制备重组玻尿酸酶的方法与流程

1.本发明涉及制备玻尿酸酶ph20变体的方法，所述玻尿酸酶ph20变体包含一或多个氨基酸残基取代，并可选地包含于玻尿酸酶的某些n-末端和/或c-末端氨基酸残基的缺失，尤其是野生型或成熟的野生型ph20或是野生型或成熟的野生型ph20氨基酸序列。


背景技术：

2.玻尿酸酶(hyaluronidase)系降解存在于胞外基质的玻尿酸的酵素。玻尿酸酶水解玻尿酸从而降低胞外基质中玻尿酸黏度并增加对组织(皮肤)的渗透性(bookbinder et al.,2006)。玻尿酸酶已被用于提升由皮下注射(muchmore et al.,2012)或肌内注射(krantz et al.,2016)提供的体液的吸收，以及改善局部麻醉的扩散(clement et al.al.,2003)。以此种方式促进皮下给药的药物包含吗啡(thomas et al.,2009)、头孢克松(ceftriaxone)(harb et al.,2010)、胰岛素(muchmore et al.,2012)及免疫球蛋白(wasserman et al.,2014)。玻尿酸酶亦可用于改善由静脉注射或血肿扩散而渗入组织的药物或液体的分散。在玻尿酸酶之中，在中性ph下具有活性的重组人类ph20蛋白由halozyme therapeutics inc.开发，并以商标名“hylenex”销售(bookbinder et al.,2006)。
3.已报导重组人类ph20蛋白于酵母菌(p.pastoris)、ds-2昆虫细胞及动物细胞中表达。于昆虫细胞及酵母菌中产生的重组ph20蛋白在转译后修饰的过程中n-糖苷化模式方面不同于人类ph20，因此会影响其活性且带来在体内发生副作用的风险。
4.对于生物制药开发而言，产品同一性及长保存期限系提供制备灵活性的重要因素。在制备过程中，因酵素或自发降解及修饰所导致的尺寸及电荷的差异会出现各种类型的微异质性(microheterogeneity)。如去酰胺化(deamidation)及唾液酸化(sialylation)的各种化学及酵素修饰都会增加抗体中的净负电荷并减少pi值，从而形成酸性变体(harris rj et al.,2004)。此外，c-末端离氨酸裂解会造成净正电荷的缺失以及酸性变体的形成。碱性变体的形成可由c-末端离氨酸或甘氨酸去酰胺化、琥珀酰亚胺形成、氨基酸氧化或是唾液酸去除而造成，其中唾液酸去除会去除额外的正电荷或负电荷，两种类型的修饰都会增加pi值(harris rj et al.,2004)。
5.糖苷化(glycosylation)系细胞(真核生物)中蛋白质的转译后过程，并发生于内质网及高基氏体。糖苷化分为n-糖苷化及o-糖苷化，其依据所连接的官能基而不同。将如乳糖或岩藻糖的糖类连接于细胞中所产生的蛋白质过程被广泛称为“糖苷化”。当聚糖透过糖苷化连接于蛋白质时，蛋白质会进行“折叠”过程以形成三维结构。这赋予蛋白质稳定性，而使得其能长时间保持而不松开(展开)。聚糖系用以使细胞间能够沟通及信息交换的关键过程。
6.将聚糖添加至蛋白质有两种类型的反应：n-连接(n-linked)或o-连接(o-linked)糖苷化。这两种糖苷化过程在聚糖合成及添加机制上不同，其中，n-糖苷化的机制与角色较为人所知。透过n-糖苷化添加的聚糖称为“n-聚糖”，且形成于内质网中。存在于内质网膜的
多萜醇焦磷酸(dolichol pyrophosphate，pp-dol)上的一系列的天门冬酰氨酸连接糖苷化(asparagine-linked glycosylation，alg)酶添加有n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)、甘露糖(man)、葡萄糖(glc)等，最终合成glc3man9glcnac2-pp-dol，其为一种脂质连接寡糖(lipid-linked oligosaccharide，llo)形式的复杂聚糖。合成的llo转移至包含n-x-s/t之的胜肽的n-糖苷化序列，n-x-s/t透过由8或更多个次单元组成的寡糖转移酶的转译中移位机制直接从核糖体转译至内质网。连接于蛋白质的n-聚糖由存在于内质网的葡萄糖苷酶(α-葡萄糖苷酶i，gls1p；α-葡萄糖苷酶ii，glsp ii)从聚糖的末端一个个被移除。由于第二及第三个葡萄糖移除得较慢，故会在凝集素伴护蛋白(lectin chaperone)、钙连伴护蛋白(calnexin)及钙网伴护蛋白(calreticulin)的帮助下完成折叠。当所有葡萄糖都被切除时，蛋白质折叠视为完成，连接于其的man8glcnac2聚糖转移至高基氏体。在此方面，在其从内质网转移至高基氏体之前，会有再次验证糖蛋白的折叠的质量管理过程。当未达成适当的折叠时，会重复通过使一分子的葡萄糖进入钙连伴护蛋白/钙网伴护蛋白循环以提供完成折叠的机会的过程。
7.上述于内质网中的n-聚糖的生物合成的初始过程在从酵母菌(一种简单的真核微生物)至动物(即高等生物)的广泛范围的生物体中几乎以相同的方式保守。然而，转移至高基氏体的聚糖会进行各物种特定的多种聚糖修饰，导致在酵母菌、昆虫及动物中形成完全不同类型的聚糖。然而，这些多种聚糖通常亦共有一种核心位置，即三个甘露糖及两个glcnac连接于天门冬酰氨酸的氮的结构，其称为“三甘露糖核(trimannosyl core)”。甘露糖主要连接于三甘露糖核的形式称为“高甘露糖型(high-mannose type)”，并常见于酵母菌及霉菌中。多个甘露糖连续添加于高基氏体的结构亦发现于酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)，其为一种众所周知的酵母菌。另一方面，具有缺乏甘露糖型(deficient mannose type)(少甘露糖型(pauci-mannose type))的聚糖的糖蛋白被发现于昆虫细胞。这些首先在高基氏体中通过甘露糖苷酶ia、ib及ic修剪以形成man5glcnac2，n-乙酰葡萄糖胺转移酶(gnt)i用以将一个glcnac添加至man5glcnac2，接着甘露糖苷酶ii用以形成一个glcnac添加至三甘露糖核的混合结构。接着，所添加的glcnac再次被切除，形成缺乏甘露糖型的聚糖结构。在动物细胞中，α(1,6)-岩藻糖常被添加至连结于天门冬酰氨酸残基的第一个glcnac。在动物中，gnt ii作用于一个glcnac添加至三甘露糖核且另一个glcnac添加于其的结构，形成具有二天线结构(two antenna structure)的聚糖。接着，gnt iv及v可用以形成四天线结构，在某些情况下，gnt vi、ix或vb可用以形成六天线结构。在添加glcnac以形成天线骨架之后，存在于高基氏体的β-半乳糖转移酶及α-唾液酸转移酶用以形成半乳糖及唾液酸添加至glcnac的复杂聚糖结构。
8.n-糖苷化可深深影响蛋白质的折叠或活性，当在工业应用上使用基因工程方法制备存在于自然界的蛋白质或其变体时，糖苷化的存在及聚糖的结构或形式很有可能依据宿主细胞、重组操作方法及培养条件而异(schilling,et al.,2002)。亦即，依据蛋白质生产过程中的生产条件的差异会出现构成聚糖的糖成分或聚糖的结构的量的差异。影响n-糖苷化的培养条件包含培养基中葡萄糖或谷氨酰胺的浓度(tachibana et al.1994)、溶氧(dissolved oxygen，do)的浓度(restelli et al.2006)、培养基的ph(borys et al.1993)、培养基中氨的浓度(borys et al.1994)、培养温度(clark et al.2004)等。
9.一般而言，酵素会特定结合于物质以形成酵素-物质复合物，其作为催化剂以降低
反应的活化能并促进酵素的反应。酵素能够区分物质以及与物质竞争的分子，并且因酵素结合于物质的位置的互补电荷的分布、互补结构以及亲水性及疏水性而能够特定结合于物质。为了阐明酵素的结合位置，已提出一种酵素和物质彼此互补且具有几何形状的锁钥模型，但不能满意地解释酵素-物质复合物的过渡态。根据为克服此问题而提出的诱导嵌合模型，随着酵素与物质在酵素-物质复合物中持续相互作用，它们会基于酵素蛋白质的可变性结构而改变其结构。在此过程中，透过由构成活性位置的n-聚糖或氨基酸残基所致的周围电荷的分布或是透过亲水性/疏水性的分布能够进一步促进反应。
10.再者，电荷相互作用对于玻尿酸酶的反应为必需，玻尿酸酶为一种水解作为物质的玻尿酸的酵素。arming等人揭露在玻尿酸酶ph20中的具有正电荷的精氨酸对于结合玻尿酸的酵素活性而言为必需，其中玻尿酸为一种具有大量负电荷分布于其中的物质(arming et al.1997)。因此，可推断n-聚糖的电荷分布亦会影响此酵素活性。重要的是证明当作为具有大量负电荷的物质的玻尿酸结合至玻尿酸酶时，n-聚糖中的带负电的唾液酸加帽糖(sialic-acid-capping sugar)的程度(即，唾液酸化程度)会影响酵素-物质复合物的形成或是酵素反应的进行。为了限制唾液酸化程度，应限制唾液酸转移至半乳糖残基、应进行去唾液酸化或是应限制半乳糖化程度。
11.因此，重组玻尿酸酶ph20及其变体的生产力及活性会受n-聚糖的程度变化影响，故对于在本领域有效大量生产而言，需要研究开发一种制备具有高活性及生产力并透过控制及维持n-聚糖的程度而可用于工业上的玻尿酸酶ph20或其变体的方法。


技术实现要素：

12.因此，本发明系鉴于上述问题而完成，本发明的一目的在于提供一种培养制备重组玻尿酸酶ph20或其变体的宿主细胞的方法以及通过此方法制备的玻尿酸酶ph20或其变体，尤其是一种制备具有改善的酵素活性及生产力的玻尿酸酶ph20或其变体的方法。
13.本发明的目的不限于上述内容。本领域具有通常知识者将由以下说明清楚理解于此未描述的其他目的。
14.在本发明中，当用于制备重组玻尿酸酶ph20或其变体的宿主细胞在特定培养条件下培养时，所产生的重组玻尿酸酶ph20或其变体的n-糖苷化特性，进一步而言，所产生的玻尿酸酶ph20或其变体的酵素活性，会显著改善。
15.具体而言，发现通过控制n-聚糖中的唾液酸化、半乳糖化和/或甘露糖化程度，尤其是唾液酸化程度，会有效提升所产生的玻尿酸酶ph20或其变体的活性，并发现通过在改变培养温度后进行培养特定时间，能够显著改善根据本发明的玻尿酸酶ph20或其变体的酵素活性及生产力。
16.具体而言，根据本发明的制备玻尿酸酶ph20或其变体的方法，包含：
17.(1)于35℃至38℃的培养温度培养表达重组玻尿酸酶ph20或其变体的宿主细胞至积分活细胞密度(integral viable cell density)为20x106至120x106个细胞x天/毫升；以及
18.(2)将培养温度降低至28℃至34℃，接着依据选自以下的至少一种方法，在维持培养温度同时将宿主细胞培养2至18天：
19.(a)培养宿主细胞，同时在培养期间维持培养基中的剩余葡萄糖的浓度介于0.001
克/升(g/l)及4.5g/l之间；以及
20.(b)培养宿主细胞，同时维持培养基的ph于6.8至7.2。
21.由根据本发明的制备方法所制备的ph20或其变体的特征在于所产生的ph20或其变体的n-聚糖的唾液酸化量为1至38％，从而酵素活性会显著提升，但不限于此，此数值为具有10％的误差范围的实验数值。其原因在于在设定培养条件时，取决于例如使用于培养的设备及试验者的操作熟练度的条件而会产生差异，故考虑这些差异，本发明所设定的数值应被解释为广义的意义，而非狭义的意义。宿主细胞可通过选自批次培养(batch culture)、重复批次培养(repeated batch culture)、馈料批式培养(fed-batch culture)、重复馈料批式培养(repeated fed-batch culture)、连续培养(continuous culture)及灌注培养(perfusion culture)中的一种或多种方法来进行。
附图说明
22.本发明的上述及其他目的、特征及其他优点，由以下实施方式参考附图将更清楚理解，其中：
23.图1揭示对于野生型人类玻尿酸酶ph20及其变体的酵素活性、等电聚焦模式(isoelectric focusing pattern)及n-聚糖量的分析结果，其中
24.图1a揭示野生型人类玻尿酸酶ph20及其变体的酵素活性，
25.图1b揭示各样品的等电聚焦的结果，以及
26.图1c揭示n-聚糖量。
27.图2揭示以pngase f、唾液酸酶a及唾液酸酶a 半乳糖酶处理的经纯化的玻尿酸酶ph20变体部分之间的酵素活性及等电聚焦模式的比较分析的结果，其中
28.图2a揭示各样品的等电聚焦的结果，
29.图2b揭示酵素活性，以及
30.图2c揭示n-聚糖量。
31.图3揭示对于制备玻尿酸酶ph20变体的细胞，取决于添加n-乙酰基-d-甘露糖胺(mannac)或半乳糖的培养条件的细胞生长、细胞生存力、ph及乳酸浓度的变化的结果，其中
32.图3a揭示细胞生长的变化，
33.图3b揭示细胞生存力的变化，
34.图3c揭示ph的变化，以及
35.图3d揭示乳酸浓度的变化。
36.图4为揭示取决于添加n-乙酰基-d-甘露糖胺(mannac)或半乳糖的培养条件的所收获的用于制备玻尿酸酶ph20变体的细胞培养液的活性的图式。
37.图5揭示取决于添加n-乙酰基-d-甘露糖胺(mannac)或半乳糖的培养条件的所收获的用于制备玻尿酸酶ph20变体的细胞培养液的等电聚焦分析的结果。
38.图6揭示取决于添加n-乙酰基-d-甘露糖胺(mannac)或半乳糖的培养条件的所收获的用于制备玻尿酸酶ph20变体的细胞培养液的n-聚糖结构分析的结果。
39.图7揭示制备玻尿酸酶ph20变体的细胞的细胞生长、细胞生存力及氨浓度的变化作为培养天数的函数，其中
40.图7a揭示细胞生长的变化，
41.图7b揭示细胞生存力的变化，
42.图7c揭示积分活细胞密度的变化，以及
43.图7d揭示氨浓度。
44.图8为显示随细胞培养天数的所收获的用于制备玻尿酸酶ph20变体的细胞培养液的比活性的图式。
45.图9揭示随细胞培养天数的所收获的用于制备玻尿酸酶ph20变体的细胞培养液的等电聚焦的结果。
46.图10揭示随细胞培养天数的所收获的用于制备玻尿酸酶ph20变体的细胞培养液的活性分析及n-聚糖结构的结果。
47.图11揭示对于制备玻尿酸酶ph20变体的细胞，取决于葡萄糖浓度条件、细胞生存力、ph、渗透压、葡萄糖浓度及乳酸浓度的细胞生长的变化，其中
48.图11a揭示细胞生长的变化，
49.图11b揭示细胞生存力的变化，
50.图11c揭示ph的变化，
51.图11d揭示渗透压的变化，
52.图11e揭示葡萄糖浓度的变化，以及
53.图11f揭示乳酸浓度的变化。
54.图12为揭示取决于葡萄糖浓度的所收获的用于制备玻尿酸酶ph20变体的细胞培养液的比活性的图式。
55.图13揭示取决于葡萄糖浓度的所收获的用于制备玻尿酸酶ph20变体的细胞培养液的等电聚焦的结果。
56.图14揭示取决于葡萄糖浓度的所收获的用于制备玻尿酸酶ph20变体的细胞培养液的n-聚糖结构分析的结果。
57.图15揭示对于制备玻尿酸酶ph20变体的细胞，取决于ph程度的细胞生长、细胞生存力、ph及积分活细胞密度的变化的结果，其中
58.图15a揭示细胞生长的变化，
59.图15b揭示细胞生存力的变化，
60.图15c揭示ph的变化，以及
61.图15d揭示积分活细胞密度的变化。
62.图16为揭示所收获的用于制备玻尿酸酶ph20变体的细胞的细胞培养液取决于ph程度的比活性的图式。
63.图17揭示所收获的用于制备玻尿酸酶ph20变体的细胞培养液取决于ph程度的等电聚焦的结果。
64.图18为在玻尿酸酶ph20变体的纯化过程中透过初级阴离子交换树脂色谱法获得的纯化色谱图。
65.图19为在玻尿酸酶ph20变体的纯化过程中透过二级阴离子交换树脂色谱法获得的纯化色谱图。
66.图20为在玻尿酸酶ph20变体的纯化过程中透过阳离子交换树脂色谱法获得的纯化色谱图。
具体实施方式
67.除非另有定义，否则于此所使用的技术及科学术语与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解具有相同意义。一般而言，于此所使用的命名法为众所周知且常为人所用。
68.本发明基于以下发现：唾液酸化、半乳糖化和/或甘露糖化程度，尤其系n-聚糖的唾液酸化程度，对于当在工业应用上使用基因工程方法制备玻尿酸酶ph20或其变体时的玻尿酸酶ph20或其变体的酵素活性及生产力而言相当关键。
69.具体而言，发现当ph20或其变体的n-聚糖的唾液酸化量为1至38％时，优选为1至30％，更佳为1.5至28％，最优选为2至25％，玻尿酸酶ph20或其变体的酵素活性及生产力会改善至出乎意料之高的程度。
70.更具体而言，发现当ph20或其变体的n-聚糖的半乳糖化程度为1至68％、其唾液酸化量为1至38％且其甘露糖化量为40至63％时，优选为当其半乳糖化量为5至60％、其唾液酸化为1至30％且其甘露糖化量为42至62％时，更佳为当其半乳糖化量为10至56％、其唾液酸化量为1.5至28％且其甘露糖化量为44至61％时，最优选为当其半乳糖化量为15至50％、其唾液酸化量为2至25％且其甘露糖化量为47至60％时，玻尿酸酶ph20或其变体的酵素活性及生产力会改善至出乎意料之高的程度。
71.上述数值来自表1所示实施例的实验结果，且系以95％信赖区间所获得的数值，该数值亦可包含10％的误差。这是因为在蛋白质中的糖(葡萄糖)程度的量测上存在差异，其取决于例如使用于实验的设备、酵素反应时间、试验温度、试验者的熟练度等的条件，故考虑实验室之间的差异，本发明中所量测的葡萄糖程度应被解释为广义的意义，而非受限的意义。
72.在本发明中，n-聚糖的半乳糖化比例(％)为在n-聚糖的中于其末端含有半乳糖的聚糖的比例(％)的总和，例如g1、g1f、g1f'、g2、g2f、a1、a1f、a2及a2f，唾液酸化比例(％)为在n-聚糖之中于其末端含有唾液酸的n-聚糖的比例(％)的总和，例如a1、a1f、a2及a2f，甘露糖化比例(％)为在n-聚糖之中于其末端含有甘露糖的n-聚糖的总和，例如的m4g0f、m5、m5g0、m6、m7及m8。
73.更具体而言，根据本发明的制备n-聚糖中的唾液酸化量为1至38％的玻尿酸酶ph20或其变体的方法包含：
74.(1)于35℃至38℃的培养温度培养表达重组玻尿酸酶ph20或其变体的宿主细胞至积分活细胞密度(integral viable cell density)为20x106至120x106个细胞x天/毫升；以及
75.(2)将培养温度降低至28℃至34℃，接着依据选自以下的至少一种方法，在维持培养温度同时将宿主细胞培养2至18天：
76.(a)培养宿主细胞，同时在培养期间维持培养基中的剩余葡萄糖的浓度介于0.001克/升(g/l)及4.5g/l之间；以及
77.(b)培养宿主细胞，同时维持培养基的ph于6.8至7.2。
78.上述数值为具有10％误差范围的实验数值。其原因在于在设定培养条件时，取决于例如使用于培养的设备及试验者的操作熟练度的条件而会产生差异，故考虑这些差异，本发明所设定的数值应被解释为广义的意义，而非狭义的意义。
79.从步骤(1)至步骤(2)的培养温度的降低在积分活细胞密度达到20x106至120x106个细胞x天/毫升时进行，优选为40x106至100x106个细胞x天/毫升，更佳为60x106至80x106个细胞x天/毫升，但不限于此。
80.此外，步骤(2)的培养期间可为2至18天，优选为3至16天，更佳为4至14天，但不限于此。
81.举例而言，在根据本发明的ph20或其变体的制备中使用馈料批式培养方法的情况下，透过下述方式，ph20或其变体的生产力能最大化且所产生的ph20或其变体的酵素活性能显著改善，方式如下：在主要培养之前立即透过灌注培养或馈料批式培养在35℃至38℃下进行种菌培养直到细胞浓度达到特定程度，接下来在低于35℃的降低的温度下透过接种进行主要培养2至18天，优选为3至16天，更佳为4至14天。
82.主要培养的细胞接种浓度可为1x105个细胞/毫升或更高，优选为5x105个细胞/毫升或更高，更佳为1x106个细胞/毫升或更高，但不限于此。
83.通过在根据本发明的ph20或其变体的制备中使用馈料批式培养与灌注培养的组合进行培养，ph20或其变体的生产力能最大化且所产生的ph20或其变体的酵素活性能显著提升。
84.在本发明中，在培养期间中培养基中的剩余葡萄糖浓度维持于0.001g/l至4.5g/l，优选为0.01至4.0g/l，更佳为0.1至3.5g/l，但本发明不限于此。
85.于此所使用的“在培养过程中培养基中的剩余葡萄糖浓度维持于0.001g/l至4.5g/l，优选为0.01至4.0g/l，更佳为0.1至3.5g/l”的表述，表示当在培养期间以1至36小时，优选为3至30小时，更佳为6至24小时，或是实时量测的培养基中的剩余葡萄糖浓度低于0.001g/l至4.5g/l的设定参考浓度时，优选为0.01至4.0g/l时，更佳为0.1至3.5g/l时，将葡萄糖原液加入培养基以在培养时获得对应的参考浓度。
86.在本发明中，对于本领域具有通常知识者显而易见的是，培养基中的剩余葡萄糖浓度的参考浓度可设定于0.001g/l至4.5g/l，优选为0.01至4.0g/l，更佳为0.1至3.5g/l，参考浓度在培养期间可适当改变。举例而言，在培养的第一及第二天培养基中的剩余葡萄糖的参考浓度为2g/l，在培养的第三至第五天将参考浓度降低为1.5g/l，之后将参考浓度设定为低于1.5g/l的程度，例如1.0g/l。
87.由根据本发明的方法制备且于n-聚糖部分具有预定的唾液酸化、半乳糖化和/或甘露糖化程度的玻尿酸酶ph20或其变体在玻尿酸酶的培养基中的活性为10,000单位/毫升(unit/ml)，优选为11,000units/ml，或更佳为12,000units/ml或更高，但不限于此。
88.此外，由根据本发明的方法制备且于n-聚糖具有预定的唾液酸化、半乳糖化和/或甘露糖化的玻尿酸酶ph20或其变体为由本领域已知方法制备之野生型人类ph20，且相较于由本领域已知方法制备的野生型人类ph20的活性，酵素活性提升10％或更多，优选为12％或更多，更佳为15％或更多，但本发明不限于此。
89.优选地，在根据本发明的制备玻尿酸酶ph20或其变体的方法中，在步骤(1)和/或步骤(2)中宿主细胞的培养可在选自以下的一个或多个条件下进行：(i)将氨添加至培养基或提高培养基中的氨浓度至5mm或更多；(ii)将选自谷氨酰胺、葡萄糖胺、尿苷、葡萄糖胺及丁酸钠中的一种或多种物质加入培养基；以及(iii)不将半乳糖及mannac加入至培养基，但本发明不限于此。
90.更具体而言，在根据本发明的制备玻尿酸酶ph20或其变体的方法中，在步骤(1)和/或步骤(2)中宿主细胞的培养可通过以下方式进行：将氨添加至培养基、提升氨浓度至5mm或更多、将谷氨酰胺加入其中、不将半乳糖及mannac加入其中、将尿苷或葡萄糖胺加入其中并将丁酸钠加入其中，但本方法不限于此。
91.于此所使用的用语“玻尿酸酶ph20或其变体”是指降解位于胞外基质的玻尿酸的酵素。
92.于此所使用的用语“玻尿酸酶ph20”或“ph20”被解释为包含野生型ph20及其成熟型两者，用语“玻尿酸酶ph20或ph20的变体”表示包含一或多个氨基酸残基的取代、缺失或插入并可选地包含于“玻尿酸酶ph20”或“ph20”的氨基酸序列中某些n-末端和/或c-末端氨基酸残基的缺失的ph变体，但不限于此。
93.根据本发明的玻尿酸酶是指源自动物或如链霉菌属(streptomyces)的微生物且具有玻尿酸酶活性的玻尿酸酶，其中“玻尿酸酶ph20”或“ph20”源自动物或如链霉菌属的微生物，优选为源自人类、牛或羊。
94.根据本发明的源自人类的“玻尿酸酶ph20”或“ph20变体”实施例于国际专利公开第2020/022791号及美国专利第9,447,401号，但不限于此，并被解释为包含任何包含一或多个氨基酸残基的取代、缺失及插入并可选地包含于“玻尿酸酶ph20”或“ph20”的氨基酸序列中n-末端和/或c-末端氨基酸残基的截断(truncation)且具有玻尿酸酶酵素活性的玻尿酸酶或变体。
95.于此所使用的用于表达玻尿酸酶蛋白的宿主细胞的实施例可包含动物细胞、酵母菌、放线菌及昆虫细胞等，但不限于此。
96.动物细胞优选为哺乳动物细胞，更佳地，常用的动物培养细胞，例如cho细胞、hek细胞、cos细胞、3t3细胞、骨髓瘤细胞、bhk细胞、hela细胞及vero细胞，具体优选为用于大量表达的cho细胞。此外，为了制备期望的蛋白质，优选使用适合用于导入期望的基因的细胞，例如dhfr-cho细胞(proc.natl.acad.sci.usa(1980)77,4216-4220)或cho k-1细胞(其为dhfr基因剔除的cho细胞)(proc.natl.acad.sci.usa(1968)60,1275)或cho k-1细胞(proc.natl.acad.sci.usa(1968)60,1275)。cho细胞具体优选为dg44、dxb-11、k-1或cho-s细胞株，载体至宿主细胞导入使用如磷酸钙方法、deae右旋糖聚糖方法或脂蛋白方法的方法进行。
97.酵母菌的实施例包含saccharomyces sp.、hansenula sp.、kluyveromyces、pichia sp.等，放线菌包含例如streptomyces，但不限于此。
98.在根据本发明的制备玻尿酸酶ph20或其变体的方法中，在步骤(1)和/或步骤(2)中宿主细胞的培养可通过选自批次培养、重复批次培养、馈料批式培养、重复馈料批式培养、连续培养及灌注培养中的一种或多种方法进行，但不限于此。
99.批次培养系在培养过程中不添加新鲜培养基或排放培养溶液的用于增殖细胞的培养方法。连续培养系在培养过程中连续添加及排放培养基的培养方法。此外，连续培养包含灌注培养。馈料批式培养介于批次培养及连续培养之间，亦称为“半批次培养”，涉及在培养过程中连续或依序添加培养基。此培养方法即使连续排放培养溶液亦会防止细胞的排放。在本发明中，可使用任何培养方法，优选为馈料批式培养或连续培养，具体优选为馈料批式培养。
efficientfeedtm c agttm、cd cho efficientfeedtm a plus agttm、cd cho efficientfeedtm b plus agttm、cd cho efficientfeedtm c plus agttm(gibco,usa)、cho feed 4(irvine scientific,usa)、ex-advanced cho feed(sigma-aldrich,usa)、cho-u feed mix u1b7/cho-u feed mix u2b13(kerry,usa)作为供料培养基，但本发明不限于此。
109.于此所使用的用语“供料培养基”及“浓缩营养培养基”是指由特定营养物或如氨基酸、维生素、盐类、微量元素、脂质及葡萄糖的多种营养物组成的培养基，并可为基础培养基的浓缩产物。所制备的供料培养的成分及浓度可依据所欲培养的细胞而变化。此外，可使用市售可用的供料培养基，例如cell boost系列补充培养基(hyclone,usa)、efficientfeed补充培养基、glycantune供料培养基(gibco,usa)、balancd cho供料培养基(irvine scientific,usa)、cho细胞培养供料培养基(merck,usa)、ex-advanced cho供料培养基(sigma-aldrich,usa)等，作为供料培养基，但本发明不限于此。
110.于此所使用的用语“源自植物的水解产物”是指从豌豆、棉籽、小麦麸质(wheat glute)、大豆等萃取且不包含源自动物的成分的产品，且系包含大量氨基酸、胜肽、维生素、碳水化合物、核苷酸、矿物质及其他成分的补充物，亦可依据所欲培养的细胞而制备成包含多种成分及成分浓度。此外，可使用市售可用的源自植物的水解产物，例如hypep
tm
7404、ultrapep
tm cotton、hypep
tm 7504、hypep
tm 4601n(kerry,usa)、cotton 100、cotton 200、phytone
tm
及soy 100(gibco,usa)，作为补充物，但本发明不限于此。
111.用于增加或减少本发明中所使用的糖蛋白的n-聚糖量的添加物通常为已知涉及蛋白质糖苷化的成分。尤其，为了限制唾液酸化量，应限制唾液酸至半乳糖残基的传递、应进行去唾液酸化(desialylation)或是应限制半乳糖化量。当培养细胞时，以预定浓度添加至培养基的此种添加物包含作为如n-乙酰基-d-甘露糖胺、葡萄糖、甘露糖、谷氨酰胺及半乳糖的糖苷化前驱物的成分、氨及丁酸。
112.大部分动物细胞的培养主要使用含有血清的培养基。然而，由于含有血清的培养基为复杂的组合物且其化学组成尚不清楚，故难以设计出适用于蛋白质制备的培养基。由于血清可能在分离或纯化上有负面影响以及有成本及再现性相关的问题，故主要使用无血清培养基或含有少量血清的培养基。由于在无血清培养基中作为碳源的葡萄糖的浓度非常低，故会进一步将葡萄糖添加至用于培养的培养基作为主要碳源以维持细胞生长并产生高浓度的目标蛋白质，可进一步将谷氨酰胺添加至其中以用于培养。尤其，在蛋白质制药的生产上为了增加体内半衰期，唾液酸化程度应提高。为此，培养基中的葡萄糖及谷氨酰胺应维持于特定浓度或更高以免耗尽，且培养基的ph亦应维持于特定程度。培养基中所量测的葡萄糖及谷氨酰胺的浓度是指在被细胞消耗后剩余的葡萄糖及谷氨酰胺的浓度。此外，可使用改善与唾液酸化程度的提升相关的酵素的活性的启动子或是抑制去唾液酸化的抑制子。此外，通过增加n-聚糖的前驱物或控制相关酵素的活性启动子或培养条件，能增加半乳糖化程度，亦能因此增加唾液酸化程度。
113.然而，在玻尿酸酶ph20或其变体的制备中无法通过上述方法控制n-聚糖程度，而在通过根据本发明的方法制备时，能够制备具有期望的聚糖程度及高酵素活性的玻尿酸酶ph20或其变体。
114.根据本发明的制备方法可还包含分离及纯化所制备的玻尿酸酶ph20或其变体。
115.根据本发明的玻尿酸酶ph20或其变体的分离及纯化优选为不使用亲和性结合而是使用玻尿酸酶ph20或其变体的离子键和/或疏水性相互作用特性来进行，但本发明不限于此。
116.具体而言，根据本发明的玻尿酸酶ph20或其变体的分离及纯化优选为不使用亲和性色谱法而是使用疏水性相互作用色谱法及离子交换色谱法来进行，例如阳离子交换色谱法和/或阴离子交换色谱法，但本发明不限于此。
117.此外，根据本发明的玻尿酸酶ph20或其变体的分离及纯化旨在移除具有低酵素活性的酸性玻尿酸酶ph20或其变体，酸性玻尿酸酶ph20或其变体的移除优选为使用离子交换色谱法来进行。
118.需要分析酵素的催化反应速率以确定酵素的工业应用性。酵素反应可分为具有固定反应性的活性位置的酵素反应以及具有不同反应性的多个活性位置的酵素反应。已知具有固定反应性的单一活性位置的酵素的催化反应的速率，例如玻尿酸酶，遵循米氏(michaelis-menten)动力学方程式。
119.米氏(michaelis-menten)酵素动力学以下述为前提：假设酵素反应为包含可逆反应及不可逆反应的两步反应系统，在可逆反应中形成酵素(e)-物质(s)的复合物〔es〕，在不可逆反应中es复合物解离并产生产物(p)。在此情况下，kf、kr及kcat为各方向的反应的速率常数(alan fersht(1977).enzyme structure and mechanism)。
[0120][0121]
对于酵素反应，假设酵素与物质反应而产生es复合物的过程快速达到平衡或是拟稳态(pseudo-steady state)，假设透过通过进行维持足够高物质浓度的反应来充分降低酵素的浓度而满足d[es]/dt≒0。由于假设快速平衡或拟稳态的动力学公式系以相同方式推导，故在大部分实验中会假设物质浓度最初高于酵素浓度的拟稳态。
[0122]
当基于此假设而采用例如“在反应前后酵素的量恒定”及“当化学反应达到化学平衡时，获得产物时的反应速率等于产物再次分解时的速率”的情况时，最终产物的反应速率可由以下米氏(michaelis-menten)动力学方程式表示。在此情况下，km＝(kr kcat)/kf且vmax＝kcat[e]0。
[0123][0124]
赖威佛氏-柏克氏(lineweaver-burk)方程式用于实验分析使用米氏(michaelis-menten)动力学方程式的酵素反应速率。此方程式显示实验测得的反应速率的倒数1/v与实验中给定物质浓度的倒数1/[s]之间的关系。此方程式为线性方程式的统计验证表示酵素反应系遵循米氏(michaelis-menten)动力学方程式的反应，且能够使用此方程式计算出km及vmax。
[0125]
催化化学反应的酵素在于活性位置结合物质后具有过渡态，透过与物质的多重键结来降低用于达到具有高能量的过渡态的活化能。用于达到此过渡态的平衡常数正比于kcat/km。于此，1/km系结合“由结合酵素与物质而产生酵素-物质复合物”的程度与“维持酵素-物质复合物而不分解”的程度的指数，kcat系从酵素-物质复合物获得产物时的平衡常数。因此，kcat/km可说是能够从物质及酵素获得多少产物的指标，亦即，酵素的催化效率。
[0126]
玻尿酸酶的工业可用性正比于其酵素催化效率。尤其，当酵素与聚合药理活性物质(例如单株抗体)一起皮下注射时，玻尿酸酶的酵素催化效率扮演重要的角色。在根据本发明的变体相较于野生型ph20具有较高的kcat/km的情况下，当将包含于聚合药理活性物质的玻尿酸酶皮下给药时，存在于其中的玻尿酸被快速分解，故能够获得快速分散药理活性物质的优越的效果。此外，当根据本发明的变体相较于野生型ph20具有较大的kcat时，在相同下酵素浓度下最大反应速率vmax会增加，从而提供在相同期间分解更大量的玻尿酸以及将药理活性物质分散于更宽广区域的优异的效果。
[0127]
因此，为了确定根据本发明的ph20变体的酵素性质，分析了各变体的酵素反应速率，于实施例4中比较了其vmax(最大酵素反应速率)、km(在50％ vmax情况下的物质浓度)、kcat(物质转换速率)及kcat/km(酵素催化效率)。这些结果表示根据本发明的ph20变体优于野生型ph20。
[0128]
实施例
[0129]
在下文中，参考实施例详细描述本发明。然而，对于本领域具有通常知识者显而易见的是，这些实施例仅供用于说明本发明，且不应被解释为限制本发明的范围。
[0130]
实施例1，玻尿酸酶的活性、n-聚糖及等电聚焦模式(isoelectric focusing pattern)之间的关系
[0131]
野生型人类玻尿酸酶ph20及其变体hm46的活性、等电聚焦模式及n-聚糖程度揭示于图1。尽管两种玻尿酸酶的活性单位的差异大于两倍，但在等电点范围或n-聚糖程度上没有太大差异。
[0132]
进行实验以确定玻尿酸酶ph20中n-聚糖、等电聚焦模式及活性之间的关系。在纯化玻尿酸酶ph20变体的过程中，可将碱性部分(部分1)及酸性部分(部分2)分离，并使用各部分作为样品。图2揭示使用pngase f处理以移除所有n-聚糖的样品、使用唾液酸酶a处理以移除末端的唾液酸的样品以及使用唾液酸酶a及半乳糖酶处理以移除末端的唾液酸及半乳糖的样品的等电聚焦模式及酵素活性的分析的结果。两个部分在等电点的范围表达出差异，酸性部分表达出降低的酵素活性。当以pngase f处理时，两个部分不具有活性且具有相似的等电聚焦模式。这些结果显示出n-聚糖程度与酵素活性密切相关。再者，透过当移除位于末端的唾液酸时酸性部分的等电聚焦模式或酵素活性相似于碱性部分的等电聚焦模式或酵素活性的现象，发现位于末端的唾液酸的含量与酵素活性之间有关系。然而，相较于具有高唾液酸含量的酸性部分，具有末端低唾液酸含量的碱性部分表达出改善的玻尿酸酶的酵素活性。
[0133]
基于评估源自不同培养细胞的野生型及多种变异的玻尿酸酶的结果进一步说明酵素活性与n-聚糖量之间的关系。
[0134]
表1
[0135][0136][0137]
相对活性：以(样品的活性)/(野生型人类ph20的活性)的百分比表示的活性。
[0138]
半乳糖化百分比(％)：如g1、g1f、g1f'、g2、g2f、a1、a1f、a2及a2f的于末端含有半乳糖的n-聚糖的含量百分比(％)的总和。
[0139]
唾液酸化百分比(％)：如a1、a1f、a2及a2f的于末端含有唾液酸的n-聚糖的含量百分比(％)的总和。
[0140]
甘露糖化百分比(％)：如m4g0f、m5、m5g0、m6、m7、m8及m9的于末端含有甘露糖的n-聚糖的含量百分比(％)的总和。
[0141]
野生型人类ph20及hm46的序列揭露于国际专利公开第2020/022791号。
[0142]
通过于实施例10所示的方法制备羊ph20及倭黑猩猩(bonobo)ph20样品，序列揭示于表3。
[0143]
如表1所示，制备了多种类型的玻尿酸酶ph20及变异蛋白并调查了n-聚糖量。为此，进行了使用多种细胞来源的培养，例如通过在每次培养时使用expifectamine cho试剂(gibco，usa)以重组基因转染expicho细胞而产生的暂时表达培养(temporary expression culture)、利用使用重组基因所产生的细胞株殖株的细胞株殖株培养(cell line clone culture)以及使用具有高生产力的经筛选的单株的细胞株培养(cell line culture)。于此，细胞株殖株培养系利用使用选择性标记从转染有重组基因的哺乳动物细胞殖株选择出高生产力的细胞株殖株的培养，并使用多株细胞株进行，并旨在产生单株细胞株。细胞株包
含研究用细胞库(research cell bank，rcb、生产用主细胞库(production master cell bank，mcb)及工作用细胞库(working cell bank，wcb)。此外，在培养方法中，尝试试验培养的多种结合以优化生产，即使于此亦发现在活性及n-聚糖上有差异。
[0144]
细胞株殖株试验培养#1是使用hycellcho培养基(hyclone,usa)不调整培养温度在37℃下进行的2升(l)批次培养。细胞株殖株试验培养#2纯化部分#1及细胞株殖株试验培养#2纯化部分#2系从所收获的细胞培养液透过阴离子交换色谱法分离并纯化的部分，其中所收获的细胞培养液是使用于8l批次中含有ex-advanced cho馈料批式培养基(sigma-aldrich,usa)与cotton 100uf(gibco)及cho feed 4(irvine scientific,usa)的馈料批式方法在37℃下培养，纯化部分#1为低盐溶析部分，纯化部分#2为高盐溶析部分。细胞株试验培养#1是通过使用于2l批次中含有ex-advanced cho馈料批式培养基(sigma-aldrich,usa)与cotton 100uf(gibco)及cho feed 4(irvine scientific,usa)的馈料批式方法在37℃的培养温度下培养，并接着在积分活细胞密度达到预定程度时将培养温度调整至32℃而获得。细胞株试验培养#2是通过使用于10l批次中含有ex-advanced cho馈料批式培养基(sigma-aldrich,usa)与cotton 100uf(gibco,usa)及cd cho efficientfeedtm b plus agttm(gibco,usa)的馈料批式方法在37℃的培养温度下培养，并接着在积分活细胞密度达到预定程度时将培养温度调整至32℃，随后进行培养12天而获得。细胞株试验培养#3是通过使用于50l批次中含有ex-advanced cho馈料批式培养基(sigma-aldrich,usa)与cotton 100uf(gibco,usa)及cd cho efficientfeedtm b plus agttm(gibco,usa)的馈料批式方法在37℃的培养温度下培养，并接着在积分活细胞密度达到预定程度时将培养温度调整至32℃而获得。细胞株试验培养#4是通过使用于10l批次中含有ex-advanced cho馈料批式培养基(sigma-aldrich,usa))与cotton 100uf(gibco,usa)及cd cho efficientfeedtm b plus agttm(gibco,usa)的馈料批式方法在37℃的培养温度下培养，并接着在积分活细胞密度达到预定程度时将培养温度调整至32℃，并将细胞培养13天而获得。细胞株培养#1、细胞株培养#2、细胞株培养#3及细胞株培养#4是通过使用于200l批次中补充ex-advanced cho馈料批式培养基(sigma-aldrich,usa)与cotton 100uf(gibco,usa)及cd cho efficientfeedtm b plus agttm(gibco,usa)的馈料批式方法在37℃的培养温度下培养研究用细胞库(rcb)、生产用主细胞库(mcb)及工作用细胞库(wcb)，并接着在积分活细胞密度达到预定程度时将培养温度调整至32℃，并将细胞培养12天而获得。基于这些条件，进行实施例2至5的针对培养条件的实验以建立用于维持n-聚糖程度的培养方法。
[0145]
从表1可看出，野生型人类玻尿酸酶ph20及其变体以及哺乳动物玻尿酸酶ph20在n-聚糖中的半乳糖化程度应为15至50％、唾液酸化程度应为2.5至28％且甘露糖化程度应为47至60％，并且在对试验结果应用95％信赖区间时，n-聚糖半中的乳糖化程度应为1至68％、唾液酸化程度应为1至38％且甘露糖化程度应为40至63％，以对其赋予工业上有用的玻尿酸酶活性。此数值亦可包含10％的误差，因为在蛋白质中的葡萄糖程度的量测上存在差异，其取决于例如使用于实验的设备、酵素反应时间、试验温度、试验者的熟练度等的条件，故考虑实验室的间的差异，本发明中所量测的葡萄糖程度应被解释为广义的意义，而非受限的意义。
[0146]
再者，尤其，考虑活性与唾液酸化之间的关系，可看出仅在唾液酸化限制于约30％或更少时才能制备出具有高于野生型人类ph20的活性的活性而因此可用于工业上的玻尿酸酶。上述数值可源自实验结果并可包含10％的误差。
[0147]
通过暂时表达培养确定了维持n-聚糖程度的高质量玻尿酸酶，通过选择具有高生产力的单株菌株来制备细胞株以用于稳定商业生产。所有的细胞株试验培养#2、#3、#4及细胞株培养#1、#2、#3、#4揭示于表1，其通过使用实施例2、3、4、5的结果的培养方法来获得，其表达出10,000单位/毫升或更多的酵素表达程度，从而提出以高效率及低成本制备高质量玻尿酸酶的可能性。
[0148]
实施例2，取决于添加物的培养
[0149]
将玻尿酸酶ph20变体以2x106个细胞/毫升接种于补充有或没有cotton 200uf(gibco,usa)及20mm n-乙酰基-d-甘露糖胺(nzp,netherlands)或50mm半乳糖(pfanstiehl,usa)的含有ex-advanced cho馈料批式培养基(sigma-aldrich,usa)的三个锥形瓶的每一个中，在37℃及8％ co2下于培养箱中通过批次培养进行培养，并接着在积分活细胞密度(integral viable cell density，ivcd)到达调整范围时在32℃的降低的温度下进行馈料批式培养。cd cho efficientfeedtm b plus agttm培养基(gibco，usa)作为供料培养基每日以烧瓶中培养起始体积的1.88％的量供应。每日从细胞培养液收集细胞样品，量测活细胞密度、细胞生存力、ph及乳酸程度。在培养终止之后，以2,000rpm进行离心10分钟以获得培养上清液。通过hplc及浊度分析确定在上述条件下培养的样品的活性，通过等电聚焦及糖苷化分析观察蛋白质模式及n-聚糖程度。相较于未补充有50mm半乳糖的培养基，补充有50mm半乳糖的培养基表达出半乳糖化增加24％且活性降低2％，相较于未补充有n-乙酰基-d-甘露糖胺的培养基，补充有20mm n-乙酰基-d-甘露糖胺的培养基表达出唾液酸化增加35％且活性降低20％(图3、图4、图5、图6)。
[0150]
实施例3，取决于培养期间的培养
[0151]
将表达玻尿酸酶ph20变体的细胞以2x106个细胞/毫升接种于sartorius 200l生物反应器中的ex-advanced cho馈料批式培养基(sigma-aldrich,usa)。在培养的第二天，使用cotton 200uf(gibco,usa)及cd cho efficientfeedtm b plus agttm培养基(gibco,usa)，其为浓缩的营养培养基(gibco,usa)，作为供料培养基，进行馈料批式培养，在47rpm的速率下ph为7.2
±
0.4且do为40％进行培养。在37℃下进行初始培养，当积分活细胞密度达到改变范围时，将温度调整至32℃，进行馈料批式培养。cd cho efficientfeedtm b plus agttm培养基(gibco，usa)作为供料培养基每日以200l生物反应器中培养起始体积的1.88％的量供应。对于培养期间，培养在培养后的第19天终止，此时细胞生存力降至40％或更低。每日从细胞培养液收集多个细胞样品，量测活细胞密度、细胞生存力、积分活细胞密度及铵离子程度，使用深度过滤器(depth filter)收获所培养的溶液。通过hplc及浊度分析确定在上述条件下培养的样品的活性，通过等电聚焦及糖苷化分析观察蛋白质模式及n-聚糖程度。随着培养天数增加，半乳糖化及唾液酸化程度降低且活性增加(图7、图8、图9、图10)。
[0152]
实施例4，在培养基中受控的葡萄糖浓度下的培养
[0153]
将表达玻尿酸酶ph20变体的细胞以2x106个细胞/毫升接种于sartorius 2l生物反应器中的ex-advanced cho馈料批式培养基(sigma-aldrich，usa)。在培养的第
二天，使用cotton 200uf(gibco，usa)及cd cho efficientfeedtm b plus agttm培养基(gibco，usa)，其为浓缩的营养培养基(gibco，usa)，作为供料培养基，进行馈料批式培养，在120rpm的速率下ph为7.2
±
0.4且do为40％进行培养。在37℃下进行初始培养，当积分活细胞密度达到改变范围时，将温度调整至32℃，接着进行馈料批式培养。cd cho efficientfeedtm b plus agttm培养基(gibco,usa)作为供料培养基每日以2l生物反应器中培养起始体积的1.88％的量供应。每日从细胞培养液收集多个细胞样品，量测活细胞密度、细胞生存力、ph、渗透压以及葡萄糖及乳酸浓度。
[0154]
每日量测培养基中葡萄糖的浓度，并在随着葡萄糖因细胞生长而消耗时培养上清液中所含葡萄糖的浓度不超过2、4或6g/l的参考浓度时，从此时点开始控制葡萄糖的浓度。当所量测的葡萄糖浓度为2、4或6g/l或更低(其为各自的标准浓度)时，以最长时间为3小时加入一定量的200g/l葡萄糖原液，以达到标准浓度。当所量测的葡萄糖浓度为2、4或6g/l或更多时，不加入原液以维持标准浓度。一般而言，在哺乳动物细胞培养的过程中，葡萄糖含量变化对细胞生长的影响在3小时内可忽略不计。
[0155]
在此情况下，将维持2g/l作为参考浓度的条件称为1g/l(
±
1g/l)浓度条件，将维持4g/l作为参考浓度的条件称为3g/l(
±
1g/l)浓度条件，将维持6g/l作为参考浓度的条件称为5g/l(
±
1g/l)浓度条件。举例而言，维持葡萄糖浓度为1g/l(
±
1g/l)的条件表示葡萄糖浓度的控制范围的下限设定为0g/l且葡萄糖浓度的控制范围的上限设定为2g/l，并表示在实际培养中，当所量测的培养上清液中的葡萄糖浓度达到0g/l的下限时，进一步加入200g/l的葡萄糖原液，而使得最大葡萄糖浓度达到2g/l，并且，当培养上清液中的葡萄糖浓度达到2g/l的上限时，不添加200g/l的葡萄糖原液。因此，在两种浓度条件下，亦即1g/l(
±
1g/l)浓度及3g/l(
±
1g/l)浓度，2g/l的浓度条件对应1g/l(
±
1g/l)浓度条件的上限并对应3g/l(
±
1g/l)浓度条件的下限，故此两种条件为发生完全不同的动作的条件，因此不被认为彼此重迭。
[0156]
在培养终止后，通过在4℃及10,000rpm下离心60分钟获得培养上清液。通过hplc及浊度分析确定在上述条件下培养的样品的活性，通过等电聚焦及糖苷化分析观察蛋白质模式及n-聚糖程度。结果揭示随着在培养上清液中葡萄糖浓度增加，半乳糖化及唾液酸化的程度增加且活性降低(图11、图12、图13及图14)。
[0157]
实施例5，在受控的ph下的培养
[0158]
将表达玻尿酸酶ph20变体的细胞以2x106个细胞/毫升接种于sartorius 2l生物反应器中的ex-advanced cho馈料批式培养基(sigma-aldrich,usa)。在培养的第二天，使用cotton 200uf(gibco,usa)及cd cho efficientfeedtm b plus agttm培养基(gibco,usa)，其为浓缩的营养培养基(gibco,usa)，作为供料培养基，进行馈料批式培养，在120rpm的速率下do为40％进行培养。在37℃下进行初始培养，当积分活细胞密度达到改变范围时，将温度调整至32℃，接着进行馈料批式培养。cd cho efficientfeedtm b plus agttm培养基(gibco,usa)作为供料培养基每日以2l生物反应器中培养起始体积的1.88％的量供应。调整培养温度，并根据四种ph条件将培养分开并进一步培养，亦即ph 6.8
±
0.1、ph 7.0
±
0.1、ph 7.2
±
0.1及ph 7.4
±
0.1，以找到相较于一般ph 7.2
±
0.4为改善的条件。使用包含ph控制功能的一般的生物反应器根据这四种条件设定培养的ph控制范围。举例而言，ph 7.0
±
0.1表示ph控制范围的下限为ph 6.9，ph控制范围的上限为ph 7.1。在实际培
养中，当培养基的ph达到ph 6.9的下限时，加入碱以提升ph，当培养基的ph达到ph 7.1的上限时，加入二氧化碳以降低ph。因此，在ph 6.8
±
0.1及ph 7.0
±
0.1的两种条件中，ph 6.9的条件对应ph 6.8
±
0.1的上限以及对应ph 7.0
±
0.1的下限。因此，两种条件被认为彼此不重迭。进行培养直到细胞生存力为40％或更低的培养日，每日从细胞培养液收集多个细胞样品，量测活细胞密度、细胞生存力、ph及积分活细胞密度程度。在培养终止后，通过在4℃及10,000rpm下离心60分钟获得培养上清液。通过hplc及浊度分析确定在上述条件下培养的样品的活性，通过等电聚焦确定蛋白质模式。在ph 7.0
±
0.1下观察到活性依培养基的ph而变化以及最高的活性及最低的唾液酸化程度，这相较于一般条件为改善的条件(表2、图15、图16、图17)。
[0159]
表2
[0160][0161][0162]
实施例6，使用动物细胞培养上清液的玻尿酸酶的纯化
[0163]
步骤1：用缓冲液交换/界面活性剂处理上清液
[0164]
使用30kda mwco膜过滤器透过uf/df控制导电性及ph，将培养溶液的条件重新调整至第一阴离子交换管柱平衡条件。使用适当浓度的溶剂/界面活性剂处理经重新调整的溶液以使病毒去活性，并在室温下反应约60分钟。
[0165]
步骤2：初级阴离子交换(q sepharose fast flow)管柱色谱
[0166]
将经过滤的蛋白质溶液通过初级阴离子交换管柱以透过阴离子交换树脂捕获玻尿酸酶，并在高盐浓度下从管柱溶析出。在加载前，使用三羟甲基氨基甲烷(tromethamine)缓冲液(ph为8.0且盐浓度为30mm)平衡管柱。在加载后，使用相同缓冲液冲洗管柱(初级冲洗)。在初级冲洗后，使用相同缓冲液(ph为8.0，但盐浓度为60mm，且相较于初级冲洗中的导电性具有较高的导电性)第二次冲洗管柱。在第二次冲洗后，使用ph为8.0且盐浓度为200mm的适当的缓冲液进行期望蛋白质(玻尿酸酶)的溶析，如图18所示。
[0167]
步骤3：二级阴离子交换(capto q)管柱色谱
[0168]
将经过滤的蛋白质通过二级阴离子交换管柱以利用阴离子树脂交换移除酸性的玻尿酸酶的变体。在加载前，使用bistris缓冲液(ph为6.0且不含盐)平衡管柱。在加载后，使用相同.bistris缓冲液冲洗管柱(初级冲洗)。在初级冲洗后，使用相同bistris缓冲液(盐浓度为20mm，相较于初级冲洗中的盐浓度的导电性具有较高的导电性)冲洗管柱。在第二次冲洗后，使用具有一定盐浓度的bistris缓冲液进行期望蛋白质(玻尿酸酶)的溶析，如图19所示。
[0169]
步骤4：阳离子交换(capto mmc)管柱色谱
[0170]
将经重新调整的蛋白质溶液通过阳离子交换管柱以利用阳离子交换树脂移除酸
性的玻尿酸酶的变体，并在高盐浓度下从管柱溶析出。在加载前，使用盐浓度为80mm的ph 5.5柠檬酸盐缓冲液平衡管柱。在加载后，使用相同柠檬酸盐缓冲液冲洗管柱(初级冲洗)。在初级冲洗后，使用适当的ph 7.5bistris缓冲液冲洗管柱。在第二次冲洗后，使用盐浓度为400mm的ph 8.0bistris缓冲液进行期望蛋白质(玻尿酸酶)的溶析，如图20所示。
[0171]
步骤5：奈米过滤/配方
[0172]
在阳离子交换管柱步骤后，透过1微米过滤器过滤含有期望的玻尿酸酶的蛋白质溶液，并将其进行奈米过滤。将经奈米过滤的蛋白质溶液浓缩至10毫克/毫升(mg/ml)的高浓度，并使用8kda mwco膜过滤器透过uf/df重新调整以与含有145mm盐的ph 7.0组氨酸缓冲液交换。
[0173]
实施例7，玻尿酸酶的酵素活性的分析
[0174]
使用如下所述的浊度法量测玻尿酸酶ph20及其他玻尿酸酶的酵素活性。
[0175]
浊度法是使用吸光度量测在混合玻尿酸与白蛋白(bsa)的过程中产生的沉淀物的方法。当玻尿酸被ph20水解时，在与白蛋白混合的过程中吸亮度会降低。一般而言，此过程进行如下。将玻尿酸酶ph20(sigma)稀释至1、2、5、7.5、10、15、20、30、50或60units/ml并放置于各管中。将经纯化的蛋白质样品溶解于酵素稀释缓冲液(20mm tris
·
hclph 7.0，77mm nacl，0.01％(w/v)牛血清白蛋白)并稀释100x、300x、600x、1200x或2400x于各管中。将3mg/ml的玻尿酸溶液稀释10x至0.3mg/ml于其他管中以将各管中的体积调整为180微升(μl)。将60μl的酵素与经稀释的玻尿酸溶液混合并在37℃下反应45分钟。在反应后，将50μl的经反应的酵素及250μl的酸性白蛋白溶液加入96孔盘的各孔中并摇晃10分钟，使用分光亮度计在600奈米量测吸亮度。样品的活性单位使用活性单位已知的标准品的试验结果与样品的试验结果来获得。
[0176]
实施例8，玻尿酸酶的等电聚焦分析
[0177]
使用预凝胶(precast gel)(ph 3-7,invitrogen)及用于等电聚焦的缓冲溶液分析玻尿酸酶的等电聚焦。将经纯化的玻尿酸酶样品加载于预凝胶，使用novex corporation制的电泳仪在100v将凝胶进行电泳1小时，在200v进行1小时，在500v进行30分钟。在电泳完成后，使用纯水冲洗凝胶，将蛋白质以12％ tca溶液固定、以coomassie blue r-250染色溶液染色并以乙酸-甲醇溶液漂白，以分析呈现于凝胶上的蛋白质带。
[0178]
实施例9，玻尿酸酶的n-聚糖程度的分析
[0179]
玻尿酸酶的n-聚糖程度透过标记n-聚糖样品来分析，透过以pngase f(n-糖苷酶f)、2-ab(2-氨基苯甲酰胺)处理玻尿酸酶来分离，接着透过使用acquity uplc glycan beh amide管柱(waters)进行超高效液相色谱。将经纯化的玻尿酸酶样品去盐并以pngase f在37℃下反应16至18小时，以从其中分离n-聚糖。将n-聚糖以2-ab标记，接着在65℃下反应3小时，并从其中移除过量的2-ab。将经标记的n-聚糖样品以72％-20％乙腈梯度透过hplc分离。以用荧光侦测器(fld)侦测经分离的样品以分析n-聚糖程度。将各个分离的n-聚糖分类，将于其末端含有半乳糖的n-聚糖(g1、g1f、g1f'、g2、g2f、a1、a1f、a2、a2f等)相加以确定半乳糖化百分比(％)程度，将于其末端含有唾液酸的n-聚糖(a1、a1f、a2、a2f等)相加以确定唾液酸化百分比(％)程度，将于其末端含有甘露糖的n-聚糖(m4g0f、m5、m5g0、m6、m7、m8、m9等)相加以确定甘露糖化百分比(％)程度。
[0180]
实施例10，源自动物的玻尿酸酶的制备及n-聚糖程度的分析
[0181]
(1)倭黑猩猩(bonobo)及羊玻尿酸酶ph20基因的制备
[0182]
为了研究源自动物的类人猿(anthropoid)(即倭黑猩猩)及偶蹄目(即羊)的玻尿酸酶ph20的n-聚糖程度及活性，如下制备玻尿酸酶ph20。从野生型基因合成出cdna，并将其插入pcdna3.4-topo载体的xho i及not i限制酶位置。为了在expicho细胞中表达，使用人类生长激素、人类血清白蛋白或人类hyal1其中一者的讯息肽作为讯息肽，而不使用ph20的天然讯息肽。为了使用histrap管柱进行蛋白质纯化，his-tag dna序列位于ph20 cdna的3'端。使用dna定序确定各序列。表3揭示源自动物的玻尿酸酶的序列。
[0183]
表3
[0184][0185][0186]
(2)倭黑猩猩及羊玻尿酸酶ph20表达
[0187]
使用expicho表达系统进行表达。当expicho细胞的数量达到6x106个细胞/毫升时，使用expifectamine cho试剂以玻尿酸酶ph20 cdna插入pcdna3.4-topo载体的质体转染expicho细胞。于此使用的细胞培养基为expicho表达培养基(100～500毫升)。在转染后，培养expicho细胞同时以130rpm摇晃共6天。在此期间，将细胞在37℃下培养1天，接着进一步在32℃的降低的温度下培养5天。当培养完成时，将细胞以10,000rpm离心30分钟以获得细胞上清液。
[0188]
(3)倭黑猩猩及玻尿酸酶ph20的纯化
[0189]
使用akta prime系统(ge healthcaresystems)透过两步骤的管柱色谱纯化在expicho细胞产生的c-末端连接his-tag的源自动物的玻尿酸酶重组蛋白。倭黑猩猩ph20的pi为6，故使用阴离子交换色谱的q sepharose，羊ph20的pi为8或更多，故使用阳离子交换
色谱的capto s管柱进行一步骤纯化。使用his-tag亲和性色谱的histrap hp管柱对各蛋白质进行两步骤纯化。
[0190]
为了使用q sepharose管柱进行蛋白质纯化，制备缓冲液a(20mm磷酸钠，ph 7.5)及缓冲液b(20mm磷酸钠，ph 7.5，0.5m nacl)。蛋白质结合于q sepharose管柱，以5管柱体基(cv)的缓冲液a冲洗管柱以移除非特异性结合蛋白，并接着以5cv的缓冲液b在0至100％的浓度梯度下冲洗以溶析出蛋白质。
[0191]
为了使用capto s管柱进行蛋白质纯化，制备缓冲液a(20mm磷酸钠，15mm nacl，ph 6.0)及缓冲液b(20mm磷酸钠，500mm nacl，ph 6.0)。将培养基的ph及导电性调整为与缓冲液a相同，透过具有0.22μm的孔径的膜过滤培养基。蛋白质样品结合于capto s管柱，以3cv的缓冲液a冲洗管柱以移除非特异性结合蛋白。以4cv的缓冲液b冲洗管柱以溶析出蛋白质。
[0192]
为了使用histrap hp管柱进行蛋白质存化，制备缓冲液a(20mm磷酸钠，500mm nacl，ph 7.5)及缓冲液b(20mm磷酸钠，500mm nacl，500mm咪唑ph 7.5)。蛋白质样品结合于histrap hp管柱，以7cv的7％缓冲液b冲洗管柱以移除非特异性结合蛋白，接着以3cv的40％缓冲液b冲洗管柱以溶析出目标蛋白。使用透析缓冲液(20mm磷酸钠，100mm nacl，ph 7.0)将管柱析出液进行透析。
[0193]
(4)倭黑猩猩及羊ph-20玻尿酸酶分析
[0194]
以与实施例7相同的方式进行活性分析，以与实施例9相同的方式进行n-聚糖程度分析。结果揭示于表1。
[0195]
实施例11，取决于n-聚糖程度的变体的酵素动力学分析
[0196]
为了分析根据本发明的变体的酵素动力学，通过morgan-elson方法(takahashi,t.et al(2003)anal.biochem.322:257-263)量测酵素活性。morgan-elson方法系一种比色法，其以对二甲基氨基苯甲醛(dmab)(即ehrlich试剂)检测在玻尿酸被玻尿酸酶水解时所产生的n-乙酰基-d-葡萄糖胺(glcnac)的还原端的反应所产生的红色物质(于545nm)。在稀释缓冲溶液(0.1m napi，0.1m nacl，1.5mm葡萄糖二酸-1,4-内酯，ph 5.35)中经稀释为0.25、0.50、0.75、1.00或1.25mm的n-乙酰基-d-葡萄糖胺(glcnac,sigma)在各试验管中透过四硼酸盐处理来还原，接着加入dmab以诱导比色反应。在反应后，于545nm量测吸亮度以制作glcnac的标准反应曲线。在各试验管中于稀释缓冲溶液中将作为物质的玻尿酸稀释为0.54、0.65、0.87、1.23或2.17μm，将玻尿酸酶加入各试验管，接着在37℃下反应5分钟并在100℃下加热5分钟以完成酵素反应。将产物透过以四硼酸盐处理来还原，加入dmab以诱导比色反应。在反应后于545nm量测吸亮度，使用上述的glcnac的标准反应曲线量测酵素活性。使用此方法分析seq id no:1的野生型ph20及根据本发明的ph20变体的酵素动力学。结果，发现赖威佛氏-柏克氏(lineweaver-burk)曲线为线性，这表示根据本发明的ph20变体遵循米氏(michaelis-menten)酵素动力学公式。
[0197]
表4揭示在实施例1的表1中的样品的中从细胞株殖株试验培养#2获得的部分#1及部分#2的酵素动力学的分析。这些结果显示当半乳糖化及甘露糖化程度落于相似范围且唾液酸化程度低时，重组玻尿酸酶的酵素活性会因酵素的高催化效率(kcat/km)而增加。
[0198]
实验结果证实具有相同氨基酸结构的酵素的活性可能受糖苷化改变影响，更具体而言，受唾液酸化程度改变影响。因此，这表示在试图透过使用重组方法大量制备野生型ph20玻尿酸酶或其变体来制备工业上有用的玻尿酸酶时，透过控制唾液酸化程度能开发具
有更大工业上应用性的酵素。
[0199]
表4
[0200][0201]
根据本发明的制备重组玻尿酸酶ph20蛋白质或其变体的方法能够制备具有高生产力及高酵素活性的重组玻尿酸酶ph20蛋白质或其变体，故实现重组玻尿酸酶ph20蛋白质或其变体的大量制备及供应。
[0202]
尽管已详细描述本发明的特定组态，但本领域具有通常知识者应理解，实施方式作为优选实施例仅供说明目的，不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由申请专利范围及其均等范围所界定。
[0203]
参考文献
[0204]
1.l.h.bookbinder,a.hofer,m.f.haller,m.l.zepeda,g-a.keller,j.e.lim,t.s.edgington,h.m.shepard,j.s.patton,g.i.frost.(2006).a recombinant human enzyme for enhanced interstitial transport of therapeutics.j.control.release.114,230-241.
[0205]
2.douglas b.muchmore,m.d.,and daniel e.vaughn,ph.d.(2012).accelerating and improving the consistency of rapid-acting analog insulin absorption and action for both subcutaneous injection and continuous subcutaneous infusion using recombinant human hyaluronidase.j.diabetes sci.and technol.6(4):764-72
[0206]
3.e.m.krantz.(1980).low-dose intramuscular ketamine and hyaluronidase for induction of anaesthesia in non-premedicated children.s.afr.med.j.58(4):161-2.
[0207]
4.w.a.clement,s.h.vyas,j.n.marshall,j.h.dempster.(2003).the use of hyaluronidase in nasal infiltration:prospective randomized controlled pilot study.j.laryngol.otol.117(8):614-8.
[0208]
5.thomas j.r.,wallace m.s.,yocum r.c.,vaughn d.e.,haller m.f.,flament j.(2009).the infuse-morphine study:use of recombinant human hyaluronidase(rhuph20)to enhance the absorption of subcutaneously administered morphine in patients with advanced illness.j.pain and symptom manag.38(5):663-672.
[0209]
6.george harb,francois lebel,jean battikha,jeffrey w thackara.(2010)
.safety and pharmacokinetics of subcutaneous ceftriaxone administered with or without recombinant human hyaluronidase(rhuph20)versus intravenous ceftriaxone administration in adult volunteers.curr.med.res.opin.26(2):279-88.
[0210]
7.richard l.wasserman.(2014).overview of recombinant human hyaluronidase-facilitated subcutaneous infusion of igg in primary immunodeficiencies.immunotherapy.6(5):553-67.
[0211]
8.harris r.j.,shire s.j.,winter c.(2004).commercial manufacturing scale formulation and analytical characterization of therapeutic recombinant antibodies.drug.dev.res.61:137-154.
[0212]
9.stephan schilling,torsten hoffmann,fred rosche,susanne manhart,claus wasternack,and hans-ulrich demuth.(2002).heterologous expression and characterization of human glutaminyl cyclase:evidence for a disulfide bond with importance for catalytic activity.biochemistry,35,10849-10857.
[0213]
10.h.tachibana 1,k.taniguchi,y.ushio,k.teruya,k.osada,h.murakami.(1994).changes of monosaccharide availability of human hybridoma lead to alteration of biological properties of human monoclonal antibody.cytotechnology.16(3):151-7.
[0214]
11.veronica restelli,ming-dong wang,norman huzel,martin ethier,helene perreault,michael butler.(2006).the effect of dissolved oxygen on the production and the glycosylation profile of recombinant human erythropoietin produced from cho cells.biotechnol.bioeng.94:481-494.
[0215]
12.m.c.borys,d.i.linzer,e.t.papoutsakis.(1993).culture ph affects expression rates and glycosylation of recombinant mouse placental lactogen proteins by chinese hamster ovary(cho)cells.biotechnology(ny).11:720-724.
[0216]
13.m.c.borys,d.i.linzer,e.t.papoutsakis.(1994).ammonia affects the glycosylation patterns of recombinant mouse placental lactogen-i by chinese hamster ovary cells in a ph-dependent manner.biotechnol.bioeng.43:505-514.
[0217]
14.clark k.j.,chaplin f.w.,harcum s.w.(2004).temperature effects on product quality-related enzymes in batch cho cell cultures producing recombinant tpa.biotechnol.prog.20:1888-1892.
[0218]
15.arming s.,strobl b.,wechselberger c.,kreil g.(1997)in-vitro mutagenesis of ph-20hyaluronidase from human sperm.eur j.biochem.247:810-814