理的野生型(wt) 小鼠中几乎检测不到。皮肤匀浆的western blot分析显示，早在第5天，ca就有效地诱导了cleaved caspase-3的产生(图2d)。因此，ca诱导的小鼠毛发生长过程受损可能与炎症和细胞凋亡的异常调节有关。
[0110]
实施例3柠檬酸在体外抑制人hf的生长
[0111]
在病理条件下，毛囊周期受损表现为从一个快速生长和毛干产生的生长期转变为一个短的、凋亡驱动的休止期。为了评估ca是否对hf的发展和hf周期转变具有重要作用，将人hfs与柠檬酸一起培养；组织形态学分析显示，与生理盐水对照相比，ca组毛干长度显著降低(图3a)。同时,只有35％的hfs处于生长期阶段,而65％毛囊则进入了退行期；与之不同的是，生理盐水组80％的hfs处于生长期，却仅仅有15％的hfs处于退行期,这意味着ca刺激后的hfs周期倾向于向退行期转换(图3b)。此外，免疫荧光染色显示，与生理盐水处理的hfs相比，ca处理的hfs中ki67阳性dpcs数量减少(图3c)。进一步，检验了ca处理对hfs细胞凋亡的影响。结果显示，ca处理的hfs导致包括dpcs在内的所有细胞发生了广泛的凋亡(图3d)。western blot表明，ca处理的hfs中cleaved-caspase 3 水平的升高，证实了ca的促凋亡作用(图3e)。此外，ca显著上调了hf中p-p65的表达。结果表明，ca通过调节细胞凋亡和炎症反
应抑制hf的生长。综上所述，结果证实，ca通过促进细胞凋亡和诱导炎症反应抑制了体外hf的生长。
[0112]
实施例4柠檬酸通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞进行抑制dpcs增殖
[0113]
鉴于dpcs在hf的生长、形成、干性维持和循环中发挥关键作用，本实验评估了ca 在dpcs中的一系列作用。实时细胞分析(real-time cell analysis,rtca)结果显示，ca 处理的dpcs细胞指数明显低于对照组，提示ca对dpcs具有抗增殖作用(图4a)。同时，流式细胞术分析显示，ca处理的dpcs中s期细胞的百分比明显下降(图4b)。此外，在ca 处理的dpcs中，凋亡细胞的百分比增加(图4c)。通过测量caspase-3活性进一步评估细胞凋亡发现，在与ca孵育的dpcs中，cleaved caspase-3蛋白水平显著上调(图4d)。继而，检测dpcs中的炎症反应，发现ca增加了p-p65蛋白表达(图4e)。结果证实，ca通过调节细胞周期、细胞凋亡和炎症减弱dpcs的生长。
[0114]
实施例5柠檬酸诱导的炎症和凋亡是nlrp3依赖性的
[0115]
上述结果表明，ca在体内和体外均能显著促进炎症反应。但是，潜在机制仍不清楚。体内实验表明，nlrp3通路参与了ca诱导的炎症反应，因为在ca注射后第3天，ca处理组的nlrp3、il18和il1β明显升高。为了证实nlrp3通路在毛发生长中的促炎作用，本实验使用nlrp3抑制剂mcc950进行以下实验，elisa分析显示，mcc950显著降低ca诱导的培养hfs中il18和il1β的产生(图5a)。同样的，mcc950显著下调ca刺激下上调的 p-p65蛋白水平在，且几乎恢复到生理水平(图5b)。结果还显示，mcc950也降低了cleavedcaspase 3(casp3)的蛋白水平(图5b)。在mcc950处理的人dpcs中，当测量il18、il1β、 p-p65和cleaved casp3时，显示类似的结果(图5c-d)。所述结果支持了ca诱导的炎症和凋亡在很大程度上依赖于nlrp3通路。
[0116]
实施例6敲低柠檬酸合酶降低柠檬酸的产生并恢复人类hfs和dpcs的生长
[0117]
进一步，探索了cs对ca积累的影响。本实验采用特异性小干扰rna介导cs敲除。用si-cs或阴性对照(nc)转染培养的dpcs，48小时后，cs sirna显著下调cs的mrna和蛋白表达水平(图6a-b)，接下来，检测dpcs中的柠檬酸水平，发现与nc组相比，si-cs 组的柠檬酸浓度明显降低(图6c)，结果表明ca的合成依赖于cs。考虑到ca对dpc细胞生长的抑制作用，进一步检测cs在dpc细胞周期和凋亡中的作用，如图6d rtca结果所示，与nc组相比，si-cs组dpcs的生长速率显著增加。继续发现cs sirna同样诱导hfs 组织中cs mrna和蛋白的有效降低(图6e-f)。随后发现，si-cs介导的cs敲低降低了hfs 中的柠檬酸水平(图6g)。而且，si-cs组的毛干长度比nc组更长。进一步研究发现cs缺陷促使hfs周期保持在生长期，即cs sirna组中90％的hfs处于生长期，而只有10％处于退行期；nc组中30％的hfs处于退行期，70％处于生长期(图6h)。结果表明，cs抑制了ca 的合成，促进了hfs和dpcs的生长。
[0118]
以上所述，仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本技术公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。