1.在本发明中提供了新的淀粉酶。更具体地，本发明提供了基因工程化的淀粉酶、包含该酶的组合物以及使用该酶或包含该酶的组合物的方法。基因工程化的淀粉酶可用于许多不同的应用，例如衣物洗涤剂、餐具洗涤剂和用于家庭的清洁产品、工业、车辆护理、烘焙、动物饲料、纸浆和纸加工、淀粉加工和乙醇生产。淀粉酶已用于去除淀粉污渍，并已添加到各种组合物中，例如清洁产品。这些应用中的许多需要使用在升高的温度下或在变性条件下稳定的淀粉酶。因此，需要具有改善的特性，特别是具有改善的稳定性和改善的性能的基因工程化的淀粉酶。
技术实现要素：
2.本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42的氨基酸序列至少75％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no:44的氨基酸序列至少75％相同。
3.优选地，所述具有α-淀粉酶活性的多肽由a和b结构域和c结构域组成，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42的氨基酸序列至少75％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no:44的氨基酸序列至少75％相同。
4.优选地，所述具有α-淀粉酶活性的多肽的a和b结构域与具有seq id no:42的氨基酸序列的a和b结构域具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
5.优选地，所述具有α-淀粉酶活性的多肽的c结构域与具有seq id no:44的氨基酸序列的c结构域具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
6.优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在一个或多个位置包含取代、缺失和/或插入。
7.优选地，具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含序列tqxdyldhpdvigwtregdxxhxxsglaxlmsdgpxgxkwmxvgknnagexwxditgnqtntvtinxdgxgqfxvxxgsxsiyxqx，其中x可以是任何氨基酸。
8.优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽具有一个或多个选自以下的基于seq id no：39的编号的氨基酸残基：402r，h；419s，g，d；420v，i；422a，v；423n，d，g，k；428t，a；435g，r，e；437s，a；441n，e，d；444k，e；450v，i；452y，h，r；466k，r；469w，s；473h，q，r；475s，n；476g，e；479v，a；483v，i；和485r，q，k，优选地选自基于seq id no：39的编号的402r；419d；420v；422a；423d；428a，t；435r；437s；441e；444k；450v；452y；466k；469w；473r；475s；476g；479v；483v；和485q。
9.优选地，基于seq id no：39的编号，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含在一个或多个选自430和454的位置上的取代，优选地，本发明的淀粉酶包含氨基酸残基430m和/或430i，优选地，产生430m和/或454i的取代，优选地，选自i430m和
m454i的取代。
10.优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在一个或多个选自401、403、405、411、413、415、424、426、428、432、455、477、479和481的氨基酸位置(根据seq id no：39编号)上包含如seq id no：39所示的氨基酸残基。
11.优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在一个或多个选自309、313、347、348、350、351、354、355、358、359、388、389、392和396的氨基酸位置(根据seq id no：39编号)上包含如seq id no：40所示的氨基酸残基。
12.优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在对应于seq id no：39的编号的相应于位置181、182、183和184包含一个或多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181、182、183和184的两个或更多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181和182、182和183或183和184的氨基酸的缺失(根据seq id no：39编号)。
13.优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在一个或多个选自根据seq id no：39编号的9、130、195、206、244、202、179、181、186、和190的位置上包含取代，优选地，包含选自根据seq id no:39编号的m9l、e130v、n195f、i206l、s244q、m202l、k179l、r181e、g186e/n/q/s和e190p中的一个或多个取代。
14.优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含：
15.(a)与seq id no:54、seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列；
16.(b)由与seq id no:55、seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、或seq id no:38具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多核苷酸编码的氨基酸序列，
17.(c)由多核苷酸编码的氨基酸序列，所述多核苷酸在高严格条件下与以下序列的互补序列杂交：
18.(i)seq id no:54、seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、或seq id no:37的编码序列；或
19.(ii)seq id no：55、seq id no：2、seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、seq id no：10、seq id no：12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36或seq id no:38所示的多核苷酸；
20.或者
21.(d)具有淀粉酶活性的(a)、(b)或(c)的片段。
22.优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽与seq id no:39或seq id no:40所示的淀粉酶相比，包括增加的表达、活性、热稳定性、稳定性、洗衣性能、比活性、底物特异性、ph依赖的活性、ph依赖的稳定性、氧化稳定性、ca2 依赖性或其任意组合，优选地，与seq id no:39或seq id no:40所示的淀粉酶相比，所述淀粉酶具有增加的热稳定性。
23.本发明还涉及一种分离的、合成的或重组的核酸，其包含：
24.(a)核酸序列，其与seq id no:55、seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、或seq id no:38具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述核酸编码具有淀粉酶活性的多肽；
25.(b)核酸序列，所述核酸序列编码与seq id no:54、seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，其中所述多肽具有淀粉酶活性，或所述核酸序列编码本文所述的任何具有淀粉酶活性的多肽；
26.(c)多核苷酸，所述多核苷酸在高严格条件下与以下序列的互补序列杂交：
27.(i)seq id no:54、seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、或seq id no:37的编码序列；或
28.(ii)seq id no：55、seq id no：2、seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、seq id no：10、seq id no：12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36或seq id no:38所示的多核苷酸；
29.(d)(a)、(b)或(c)的片段，其中所述片段编码具有淀粉酶活性的多肽；或者
30.(e)与(a)至(d)中任一项完全互补的核酸序列。
31.本发明还涉及包含如本文所述的多核苷酸的核酸构建体。
32.本发明还涉及包含如本文所述的多核苷酸或核酸构建体的表达载体。
33.本发明还涉及包含如本文所述的多核苷酸、如本文所述的核酸构建体或如本文所述的表达载体的宿主细胞。
34.本发明还涉及包含如本文所述的具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽的组合物。
35.优选地，所述组合物还包含至少一种选自以下的第二酶：第二淀粉酶、脂酶、蛋白酶、纤维素酶、漆酶、甘露聚糖酶、果胶酶、木聚糖酶和核酸酶。
36.本发明还涉及一种制备如本文所述的具有α-淀粉酶的分离的、合成的或重组的多肽的方法，所述方法包括：提供编码所述多肽的核酸序列，将所述核酸序列转化到表达宿主中，培养表达宿主以产生多肽，和任选地纯化多肽。
37.本发明还涉及一种制备面团或由所述面团制备的烘焙产品的方法，所述方法包括将本文所述的具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽添加到所述面团中并烘焙所述面团。
38.本发明还涉及如本文所述的具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽的使用方法，其用于加工淀粉，用于清洁或洗涤纺织品、硬表面或餐具，用于制造乙醇，用于加工纸浆或纸，或用于饲养动物。
39.本发明还涉及一种制备具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽的方法，所述方法包括从至少两种不同的淀粉酶制备杂合体的步骤，其中所述杂合体包含a和b结构域以及c结构域，其中所述a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42的氨基酸序列至少75％相同，并且所述c结构域的氨基酸序列与seq id no:44的氨基酸序列至少75％相同。
40.本发明还涉及第一淀粉酶的c结构域的使用方法，所述c结构域含有与seq id no:44的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列，其用于改善含有与seq id no：42的氨基酸序列具有至少75％同一性的a和b结构域的第二α淀粉酶的一种或多种选自以下的性质：稳定性、ph曲线、表达、活性、热稳定性、比活性、底物特异性、ph依赖的活性、ph依赖的稳定性、氧化稳定性、ca2 依赖性、洗衣性能、加工淀粉、清洁纺织品、清洁硬表面、清洁餐具、制造乙醇、加工纸浆或纸、和饲养动物，所述使用包括用第一α淀粉酶的c结构域替换第二α淀粉酶的c结构域。
具体实施方式
41.酶是包含氨基酸残基序列的生物分子(多肽)，其中酶可以催化反应。因此，酶是具有催化活性的蛋白质或多肽。酶名称是根据国际生物化学和分子生物学联盟(iubmb)命名委员会的建议确定的。酶由ec(enzyme commission)编号、推荐名称、替代名称(如果有)、催化活性和其他因素定义。本文中的酶可以通过多肽序列(本文中也称为氨基酸序列)鉴定。多肽序列限定了包括酶的“活性位点”的三维结构，进而决定了酶的催化活性。多肽序列可以通过seq id no标识。
42.酶获自或衍生自许多不同的来源，包括：植物、动物、细菌、古细菌、真菌、酵母、含有编码酶的dna的环境样本、或可以在实验室合成生成的酶。例如，细菌来源的酶包括源自芽孢杆菌属(bacillus)、链霉菌属(streptomyces)、大肠杆菌(e.coli)和假单胞菌属(pseudomonas)的酶；真菌来源的酶包括源自曲霉属(aspergillus)、镰孢霉(fusarium)、嗜热真菌属(thermomyces)和木霉菌(trichoderma)的酶；酵母来源的酶包括源自毕赤酵母(pichia)和酵母菌属(saccharomyces)的酶。
43.世界知识产权局(wipo)标准st.25(1998)规定，氨基酸残基应在序列表中使用以下三个字母的符号表示，其中第一个字母为大写。下表提供了氨基酸标识符以及使用标准遗传标准编码氨基酸的相应dna密码子的概述。编码氨基酸残基的dna密码子可以根据所使用的生物体而不同，并且可以应用略微不同的遗传密码翻译表。此类非标准密码翻译表的汇编维护在ncbi。
[0044]“亲本”多肽氨基酸序列是用于向序列引入突变(例如通过引入一个或多个(片段)氨基酸取代、插入、缺失或其组合)的起始序列，从而产生该亲本多肽氨基酸序列的“变体”。亲本包括：野生型多肽氨基酸序列或用作引入(进一步)变化的起始序列的合成产生的多肽氨基酸序列。
[0045]“变体多肽”是指氨基酸序列与其亲本不同的酶。亲本多肽和变体多肽之间的差异可以是一个单个氨基酸残基，或多于一个的氨基酸残基。多于一个的氨基酸残基可以是连续的氨基酸残基或不连续的氨基酸残基。连续的氨基酸残基可以是四个连续的氨基酸残基；五个连续的氨基酸残基；八个连续的氨基酸残基；九个连续的氨基酸残基；十一个连续的氨基酸残基；十三个连续的氨基酸残基；或十四个连续的氨基酸残基。尽管下面的定义描述了在氨基酸变化的情况中的变体，但核酸可以被类似地修饰，例如被取代。
[0046]“成熟多肽”是指处于最终形式的酶，其包含任何翻译后修饰、糖基化、磷酸化、截短、n-末端修饰、c-末端修饰、信号序列缺失。成熟多肽可根据表达系统、载体、启动子和/或生产过程而变化。
[0047]“合成的”或“人工的”化合物通过体外化学或酶促合成产生。
[0048]
术语“非天然存在的”是指不存在于其原始天然存在环境或来源中的(多)核苷酸、氨基酸、(多)肽、酶、蛋白质、细胞、生物体或其他物质。优选地，本发明的淀粉酶是非天然存在的淀粉酶。
[0049]
变体多核苷酸和变体多肽序列可以通过它们与亲本序列比较时的序列同一性来定义。序列同一性通常以“％序列同一性”或“％同一性”的形式提供。为了计算序列同一性，第一步产生序列比对。根据本发明，产生了成对的全局比对，这意味着两个序列在它们的整个长度上进行比对，这通常通过使用称为比对算法的数学方法产生。
[0050]
根据本发明，所述比对通过使用needleman和wunsch(j.mol.biol.(1979)48,第443-453页)算法产生。优选地，为了本发明的目的，使用程序“needle”(欧洲分子生物学开放软件套件(emboss))，其中使用程序默认参数(多核苷酸：空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5，以及矩阵＝ednafull；多肽：空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5，以及矩阵＝eblosum62)。
[0051]
在比对两个序列后，在第二步骤中，根据产生的比对确定同一性值。
[0052]
为了该目的，通过将相同残基的数量除以比对区域的长度再乘以100来计算％同一性，该比对区域在其完整长度上显示了本发明的相应序列：％同一性＝(相同残基/比对区域的长度，该比对区域在其完整长度上显示本发明的相应序列)*100。
[0053]
对于计算两个核酸序列的百分比同一性，应用与计算两个氨基酸序列的百分比同一性相同的方法，其中有一些具体规范。对于编码蛋白质的核酸序列，应在本发明序列的编码区从起始密码子到终止密码子(不包括内含子)的完整长度上进行成对比对。也可以去除与本发明的序列进行比较的其他序列中存在的内含子，用于成对比对。然后通过％同一性＝(相同残基/比对区域的长度，该比对区域在从起始密码子到终止密码子(不包括内含子)的其完整长度上显示本发明的序列)*100计算同一性百分比。在比对两个序列后，在第二步骤中，根据产生的比对确定同一性值。
[0054]
此外，优选的实施needleman和wunsch算法(j.mol.biol.(1979)48,第443-453页)的核酸序列比对程序是“needle”(欧洲分子生物学开放软件套件(emboss))，采用程序默认
参数(空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5，以及矩阵＝ednafull)。
[0055]
与本发明的序列具有相同或相似区域、并且应与本发明的序列进行比较以确定％同一性的序列，可以通过本领域技术范围内的各种方式容易地鉴定，例如，使用公众可获得的计算机方法和程序，例如blast、blast-2，例如可在ncbi获得。
[0056]
当与亲本序列比较时，可以通过它们的序列相似性定义变体多肽。序列相似性通常作为“％序列相似性”或“％相似性”提供。％序列相似性考虑了限定的氨基酸组具有相似的特性，例如根据其大小、其疏水性、其电荷或其它特性，具有相似的特性。在本文中，一个氨基酸与相似氨基酸的交换可称为“保守突变”。根据本发明的相似氨基酸如下定义，其也应适用于确定根据本发明的％相似性，其也符合例如程序“needle”使用的blosum62矩阵，其是用于数据库检索和序列比对的最常用的氨基酸相似性矩阵之一：
[0057]
氨基酸a与氨基酸s相似
[0058]
氨基酸d与氨基酸e；n相似
[0059]
氨基酸e与氨基酸d；k；q相似
[0060]
氨基酸f与氨基酸w；y相似
[0061]
氨基酸h与氨基酸n；y相似
[0062]
氨基酸i与氨基酸l；m；v相似
[0063]
氨基酸k与氨基酸e；q；r相似
[0064]
氨基酸l与氨基酸i；m；v相似
[0065]
氨基酸m与氨基酸i；l；v相似
[0066]
氨基酸n与氨基酸d；h；s相似
[0067]
氨基酸q与氨基酸e；k；r相似
[0068]
氨基酸r与氨基酸k；q相似
[0069]
氨基酸s与氨基酸a；n；t相似
[0070]
氨基酸t与氨基酸s相似
[0071]
氨基酸v与氨基酸i；l；m相似
[0072]
氨基酸w与氨基酸f；y相似
[0073]
氨基酸y与氨基酸f；h；w相似
[0074]
保守性氨基酸取代可发生在功能性蛋白质如酶的多肽序列的全长序列上。在一个实施方案中，此类突变不涉及酶的功能性结构域。在一个实施方案中，保守突变不涉及酶的催化中心。
[0075]
为了计算序列相似性，在第一步骤中，如上所述产生序列比对。在比对两个序列后，在第二步骤中，根据产生的比对确定相似性值。
[0076]
为了该目的，通过相同残基的数量加上相似残基的数量，除以比对区域的长度，再乘以100来计算％相似性，该比对区域在其完整长度上显示本发明的序列：％相似性＝[(相同残基 相似残基)/比对区域的长度，该比对区域在其完整长度上显示本发明的序列]*100。
[0077]
本发明涉及一种具有淀粉酶活性的多肽，其包含与以下全长氨基酸序列中的任一个至少80％相同、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、
至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:54、seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、或seq id no:37。
[0078]
本发明进一步涉及编码本发明变体多肽的多核苷酸。术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用并且指任何长度的聚合无分支形式的核苷酸，或者核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者的组合。“基因”是携带某种遗传信息的dna区段。
[0079]“亲本”多核苷酸序列是起始序列，用于将突变引入该序列，以产生所述亲本多核苷酸序列的“变体”。“变体多核苷酸”是指编码酶的多核苷酸，并且所述变体多核苷酸在其核酸序列上与其亲本多核苷酸不同。
[0080]
一方面，本发明的多核苷酸具有核酸序列，所述核酸序列与seq id no:55、seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36或seq id no:38的全长多核苷酸序列比较时，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％，至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％的同一性。
[0081]
优选地，多核苷酸是密码子优化的多核苷酸，用于改善在特定宿主细胞中的表达。
[0082]“取代”是通过提供原始氨基酸、然后是氨基酸序列中的位置编号、然后是取代的氨基酸来描述的。特定的氨基酸残基可以被与原始氨基酸残基不同的19个氨基酸残基中的任何一个取代。例如，第120位的组氨酸被丙氨酸取代被指定为“his120ala”或“h120a”。氨基酸位置的可选取代如下所示“his120ala,leu”或“h120a,l”。在本文中应理解，使用保守氨基酸替代物的替代取代可用于代替所指示的特定取代。
[0083]
氨基酸缺失是通过提供亲本酶的原始氨基酸，然后是氨基酸序列中的位置编号，然后是*来描述的。因此，第150位甘氨酸的缺失被指定为“gly150*”或g150*”。或者，例如，缺失被表示为“d183和g184的缺失”。
[0084]
氨基酸插入是通过提供亲本酶的原始氨基酸，然后是氨基酸序列中的位置编号，然后是原始氨基酸和添加的氨基酸来描述的。例如，在第180位紧邻甘氨酸插入赖氨酸被指定为“gly180glylys”或“g180gk”。当插入多于一个氨基酸残基时，例如gly180之后的lys和ala，这可以表示为：gly180glylysala或g195gka。
[0085]
在取代和插入发生在相同位置的情况下，这可以表示为s99sd s99a或简称s99ad。
[0086]
变体多肽的一个或多个氨基酸取代可以是一个或多个保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”或“相关氨基酸”是指用与亲本氨基酸序列相比在相同位置具有相似性质的不同氨基酸残基替换氨基酸序列中的一个氨基酸残基。保守氨基酸取代的一些示例包括但不限于用不同的带正电荷的氨基酸残基替换带正电荷的氨基酸残基；用不同的极性氨基酸残基替换极性氨基酸残基；用不同的非极性氨基酸残基替换非极性氨基酸残基，用不同的碱性
氨基酸残基替换碱性氨基酸残基，或用不同的芳香族氨基酸残基替换芳香族氨基酸残基。
[0087]“酶活性”是指由酶发挥的至少一种催化作用。酶活性表示为每毫克酶的单位(比活性)或每分钟每分子酶转化的底物分子(分子活性)。酶活性可以通过酶的实际功能指定，例如蛋白酶通过催化肽键的水解裂解发挥蛋白水解活性，脂酶通过酯键的水解裂解发挥脂解活性，淀粉酶活性涉及多糖中糖苷键的(内)水解等。
[0088]
在酶的储存或操作使用过程中，酶活性可能发生变化。术语“酶稳定性”涉及在储存或操作期间随时间变化而保留的酶活性。本文中的术语“储存”是指产品或组合物或制剂从被制造时到用于最终应用的时间点被储存的事实。在储存期间随时间变化而保留的酶活性在本文中可称为“储存稳定性”。
[0089]
为了确定和定量在某些条件下储存或使用的酶的催化活性随时间的变化，在限定的条件下在时间零测量“初始酶活性”(100％)，并且在以后的某个时间点进行测量(x％)。通过比较测量值，可以确定酶活性的潜在损失程度。酶活性损失的程度决定了酶的稳定性或不稳定性。
[0090]
影响酶的酶活性和/或储存稳定性和/或操作稳定性的参数是，例如，ph、温度、螯合剂和氧化物质的存在。
[0091]
变体多肽可以在约ph 4.0至约ph 12.0范围内的任何单个点，在宽的ph范围内具有活性。变体多肽酶可以在ph 5.0至ph 11.0、ph 6.0至ph 10.0、以及ph 7.0至ph 9.0的范围内具有活性。在另一个实施方案中，变体多肽酶可以在ph 7.1至ph 8.9、ph 7.2至ph 8.8、ph 7.3至ph 8.7、ph 7.4至ph 8.6、ph 7.5至ph 8.5内具有活性。变体多肽可以在ph 4.0、ph 4.1、ph 4.2、ph 4.3、ph 4.4、ph 4.5、ph 4.6、ph 4.7、ph 4.8、ph 4.9、ph 5.0、ph 5.1、ph 5.2、ph 5.3、ph 5.4、ph 5.5、ph 5.6、ph 5.7、ph 5.8、ph 5.9、ph 6.0、ph 6.1、ph 6.2、ph 6.3、ph 6.4、ph 6.5、ph 6.6、ph 6.7、ph 6.8、ph 6.9、ph 7.0、ph 7.1、ph 7.2、ph 7.3、ph 7.4、ph 7.5、ph 7.6、ph 7.7、ph 7.8、ph 7.9、ph 8.0、ph 8.1、ph 8.2、ph 8.3、ph 8.4、ph 8.5、ph 8.6、ph 8.7、ph 8.8、ph 8.9、ph 9.0、ph 9.1、ph 9.2、ph 9.3、ph 9.4、ph 9.5、ph 9.6、ph 9.7、ph 9.8、ph 9.9、ph 10.0、ph 10.1、ph 10.2、ph 10.3、ph 10.4、ph 10.5、ph 10.6、ph 10.7、ph 10.8、ph 10.9、ph 11.0、ph 11.1、ph 11.2、ph 11.3、ph 11.4、ph 11.5、ph 11.6、ph 11.7、ph 11.8、ph 11.9、ph 12.0、ph 12.1、ph 12.2、ph 12.3、ph 12.4、和ph 12.5、ph 12.6、ph 12.7、ph 12.8、ph 12.9或更高下具有活性。
[0092]“ph稳定性”是指酶在特定ph范围内发挥酶活性的能力。
[0093]
变体多肽可以在宽的温度下具有活性，其中温度是约10℃至约95℃范围内的任何点。变体多肽可以在以下温度范围内具有活性：10℃至55℃、10℃至50℃、10℃至45℃、10℃至40℃、10℃至35℃、10℃至30℃、或10℃至25℃。变体多肽可以在以下温度范围内具有活性：20℃至55℃、20℃至50℃、20℃至45℃、20℃至40℃、20℃至35℃、20℃至30℃、或20℃至25℃。变体多肽在以下温度下具有活性：至少10℃,11℃,12℃,13℃,14℃,15℃,16℃,17℃,18℃,19℃,20℃,21℃,22℃,23℃,24℃,25℃,26℃,27℃,28℃,29℃,30℃,31℃,32℃,33℃,34℃,35℃,36℃,37℃,38℃,39℃,40℃,41℃,42℃,43℃,44℃,45℃,46℃,47℃,48℃,49℃,50℃,51℃,52℃,53℃,54℃,55℃,56℃,57℃,58℃,59℃，60℃,61℃,62℃,63℃,64℃,65℃,66℃,67℃,68℃,69℃,70℃,71℃,72℃,73℃,74℃,75℃,76℃,77℃,78℃,79℃,80℃,81℃,82℃,83℃,84℃,85℃,86℃,87℃,88℃,89℃,90℃,91℃,92
℃,93℃,94℃,95℃或更高的温度。
[0094]
术语“热稳定性”和“热的稳定性”是指蛋白质在特定温度范围内发挥催化活性的能力。酶的热稳定性可以通过已知为t
50
值(也称为半衰期，见上文)表征。t
50
表示与未经过热处理的参考样品相比，在热灭活一定时间后仍存在50％残余酶活性的温度。
[0095]
在一个实施方案中，变体多肽与亲本分子相比提高了热稳定性。在另一个实施方案中，与亲本多肽相比，变体多肽将热稳定性提高3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃或更高的摄氏度。在另一个实施方案中，在65℃至100℃之间的温度下测量热稳定性的增加。可以在65℃,66℃,67℃,68℃,69℃,70℃,71℃,72℃,73℃,74℃,75℃,76℃,77℃,78℃,79℃,80℃,81℃,82℃,83℃,84℃,85℃,86℃,87℃,88℃,89℃,90℃,91℃,92℃,93℃,94℃,95℃,96℃,97℃,98℃,99℃,和/或100℃下测量热稳定性的增加。在另一个实施方案中，在70℃的温度下测量热稳定性的增加。在另一个实施方案中，在80℃的温度下测量热稳定性的增加。在另一个实施方案中，在90℃的温度下测量热稳定性的增加。在一个实施方案中，增加了在70℃、80℃或90℃下的热稳定性，优选地增加了在70℃下的热稳定性。在另一个实施方案中，增加了65℃至90℃之间的温度范围内的热稳定性，优选增加了70℃至85℃之间的热稳定性，优选增加了70℃至80℃之间的热稳定性。
[0096]
在一个实施方案中，变体多肽是全长氨基酸序列的片段，并且该片段具有淀粉酶活性。
[0097]
如本文所用，“片段”或“子序列”是多核苷酸或氨基酸序列的一部分。
[0098]
术语“功能片段”是指任何核酸或氨基酸序列，其分别仅包含全长氨基酸序列的一部分，但仍具有相同或相似的活性和/或功能。优选地，功能片段与全长氨基酸序列的原始序列至少75％相同、至少76％相同、至少77％相同、至少78％相同、至少79％相同、至少80％相同、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、或至少99.5％相同。与原始核酸或原始氨基酸序列相比，功能片段分别包含连续的核酸或氨基酸。
[0099]
a、b和c结构域：
[0100]
α-淀粉酶的结构包含三个不同的结构域a、b和c，参见，例如，machius等人,1995,j.mol.bio/.246:545-559。术语“结构域”是指本身形成整个分子的独特且独立的亚结构的多肽区域。α-淀粉酶由具有活性位点残基的β/α-8桶(指示为a结构域)、β-片层和α-螺旋3之间的相当长的环(指示为b结构域)(二者一起为“a和b结构域”)、和c结构域组成，在一些情况下还具有另外的碳水化合物结合结构域(例如，wo2005/001064；machius等人，同上)。
[0101]
α-淀粉酶的结构域可以通过结构分析来确定，例如使用晶体学技术。确定α-淀粉酶结构域的另一种方法是通过α-淀粉酶的氨基酸序列与已经确定结构域的另一种α-淀粉酶进行序列比对。例如，与已确定其c-结构域的α-淀粉酶中的c-结构域序列进行比对的序列可以被认为是给定α-淀粉酶的c-结构域。
[0102]
a和b结构域：
[0103]
本文所用的术语“a和b结构域”是指这两个结构域作为α-淀粉酶的一个单元，而c结构域是α-淀粉酶的另一个单元。因此，“a和b结构域”的氨基酸序列被理解为包含“a和b结
构域”和其他附加结构域(例如c结构域)的α-淀粉酶的一个连续序列或序列的一部分。因此，术语“a和b结构域与seq id no:42具有至少75％的序列同一性”意味着形成a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42具有至少75％的序列同一性。如本文所用，α-淀粉酶的“a和b结构域”对应于seq id no:39的氨基酸1-399。
[0104]
ab结构域供体：
[0105]
本文使用的术语ab结构域供体是指从中获得a和b结构域的α-淀粉酶。因此，对于具有seq id no：42的氨基酸序列的a和b结构域，ab结构域供体是seq id no：39的α-淀粉酶。
[0106]
c结构域：
[0107]
如本文所用，α-淀粉酶的“c结构域”对应于，例如，seq id no:39的氨基酸400-485。因此，可以通过将所述α淀粉酶与seq id no:39的α淀粉酶进行比对来发现α淀粉酶的c结构域。与seq id no：39的氨基酸400-485对齐的所述α淀粉酶的部分为根据本发明的α淀粉酶的“c结构域”。因此，例如，具有seq id no:40的氨基酸序列的α淀粉酶的c结构域由本文公开为seq id no:44的氨基酸401-486组成。
[0108]
碳水化合物结合结构域或碳水化合物结合模块(cbm)：
[0109]
包含催化模块(a、b和c结构域)的淀粉酶可进一步包含一种或多种非催化的cbm(碳水化合物结合模块，也称为碳水化合物结合结构域或专门用于淀粉酶的淀粉结合结构域)。cbm可以提高酶与底物的结合。cbm连接至c结构域。
[0110]
本发明的α-淀粉酶包含三个结构域：a、b和c结构域。优选地，本发明的淀粉酶不包含碳水化合物结合结构域。优选地，本发明的α-淀粉酶仅由三个结构域组成，即a、b和c结构域。
[0111]
本发明的发明人惊奇地发现，作为来自seq id no：39或其变体的第一α淀粉酶(“ab结构域供体”)的a和b结构域与来自seq id no:40或其变体的第二α淀粉酶(“c结构域供体”)的c结构域的杂合体的多肽，与ab结构域供体(seq id no:39或其变体)的α-淀粉酶和c结构域供体(seq id no:40或其变体)的α-淀粉酶和/或甚至seq id no：41的α-淀粉酶(其是具有提高稳定性的seq id no：39的α-淀粉酶的变体，即，根据seq id no：39的编号在氨基酸位置182和183上缺失)相比，具有改善的特性。
[0112]
具有seq id no：39的氨基酸序列的α-淀粉酶的a和b结构域被确定为对应于氨基酸1-399。该序列在本文中也公开为seq id no:42。seq id no：39的氨基酸序列的c结构域被确定为对应于氨基酸400-485(在本文中公开为seq id no:43)。具有seq id no：40的氨基酸序列的α-淀粉酶的c结构域被确定为对应于seq id no:40的氨基酸401-486，并且在本文中也公开为seq id no:44。因此，在本发明的一个实施方案中，具有α-淀粉酶活性的多肽是seq id no:39或其变体的氨基酸1-399与seq id no:40或其变体的氨基酸401-486的杂合体。
[0113]
ab结构域供体：
[0114]
在一个实施方案中，a和b结构域从包含seq id no:39的氨基酸序列的α-淀粉酶获得，其中a和b结构域在本文中也公开为seq id no:42。在本发明的一个实施方案中，形成a和b结构域的氨基酸序列与seq id no：42的氨基酸序列具有至少75％的同一性，例如至少78％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、
至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
[0115]
其他合适的ab结构域供体是与seq id no:39的α-淀粉酶密切相关的α-淀粉酶。优选地，ab结构域供体是α-淀粉酶，其与seq id no:39的α-淀粉酶具有至少75％的同一性，例如至少78％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。优选地，ab结构域供体是α-淀粉酶，其与seq id no:41的α-淀粉酶具有至少75％的同一性，例如至少78％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
[0116]
或者，ab结构域供体是α-淀粉酶，其与seq id no:40的α-淀粉酶具有至少75％的同一性，例如至少78％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
[0117]
c结构域供体：
[0118]
最优选的c结构域供体是作为seq id no:40公开的α-淀粉酶，其中的c结构域被确定为对应于氨基酸401-486，本文中也公开为seq id no:44。因此，本发明在最优选的实施方案中涉及以上公开的a和b结构域与作为seq id no:44公开的c结构域、与其具有至少75％序列同一性的c结构域融合。在另一个实施方案中，本发明涉及α-淀粉酶，其包含与c结构域融合的上述a和b结构域，所述c结构域具有与seq id no:44的序列至少80％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及α-淀粉酶，其包含与c结构域融合的上述a和b结构域，所述c结构域具有与seq id no:44的序列至少85％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及α-淀粉酶，其包含与c结构域融合的上述a和b结构域，所述c结构域具有与seq id no:44的序列至少90％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及α-淀粉酶，其包含与c结构域融合的上述a和b结构域，所述c结构域具有与seq id no:44的序列至少95％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及α-淀粉酶，其包含与c结构域融合的上述a和b结构域，所述c结构域具有与seq id no:44的序列至少97％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及α-淀粉酶，其包含与c结构域融合的上述a和b结构域，所述c结构域具有与seq id no:44的序列至少98％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及α-淀粉酶，其包含与c结构域融合的上述a和b结构域，所述c结构域具有与seq id no:44的序列至少99％相同的序列。在另一个实施方案中，本发明涉及α-淀粉酶，其包含与c结构域融合的上述a和b结构域，所述c结构域具有与seq id no:44的序列100％相同的序列。
[0119]
与seq id no：44的c结构域至少75％相同的合适的c结构域是本文公开为seq id no：46和48的两个c结构域。其相应的杂合淀粉酶示于seq id no:49和50中。
[0120]
优选地，c结构域供体是α-淀粉酶，其与seq id no:40的α-淀粉酶具有至少75％的同一性，例如至少78％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
[0121]
或者，c结构域供体是α-淀粉酶，其与seq id no:39的α-淀粉酶具有至少75％的同一性，例如至少78％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
[0122]
因此，在可替代的实施方案中，如果ab结构域供体是与seq id no:40的α-淀粉酶具有至少75％的同一性，例如至少78％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少
no:39的c结构域中、在选自以下位置的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸残基被替换：根据seq id no:39编号的位置400,402,408,409,410,418,419,420,422,423,429,430,437,441,444,446,449,452,454,458,459,460,466,471,473,475,482,484和485，优选被替换为seq id no:40中存在的氨基酸残基。
[0129]
优选地，所述α-淀粉酶与seq id no:39中所示的α-淀粉酶具有至少75％的同一性，例如至少78％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，并且在seq id no:39的c结构域中，氨基酸序列包含选自以下的一个或多个取代：根据seq id no:39编号的k400t,n402r,h408p,n409d,m410v,n418d,t419g,a420v,p422a,n423d,i429l,m430i,n437s,y441e,r444k,k446n,q449e,r452y,i454m,r458q,s459t,g460n,a466k,n471q,s473h,n475s,w482y,n484q,和n485q。
[0130]
或者，亲本淀粉酶是seq id no：40中所示的淀粉酶，并且在seq id no:40的ab结构域中引入一个或多个氨基酸取代，优选在1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122或123个位置，优选在1-123个位置，更优选在1-100个位置，甚至更优选在1-50个位置，以将这些位置的氨基酸序列转换为seq id no:39。
[0131]
优选地，所述α-淀粉酶与seq id no:40中所示的α-淀粉酶具有至少75％的同一性，例如至少78％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，并且seq id no:40的a和b结构域中，选自以下位置的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸残基被替换：根据seq id no:39编号的位置1,2,3,4,5,9,17,25,28,29,32,35,36,41,48,51,52,82,83,86,87,89,90,93,94,95,96,98,113,116,118,123,124,125,129,136,138,142,144,150,158,165,169,170,172,174,183,186,192,193,206,208,212,214,217,218,222,225,227,229,235,242,243,244,245,246,250,251,255,256,260,263,267,269,273,274,275,276,280,282,284,286,291,297,298,299,302,303,304,311,313,318,320,323,324,328,330,337,338,339,343,345,346,355,356,360,361,374,375,376,377,378,379,382,384,391,394,395和396，优选被替换为seq id no:39中存在的氨基酸残基。
[0132]
优选地，所述α-淀粉酶与seq id no:40中所示的α-淀粉酶具有至少75％的同一性，例如至少78％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，并且在seq id no：40的a和b结构域中，氨基酸序列包含选自以下位置的一个或多个取代：根据seq id no:39的编号，a1hh,a2h，t3n，i4g，n5t，l9m，a17l，k25n，h28r，t29s，g32s，a35k，q36d，s41a，y48w，t51a，t52s，k82r，a83n，k86q，s87a，i89v，e90t，h93k，k94s，q95n，n96g，n98q，y113a，t116w，t118r，d123n，r124p，n125s，i129q，e136t，n138e，g142k，n144d，d150n，k158r，t165v，e169q，g170s，k172q，l173lq，i183d，a186g，s192d，s193t，l206i，f208m，d212e，
a214v，m217l，k218r，t222v，a225t，e227t，n229g，l235i，d242k，h243y，e244s，y245f，l246t，v250l，n251t，q255n，q256t，e260n，t263a，y267f，q269k，q273g，t274a，l275i，n276e，a280s，v282t，y284w，q286h，a291v，f297l，h298y，y299n，k302r，g303s，n304g，n311q，l313f，m318v，n320r，a323t，l324h，l328f，e330d，g337e，q338e，s339a，v343f，s345e，p346e，f355l，i356t，a360d，e361q，tsgn374i，s375p，s376t，y377h，e378g，i379v，l382m，d384s，m391e，k394q，n395k和f396y。
[0133]
在一个实施方案中，杂合淀粉酶包含a和b结构域、以及c结构域，所述a和b结构域来自具有与seq id no.39中所示的淀粉酶具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的淀粉酶，并且所述c结构域来自具有与seq id no：40中所示的淀粉酶具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的淀粉酶。
[0134]
在本发明的一个实施方案中，形成a和b结构域的氨基酸序列与seq id no：42的氨基酸序列具有至少75％的同一性，例如至少78％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且形成c结构域的氨基酸序列与seq id no：44具有至少75％的同一性。
[0135]
可以通过用另一α-淀粉酶的c结构域或其部分取代α-淀粉酶的c结构域或其部分产生α-淀粉酶。当产生杂合α-淀粉酶时，接头区不应缺失或插入任何氨基酸，其中接头区在本文中理解为根据seq id no：39的编号的氨基酸位置380-420。优选地，淀粉酶的根据seq id no：39的编号的氨基酸位置380-420包含存在于seq id no：39和/或seq id no：40中的氨基酸残基。优选地，淀粉酶的根据seq id no：39的编号的氨基酸位置390-410包含存在于seq id no：39和/或seq id no：40中的氨基酸残基。优选地，淀粉酶的根据seq id no：39的编号的氨基酸位置395-405包含存在于seq id no：39和/或seq id no：40中的氨基酸残基。优选地，淀粉酶在氨基酸位置380-399(根据seq id no：39的编号)包含seq id no：39的氨基酸残基。优选地，淀粉酶在氨基酸位置400-420(根据seq id no：39的编号)包含seq id no：40的氨基酸残基。
[0136]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在一个或多个位置包含取代、缺失和/或插入。
[0137]
优选地，具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含序列tqxdyldhpdvigwtregdxxhxxsglaxlmsdgpxgxkwmxvgknnagexwxditgnqtntvtinxdgxgqfxvxxgsxsiyxqx，其中x可以是任何氨基酸。
[0138]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽具有一个或多个选自以下的基于seq id no：39的编号的氨基酸残基402r，h；419s，g，d；420v，i；422，a，v；423n，d，g，k；428t，a；435g，r，e；437s，a；441n，e，d；444k，e；450v，i；452y，h，r；466k，r；469w，s；473h，q，r；475s，n；476g，e；479v，a；483v，i；和485r，q，k，优选地选自基于seq id no：39的编号的402r；419d；420v；422a；423d；428a，t；435r；437s；441e；444k；450v；452y；466k；469w；473r；475s；476g；479v；483v；和485q。
[0139]
在另一个实施方案中，本发明涉及上文公开的多肽的变体。本发明的淀粉酶可以在一个或多个位置包含额外的取代、缺失和/或插入。多肽可以仅在a和b结构域中、或仅在c结构域中、或在a和b结构域以及c结构域中发生突变(取代、缺失和/或插入)。如果存在额外
的残基，例如碳水化合物结合结构域，则多肽可以在a和b结构域以及c结构域之外发生突变(取代、缺失和/或插入)。氨基酸的改变可能是次要性质的，即，不显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；通常为1-30个氨基酸的小的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；最多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其他功能促进纯化的小延伸，例如多组氨酸序列、抗原表位或结合结构域。
[0140]
在一个实施方案中，在一个或多个位置包含取代并且具有淀粉酶活性的seq id no：54，1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35或37的淀粉酶的变体包含1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个取代，优选地，在1-20个位置，更优选地，在1-10个位置，优选地为保守取代。
[0141]
可根据本领域已知的程序来鉴定多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(cunningham and wells，1989，science 244：1081-1085)。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，然后测试所得突变分子的α-淀粉酶活性，以确定对分子活性至关重要的氨基酸残基。还参见，hilton等人,1996,j.bio/.chem.271:4699-4708。也可以通过结构的物理分析来确定酶或其他生物相互作用的活性位点，如通过核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记等技术，结合假定的接触位点氨基酸突变来确定。例如，参见de vos等人,1992,science 255:306-312；smith等人,1992,j.mol.bio/.224:899-904；wlodaver等人,1992,febs lett.309:59-64。也可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基酸。seq id no：39的氨基酸序列中的必需氨基酸位于位置d236、e266和d333，其是催化残基。优选这些残基应该不被突变。可以使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关筛选程序，例如reidhaar-olson and sauer,1988,science 241:53-57；bowie and sauer,1989,proc.natl.acad.sei.usa 86:2152-2156；wo 95/17413；或wo 95/22625中公开的那些方法，制备和测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。可以使用的其他方法包括易错pcr、噬菌体展示(例如,lowman等人,1991,biochemistry 30:10832-10837；美国专利号5,223,409；wo 92/06204)、和区域定向诱变(derbyshire等人,1986,gene 46:145；ner等人,1988,dna 7:127)。
[0142]
诱变/改组方法可以与高通量、自动筛选方法相结合，以检测宿主细胞表达的克隆、诱变多肽的活性(ness等人,1999,nature biotechnology 17:893-896)。编码活性多肽的诱变dna分子可以从宿主细胞中回收并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
[0143]
优选的突变是在选自seq 1d no：39的181、182、183和184中的一个或多个，优选至少2个氨基酸位置上的缺失，例如氨基酸181 182、或182 183、或181 183或181 184的缺失。由此，分子相当稳定。在本发明的一个优选实施方案中，对应于seq id no:39的182和183的氨基酸缺失。在一个实施方案中，本发明的杂合淀粉酶包含如本文公开的seq id no:39或变体的a和b结构域、来自如本文公开的seq id no:40或变体的α淀粉酶的c结构域、以及进一步包含对应于seq id no:39的182和183的氨基酸的缺失。此类变体在本文中公开为，例如seq id no：54。
[0144]
在本发明的其他实施方案中，杂合淀粉酶在结构域c与a和b结构域的界面内包含氨基酸取代，以避免空间冲突。在一个实施方案中，优选的取代是在等同位置进入待取代c结构域的氨基酸(如seq id no:43)中的供体淀粉酶的c结构域(例如seq id no:44)内的取
代。可以通过比对两个序列来定义等同位置。通过检查结构模型来分析这些突变的优选位置。优选地，但非限制性地，在供体c结构域内以下氨基酸位置中的一个或多个位置上的取代：401,403,405,411,413,415,424,426,428,430,432,454,455,477,479和481(编号根据seq id no:39)。优选地，所述具有淀粉酶活性的多肽在一个或多个选自401,403,405,411,413,415,424,426,428,430,432,454,455,477,479和481的氨基酸位置(根据seq id no：39编号)上包含如seq id no：39中存在的氨基酸残基。
[0145]
在另一个实施方案中，优选的取代是在等同位置上存在的c结构域受体淀粉酶的a和b结构域(例如seq id no:42)内的c结构域供体淀粉酶的a和b结构域的氨基酸(如seq id no:51)中的取代。可以通过比对两个序列来定义等同位置。通过检查结构模型来分析这些突变的优选位置。优选地，但非限制性地，是在c结构域受体淀粉酶的a和b结构域内，优选地，在seq id no：39的a和b结构域内的以下氨基酸位置中的一个或多个位置的取代：309,313,347,348,350,351,354,355,358,359,388,389,392和396(根据seq id no：39编号)。优选地，所述具有淀粉酶活性的多肽在一个或多个选自309,313,347,348,350,351,354,355,358,359,388,389,392和396的氨基酸位置(根据seq id no：39编号)上包含如seq id no：40中存在的氨基酸残基。
[0146]
为适应由sed id no：42中给出的a和b结构域和seq id no:44中给出的c结构域组成的杂合淀粉酶(生成seq id no:52中给出的杂合淀粉酶)内的界面的示例是突变i430m和m454i，生成seq id no:53或seq id no:54中给出的淀粉酶(根据seq id no:39编号)。因此，优选地，基于seq id no：39的编号，本发明的淀粉酶包含在一个或多个选自430和454的位置上的取代，优选地，本发明的淀粉酶包含氨基酸残基430m和/或430i，优选地，产生430m和/或454i的取代，优选地，选自i430m和m454i的取代。
[0147]
本发明的具有淀粉酶活性的多肽可以进一步包含在选自9,130,195,206,244,202,179,181,186和190中的一个或多个位置上的取代，优选地，在选自9,179,186,195和206中的一个或多个位置上的取代，更优选地，在选自179,195和206中的一个或多个位置上的取代(根据seq id no:39编号)，优选地，一个或多个取代选自m9l,e130v,n195f,i206l,s244q,m202l,k179l,r181e,g186e/n/q/s和e190p，优选地，一个或多个取代选自m9l,k179l,g186e/n/q/s,n195f和i206l，更优选地，一个或多个取代选自k179l,g186e,n195f和i206l(根据seq id no:39编号)。在另一个实施方案中，本发明还涉及编码本发明淀粉酶的多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明还涉及由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在高严格条件下与(i)本文所述的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补序列杂交。如本文所定义的术语“杂交”是其中基本上互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可以完全发生在溶液中，即两个互补核酸都在溶液中。杂交过程也可以发生在互补核酸之一固定到基质(例如磁珠、琼脂糖凝胶珠或任何其他树脂)上的情况。此外，杂交过程可以发生在互补核酸之一固定到固相支持物(例如硝化纤维素或尼龙膜)或通过例如光刻法固定到包括但不限于硅质玻璃支持物的载体(后者已知作为核酸阵列或微阵列或作为核酸芯片)上的情况。为了允许杂交发生，核酸分子通常被热或化学变性以将双链解链成两条单链和/或从单链核酸去除发夹或其他二级结构。
[0148]
这种杂交的形成或解链取决于多种参数，包括但不限于温度。温度升高有利于解链，而温度降低有利于杂交。然而，这种杂交形成过程并不以线性方式遵循所应用的温度变
temperature calculation methods for short dna sequences.bioinformatics,21(6):711-722)，
[0164]
其中：
[0165]
tm是以摄氏度表示的解链温度；
[0166]
∑(δhd)和∑(δsd)是在所有内部最近邻双峰上计算的焓和熵的总和(相应地)；
[0167]
δsself是自互补序列的熵罚分；
[0168]
δhi和δsi分别是起始焓和熵的总和；
[0169]
r为气体常数(固定为1.987cal/k
·
mol)；
[0170]
ct是摩尔单位的总链浓度；
[0171]
对于非自互补序列，常数b取值为4，对于自互补链的双链或当其中一条链显著过量时的双链，常数b取值为1。
[0172]
热力学计算假设退火发生在ph值接近7.0的缓冲溶液中，并且发生二态转换。
[0173]
可以从(alejandro panjkovich,francisco melo,2005.comparison of different melting temperature calculation methods for short dna sequences.bioinformatics,21(6):711-722)中的表1中，或者从原始研究论文(breslauer,k.j.,frank,r.,h.,marky,l.a.1986predicting dna duplex stability from the base sequence.proc.natl acad.sci.usa 833746
–
3750；santalucia,j.,jr,allawi,h.t.,seneviratne,p.a.1996improved nearest-neighbor parameters for predicting dna duplex stability.biochemistry 353555
–
3562；sugimoto,n.,nakano,s.,yoneyama,m.,honda,k.1996 improved thermodynamic parameters and helix initiation factor to predict stability of dna duplexes.nucleic acids res.244501
–
4505)中获得用于计算的热力学值。
[0174]
根据该实施方案对于用计算机估算tm，首先生成两个序列之间的一组生物信息学序列比对。这样的比对可由本领域技术人员已知的各种工具生成，例如产生局部比对的程序“blast”(ncbi)、“water”(emboss)或“matcher”(emboss)，或产生全局比对的“needle”(emboss)。这些工具应以其默认参数设置应用，但也使用一些参数变化。例如，程序“matcher”可以以gapopen/gapextend的各种参数应用(如14/4；14/2；14/5；14/8；14/10；20/2；20/5；20/8；20/10；30/2；30/5；30/8；30/10；40/2；40/5；40/8；40/10；10/2；10/5；10/8；10/10；8/2；8/5；8/8；8/10；6/2；6/5；6/8；6/10)，程序“water”可以以gapopen/gapextend的各种参数应用(如10/0,5；10/1；10/2；10/3；10/4；10/6；15/1；15/2；15/3；15/4；15/6；20/1；20/2；20/3；20/4；20/6；30/1；30/2；30/3；30/4；30/6；45/1；45/2；45/3；45/4；45/6；60/1；60/2；60/3；60/4；60/6)，而且这些程序应通过使用给定的两种核苷酸序列来应用，但也应使用序列之一的反向互补形式。例如，可以应用具有增加的e值截止值(例如，e 1或甚至e 10)的blastn(ncbi)来识别非常短的比对，尤其是在小规模的数据库中。
[0175]
重要的是要考虑局部比对，因为杂交可能不一定发生在两个序列的整个长度上，但可能最好发生在不同的区域，而这些区域然后实际决定解链温度。因此，必须从所有创建的比对中确定比对长度、比对gc％含量(更准确地说，是比对中匹配的碱基的gc％含量)和比对同一性。然后必须计算每个比对的预测解链温度(tm)。使用计算出的最高tm预测实际的解链温度。
[0176]
如本文所定义的术语“在本发明的完整序列上杂交”是指当本发明的序列被片段化为约300至500个碱基长度的碎片时，对于长度超过300个碱基的序列杂交，每个片段都必须杂交。例如，可以使用一种或多种限制酶将dna片段化。然后通过与上述相同的程序进行tm的生物信息学计算机计算，对每个片段都进行。可以通过标准的southern分析或本领域技术人员已知的类似方法分析各个片段的物理杂交。
[0177]
如本文所定义的术语“严格性”描述两个核苷酸序列之间可发生杂合体形成的容易程度。“较高严格性”的条件要求一个序列的更多碱基与另一序列配对(在“较高严格”的条件下，解链温度tm降低)，“较低严格性”的条件允许更多碱基未配对。因此，两个序列之间的关系程度可以通过它们仍然能够形成杂合体的实际严格性的条件来估计。可以通过保持实验杂交温度恒定以及降低盐浓度，或通过保持盐恒定并提高实验杂交温度，或这些参数的组合，来实现增加的严格性。甲酰胺的增加也会增加严格性。技术人员知道在杂交期间可以改变的其他参数，这些参数将保持或改变严格性的条件(sambrook等人(2001)molecular cloning:a laboratory manual,3rd edition,cold spring harbor laboratory press,csh,new york or to current protocols in molecular biology,john wiley&sons,n.y.(1989，每年更新)。
[0178]
典型的杂交实验通过初始杂交步骤、然后是一步到几步的洗涤步骤完成。用于这些步骤的溶液可含有其他成分，这些成分防止被分析序列的降解和/或防止探针的非特异性背景结合，如edta、sds、片段化的精子dna或类似的试剂，这些都是本领域技术人员已知的(sambrook等人(2001)molecular cloning:a laboratory manual,3
rd edition,cold spring harbor laboratory press,csh,new york or to current protocols in molecular biology,john wiley&sons,n.y.(1989，每年更新)。
[0179]
用于杂交实验的典型探针是通过随机引物标记方法生成的，该方法最初由feinberg和vogelstein(anal.biochem.,132(1),6-13(1983)；anal.biochem.,137(1),266-7(1984)开发，并且基于所有可能的六核苷酸的混合物与待标记的dna的杂交。标记的探针产品实际上是一组各种长度的片段，通常的尺寸范围为100-1000个核苷酸长度，最高片段浓度通常约为200到400bp。最终用作杂交实验探针的探针片段的实际尺寸范围也可能受到以下影响：所使用的标记方法的参数、生成的探针的后续纯化(例如琼脂糖凝胶)以及所使用的用于标记的模板dna的大小(例如，大模板可以在标记前使用4bp切割物进行限制性消化，例如使用haeiii)。
[0180]
对于本发明，本文所述的序列通过杂交实验进行分析，其中探针由另一序列产生，并且该探针通过标准随机引物标记方法产生。对于本发明，探针由一组大小为约200-400个核苷酸的标记的寡核苷酸组成。本发明的序列和其他序列之间的杂交是指，探针的杂交发生在本发明的完整序列上，如上文所定义。通过最终洗涤步骤的严格性实现最高严格性，来完成杂交实验。最终洗涤步骤具有至少与洗涤条件1的严格条件相当的严格条件：1.06 x ssc、0.1％sds、0％甲酰胺，50℃，在另一实施方案中，至少与洗涤条件2相当：1.06 x ssc、0.1％sds、0％甲酰胺，55℃，在另一实施方案中，至少与洗涤条件3相当：1.06 x ssc、0.1％sds、0％甲酰胺，60℃，在另一实施方案中，至少与洗涤条件4相当：1.06 x ssc、0.1％sds、0％甲酰胺，65℃，在另一实施方案中，至少与洗涤条件5相当：0.52 x ssc、0.1％sds、0％甲酰胺，65℃，在另一实施方案中，至少与洗涤条件6相当：0.25 x ssc、0.1％sds、0％甲酰胺，
65℃，在另一实施方案中，至少与洗涤条件7相当：0.12 x ssc、0.1％sds、0％甲酰胺，65℃，在另一实施方案中，至少与洗涤条件8相当：0.07 x ssc、0.1％sds、0％甲酰胺，65℃。
[0181]“低严格洗涤”具有至少与洗涤条件1的严格条件相当、但不比洗涤条件3更严格的严格条件，其中洗涤条件如上所述。
[0182]“高严格洗涤”具有至少与洗涤条件4的严格条件相当的严格条件，在另一个实施方案中至少与洗涤条件5相当的严格条件，在另一个实施方案中至少与洗涤条件6相当的严格条件，在另一个实施方案中至少与洗涤条件7相当的严格条件，在另一个实施方案中至少与洗涤条件8相当的严格条件，其中洗涤条件如上所述。
[0183]
本发明的淀粉酶显示出改善的特性。优选地，改善的特性是相对于seq id no：39和/或seq id no:40中所示的淀粉酶的特性。优选地，在15℃下的洗涤性能得到改善。在一个实施方案中，改善的特性是洗涤剂稳定性。在另一个实施方案中，改善的特性是比活性。在另一个实施方案中，改善的特性是热稳定性。在另一个实施方案中，改善的特性是ph依赖的稳定性。在另一个实施方案中，改善的特性是氧化稳定性。在另一个实施方案中，改善的特性是ca2 依赖性的降低。在又一个实施方案中，改善的特性是低温下的洗涤性能。在本发明的一个实施方案中，多肽具有改善的低温下的洗涤性能，例如在40℃或低于40℃，或在30℃或低于30℃，或在25℃或低于25℃，或在20℃或低于20℃，或在15℃或低于15℃，或在10℃或低于10℃。在一个优选的实施方案中，改善的特性是热稳定性。
[0184]
优选的具有淀粉酶活性的多肽(淀粉酶)：
[0185]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no：42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no：44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。
[0186]
优选地，具有α-淀粉酶活性的多肽由a和b结构域和c结构域组成，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no：42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no：44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。
[0187]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no：42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no：44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含序列tqxdyldhpdvigwtregdxxhxxsglaxlmsdgpxgxkwmxvgknnagexwxditgnqtntvtinxdgxgqfxvxxgsxsiyxqx，其中x可以是任何氨基酸。
[0188]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no：42的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no：44的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含序列tqxdyldhpdvigwtregdxxhxxsglaxlmsdgpxgxkwmxvgknnagexwxditgnqtntvtinxdgxgqfxvxxgsxsiyxqx，其中x可以是任何氨基酸。
[0189]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no：42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no：44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽具有一个或多个选自402r，h；419s，g，d；420v，i；422，a，v；423n，d，g，k；428t，a；435g，r，e；437s，a；441n，e，d；444k，e；450v，i；452y，h，r；466k，r；469w，s；473h，q，r；475s，n；476g，e；479v，a；483v，i；和485r，q，k，的氨基酸残基；优选地，选自402r；419d；420v；422a；423d；428a，t；435r；437s；441e；444k；450v；452y；466k；469w；473r；475s；476g；479v；483v；和485q，根据seq id no：39的编号，还优选地，选自根据seq id no：39的编号的435r，437a，441d，和485k。
[0190]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no：42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no：44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或所有选自根据seq id no：39编号的402r，h；419s，g，d；420v，i；422，a，v；423n，d，g，k；428t，a；435g，r，e；437s，a；441n，e，d；444k，e；450v，i；452y，h，r；466k，r；469w，s；473h，q，r；475s，n；476g，e；479v，a；483v，i；和485r，q，k的氨基酸残基；优选地选自根据seq id no：39的编号的402r；419d；420v；422a；423d；428a，t；435r；437s；441e；444k；450v；452y；466k；469w；473r；475s；476g；479v；483v；和485q。
[0191]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no：42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no：44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至
少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中，基于seq id no：39的编号，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含在一个或多个选自430和454的位置上的取代，优选地，所述淀粉酶包含氨基酸残基430m和/或430i，优选地，所述取代选自i430m和m454i，优选地，所述取代为i430m和m454i。
[0192]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no：42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no：44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中，基于seq id no：39的编号，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含在一个或多个选自430和454的位置上的取代，优选地，所述淀粉酶包含氨基酸残基430m和/或430i，优选地，所述取代选自i430m和m454i，优选地，所述取代为i430m和m454i，其中具有α-淀粉酶的多肽对应于seq id no：39的编号的相应于位置181、182、183和184包含一个或多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181、182、183和184的两个或更多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181和182、182和183或183和184的氨基酸的缺失(根据seq id no：39编号)。
[0193]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no：42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no：44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中，基于seq id no：39的编号，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含在一个或多个选自430和454的位置上的取代，优选地，所述取代选自i430m和m454i，优选地，所述取代为i430m和m454i，其中具有α-淀粉酶的多肽对应于seq id no：39的编号的相应于位置181、182、183和184包含一个或多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181、182、183和184的两个或更多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181和182、182和183或183和184的氨基酸的缺失(根据seq id no：39编号)，并且其中具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含序列tqxdyldhpdvigwtregdxxhxxsglaxlmsdgpxgxkwmxvgknnagexwxditgnqtntvtinxdgxgqfxvxxgsxsiyxqx，其中x可以是任何氨基酸，优选地，其中所述多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸残基：根据seq id no：39的编号的402r，h；419s，g，d；420v，i；422，a，v；423n，d，g，k；428t，a；435g，r，e；437s，a；441n，e，d；444k，e；450v，i；452y，h，r；466k，r；469w，s；473h，q，r；475s，n；476g，e；479v，a；483v，i；和485r，q，k；优选地选自根据seq id no：39的编号的402r；419d；420v；422a；423d；428a，t；435r；437s；441e；444k；450v；452y；466k；469w；473r；475s；476g；479v；483v；和485q。
[0194]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no：42的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与
seq id no：44的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中，基于seq id no：39的编号，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含在一个或多个选自430和454的位置上的取代，优选地，所述淀粉酶包含氨基酸残基430m和/或430i，优选地，所述取代选自i430m和m454i，优选地，所述取代为i430m和m454i，其中具有α-淀粉酶的多肽对应于seq id no：39的编号的相应于位置181、182、183和184包含一个或多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181、182、183和184的两个或更多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181和182、182和183，或183和184的氨基酸的缺失(根据seq id no:39编号)。
[0195]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含与seq id no:52的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中，基于seq id no：39的编号，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含在一个或多个选自430和454的位置上的取代，优选地，所述淀粉酶包含氨基酸残基430m和/或430i，优选地，所述取代产生430m和/或454i，优选地，所述取代选自i430m和m454i，优选地，所述取代为i430m和m454i，其中具有α-淀粉酶的多肽对应于seq id no：39的编号的相应于位置181、182、183和184包含一个或多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181、182、183和184的两个或更多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181和182、182和183，或183和184的氨基酸的缺失(根据seq id no:39编号)。
[0196]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含与seq id no:53的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，其中具有α-淀粉酶的多肽对应于seq id no：39的编号的相应于位置181、182、183和184包含一个或多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181、182、183和184的两个或更多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181和182、182和183，或183和184的氨基酸的缺失(根据seq id no:39编号)。
[0197]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no:44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在一个或多个选自401、403、405、411、413、415、424、426、428、430、432、454、455、477、479和481的氨基酸位置(根据seq id no：39编号)上包含如seq id no：39所示的氨基酸残基。
[0198]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no:44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、
至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、或至少13个、或所有选自401,403,405,411,413,415,424,426,428,430,432,454,455,477,479和481的氨基酸位置(根据seq id no：39的编号)的氨基酸残基上包含如seq id no:39所示的氨基酸残基。
[0199]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no:44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在一个或多个选自309、313、347、348、350、351、354、355、358、359、388、389、392和396的氨基酸位置(根据seq id no：39编号)上包含如seq id no：40所示的氨基酸残基。
[0200]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no:44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、或所有选自309,313,347,348,350,351,354,355,358,359,388,389,392和396的氨基酸位置(根据seq id no：39的编号)的氨基酸残基上包含如seq id no:40所示的氨基酸残基。
[0201]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no:44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽对应于seq id no:39的编号的相应于位置181、182、183和184包含一个或多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181、182、183和184的两个或更多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181和182、182和183，或183和184的氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置182和183的氨基酸的缺失。
[0202]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no:44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中，
所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的、或重组的多肽包含在选自9,130,195,206,244,202,179,181,186和190中的一个或多个位置上的取代，优选地，在选自9,179,186,195和206中的一个或多个位置上的取代，更优选地，在选自179,195和206中的一个或多个位置上的取代(根据seq id no:39编号)，优选地，一个或多个取代选自m9l,e130v,n195f,i206l,s244q,m202l,k179l,r181e,g186e/n/q/s和e190p，优选地，一个或多个取代选自m9l,k179l,g186e/n/q/s,n195f和i206l，更优选地，一个或多个取代选自k179l,g186e,n195f和i206l(根据seq id no:39编号)。
[0203]
本文还公开了具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含与seq id no:39或seq id no:40的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在选自根据seq id no:39编号的9、130、195、206、244、202、179、181、186和190中的一个或多个位置上，优选至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或所有氨基酸残基位置上，包含取代，优选地，包含选自根据seq id no:39编号的m9l、e130v、n195f、i206l、s244q、m202l、k179l、r181e、g186e/n/q/s和e190p中的一个或多个取代。
[0204]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq idno:44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在选自根据seq id no:39编号的9、130、195、206、244、202、179、181、186和190中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或所有氨基酸残基位置上，包含取代，优选地，包含选自根据seq id no：39的编号的m9l,e130v,n195f,i206l,s244q,m202l,k179l,r181e,g186e/n/q/s和e190p中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或所有氨基酸取代。
[0205]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no:44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽与seq id no:39或seq id no:40所示的淀粉酶相比，包括增加的表达、活性、热稳定性、稳定性、洗衣性能、比活性、底物特异性、ph依赖的活性、ph依赖的稳定性、氧化稳定性、ca2 依赖性或其任意组合，优选地，与seq id no:39或seq id no:40所示的淀粉酶相比，所述淀粉酶具有增加的热稳定性。
[0206]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a
id no：9，seq id no：11，seq id no：13，seq id no：15，seq id no：17，seq id no：19，seq id no：21，seq id no：23，seq id no：25，seq id no：27，seq id no：29，seq id no：31，seq id no：33，seq id no：35或seq id no：37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含序列tqxdyldhpdvigwtregdxxhxxsglaxlmsdgpxgxkwmxvgknnagexwxditgnqtntvtinxdgxgqfxvxxgsxsiyxqx，其中x可以是任何氨基酸。
[0216]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含与seq id no：39具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列，其中具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含序列tqxdyldhpdvigwtregdxxhxxsglaxlmsdgpxgxkwmxvgknnagexwxditgnqtntvtinxdgxgqfxvxxgsxsiyxqx，其中x可以是任何氨基酸，优选地，其中所述多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸残基：根据seq id no：39的编号的402r，h；419s，g，d；420v，i；422，a，v；423n，d，g，k；428t，a；435g，r，e；437s，a；441n，e，d；444k，e；450v，i；452y，h，r；466k，r；469w，s；473h，q，r；475s，n；476g，e；479v，a；483v，i和485r，q，k；优选地选自根据seq id no：39的编号的402r；419d；420v；422a；423d；428a，t；435r；437s；441e；444k；450v；452y；466k；469w；473r；475s；476g；479v；483v和485q。
[0217]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含与seq id no：54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含序列tqxdyldhpdvigwtregdxxhxxsglaxlmsdgpxgxkwmxvgknnagexwxdi，tgnqtntvtinxdgxgqfxvxxgsxsiyxqx，其中x可以是任何氨基酸。
[0218]
优选地，本发明的淀粉酶包含至少一个如本文所述的氨基酸取代，并且包含与以下氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列：seq id no：54，seq id no：1，seq id no：3，seq id no：5，seq id no：7，seq id no：9，seq id no：11，seq id no：13，seq id no：15，seq id no：17，seq id no：19，seq id no：21，seq id no：23，seq id no：25，seq id no：27，seq id no：29，seq id no：31，seq id no：33，seq id no：35或seq id no：37，优选地，seq id no：54，seq id no：5，seq id no：11，seq id no：17或seq id no：27。
[0219]
优选地，本发明的淀粉酶包含至少一个如本文所述的氨基酸取代，并且包含与seq id no：54的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列，优选地，包含与seq id no：54的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。
[0220]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所进氨基酸序列与seq id no：54，seq id no：1，seq id no：3，seq id no：5，seq id no：7，seq id no：9，seq id no：11，seq id no：13，seq id no：15，seq id no：17，seq id no：19，
seq id no：21，seq id no：23，seq id no：25，seq id no：27，seq id no：29，seq id no：31，seq id no：33，seq id no：35或seq id no：37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽具有一个或多个选自以下的氨基酸残基：根据seq id no：39编号的402r，h；419s，g，d；420v，i；422，a，v；423n，d，g，k；428t，a；435g，r，e；437s，a；441n，e，d；444k，e；450v，i；452y，h，r；466k，r；469w，s；473h，q，r；475s，n；476g，e；479v，a；483v，i；和485r，q，k，优选地，选自435r，437a，441d和485k。
[0221]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no：39具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽具有一个或多个选自以下的氨基酸残基：根据seq id no：39的编号的402r，h；419s，g，d；420v，i；422，a，v；423n，d，g，k；428t，a；435g，r，e；437s，a；441n，e，d；444k，e；450v，i；452y，h，r；466k，r；469w，s；473h，q，r；475s，n；476g，e；479v，a；483v，i；和485r，q，k，优选地，选自根据seq id no：39的编号的402r；419d；420v；422a；423d；428a，t；435r；437s；441e；444k；450v；452y；466k；469w；473r；475s；476g；479v；483v和485q。
[0222]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no：54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽具有一个或多个选自以下的氨基酸残基：402r，h；419s，g，d；420v，i；422，a，v；423n，d，g，k；428t，a；435g，r，e；437s，a；441n，e，d；444k，e；450v，i；452y，h，r；466k，r；469w，s；473h，q，r；475s，n；476g，e；479v，a和485r，q，k，优选地，选自根据seq id no：39的编号的402r；419d；420v；422a；423d；428a，t；435r；437s；441e；444k；450v；452y；466k；469w；473r；475s；476g；479v；483v和485q，优选地，选自根据seq id no：39的编号的435r，437s，a，441e，d和485q，k。
[0223]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no：54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或所有选自以下的氨基酸残基：根据seq id no：39的编号的402r，h；419s，g，d；420v，i；422，a，v；423n，d，g，k；428t，a；435g，r，e；437s，a；441n，e，d；444k，e；450v，i；452y，h，r；466k，r；469w，s；473h，q，r；475s，n；476g，，e；479v，a；483v，i和485r，q，k，优选地，选自根据seq id no：39的编号的402r；419d；420v；422a；423d；428a，t；435r；437s；441e；444k；450v；452y；466k；469w；473r；475s；476g；479v；483v和485q。
[0224]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no：54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、
至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽具有根据seq id no：39的编号的氨基酸残基402r，h；419s，g，d；420v，i；422，a，v；423n，d，g，k；428t，a；435g，r，e；437s，a；441n，e，d；444k，e；450v，i；452y，h，r；466k，r；469w，s；473h，q，r；475s，n；476g，e；479v，a；483v，i和485r，q，k，优选地，选自根据seq id no：39的编号的402r；419d；420v；422a；423d；428a，t；435r；437s；441e；444k；450v；452y；466k；469w；473r；475s；476g；479v；483v和485q。
[0225]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no：54，seq id no：1，seq id no：3，seq id no：5，seq id no：7，seq id no：9，seq id no：11，seq id no：13，seq id no：15，seq id no：17，seq id no：19，seq id no：21，seq id no：23，seq id no：25，seq id no：27，seq id no：29，seq id no：31，seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在一个或多个选自根据seq id no：39的编号的430和454位置包含取代，优选地，所述淀粉酶包含氨基酸残基430m和/或430i，优选地，所述取代产生430m和/或454i，优选地，所述取代选自i430m和m454i。
[0226]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在一个或多个选自根据seq id no：39的编号的430和454位置包含取代，优选地，所述淀粉酶包含氨基酸残基430m和/或430i，优选地，所述取代产生430m和/或454i，优选地，所述取代选自i430m和m454i。
[0227]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在根据seq id no：39的编号的430和454位置包含取代，优选地，所述取代产生430m和/或454i，优选地，所述取代选自i430m和m454i。
[0228]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在根据seq id no：39的编号的430和454位置包含取代，优选地，所述取代产生430m和/或454i，优选地，所述取代选自i430m和m454i，其中所述具有α-淀粉酶活性的多肽对应于seq id no：39的编号的相应于位置181、182、183和184包含一个或多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181、182、183和184的两个或更多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181和182、182和183，或183和184的氨基酸的缺失(根据seq id no:39编号)。
[0229]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，
所述氨基酸序列与seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在一个或多个选自401,403,405,411,413,415,424,426,428,430,432,454,455,477,479和481的氨基酸位置(根据seq id no:39编号)包含如seq id no:39所示的氨基酸残基。
[0230]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在一个或多个选自401,403,405,411,413,415,424,426,428,430,432,454,455,477,479和481的氨基酸位置(根据seq id no:39编号)包含如seq id no:39所示的氨基酸残基。
[0231]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在选自401,403,405,411,413,415,424,426,428,430,432,454,455,477,479和481的氨基酸位置(根据seq id no:39编号)的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或所有氨基酸残基上包含如seq id no:39所示的氨基酸残基。
[0232]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在选自401,403,405,411,413,415,424,426,428,430,432,454,455,477,479和481的氨基酸位置(根据seq id no:39编号)的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或所有氨基酸残基上包含如seq id no:39所示的氨基酸残基。
[0233]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％
或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在一个或多个选自309,313,347,348,350,351,354,355,358,359,388,389,392和396的氨基酸位置(根据seq id no:39编号)包含如seq id no:40所示的氨基酸残基。
[0234]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在一个或多个选自309,313,347,348,350,351,354,355,358,359,388,389,392和396的氨基酸位置(根据seq id no:39编号)包含如seq id no:40所示的氨基酸残基。
[0235]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在选自309,313,347,348,350,351,354,355,358,359,388,389,392和396的氨基酸位置(根据seq id no:39编号)的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或所有氨基酸残基上包含如seq id no:40所示的氨基酸残基。
[0236]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽对应于seq id no:39的编号的相应于位置181、182、183和184包含一个或多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181、182、183和184的两个或更多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181和182、182和183，或183和184的氨基酸的缺失(根据seq id no:39编号)。
[0237]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽相应于位置182和183包含一个或多个氨基酸的缺失，优选地，相应于位置182和183包含两个氨基酸的缺失(根据seq id no:39的编号)。
[0238]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽对应于seq id no:39的编号的相应于位置181、182、183和184包含一个或多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181、182、183和184的两个或更多个氨基酸的缺失，优选地包含相应于位置181和182、182和183，或183和184的氨基酸的缺失(根据seq id no:39编号)。
[0239]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽相应于位置182和183包含一个或多个氨基酸的缺失，优选地，相应于位置182和183包含两个氨基酸的缺失(根据seq id no:39的编号)。
[0240]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽相应于位置182和183包含两个氨基酸的缺失(根据seq id no:39的编号)。
[0241]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在一个或多个选自9,130,195,206,244,202,179,181,186和190的位置(根据seq id no:39编号)包含取代，优选地，包含选自根据seq id no:39编号的m9l,e130v,n195f,i206l,s244q,m202l,k179l,r181e,g186e/n/q/s和e190p中的一个或多个取代。
[0242]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽根据seq id no：39的编号，在一个或多个选自9,130,195,206,244,202,179,181,186和190的位置包含取代，优选地，在一个或多个选自9,179,186,195和206的位置包含取代，更优选地，在一个或多个选自179,195和206的位置包含取代。优选地，一个或多个取代选自m9l,e130v,n195f,i206l,s244q,m202l,k179l,r181e,g186e/n/q/s和e190p，优选地，一个或多个取代选自m9l,k179l,g186e/n/q/s,n195f和i206l，更优选地，一个或多个取代选自k179l,g186e,n195f和i206l(根据seq id no:39编号)。
[0243]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，
所述氨基酸序列与seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在选自9,130,195,206,244,202,179,181,186和190的氨基酸残基位置(根据seq id no:39编号)的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或所有氨基酸残基位置上包含取代，优选地，包含选自根据seq id no：39的编号的m9l,e130v,n195f,i206l,s244q,m202l,k179l,r181e,g186e/n/q/s和e190p中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或所有氨基酸取代。
[0244]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽在选自9,130,195,206,244,202,179,181,186和190的氨基酸残基位置(根据seq id no:39编号)的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或所有氨基酸残基位置上包含取代，优选地，包含选自根据seq id no：39的编号的m9l,e130v,n195f,i206l,s244q,m202l,k179l,r181e,g186e/n/q/s和e190p中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个或所有氨基酸取代。
[0245]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽与seq id no:39或seq id no:40中所示的淀粉酶相比，包括增加的表达、活性、热稳定性、稳定性、洗衣性能、比活性、底物特异性、ph依赖的活性、ph依赖的稳定性、氧化稳定性、ca2 依赖性或其任意组合，优选地，与seq id no:39或seq id no:40所示的淀粉酶相比，所述淀粉酶具有增加的热稳定性。
[0246]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽与seq id no:39或seq id no:40中所示的淀粉酶相比，包括增加的表达、活性、热稳定性、稳定性、洗衣性能、比活性、底物特异性、ph依赖的活性、ph依赖的稳定性、氧化稳定性、ca2 依赖性或其任意组合，
优选地，与seq id no:39或seq id no:40所示的淀粉酶相比，所述淀粉酶具有增加的热稳定性。
[0247]
优选地，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽与seq id no:39或seq id no:40所示的淀粉酶相比，包括增加的热稳定性。
[0248]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no:44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
[0249]
优选地，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包含a和b结构域和c结构域，其中a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，并且c结构域的氨基酸序列与seq id no:44的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，其中，所述具有α-淀粉酶活性的分离的、合成的或重组的多肽包含与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
[0250]
本发明还涉及一种分离的、合成的或重组的核酸，其包含：
[0251]
(a)核酸序列，其与seq id no:55,seq id no:2,seq id no:4,seq id no:6,seq id no:8,seq id no:10,seq id no:12,seq id no:14,seq id no:16,seq id no:18,seq id no:20,seq id no:22,seq id no:24,seq id no:26,seq id no:28,seq id no:30,seq id no:32,seq id no:34,seq id no:36,或seq id no:38具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述核酸编码具有淀粉酶活性的多肽；
[0252]
(b)核酸序列，所述核酸序列编码与seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:
27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，其中所述多肽具有淀粉酶活性，或所述核酸序列编码本文所述的任何具有淀粉酶活性的多肽，优选地，具有α-淀粉酶活性的多肽包含a和b结构域和c结构域，其中所述a和b结构域的氨基酸序列与seq id no:42的氨基酸序列至少75％相同，并且所述c结构域的氨基酸序列与seq id no:44的氨基酸序列至少75％相同；
[0253]
(c)多核苷酸，所述多核苷酸在高严格条件下与以下序列的互补序列杂交：
[0254]
(i)seq id no:54,seq 1d no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37的编码序列；或者
[0255]
(ii)seq id no:55,seq id no:2,seq id no:4,seq id no:6,seq id no:8,seq id no:10,seq id no:12,seq id no:14,seq id no:16,seq id no:18,seq id no:20,seq id no:22,seq id no:24,seq id no:26,seq id no:28,seq id no:30,seq id no:32,seq id no:34,seq id no:36或seq id no:38所示的多核苷酸；
[0256]
(d)(a)、(b)或(c)的片段，其中所述片段编码具有淀粉酶活性的多肽；或者
[0257]
(e)与(a)至(d)中任一项完全互补的核酸序列。
[0258]
优选地，分离的、合成的或重组的核酸包含：
[0259]
(a)核酸序列，其与seq id no:55,seq id no:2,seq id no:4,seq id no:6,seq id no:8,seq id no:10,seq id no:12,seq id no:14,seq id no:16,seq id no:18,seq id no:20,seq id no:22,seq id no:24,seq id no:26,seq id no:28,seq id no:30,seq id no:32,seq id no:34,seq id no:36或seq id no:38具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述核酸编码具有淀粉酶活性的多肽；
[0260]
(b)编码多肽的核酸序列，所述多肽与seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述多肽具有淀粉酶活性；
[0261]
(c)(a)或(b)的片段，其中所述片段编码具有淀粉酶活性的多肽；或者
[0262]
(d)与(a)至(d)中任一项完全互补的核酸序列。
[0263]
本文进一步优选的是分离的、合成的或重组的核酸，其包含(a)与seq id no:55,seq id no:2,seq id no:4,seq id no:6,seq id no:8,seq id no:10,seq id no:12,seq id no:14,seq id no:16,seq id no:18,seq id no:20,seq id no:22,seq id no:24,seq id no:26,seq id no:28,seq id no:30,seq id no:32,seq id no:34,seq id no:36或seq id no:38具有至少80％序列同一性的核酸序列，其中所述核酸编码具有淀粉酶活性的多肽；
[0264]
(b)编码多肽的核酸序列，所述多肽与seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少90％的序列同一性，其中所述多肽具有淀粉酶活性；
[0265]
(c)(a)或(b)的片段，其中所述片段编码具有淀粉酶活性的多肽；或者
[0266]
(d)与(a)至(c)中任一项完全互补的核酸序列。
[0267]
本文进一步优选的是分离的、合成的或重组的核酸，其包含(a)与seq id no:55具有至少90％序列同一性的核酸序列，其中所述核酸编码具有淀粉酶活性的多肽；
[0268]
(b)编码与seq id no:54具有至少80％序列同一性的多肽的核酸序列，其中所述多肽具有淀粉酶活性；
[0269]
(c)(a)或(b)的片段，其中所述片段编码具有淀粉酶活性的多肽；或者
[0270]
(d)与(a)至(c)中任一项完全互补的核酸序列。
[0271]
优选地，分离的、合成的或重组的核酸包含：
[0272]
(a)核酸序列，其与seq id no:55,seq id no:2,seq id no:4,seq id no:6,seq id no:8,seq id no:10,seq id no:12,seq id no:14,seq id no:16,seq id no:18,seq id no:20,seq id no:22,seq id no:24,seq id no:26,seq id no:28,seq id no:30,seq id no:32,seq id no:34,seq id no:36或seq id no:38具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述核酸编码具有淀粉酶活性的多肽；
[0273]
(b)编码多肽的核酸序列，所述多肽与seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述多肽具有淀粉酶活性。
[0274]
优选地，分离的、合成的或重组的核酸包含：
[0275]
(a)核酸序列，其与seq id no:55具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述核酸编码具有淀粉酶活性的多肽；
[0276]
(b)编码多肽的核酸序列，所述多肽与seq id no:54具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中所述多肽具有淀粉酶活性。
[0277]
本文进一步优选的是包含氨基酸序列的淀粉酶，所述氨基酸序列与以下序列的全长氨基酸序列至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同：seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37。
[0278]
本文进一步优选的是具有淀粉酶活性的多肽(即，淀粉酶)，其包含与seq id no：54的全长氨基酸序列至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
[0279]
本文进一步优选的是包含氨基酸序列的淀粉酶，所述氨基酸序列与以下序列的全长氨基酸序列至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同：seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37。
[0280]
本文进一步优选的是包含氨基酸序列的淀粉酶，所述氨基酸序列与以下序列的全长氨基酸序列至少99或100％相同：seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37。
[0281]
本文进一步优选的是包含氨基酸序列的淀粉酶，所述氨基酸序列与以下序列的全长氨基酸序列至少99.5％相同：seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37。
[0282]
本文进一步优选的是包含氨基酸序列的淀粉酶，所述氨基酸序列与以下序列的全长氨基酸序列100％相同：seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37。
[0283]
本文进一步优选的是包含氨基酸序列的淀粉酶，所述氨基酸序列与以下序列的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同：seq id no:54,seq id no:52,seq id no:53,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37。
[0284]
本文进一步优选的是包含氨基酸序列的淀粉酶，所述氨基酸序列与seq id no：54的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同。
[0285]
本文进一步优选的是包含氨基酸序列的淀粉酶，所述氨基酸序列与seq id no：54的全长氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少
id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no：37，其中所述淀粉酶具有增加的热稳定性。
[0292]
本文进一步优选的是包含氨基酸序列的淀粉酶，所述氨基酸序列与seq id no:54的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同，其中所述淀粉酶具有增加的热稳定性。
[0293]
本文进一步优选的是包含氨基酸序列的淀粉酶，所述氨基酸序列与以下序列的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同：seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37，其中在70摄氏度至100摄氏度温度下的热挑战之后热稳定性增加，优选地，其中在70摄氏度至90摄氏度温度下的热挑战之后热稳定性增加，更优选地，在75摄氏度至85摄氏度下的热挑战之后热稳定性增加，最优选地，在80摄氏度下的热挑战之后热稳定性增加。
[0294]
本文进一步优选的是包含氨基酸序列的淀粉酶，所述氨基酸序列与seq id no:54的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同，其中在70摄氏度至100摄氏度温度下的热挑战之后热稳定性增加，优选地，其中在70摄氏度至90摄氏度温度下的热挑战之后热稳定性增加，更优选地，在75摄氏度至85摄氏度下的热挑战之后热稳定性增加，最优选地，在80摄氏度下的热挑战之后热稳定性增加。
[0295]
本文进一步优选的是包含氨基酸序列的淀粉酶，所述氨基酸序列与seq id no:54的全长氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同，其中所述淀粉酶包括在80摄氏度下的热挑战之后的热稳定性增加。
[0296]
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含本文所述的多肽。组合物可包含多肽与另一酶的组合。酶的组合可以是相同类别，例如包含第一淀粉酶和第二淀粉酶的组合物。酶的组合可以来自不同类别的酶，例如包含脂酶和淀粉酶的组合物。酶的组合可以是包含至少一种本发明的淀粉酶和一种或多种第二酶的组合物。在一个实施方案中，组合物包含一种第二酶、两种第二酶、三种第二酶、四种第二酶或多于四种第二酶。在一个实施方案中，第二酶选自：第二淀粉酶、脂酶、蛋白酶、纤维素酶、漆酶、果胶酶和核酸酶，或其任何组合。
[0297]
一种包含淀粉酶的组合物，所述淀粉酶包含与以下序列的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、
至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含第二酶，所述第二酶选自：第二淀粉酶、脂酶、蛋白酶、纤维素酶、漆酶、甘露聚糖酶、果胶酶、木聚糖酶、核酸酶及其任何组合。在优选的实施方案中，组合物进一步包含第二酶，并且所述第二酶是不同的淀粉酶。在另一个优选的实施方案中，组合物还包含第二酶，并且所述第二酶是蛋白酶。
[0298]
优选地，一种包含淀粉酶的组合物，所述淀粉酶包含与seq id no:54的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含第二酶，所述第二酶选自：第二淀粉酶、脂酶、蛋白酶、纤维素酶、漆酶、甘露聚糖酶、果胶酶、木聚糖酶、核酸酶及其任何组合。在优选的实施方案中，组合物进一步包含第二酶，并且所述第二酶是不同的淀粉酶。在另一个优选的实施方案中，组合物还包含第二酶，并且所述第二酶是蛋白酶。
[0299]
适用于本发明的杂合体或组合物的另外的酶在下文进一步描述。在一个实施方案中，合适的酶包括具有酶活性的酶变体，当与如下公开的亲本酶的全长多肽序列相比时，所述酶变体至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
[0300]
淀粉酶
[0301]
α-淀粉酶(ec3.2.1.1)酶可以对含有三个或更多个(1-》4)-α-连接的d-葡萄糖单元的多糖中的(1-》4)-α-d-糖苷键进行内水解。淀粉酶以随机方式作用于淀粉、糖原及相关的多糖和寡糖；还原基团以α-构型释放。淀粉酶的其他示例包括：β-淀粉酶(e.c.3.2.1.2),葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(e.c.3.2.1.60)、异淀粉酶(e.c.3.2.1.68)、葡聚糖1,4-α-麦芽六糖苷酶(e.c.3.2.1.98)和葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(e.c.3.2.1.133)。
[0302]
下文描述的淀粉酶可用作亲本淀粉酶以通过引入如本文所述的一个或多个氨基酸取代和/或缺失来产生变体淀粉酶。
[0303]
许多淀粉酶已在专利和公开的专利申请中描述了，包括但不限于：wo2002/068589、wo2002/068597、wo2003/083054、wo2004/091544和wo2008/080093。
[0304]
如wo95/10603中所述，已知淀粉酶源自具有seq id no：2的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)。合适的变体是与如wo95/10603中所述的seq id no：2至少90％相同的那些变体、和/或在以下位置包含一个或多个取代的那些变体：15,23,105,106,124,128,133,154,156,178,179,181,188,190,197,201,202,207,208,209,211,243,264,304,305,391,408和444，其具有淀粉酶活性。此类变体描述在wo94/02597、wo94/018314、wo97/043424和wo99/019467的seq id no：4中。
[0305]
已知淀粉酶源自如wo02/10355中所述的具有seq id no：6的嗜热脂肪芽孢杆菌
(b.stearothermophilus)或与其至少90％相同的淀粉酶，其具有淀粉分解活性并且任选地具有在野生型序列上的c-末端截短。seq id no:6的合适变体包括与其至少90％相同和/或进一步包含在位置181和/或182的缺失和/或在位置193的取代的那些变体。
[0306]
已知淀粉酶源自如wo99/19467中公开的具有seq id no：6的芽孢杆菌属物种(bacillus sp.)707或与其至少90％相同的淀粉酶，并且其具有淀粉分解活性。
[0307]
已知淀粉酶来自如wo96/23872中描述的具有seq id no:2或seq id no:7的盐敏芽孢杆菌(bacillus halmapalus)(也描述为sp-722)，或者与这些序列之一至少90％相同的淀粉酶，并且其具有淀粉分解活性。
[0308]
已知淀粉酶源自如wo00/22103中公开的具有seq id no：4的芽孢杆菌属物种(bacillus sp.)dsm 12649或与其至少90％相同的淀粉酶，并且其具有淀粉分解活性。
[0309]
已知淀粉酶来自如wo2009/061380中公开的具有seq id no：2的芽孢杆菌属菌株ts-23或与其至少90％相同的淀粉酶，并且其具有淀粉分解活性。
[0310]
已知淀粉酶来自如wo2013/184577中公开的具有seq id no：1的噬细胞菌属物种(cytophaga sp.)或与其至少90％相同的淀粉酶，并且其具有淀粉分解活性。
[0311]
已知淀粉酶来自如wo2010/104675中公开的具有seq id no：1的巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)dsm 90或与其至少90％相同的淀粉酶，并且其具有淀粉分解活性。
[0312]
已知淀粉酶具有如wo00/60060中所述seq id no:2的氨基酸1至485或包含与seq id no:2的氨基酸1至485至少96％相同的氨基酸序列的淀粉酶，并且其具有淀粉分解活性。
[0313]
已知淀粉酶具有如wo2006/002643中所述seq id no:12或是与其具有至少80％同一性的淀粉酶，并且其具有淀粉分解活性。合适的淀粉酶包括与seq id no:12相比具有至少80％同一性和/或在位置y295f和m202litv包含取代的那些，并且其具有淀粉分解活性。
[0314]
已知淀粉酶具有如wo2011/098531中所述seq id no:6或是与其具有至少80％同一性的淀粉酶，并且其具有淀粉分解活性。合适的淀粉酶包括与seq id no:6相比具有至少80％同一性和/或在一个或多个选自以下的位置包含取代的那些：193[g,a,s,t或m],195[f,w,y,l,i或v],197[f,w,y,l,i或v],198[q或n],200[f,w,y,l,i或v],203[f,w,y,l,i或v],206[f,w,y,n,l,i,v,h,q,d或e],210[f,w,y,l,i或v],212[f,w,y,l,i或v],213[g,a,s,t或m]和243[f,w,y,l,i或v]，并且其具有淀粉分解活性。
[0315]
已知淀粉酶具有如wo2013/001078中所述seq id no:1或是与其具有至少85％同一性的淀粉酶，并且其具有淀粉分解活性。合适的淀粉酶包括与seq id no:1相比具有至少85％同一性和/或在对应于以下位置中的两个或更多个(几个)位置处包含改变的那些g304,w140,w189,d134,e260,f262,w284,w347,w439,w469,g476和g477，并且其具有淀粉分解活性。
[0316]
已知淀粉酶具有如wo2013/001087中所述seq id no:2或是与其具有至少85％同一性的淀粉酶，并且其具有淀粉分解活性。合适的淀粉酶包括与seq id no:2相比具有至少85％同一性、和/或包含根据如wo2013/001087中所述seq id no:2编号的位置181 182、或182 183、或183 184的缺失的那些，并且其具有淀粉分解活性。合适的淀粉酶包括与seq id no:2相比具有至少85％同一性、和/或包含根据如wo2013/001087中所述seq id no:2编号的位置181 182、或182 183、或183 184的缺失的那些，其在对应于w140,w159,w167,q169,w189,e194,n260,f262,w284,f289,g304,g305,r320,w347,w439,w469,g476和g477的任何
位置中包含一个或两个或更多个修饰，并且其具有淀粉分解活性。
[0317]
淀粉酶还包括来自上述淀粉酶(例如如wo2006/066594中所述的)杂合α-淀粉酶。
[0318]
市售的淀粉酶包括：duramyl
tm
,termamyl
tm
,termamyl sc
tm
,termamyl ultra
tm
,fungamyl
tm
,stainzyme
tm
,stainzyme plus
tm
,natalase
tm
,liquozyme x,supramyl
tm amplify
tm
,amplify prime
tm
和ban
tm
(来自novozymes a/s)和rapidase
tm
,purastar
tm
,purastar oxam
tm powerasetm,effectenz
tm
(m100来自dupont),preferenz
tm
(s1000,s110和f1000；来自dupont),primagreen
tm
(all；dupont),optisize
tm
(dupont)和kam
tm
(kao)和kemzyme
tm
(biozym)。
[0319]
脂酶
[0320]“脂酶”、“脂解酶”、“脂质酯酶”均指ec类3.1.1的酶(“羧酸酯水解酶”)。脂酶(e.c.3.1.1.3，三酰基甘油脂酶)可以将甘油三酯水解成更亲水的甘油单酯和甘油二酯、游离脂肪酸和甘油。脂酶通常还包括对不同于甘油三酯的底物具有活性的酶，或裂解特定脂肪酸的酶，例如，磷脂酶a(e.c.3.1.1.4)、半乳糖脂酶(e.c.3.1.1.26)、角质酶(ec 3.1.1.74)和具有甾醇酯酶活性的酶(ec 3.1.1.13)和/或具有蜡酯水解酶活性的酶(ec 3.1.1.50)。
[0321]
许多脂酶已在专利和公开的专利申请中描述了，包括但不限于：wo2000032758,wo2003/089620,wo2005/032496,wo2005/086900,wo200600976,wo2006/031699,wo2008/036863,wo2011/046812和wo2014059360。
[0322]
脂酶用于洗涤剂和清洁产品，以去除油脂、脂肪、油和乳渍。市售脂酶包括但不限于：lipolase
tm
,lipex
tm
,lipolex
tm
和lipoclean
tm
(novozymes a/s),lumafast(最初来自genencor)和lipomax(gist-brocades/现在为dsm)。
[0323]
确定脂解活性的方法在文献中是众所周知的(参见，例如gupta等人(2003),biotechnol.appl.biochem.37,第63-71页)。例如，脂酶活性可以通过底物对硝基苯基棕榈酸酯(pnp-棕榈酸酯，c：16)中的酯键水解来测量，其释放黄色的pnp，可在405nm处检测到。
[0324]
蛋白酶
[0325]
具有蛋白水解活性的酶称为“蛋白酶”或“肽酶”。蛋白酶是发挥“蛋白酶活性”或“蛋白水解活性”的活性蛋白质。
[0326]
蛋白酶是ec 3.4类的成员。蛋白酶包括氨肽酶(ec 3.4.11)、二肽酶(ec 3.4.13)、二肽基-肽酶和三肽基-肽酶(ec 3.4.14)、肽基-二肽酶(ec 3.4.15)、丝氨酸型羧肽酶(ec3.4.16)、金属羧肽酶(ec 3.4.17)、半胱氨酸型羧肽酶(ec 3.4.18)、omega肽酶(ec 3.4.19)、丝氨酸内肽酶(ec 3.4.21)、半胱氨酸内肽酶ec 3.4.22)、天冬氨酸内肽酶(ec 3.4.23)、金属内肽酶(ec 3.4.24)、苏氨酸内肽酶(ec 3.4.25)、催化机制未知的内肽酶(ec 3.4.99)。
[0327]
市售蛋白酶包括但不限于：lavergy
tm pro(basf)；duralase
tm
,durazym
tm
,ultra,ultra,ultra,ultra,和
(novozymes a/s),以商品名a/s),以商品名prime,purafectpurafectpurafectpurafect
[0328]
和(danisco/dupont),axapem
tm
(gist-brocases n.v.)销售的那些蛋白酶，迟缓芽孢杆菌(bacillus lentus)碱性蛋白酶和来自kao的kap(嗜碱芽孢杆菌(bacillus alkalophilus)枯草杆菌蛋白酶)。
[0329]
至少一种蛋白酶可以选自丝氨酸蛋白酶(ec 3.4.21)。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶(ec 3.4.21)的特征在于在催化活性位点具有丝氨酸，其在催化反应期间与底物形成共价加合物。丝氨酸蛋白酶可以选自糜蛋白酶(例如，ec 3.4.21.1)、弹性蛋白酶(例如，ec 3.4.21.36)、弹性蛋白酶(例如，ec 3.4.21.37或ec 3.4.21.71)、颗粒酶(例如，ec 3.4.21.78或ec 3.4.21.79)、激肽释放酶(例如，ec 3.4.21.34、ec 3.4.21.35、ec 3.4.21.118或ec 3.4.21.119)、纤溶酶(例如，ec 3.4.21.7)、胰蛋白酶(例如,ec 3.4.21.4)、凝血酶(例如，ec 3.4.21.5)和枯草杆菌蛋白酶(也称为枯草杆菌肽酶，例如ec 3.4.21.62)，后者在下文中也称为“枯草杆菌蛋白酶”。
[0330]
纤维素酶
[0331]“纤维素酶”、“纤维素酶”或“纤维素分解酶”是参与纤维素水解的酶。已知三种主要类型的纤维素酶，即内切-ss-1,4-葡聚糖酶(内切-1,4-p-d-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，e.c.3.2.1.4；水解纤维素中的β-1,4-糖苷键)、纤维二糖水解酶(1,4-p-d-葡聚糖纤维二糖水解酶，ec 3.2.1.91)和ss-葡糖苷酶(ec 3.2.1.21)。
[0332]
纤维素酶已在专利和公开的专利申请中描述了，包括但不限于：wo1997/025417,wo1998/024799,wo2003/068910,wo2005/003319和wo2009020459。
[0333]
可商购的纤维素酶包括：celluzyme
tm
,endolase
tm
,carezyme
tm
,cellusoft
tm
,renozyme
tm
,celluclean
tm
(来自novozymes a/s),ecostone
tm
,biotouch
tm
,econase
tm
,ecopulp
tm
(来自ab enzymes finland),clazinase
tm
和puradax ha
tm
,genencor洗涤剂纤维素酶l,indiage
tm neutra(来自genencor international inc./dupont),revitalenz
tm
(2000来自dupont),primafast
tm
(dupont)和kac-500
tm
(来自kao corporation)。
[0334]
根据本发明的纤维素酶具有“纤维素分解活性”或“纤维素酶活性”。用于测量纤维素分解活性的分析是本领域技术人员已知的。例如，纤维素分解活性可以通过纤维素酶将羧甲基纤维素水解成还原性碳水化合物来确定，其还原能力通过根据hoffman,w.s.,j.biol.chem.120,51(1937)的铁氰化物反应的比色法测定。
[0335]
甘露聚糖酶
[0336]
甘露聚糖酶(e.c.3.2.1.78)水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中的内部β-1,4β-d-甘露糖苷键。“甘露聚糖酶”可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。甘露聚糖酶是洗涤和/或清洁制剂的有用组分，因为甘露聚糖酶去除部分含半纤维素的污渍。这些类型的污渍去除不充分可能例如导致织物泛灰。半纤维素的主要成分是异-1,4-d-木聚糖和异-1,4-β-甘露聚糖。甘露聚糖是具有β-1,4-连接的d-吡喃甘露糖残基的骨架的多糖，其可以包含半乳糖或乙酰基取代并且骨架中可能具有葡萄糖残基。已知甘露聚糖酶源自芽孢杆菌或
腐质霉菌属(humicola)的野生型，特别是源自黏琼脂芽孢杆菌(b.agaradhaerens)、地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)、嗜碱芽孢杆菌(b.halodurans)、克劳氏芽孢杆菌(b.clausii)、或特异腐质霉菌(h.insolens)。wo99/064619中描述了合适的甘露聚糖酶。
[0337]
市售的甘露聚糖酶包括：(novozymes ais)。
[0338]
果胶裂解酶
[0339]
果胶裂解酶(e.c.4.2.2.2)酶消除性裂解(1-》4)-α-d-聚半乳糖醛酸，得到在其非还原末端具有4-脱氧-α-d-galact-4-enuronosyl基的寡糖。
[0340]
果胶裂解酶已在专利和公开的专利申请中描述了，包括但不限于：wo2004/090099。已知果胶裂解酶源自芽孢杆菌，特别是源自地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)或黏琼脂芽孢杆菌(b.agaradhaerens)，或源自这些中的任一种的变体，例如,如us 6,124,127,wo 99/027083,wo 99/027084,wo 2002/006442,wo 2002/092741,wo 2003/095638中所述。
[0341]
市售的果胶裂解酶包括：xpect
tm
,pectawash
tm
和pectaway
tm
(novozymes a/s)；primagreen
tm
,ecoscour(dupont)。
[0342]
核酸酶
[0343]
核酸酶(ec 3.1.21.1)也称为脱氧核糖核酸酶i，或dnase，其进行内切核苷酸的裂解，形成5'-磷酸二核苷酸和5'-磷酸寡核苷酸终产物。
[0344]
核酸酶已在专利和公开的专利申请中描述了，包括但不限于：us3451935,gb1300596,de10304331,wo2015155350,wo2015155351,wo2015166075,wo2015181287和wo2015181286。
[0345]
在本发明的一方面，本发明的至少一种淀粉酶变体与至少一种蛋白酶组合提供。在一个实施方案中，本发明的淀粉酶变体在至少一种蛋白酶的存在下是稳定的。在一个实施方案中，当与各自的淀粉酶亲本相比时，本发明的淀粉酶变体具有增加的蛋白酶稳定性。在一个实施方案中，至少一种蛋白酶选自如wo89/06279的表i中序列a)所公开的枯草杆菌蛋白酶309，或与其至少80％相同并具有蛋白水解活性的其变体。在一个实施方案中，本发明的淀粉酶变体与根据seq id no:1的淀粉酶相比时，在所述枯草杆菌蛋白酶309或与其至少80％相同的变体存在下具有增加的蛋白酶稳定性。
[0346]
蛋白酶本身可以被蛋白酶稳定剂稳定，或者蛋白酶可以是非稳定的。在一个实施方案中，本发明的淀粉酶变体与根据seq id no:1的淀粉酶相比时，在非稳定的枯草杆菌蛋白酶309或与其至少80％相同的其非稳定的变体存在下具有增加的蛋白酶稳定性。
[0347]
制备方法：
[0348]
在另一个实施方案中，本发明涉及一种制备如本文所述的变体多肽的方法，其包括：提供编码本文所述多肽的核酸序列，将所述核酸序列转化到宿主细胞中，培养宿主细胞以产生变体多肽，以及任选地从宿主细胞中纯化变体多肽。
[0349]
可以“表达”编码多肽的多核苷酸。术语“表达”或“基因表达”是指一种特定基因或多种特定基因或特定核酸构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”是指将一个基因或多个基因或基因构建体转录成结构rna(例如，rrna、trna)或mrna，随后将后者翻译成蛋白质或不翻译成蛋白质。该过程包括dna转录和所得mrna产物的加工。
[0350]
酶的工业生产通常是通过使用表达系统来完成的。“表达系统”可以指宿主微生物、表达宿主、宿主细胞、生产生物体或生产菌株，并且这些术语中的每一个都可以互换使
用。在一个实施方案中，表达宿主选自：细菌表达系统、酵母表达系统、真菌表达系统和合成表达系统。表达宿主可以是野生型细胞或重组细胞。“野生型细胞”在本文中是指经过某种修饰之前的细胞。术语“重组细胞”(本文中也称为“基因修饰细胞”)是指经过基因改造、修饰或工程化的细胞，使得与衍生其的野生型细胞相比，其表现出改变、修饰或不同的基因型。“重组细胞”可包含编码某种蛋白质或酶的外源多核苷酸，因此可表达所述蛋白质或酶。
[0351]
因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含编码如本文所述的淀粉酶的多核苷酸的遗传构建体。
[0352]
在一个实施方案中，本发明涉及包含编码如本文所述的淀粉酶的多核苷酸的表达载体。
[0353]
在一个实施方案中，本发明涉及包含编码如本文所述的淀粉酶的多核苷酸的宿主细胞。
[0354]
在又一个实施方案中，本发明涉及一种表达多核苷酸的方法，其包括以下步骤：
[0355]
(a)通过将包含编码如本文所述的淀粉酶的多核苷酸的核酸构建体引入宿主细胞，提供包含具有编码如本文所述的淀粉酶的多核苷酸的异源核酸构建体的宿主细胞；
[0356]
(b)在有利于多核苷酸表达的条件下培养步骤(a)的重组宿主细胞；和
[0357]
(c)任选地，回收由多核苷酸编码的感兴趣的蛋白质。
[0358]
表达系统的示例包括但不限于：黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)、多形汉逊(hansenula polymorpha)、细毛嗜热霉(thermomyces lanuginosus)、尖镰孢(fusarium oxysporum)、异孢镰孢(fusarium heterosporum)、大肠杆菌(escherichia coli)、芽孢杆菌(bacillus)优选短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、或地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、假单胞菌属(pseudomonas)，优选荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、毕赤酵母(pichia pastoris)(又称komagataella phaffii)、嗜热菌丝菌(myceliopthora thermophile，c1)、嗜热嗜热菌(themothelomyces thermophila)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、木霉属(trichoderma)，优选里氏木霉(trichoderma reesei)和酵母菌(saccharomyces)，优选酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。可以使用上面列出的表达系统产生变体多肽。
[0359]
在一个实施方案中，细菌表达系统选自大肠杆菌(e.coli)、芽孢杆菌属(bacillus)、假单胞菌属(pseudomonas)和链霉菌属(streptomyces)。在一个实施方案中，酵母表达系统选自假丝酵母菌属(candida)、毕赤酵母属(pichia)、酵母菌属(saccharomyces)和/或裂殖酵母属(schizosaccharomyces)。在一个实施方案中，真菌表达系统选自青霉属(penicillium)、曲霉属(aspergillus)、镰孢属(fusarium)、菌丝属(myceliopthora)、毛霉属(rhizomucor)、根霉属(rhizopus)、嗜热属(thermomyces)和木霉属(trichoderma)。
[0360]
在多核苷酸和多肽的上下文中，术语“异源的”(或外源的或外源的或重组的)在本文中定义为：
[0361]
(a)不是宿主细胞固有的；
[0362]
(b)是宿主细胞固有的，但由于通过重组dna技术对宿主细胞的dna进行操作以包括结构修饰，例如缺失、取代和/或插入，而改变了固有序列；或者
[0363]
(c)是宿主细胞固有的，但由于通过重组dna技术(例如，更强的启动子)对宿主细胞的dna进行操作，使得表达在数量上发生改变，或者从不同于固有宿主细胞的基因组位置定向表达。
[0364]
对于两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列，术语“异源的”用于表征两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列不是以彼此的特定组合天然存在的。
[0365]
如本文所用，“遗传构建体”或“表达盒”是由可操作地连接至如本文所述的一种或多种控制序列(至少连接至启动子)的至少一种待表达的感兴趣序列组成的dna分子。通常，表达盒包含三个元件：启动子序列、开放阅读框和3'非翻译区，在真核生物中，该区通常包含聚腺苷酸化位点。其他调控元件可以包括转录增强子和翻译增强子。也可以将内含子序列添加到5'非翻译区(utr)或编码序列中，以增加细胞质中积累的成熟信息的量。表达盒可以是载体的一部分或可以整合到宿主细胞的基因组中，并与其宿主细胞的基因组一起复制。表达盒通常能够增加或减少表达。
[0366]
如本文所用，术语“载体”包括适合携带外源多核苷酸序列以转移至另一细胞、或在给定细胞内稳定或瞬时表达的任何种类的构建体。本文所用的术语“载体”包括任何种类的克隆载体，例如但不限于质粒、噬菌粒、病毒载体(例如噬菌体)、细菌噬菌体、杆状病毒、粘粒、fosmids、人工染色体、或和用于感兴趣的特定宿主的任何其他载体。还包括低拷贝数或高拷贝数载体。外源多核苷酸序列通常包含编码序列，其在本文中可称为“感兴趣的基因”。取决于宿主细胞的来源种类或目的，感兴趣的基因可以包含内含子和外显子。
[0367]
如本文所用的载体可在转化到宿主细胞或宿主细胞细胞器中后，提供用于外源多核苷酸的转录和翻译的区段。此类额外的区段可包括调节性核苷酸序列、一个或多个复制起点(在特定细胞类型中其维持和/或复制所需要的)、一个或多个选择性标记物、聚腺苷酸化信号、用于插入外源编码序列的合适位点，例如多克隆位点等。一个示例是当需要载体作为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)维持在细菌细胞中时。合适的复制起点的非限制性示例包括f1-ori和cole1。
[0368]
载体可以复制，但不整合到宿主细胞的基因组中，例如在细菌宿主细胞中作为质粒，或者载体可以将其部分或全部dna整合到宿主细胞的基因组中，从而导致其dna复制和表达。
[0369]
可以通过克隆的方式将外源核酸引入载体。克隆可以是指通过合适的方式和方法(例如，限制酶)切割载体(例如在多克隆位点内)和外源多核苷酸，可以在各个核酸内产生合适的结构，使得所述外源核酸和载体能够受控融合。
[0370]
一旦被引入载体，包含编码序列的外源核酸可以适当地被引入(转化、转导、转染等)到宿主细胞或宿主细胞细胞器中。可选择在宿主细胞或宿主细胞细胞器中适合表达外源多核苷酸序列的克隆载体。
[0371]
如本文所指，术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移到宿主细胞中，而不管用于转移的方法如何。即，如本文所用的术语“转化”不依赖于载体、穿梭系统或宿主细胞，并且其不仅涉及本领域已知的多核苷酸转移的转化方法(例如，sambrook,j.等人(1989)molecular cloning:a laboratory manual,第2版，cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny)，其还包括任何其他种类的多核苷酸转移的
方法，例如但不限于转导或转染。能够进行后续克隆繁殖的植物组织，无论是通过器官发生还是胚胎发生，都可以用遗传构建体转化并从中再生出完整的植物。选择的特定组织将根据克隆繁殖系统而变化，所述克隆繁殖系统可用于并最适合被转化的特定物种。
[0372]
在本发明的一个实施方案中，载体用于宿主细胞的转化。
[0373]
多核苷酸可以被瞬时或稳定地引入宿主细胞中，并且可以作为非整合的，例如质粒维持。“稳定转化”可以指转化的细胞或细胞器将包含外源编码序列的核酸传递给下一代细胞或细胞器。通常稳定转化是由于包含外源编码序列的核酸整合到染色体中或作为附加体(核dna的单独碎片)。
[0374]“瞬时转化”可能意味着细胞或细胞器一旦转化，在一定时间内表达外源核酸序列——大多数在一代之内。通常瞬时转化是由于包含外源核酸序列的核酸没有整合到染色体中或没有作为附加体。
[0375]
可选择地，其可以整合到宿主基因组中。然后，可以以本领域技术人员已知的方式使用所得的转化植物细胞，再生转化植物。
[0376]
与相应的野生型细胞相比，重组细胞可表现出“增加”或“减少”的表达。
[0377]
如本文所用，术语“增加的表达”、“增强的表达”或“过度表达”是指除了原始野生型表达水平(其可以是不存在表达或不可测量的表达)之外的任何表达形式。本文提及的“增加的表达”、“增强的表达”或“过度表达”被认为是指相对于对照生物体的基因表达的增加，和/或就多肽而言，是指增加的多肽水平和/或增加的多肽活性。增加的表达可以按优先顺序，与对照生物体相比增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或100％或甚至更多。
[0378]
增加基因或基因产物表达的方法在本领域中有详细记载，包括，例如，由适当启动子、转录增强子或翻译增强子的使用驱动的过度表达。用作启动子或增强子元件的分离的核酸可以被引入到非异源形式的多核苷酸的适当位置(通常是上游)，以增加编码感兴趣多肽的核酸的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代在体内改变内源性启动子(参见，kmiec等人，us 5,565,350；zarling等人，wo 93/22443)，或者可以将分离的启动子以适当的方向和与本发明基因的适当距离引入生物体中，以控制该基因的表达。
[0379]
也可以将内含子序列添加到5'非翻译区(utr)或部分编码序列的编码序列中，以增加细胞质中积累的成熟信息的量。已证明在表达构建体的转录单元中包含可剪接的内含子，使得基因表达在mrna和蛋白质水平上增加高达1000倍(buchman和berg(1988)mol.cell biol.8:4395-4405；callis等人(1987)genes dev 1:1183-1200)。当放置在转录单位的5'末端附近时，这种内含子增强的基因表达通常是最大的。
[0380]
为了获得增加的多肽表达或过度表达，最常见的是在有义方向上过度表达编码该多肽的核酸与聚腺苷酸化信号。除了适合以预期的表达模式驱动表达的启动子之外，还可以使用内含子或其他增强元件。
[0381]
酶通常通过使用表达所需酶的重组细胞在适合于表达所需酶的条件下培养而商业化生产。
[0382]
通常在允许重组细胞生长的合适营养培养基中进行培养(这个过程可以称为发酵)，并表达所需的蛋白质。在发酵结束时，收集发酵液并可进一步加工，其中发酵液包含液体部分和固体部分。
[0383]
可以从发酵液中进一步纯化感兴趣的酶。术语“纯化”或“纯化”是指其中至少一种组分(例如感兴趣的蛋白质)与至少另一种组分(例如发酵液的颗粒物质)分离并转移到不同的隔室或相中的过程，其中不同的隔室或相不一定需要由物理屏障隔开。这种不同隔室的示例是由过滤膜或过滤布隔开的两个隔室，即滤液和截留物；这种不同相的示例分别是颗粒和上清液或滤饼和滤液。从发酵液中纯化感兴趣的酶后得到的溶液在本文中称为“纯化的酶溶液”。
[0384]
所需的酶可以从宿主细胞分泌(进入发酵液的液体部分)或可以不分泌(因此包含在发酵液的细胞中)。根据这一点，可以从发酵液的液体部分或从细胞裂解物中回收所需的酶。所需酶的回收使用本领域技术人员已知的方法。从发酵液中回收蛋白质或酶的合适方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取和沉淀。如果感兴趣的酶在发酵液中沉淀或结晶或至少部分与发酵液的颗粒物质结合，则可能需要额外的处理步骤以从生物质中释放酶或溶解酶晶体和沉淀物。us6316240b1描述了一种用于从发酵液中回收酶的方法，该酶在发酵期间沉淀和/或结晶。如果所需的酶包含在发酵液的细胞中，则可能需要从细胞中释放酶。例如，但不限于，使用本领域技术人员公知的技术、通过细胞裂解可以实现从细胞中的释放。
[0385]
可以进一步加工纯化的酶溶液以形成“酶制剂”。“酶制剂”是指包含少量成分的任何非复合制剂，其中所述成分用于稳定酶制剂中包含的酶和/或稳定酶制剂本身的目的。术语“酶稳定性”涉及在储存或操作期间作为时间函数的酶活性的保留。术语“酶制剂稳定性”涉及在储存或操作期间保持酶制剂的物理外观以及在储存或操作期间避免微生物污染。
[0386]“酶制剂”是意在配制成复合制剂的组合物，其本身可以确定最终用途。根据本发明的“酶制剂”不是包含多种成分的复合制剂，其中将所述成分配制成复合制剂以在最终应用中各自发挥特定作用。复合制剂可以是但不限于洗涤剂制剂，其中以对洗涤剂制剂的洗涤性能有效的量配制各个洗涤剂成分。
[0387]
在本发明的一方面，至少一种本发明的淀粉酶变体包含在酶制剂中。
[0388]
酶制剂可以是固体或液体。可以通过使用本领域已知的技术获得酶制剂。例如，但不限于，可以通过挤出或造粒获得固体酶制剂。合适的挤出和造粒技术是本领域已知的并且例如描述在wo9419444a1和wo9743482a1中。
[0389]
在酶制剂的上下文中，“液体”与在20℃和101.3kpa下的物理外观相关。
[0390]
液体酶制剂可包含0.1重量％至40重量％、或0.5重量％至30重量％、或1重量％至25重量％、或3重量％至10重量％范围内的酶量，所有这些都相对于酶制剂的总重量。
[0391]
液体酶制剂可包含多于一种类型的酶。在一个实施方案中，酶制剂包含一种或多种根据本发明的淀粉酶。在一个实施方案中，酶制剂包含一种或多种根据本发明的淀粉酶和至少一种选自以下的另外的酶：第二淀粉酶、脂酶、蛋白酶、纤维素酶、漆酶、果胶酶、核酸酶及其任意组合。
[0392]
本发明的水性酶制剂可包含水，所述水的量大于约50重量％、大于约60重量％、大于约70重量％或大于约80重量％，所有这些都相对于酶制剂的总重量。
[0393]
本发明的液体酶制剂可包含残余组分，例如源自发酵培养基的盐、源自生产宿主细胞的细胞碎片、发酵期间生产宿主细胞产生的代谢物。
[0394]
在一个实施方案中，液体酶制剂中包含的残余组分的量可以小于30重量％、小于20重量％、小于10重量％或小于5重量％，所有这些都相对于水性酶制剂的总重量。在一个
实施方案中，酶制剂，特别是液体酶制剂，除了一种或多种酶之外，还包含一种或多种选自溶剂、盐、ph调节剂、防腐剂、稳定剂、螯合剂和增稠剂的额外化合物。液体酶制剂中的防腐剂可以是山梨醇、苯甲酸酯、proxel或其任何组合。液体酶制剂中的稳定剂可以是mpg、甘油、醋酸盐或其任何组合。液体酶制剂中的螯合剂可以是柠檬酸盐。
[0395]
在一个实施方案中，酶制剂包含至少一种本发明的多肽变体和至少一种防腐剂。合适的防腐剂的非限制性示例包括(季)铵化合物、异噻唑啉酮、有机酸和甲醛释放剂。合适的(季)铵化合物的非限制性示例包括苯扎氯铵、聚六亚甲基双胍(phmb)、二癸基二甲基氯化铵(ddac)和n-(3-氨基丙基)-n-十二烷基丙烷-1,3-二胺(diamine)。合适的异噻唑啉酮的非限制性示例包括1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(bit)、2-甲基-2h-异噻唑-3-酮(mit)、5-氯-2-甲基-2h-异噻唑-3-酮(cit)、2-辛基-2h-异噻唑-3-酮(oit)和2-丁基-苯并[d]异噻唑-3-酮(bbit)。合适的有机酸的非限制性示例包括苯甲酸、山梨酸、l-( )-乳酸、甲酸和水杨酸。合适的甲醛释放剂的非限制性示例包括n,n'-亚甲基双吗啉(mbm)、2,2',2
”‑
(六氢-1,3,5-三嗪-1,3,5-三基)三乙醇(hht)、(亚乙二氧基)二甲醇、α,α',α
”‑
三甲基-1,3,5-三嗪-1,3,5(2h,4h,6h)-三乙醇(hpt)、3,3'-亚甲基双[5-甲基恶唑烷](mbo)和顺式-1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-偶氮金刚烷氯化物(ctac)。
[0396]
其他有用的防腐剂包括碘丙炔基丁基氨基甲酸酯(ipbc)、释放卤素的化合物，例如二氯-二甲基-乙内酰脲(dcdmh)、溴-氯-二甲基-乙内酰脲(bcdmh)和二溴-二甲基-乙内酰脲(dbdmh)；溴-硝基化合物，例如bronopol(2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇)、2,2-二溴-2-氰基乙酰胺(dbnpa)；醛类如戊二醛；苯氧乙醇；联苯-2-醇；和锌或吡硫鎓纳。
[0397]
在一个实施方案中，酶制剂包含至少一种本发明的多肽变体和至少一种酶稳定剂。酶稳定剂选自能够减少包含在液体酶制剂中的至少一种酶在储存期间酶活性的损失的物质。本发明中酶活性损失的减少可以是指与储存前的初始酶活性相比时，酶活性的损失减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。优选的稳定剂选自：盐(例如cacl2)、丙二醇、聚乙二醇、mpg、甘油、乙酸盐或其任何组合。
[0398]
酶应用
[0399]
在另一个实施方案中，如本文所述的多肽变体可用于食品中，例如酶可以是烘焙添加剂。酶可用于饲料中，例如酶是动物饲料添加剂。酶可用于淀粉加工业，例如淀粉酶用于将淀粉转化为乙醇或糖(高果糖玉米糖浆)和其他副产品，例如油、干酒糟等。在纸浆和纸加工中使用多肽变体，例如，酶可用于提高纸强度。酶可用于采矿和油井服务，例如纤维素酶可用于油井压裂过程中的瓜尔胶破碎。在一个实施方案中，如本文所述的多肽变体用于洗涤剂制剂或清洁制剂中。
[0400]
在一个实施方案中，本发明涉及一种制备面团或由所述面团制备的烘焙产品的方法，所述方法包括将如本文所述的具有淀粉酶活性的变体多肽之一添加到所述面团中并烘焙所述面团。在一个实施方案中，本发明涉及一种使用如本文所述的具有淀粉酶活性的变体多肽加工淀粉的方法。在一个实施方案中，本发明涉及一种使用如本文所述的具有淀粉酶活性的变体多肽清洁或洗涤纺织品、硬表面或餐具的方法。在一个实施方案中，本发明涉
及一种使用如本文所述的具有淀粉酶活性的变体多肽制备乙醇的方法。在一个实施方案中，本发明涉及一种使用如本文所述的具有淀粉酶活性的变体多肽加工纸浆或纸的方法。在一个实施方案中，本发明涉及一种使用如本文所述的具有淀粉酶活性的变体多肽饲养动物的方法。
[0401]
在一个实施方案中，本发明的淀粉酶用于洗涤剂制剂或清洁制剂中。
[0402]“洗涤剂制剂”或“清洁制剂”是指指定用于清洁污染材料的组合物。清洁包括洗衣(laundering)和硬表面清洁。根据本发明的污染材料包括纺织品和/或硬表面。
[0403]
术语“洗衣(laundering)”涉及家庭洗衣和工业洗衣，并且是指用含有本发明洗涤剂组合物的溶液处理纺织品的过程。洗衣过程可以通过使用技术设备来进行，例如，使用家用或工业洗衣机。或者，洗衣过程可以手工完成。
[0404]
术语“纺织品”是指任何纺织材料，包括纱线(由天然或合成纤维制成的用于针织或编织的线)、纱线中间体、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料以及由这些材料制成的织物(通过编织、针织或毡合纤维制成的纺织品)，例如服装(由纺织品制成的任何衣物)、布料和其他物品。
[0405]
术语“纤维”包括天然纤维、合成纤维及其混合物。天然纤维的示例是植物(例如亚麻、黄麻和棉)或动物来源的，包括蛋白质，如胶原蛋白、角蛋白和丝蛋白(例如丝、羊毛、安哥拉山羊毛、马海毛、开士米)。合成来源的纤维的示例是聚氨酯纤维，如或聚酯纤维，聚烯烃，如弹性纤维，或聚酰胺纤维，如尼龙。纤维可以是单纤维或纺织品的一部分，例如针织、织造或非织造的。
[0406]
术语“硬表面清洁”在本文中被定义为硬表面的清洁，其中硬表面可以包括家庭中的任何硬表面，例如地板、家具、墙壁、卫生陶瓷、玻璃、金属表面，包括刀叉餐具(cutlery)或餐具(dishes)。
[0407]
术语“餐具洗涤”是指所有形式的洗涤餐具，例如通过手动或自动餐具洗涤。餐具洗涤包括但不限于：清洁所有形式的陶器，如盘子、杯子、玻璃杯、碗，所有形式的刀叉餐具(cutlery)，例如勺子、刀、叉和服务用具以及陶瓷、塑料(如三聚氰胺)、金属、瓷器、玻璃和丙烯酸树脂。
[0408]
本发明的洗涤剂制剂包含一种或多种洗涤剂组分。根据所需的清洁应用和/或洗涤剂组合物的物理形式选择组分。
[0409]
术语“洗涤剂组分”在本文中定义为表示适用于洗涤剂组合物的任何类型的成分，例如表面活性剂、助洗剂、聚合物、漂白系统。确认其已知特性的本领域已知的任何一种或多种组分是根据本发明的合适的一种或多种洗涤剂组分。在一个实施方案中的洗涤剂组分是指，当以有效量存在时提供洗涤或清洁性能或有效帮助加工(在加工、储存和使用期间保持物理特性；例如流变改性剂、助水溶剂、干燥剂)的组分。
[0410]
通常，洗涤剂组合物是多于两种洗涤剂组分的复合制剂。
[0411]
洗涤剂组分在洗涤剂制剂的最终应用中可以具有多于一种的功能，因此在本文特定功能的上下文中提及的任何洗涤剂组分在洗涤剂制剂的最终应用中也可以具有另一种功能。特定洗涤剂组分在洗涤剂制剂的最终应用中的功能通常取决于其在洗涤剂制剂中的量，即洗涤剂组分的有效量。
[0412]
术语“有效量”包括提供有效去污和有效清洁条件(例如ph值、起泡量)的确定组分的量、有效提供光学益处(例如光学增白、染料转移抑制)的某些确定组分的量、以及有效帮助加工(在加工、储存和使用期间保持物理特性；例如流变改性剂、助水溶剂、干燥剂)的确定组分的量。
[0413]
在一个实施方案中，洗涤剂制剂是多于两种洗涤剂组分的制剂，其中至少一种组分有效去污，至少一种组分有效提供最佳清洁条件，并且至少一种组分有效保持洗涤剂的物理特性。
[0414]
在相关清洁条件下评估清洁性能。本文的术语“相关清洁条件”是指在洗衣机、自动洗碗机或手动清洁过程中实际使用的条件，特别是清洁温度、时间、清洁力学(mechanics)、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。
[0415]
各个洗涤剂组分和在洗涤剂组合物中的使用是本领域技术人员已知的。合适的洗涤剂组分尤其包括表面活性剂、助洗剂、聚合物、碱、漂白体系、荧光增白剂、抑泡剂和稳定剂、助水溶剂和腐蚀抑制剂。其他示例描述在，例如，“complete technology book on detergents with formulations(detergent cake,dishwashing detergents,liquid&paste detergents,enzyme detergents,cleaning powder&spray dried washing powder)”,engineers india research institute(eiri),第6版(2015)中。本领域技术人员的另一本参考书可以是“detergent formulations encyclopedia”,solverchem publications,2016。
[0416]
洗涤剂组分在洗涤剂制剂中的类型和/或量是不同的，这取决于所需的应用，例如洗涤白色纺织品、有色纺织品和羊毛。进一步地根据洗涤剂制剂的物理形式(液体、固体、凝胶、以小袋或作为片剂提供等)选择组分。进一步地根据地区习惯选择组分，例如选择用于洗衣制剂的组分，这些地区习惯本身与使用的洗涤温度、洗衣机的机械原理(垂直vs水平轴机器)、每个洗涤周期的耗水量等方面以及地理特征如水的平均硬度有关。
[0417]
例如：低洗涤剂浓度系统包括洗衣制剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。中等洗涤剂浓度系统包括洗衣制剂，其中在洗涤水中存在约800ppm至约2,000ppm的洗涤剂组分。高洗涤剂浓度系统包括洗衣制剂，其中在洗涤水中存在多于约2,000ppm的洗涤剂组分。
[0418]
对各个洗涤剂组分列举的数值范围提供了包含在洗涤剂组合物中的量。此类范围必须被理解为包括定义该范围的数字并且包括所定义范围内的每个整数。
[0419]
如果没有另外说明，“重量％”或“w/w％”指与总洗涤剂组合物有关。在这种情况下，“重量％”或“w/w％”如下计算：物质的浓度为该物质的重量除以组合物的总重量，再乘以100。
[0420]
本发明的洗涤剂制剂可包含一种或多种表面活性剂。“表面活性剂”(在本文中与“表面活性的试剂”同义使用)是指一种有机化学品，当添加到液体中时，其改变该液体在界面处的性质。根据其离子电荷，表面活性剂被称为非离子的、阴离子的、阳离子的或两性的。
[0421]
表面活性剂的非限制性示例公开于mccutcheon的2016detergents and emulsifiers，以及mccutcheon的2016functional materials，二者均为north american and international edition,mc publishing co,2016版。在本领域技术人员已知的相同出版物的较早版本中公开了更多有用的示例。
id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37；其中所述表达宿主选自芽孢杆菌属宿主细胞，优选地选自短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)，最优选地，选自地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)。
[0430]
本文优选的是制备淀粉酶的方法，所述淀粉酶包含与seq id no:54的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列，其中所述表达宿主选自芽孢杆菌属宿主细胞，优选地选自短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)，最优选地，选自地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)。
[0431]
本文优选地是第一淀粉酶的c结构域的使用方法，所述c结构域具有与seq id no:44的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列，其用于改善具有与seq id no：42的氨基酸序列具有至少75％同一性的a和b结构域的第二α淀粉酶的一种或多种选自以下的性质：稳定性、ph曲线、表达、活性、热稳定性、比活性、底物特异性、ph依赖的活性、ph依赖的稳定性、氧化稳定性、ca2 依赖性、洗衣性能、加工淀粉、清洁纺织品、清洁硬表面、清洁餐具、制造乙醇、加工纸浆或纸、和饲养动物，所述使用包括用第一α淀粉酶的c结构域替换第二α淀粉酶的c结构域。
[0432]
本文优选的是制备面团或由所述面团制备的烘焙产品的方法，所述方法包括向所述面团中添加淀粉酶并烘焙所述面团，所述淀粉酶包含与以下序列的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37。
[0433]
本文优选的是制备面团或由所述面团制备的烘焙产品的方法，所述方法包括向所述面团中添加淀粉酶并烘焙所述面团，所述淀粉酶包含与seq id no:54的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
[0434]
本文优选的是所述淀粉酶用于加工淀粉，用于清洁或洗涤纺织品、硬表面或餐具，用于制造乙醇，用于加工纸浆或纸，或用于饲养动物，优选地，用于清洁或洗涤纺织品、硬表面或餐具的使用方法，所述淀粉酶包含与以下序列的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、
至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37。
[0435]
本文优选的是所述淀粉酶用于加工淀粉，用于清洁或洗涤纺织品、硬表面或餐具，用于制造乙醇，用于加工纸浆或纸，或用于饲养动物的使用方法，所述淀粉酶包含与seq id no:54的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
[0436]
本文优选的是所述淀粉酶用于清洁或洗涤纺织品、硬表面或餐具的使用方法，所述淀粉酶包含与以下序列的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37。
[0437]
本文优选的是所述淀粉酶用于清洁或洗涤纺织品、硬表面或餐具的使用方法，所述淀粉酶包含与seq id no:54的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
[0438]
本文优选的是所述淀粉酶用于清洁或洗涤纺织品、硬表面或餐具的使用方法，所述淀粉酶包含与seq id no:54的全长氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
[0439]
本文优选的是所述淀粉酶用于清洁或洗涤纺织品的使用方法，所述淀粉酶包含与以下序列的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:54,seq id no:1,seq id no:3,seq id no:5,seq id no:7,seq id no:9,seq id no:11,seq id no:13,seq id no:15,seq id no:17,seq id no:19,seq id no:21,seq id no:23,seq id no:25,seq id no:27,seq id no:29,seq id no:31,seq id no:33,seq id no:35或seq id no:37。
[0440]
本文优选的是所述淀粉酶用于清洁或洗涤纺织品的使用方法，所述淀粉酶包含与seq id no:54的全长氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或
100％相同的氨基酸序列。
[0441]
本文优选的是所述淀粉酶用于清洁或洗涤纺织品的使用方法，所述淀粉酶包含与seq id no:54的全长氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
[0442]
实施例
[0443]
实施例1淀粉酶表达构建体的产生
[0444]
编码氨基酸序列的基因经过密码子优化以匹配枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的固有密码子丰度，并由外部的商业dna供应商物理合成。收到后，将这些基因通过基于限制性连接的标准方案克隆到革兰氏阳性表达载体中，该载体具有编码启动子的区域、分泌信号肽的区域和核糖体结合位点的区域，这些区域已知可在芽孢杆菌科生物体中提供表达(例如，驱动枯草芽孢杆菌amye基因表达的启动子、枯草芽孢杆菌ydjm酶的信号肽和共有shine-dalgarno序列)。该载体还包含基于抗生素的选择性标记物和复制起点。
[0445]
反应后，根据spizizen(anagnostopoulos,c.and spizizen,j.(1961).j.bacteriol.81,741-746的方法将质粒组装混合物转化到名称为bs#056的枯草芽孢杆菌py79ko-7s(bacillus genetic stock center,bgscid:1s145；zeigler d.r)衍生物中，其中整合有如wo2019016051中所述的枯草芽孢杆菌bs#053的dna-甲基转移酶基因。通过在补充有20μg/ml硫酸卡那霉素的lb琼脂平板上铺板，并在37摄氏度孵育过夜，选择成功的转化。过夜选择后，获得各个菌落，然后使所获得的菌落在含有20μg/ml硫酸卡那霉素的丰富培养基(例如，lb肉汤)中，在37摄氏度下以250rpm振荡过夜生长。第二天早上，通过离心沉淀细胞，并使用macherey-nagel nucleospin试剂盒通过碱裂解法分离质粒dna。然后可以将分离的dna转化到电感受态的地衣芽孢杆菌细胞中。
[0446]
电感受态的地衣芽孢杆菌细胞的制备和dna的转化基本上按照brigidi等人(brigidi,p.,mateuzzi,d.(1991).biotechnol.techniques 5,5)的描述进行，有以下修改：dna转化后，在选择性lb琼脂平板(20μg/ml硫酸卡那霉素)上铺板并在37摄氏度下孵育过夜后，细胞回收在1ml lbspg缓冲液中并在37℃下孵育60分钟(j.,1989,fems microbio.lett.,61:165-170)。
[0447]
实施例2：淀粉酶表达和蛋白质定量
[0448]
将表达菌株的单个菌落挑到96孔板(ge life sciences part 28403943)中的60μl丰富培养基(例如lb肉汤)中，所述培养基中补充有20μg/ml硫酸卡那霉素。培养物在37摄氏度下生长16小时，然后使用15μl培养物接种96孔板中的具有20μg/ml硫酸卡那霉素的600μl限定葡萄糖矿物质培养基。培养物在37摄氏度下生长48小时，然后通过离心沉淀细胞并去除残余培养液来收集上清液。通过labchip(lc)分析鉴定具有α-淀粉酶活性的变体多肽杂合体的表达水平(浓度，mg/ml)，并且对相应的表达质粒进行测序以进行验证。
[0449]
实施例3：红色淀粉和残余活性测定法
[0450]
使用如megazyme,“assay of alpha-amylase using red-starch”描述的红色淀粉方法并进行以下修改以测量含有α-淀粉酶活性的变体多肽的淀粉水解的量。在25℃下，使10μl在50mm hepes、ph8.0的缓冲液中制备的1.33％红色淀粉与在50mm hepes、ph8.0的缓冲液中稀释的10μl酶反应。10分钟后通过加入50l无水乙醇(200proof ethanol)终止反应。剧烈混合后，将反应在室温下平衡10分钟，然后以1,200xg离心10分钟。转移40μl反应
液，并在biotek读板器中在510nm处读取溶液吸光度。通过比较在热挑战之前和之后使用红色淀粉测定法测量的每种酶的活性来计算残余活性。在25℃下使用红色淀粉测定法测试之前，通过首先将样品加热至80摄氏度持续15分钟、在4摄氏度下冷却10分钟，然后在24摄氏度下保持5分钟，对在50mm hepes、ph8.0的缓冲液中稀释的酶进行热挑战。
[0451]
针对每个酶/温度对进行技术重复(25℃重复三次或n＝5)，在不同的日子进行两次独立的实验。对于残余活性图，“100％活性”的参考是所有温度下的最高活性测量值。80℃热挑战的结果如图1所示。很明显，用seq id no：40的c结构域替换seq id no：41的c结构域导致具有seq id no：54的淀粉酶(在位置430和454处具有额外的突变)大大提高了热稳定性。使用密切相关的c结构域(如与seq id no：40的c结构域密切相关)也产生比seq id no：41更稳定的杂合体，用seq id no：9获得的结果证明此点。
[0452]
实施例4：衣物洗涤应用中的酶性能(去污)
[0453]
测量了杂合淀粉酶对沾有淀粉的棉布(污渍类型empa161和cs28)(购自swissatest testmaterilien ag和cft(center for testmaterials b.v.))的洗涤性能。根据seq id no：39的淀粉酶用作作为杂合分子的其他淀粉酶的参考。seq id no:54是例如seq id no:42和seq id no:44的杂合体，其在位置183和184处包含双缺失，并且在位置430和454处进一步包含突变。所选择的其他淀粉酶(seq id no:5、seq id no:11、seq id no:17和seq id no:27)也是与seq id no:54相比具有显著改变的c结构域的杂合体。
[0454]
在加入3.3g/l洗涤剂es1(maranil dbs/lc las 5,5％w/w,edenor可可脂肪酸c12-c18可可脂肪酸2,4％w/w,lutensol ao7aeo 5,4％w/w,texapon n70faeo 5,4％w/w,1,2丙二醇6,0％w/w,乙醇2,0％w/w,koh2,2％w/w)以及3％柠檬酸钠，使得ph为8.0-8.5的2.5mm硬水(14
°
dh,deutsche)中，淀粉酶的剂量为0.05、0.1、0.2或0.4ppm。通过launder-o-meter(sds atlas)的方式在40℃下洗涤30分钟。除去洗涤液，然后用水漂洗织物3次。样品在室温下干燥过夜。通过使用分光光度计(elrephpo，datacolor的方式、使用洗涤污渍的数字图像分析测量洗涤性能；平均l*ab强度相对于不含淀粉酶的洗涤剂基础标准化；然后提供四个数据点(0.05、0.1、0.2或0.4ppm)的平均值。
[0455]
对测试污渍cs 28和empa 161的洗涤性能显示为dde，以显示淀粉酶的特异性作用(de amy-de洗涤剂基础)。
[0456]
[0457][0458]
如上表中提供的结果表明，与亲本酶seq id no:39相比，杂合淀粉酶具有改善的性能(去污)。
[0459]
实施例5：通过热挑战进行稳定性测试
[0460]
可以通过氨基酸序列的进一步变化来稳定本发明的杂合酶。这是通过将变体储存在升高的温度下并在一定时间后测量残余活性来测试的。
[0461]
因此，在0.1m hepes ph 8.0中将酶稀释至约20μg/ml，并使用pcr仪在92℃下挑战10分钟，然后在4℃下冷却。未受挑战的对照保持在4℃。为了测量残余活性，按照制造商的说明书(megazyme)，将受挑战的酶和对照在1％红色淀粉(在0.1m hepes ph 8.0和0.05％tween20中制备)中稀释10倍，并在室温下孵育10分钟。用两个体积的冰冷乙醇淬灭反应，孵育10分钟，然后离心。将上清液转移到新板中，并在510nm处读取吸光度。改善因子(if)计算为特定变体与亲本seq id no：54之间的比率。
[0462]
使用根据seq id no:39的编号，在seq id no:54中引入突变：
[0463][0464]
实施例6：杂合变体在液体衣物洗涤剂中的储存
[0465]
通过将变体储存在液体洗涤剂中并在一定时间后测量残余活性，还测试了氨基酸序列进一步改变下的本发明杂合酶的稳定性。
[0466]
将淀粉酶在包含1％具有r101e突变的迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶(blap)的es1-c洗涤剂溶液(maranil dbs/lc las 5,5％w/w,edenor c12-c18可可脂肪酸2,4％w/w,lutensol ao7aeo 5,5％w/w,texapon n70faeo5,5％w/w,1,2丙二醇6,0％w/w,乙醇2,0％w/w,koh 2,2％w/w和柠檬酸钠3％，ph 8)中孵育，并在37℃下储存7天来检测在液体衣物洗涤剂中的储存。在第0天和第7天取出样品并在50mm mops、ph7中稀释，然后在室温下使用infinity淀粉酶试剂进行分析。活性是405nm处的斜率，计算为5分钟内的5点maxv。通过将每种变体储存后的残余活性百分比除以seq id no：54储存后的残余活性百分比，计算相对于参考杂合淀粉酶seq id no：54的改善因子(if)。使用根据seq id no：39的编号，在seq id no：54中引入突变。
[0467] ifk179l3,23g186e7,42g186n5,76g186s6,45g186q6,89n195f4,92i206l4,22seq id no：541
[0468]
实施例7：杂合变体的微量洗涤测试
[0469]
通过氨基酸序列的微小改变，可以使本发明的杂合体在清洁性能方面更有效。这通过微量洗涤试验进行了测试。
[0470]
将3.3g/l es1_c(lutensit a-lbs las 5，5％w/w，edenor可可脂肪酸c12-c18可可脂肪酸2，4％w/w，lutensol ao7 aeo 5，5％w/w，texapon n70 faeo 5，5％w/w，1，2丙二醇6，0％w/w，乙醇2，0％w/w，koh 2，2％w/w和柠檬酸钠3％，ph 8)与2.78mm硬水(15.5
°
dh，deutsche)中的变体用于洗涤陈旧的玉米淀粉污渍(cs-126)，将0.02、0.05和0.1ppm的淀粉酶添加到洗涤液中，在室温下持续60分钟，然后在流水下漂洗5分钟，干燥并测量反射光强度，作为rgb值的平均值。给出特定变体性能与seq id no：54性能的比值，大于1的数字表示更高的性能。
[0471]
使用根据seq id no：39的编号，在seq id no：54中引入突变。
[0472]
突变0,02ppm0.1ppmk179l1,571,69g186e2,151,76n195f1,541,68i206l1,581,69seq id no:541,001,00
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