用于治疗常染色体显性BEST1相关视网膜病的组合物

用于治疗常染色体显性best1相关视网膜病的组合物
1.本发明涉及包含用于特异性靶向病理性等位基因的best1编码区中的snp的靶向域的sgrna分子，其中所述靶向域由选自seq id no：3-8、41-44、14-20、50-52和54-55的序列组成，或者具体定义的第一和第二sgrna分子的sgrna分子组合，其中第一和第二sgrna分子各自包含用于特异性靶向病理性等位基因的best1基因编码区或非编码区中的snp的靶向域。本发明还涉及包含编码所述sgrna分子或sgrna分子组合的序列的核酸以及核酸组合。本发明还涉及包含根据本发明的核酸的重组腺病毒相关病毒(aav)，或重组aav组合。所述sgrna分子、所述核酸、所述重组aav和组合是通过例如基于crispr/cas9的基因编辑来编辑bestrophin-1(best1)基因中的靶域以恢复best1通道功能的有用工具。本发明还涉及所述sgrna分子、所述sgrna分子组合、所述核酸、所述核酸组合、所述重组aav和所述重组aav组合，其用于通过手术或疗法治疗人或动物身体的方法，以及用于治疗或预防best1相关视网膜病特别是常染色体显性best1相关视网膜病的方法。
2.best1(mim 607854)基因编码整合膜蛋白，其最显著地定位在人视网膜色素上皮(rpe)的基侧膜上。至少有四种不同的视网膜病，统称为bestrophinopathy，与病理性best1突变有关，包括常染色体显性best黄斑营养不良(marquardt等人，1998；petrukhin等人，1998)，常染色体显性玻璃体视网膜脉络膜病(autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy，advirc；mim607854)(yardley等人，2004)以及常染色体隐性斑bestrophinopathy(arb；mim611809)。最后，一种被称为模式性营养不良的表型可以与典型的best黄斑营养不良分开，并作为在best1中具有特定单一突变p.ala243val的常染色体显性性状遗传(boon等人，2009；khan等人，2018)。
3.best黄斑营养不良是bestrophinopathy中最常见的形式，是主要影响后极的黄斑区的进行性视网膜疾病。瑞典北部和丹麦的患病率估计分别在1∶5 000和约1∶50 000之间。据报告，2017年美国明尼苏达州best黄斑营养不良的患病率在1∶7 000至1∶21 000之间。假设欧洲人群约为5亿人，预计欧洲有10.000至100.000个病例，并且美国/加拿大的数量大致相同。
4.该疾病的特征在于脂褐素样物质和视网膜下液的积聚，导致浆液性视网膜脱离的形成，以及在初始阶段通常类似于“卵黄”(＝卵黄状)的病变。与best黄斑营养不良不同，advirc是一种罕见的周边脉络膜色素性病症，估计发病率为1∶1.000.000。best黄斑营养不良和advirc两者的共同终点是相当程度的光感受器细胞丧失，最终导致视力损伤。到目前为止，人基因突变数据库中已经报道超过250种独立的致病best1突变。best1的显性负性突变是best黄斑营养不良和advirc的原因，从而影响best1的定位、离子门控特性和蛋白质稳定性。因此，这些功能损伤导致了best1氯化物转运功能的丧失。
5.迄今为止，没有用于各种类型的bestrophinopathy的治疗。这与一些正在进行临床试验的其他视网膜营养不良形成对比，特别是基因替代疗法。2017年12月，食品和药物管理局(fda)批准了luxturna，这是首个治疗由rpe65基因功能丧失突变引起的罕见的遗传性早期视力丧失，称为leber先天性黑蒙症(leber congenital amaurosis，lca)的患者的aav载体基因疗法。显示携带编码野生型rpe65的构建体的aav颗粒的视网膜下注射对患者是安
全和有效的，没有引起不良反应。
6.鸡best1-fab复合物的x射线结构揭示，真核生物best1通道是由同源best1亚基构成的五聚体结构。认为该通道参与体积调节和/或钙稳态。假设杂合子best黄斑营养不良或advirc患者中的野生型和突变型蛋白的表达相等，突变型和野生型亚型的寡聚化导致仅仅约3％的由五个野生型亚基组成的功能性通道。因此，等位基因特异性沉默突变体等位基因的同时保持野生型等位基因完整似乎是有效的治疗方法，其消融显性负性或功能获得的基因表达，并因此可以大大增加每个细胞的功能通道单元的比例。最初的报告表明，基于crispr/cas9的基因编辑可以作为废除突变体mrna和蛋白质表达的特异性工具(long等人，2016)。
7.crispr/cas9细菌系统允许经由特定的单导向rna(sgrna)的17-20个核苷酸(nt)序列对人基因组内的任何位点进行靶向。cas9/sgrna复合物结合并切割定义的dna序列，导致基因组的插入或缺失(indel)，这是细胞易错的非同源末端连接(nhej)修复的结果。这导致在大约三分之二的indel等位基因中出现早期终止密码子。该系统的特殊特征是，cas9核酸酶需要识别位于sgrna结合位点3’的称为前间隔区相邻基序(pam)的序列基序。此类pam序列的不存在导致cas9不能切割dna靶点，并且因此是处理特定核苷酸序列的限制性因素。
8.利用crispr/cas9基因组编辑系统的特异性，最近在患者衍生的人诱导多能干细胞(hipsc)(smith等人，2015；yamamoto等人，2017)、患者成纤维细胞(monteys等人，2017；rabai等人，2019)和癌症细胞系(koo等人，2017；lee等人，2018)中以等位基因特异性的方式靶向与常染色体显性疾病相关联的单点突变。此外，这种方法已经成功转化为两种人疾病的动物模型，常染色体显性视网膜色素变性(adrp)的p23h视紫红质敲入小鼠模型(giannelli等人，2018)和常染色体显性遗传形式耳聋的beethoven小鼠(gao等人，2018)，在这两种情况下，得到显著改善的表型。
9.通常，cas9核酸酶活性对疾病等位基因的等位基因特异性靶向可以通过若干方式完成：(1)通过生成在17至20nt的sgrna序列中包含与疾病相关联的核苷酸的sgrna(基于突变的方法)，以删除病理性best1等位基因并消融显性负性或功能获得的基因表达；和(2)通过使用(i)用于编码序列中的杂合变体的单个sgrna或(ii)跨越大基因组区的两个不同内含子snp从而删除基因的一个或若干外显子，将常见单核苷酸多态性(snp)顺式靶向至突变(基于单体型的方法)。等位基因特异性方法的挑战是设计最高效和特异的sgrna，其专门抑制病理性best1等位基因，同时保持野生型等位基因完整，并在基因组中显示无脱靶效应。
10.最近的研究调查了对先天性黑蒙症10型(lca10)患者的crispr/cas9治疗选择(ruan等人，2017)，这是重度形式的遗传性视网膜病症，症状在生命的第一年早期发作。在lca10的细胞模型中，作者表明，与spcas9偶联的sgrna对高效地删除位于人cep290基因的内含子26中的特异性深内含子突变，从而阻止突变体隐蔽外显子的剪接并恢复野生型cep290的表达。2018年7月，领先的基因编辑公司之一editas medicine，inc.(cambridge，ma)发表靶向cep290基因中特定内含子突变的四个sgrna的首个专利申请(专利申请：us 2018/0195058 a1)。2018年12月，同一家公司获得美国食品和药物管理局(fda)的授权，启动用于治疗lca患者的临床试验。四个月后，开始开放标签、单次递增剂量研究，以评估安全性和功效(clinicaltrials.gov identifier：nct03872479)。治疗“edit-101”以视网膜下注射aav颗粒施用，将基因编辑工具递送至光感受器细胞。
11.通常，aav介导的递送是目前用于货物递送至视网膜细胞的黄金标准，并已多次被证明对患者的基因替代应用是安全和有效的，而不引起不良反应。就在最近，fda批准了首个用于治疗lca2患者的aav载体基因疗法(luxturna)。2018年11月，novartis pharmaceuticals corp.宣布欧盟批准luxturna。
12.wo 2019/183630公开了特定的best1 sgrna序列，并教导了这些序列可以用于治疗常染色体显性疾病，如由best1突变引起的视网膜病。如wo 2019/183630所概述，这可以通过使用一种grna或两种sgrna的组合来完成，以便在两个不同的位点进行切割，从而能够删除致病基因的部分。根据wo 2019/183630，当使用一种grna时，它应该靶向显性疾病相关基因中的snp。wo 2019/183630没有教导应该将所述一种grna靶向至病理性等位基因的编码区(外显子)中的snp。当使用两种sgrna时，wo 2019/183630公开了特异性靶向病理性等位基因非编码区的snp的第一sgrna，以及与显性疾病相关基因中的内含子杂交从而诱导内含子序列中的双等位基因双链断裂的第二sgrna。过去，假定非编码区中的双等位基因双链断裂的修复对基因表达没有影响。然而，随着非编码rna和其他非编码必需调控元件的发现，我们对人基因组中非编码序列的功能意义的认识正在稳步提高，对我们进一步理解人基因组的调控有巨大的影响。因此，2019/183630的方法可能产生副作用，因为目前人们还不能理解此类方法可能对best1或在顺式或反式位置的其他基因的表达做出什么。
13.本发明要解决的问题是提供用于治疗常染色体显性best1相关视网膜病的有效和特别安全的手段，其通过使用crispr/cas9介导的方法的基因编辑来抑制突变体best1的表达。
14.现在可用的软件工具有助于预测sgrna序列的功效和特异性，尽管仅在20个核苷酸的长度上。到目前为止，还没有预测工具可用于预测截短的(20nt)sgrna，截短的sgrna通常具有更高的序列特异性，以及因此相比原始20ntsgrna提高的基因座特异性crispr/cas9核酸酶功效。更高的序列特异性导致更少的基因组范围的脱靶。
15.本发明要解决的另一个问题是提供用于crispr/cas9介导的方法的手段，该方法具有更高的序列特异性，以及因此相比原始20nt sgrna提高的基因座特异性crispr/cas9核酸酶功效，从而减少基因组范围的脱靶的风险，并且因此，进一步提高功效和安全性。
16.本发明所依据的问题由权利要求中限定的主题来解决。
17.以下附图用于说明本发明。
18.图1显示了靶向best1 i295del突变的sgrna的计算预测。(a)通过“优化的crispr设计工具”(zhang，mit broad institute)预测靶向best1-i295del(884-886deltca)基因座的4个sgrna。(b)考虑到推定的脱靶结合，20nt导向物#1-4的特异性得分。得分范围从0到100。黑条＝得分＞50(高质量)，白条＝得分＜50(低质量)；*i295del在20nt sgrna序列中的位置。值得注意的是，中靶(on-target)预测的得分算法只限于20nt的sgrna。
19.图2显示了所分析的基因组best1区的分析以及用于靶向的通过在计算机上分析选择的22个snp的位置。基因：相互作用蛋白样1(rab3il1)，铁蛋白重链1(fth1)，best1；ex：编码外显子1-11；三角形：best1基因座内所选snp的位置；三角形(浅灰色)：best1的编码序列内的snp。
20.图3显示了根据best1基因座处鉴定的22个snp估计的欧洲人群中best1基因座的单体型频率。灰色阴影线：单体型频率＞5％；有框方块：best1编码区中的snp。
21.图4显示了根据best1基因座处的22个经鉴定的snp估计的best黄斑营养不良患者批次的单体型频率。第二行：粗框内的核苷酸序列；有框方块：best1编码区中的snp；仅指定杂合染色体，非填充位置对应于参考序列；*具有较低频率的核苷酸；单体型编号对应于图3中所示的欧洲人群。
22.图5显示了计算设计的sgrna的评估。更具体地，显示了hek293t细胞中指定sgrna的等位基因特异性spcas9切割的评估。(a)用pcag-egxxfp(空载体)(左)、pcag-eg_on-target_fp sgrna_x_20nt(上排)或pcag-eg_non-target_fp sgrna_x_20nt(下排)转染的hek293t细胞的免疫荧光成像；(b)相对于pcag-egxxfp基础荧光强度的(a)的量化(n＝3-4)。
23.图6显示了计算设计的sgrna的优化。更具体地，显示了hek293t细胞中sgrna特异性的优化。通过读板器测量相对于空pcag-egxxfp载体的egfp荧光强度的量化。用sgrna截短(a-d)和额外的序列修饰(b和d)后的pcag-eg_on-target_fp sgrna_x或pcag-eg_non-target_fp sgrna_x转染hek293t细胞；有框的sgrna显示出对指示snp变体的最高特异性和效率。
24.图7显示了crispr/spcas9体外基因编辑在best黄斑营养不良-患者衍生的hipsc-rpe细胞中的作用。更具体地，显示了等位基因特异性基因编辑在i295del突变杂合的best黄斑营养不良相关的hipsc-rpe细胞中的作用。(a)来自未处理和经编辑的cdna样品的i295del基因座的序列踪迹。(b)未处理和经编辑的hipsc-rpe细胞在转移小室(transwell)过滤器上生长6周后的共聚焦免疫荧光图像。β-连环蛋白充当单层完整性的对照。(c)对照、未处理和经编辑的hipsc-rpe细胞裂解物的代表性westem印迹图像。(d)来自(c)的best1蛋白表达归一化至来自相同印迹的β-肌动蛋白的量化。(e)慢病毒转导后表达yfp的对照hipsc-rpe细胞的代表性荧光图像。(f)在应用含cl溶液后0至6分钟的时间过程中，6分钟的碘化物预温育步骤后(时间点0)的yfp的荧光强度；*＝相对于未经处理的患者样品，p＜0.05。
25.图8显示了处理全基因组测序数据的生物信息学工作流程。更具体地，显示了来自全基因组测序的测序数据的过滤过程。给出了在未处理和crispr/cas9处理的样品中通过全基因组测序发现的遗传变异的过滤过程的说明。
26.图9显示了自限性的“多合一”aav载体的生成。更具体地，显示了启动子类型和序列长度对crispr/spcas9切割性能的作用。具有指示启动子类型和序列长度的aav构建体的示意性代表，其用于(a)双重aav载体递送(将spcas9和sgrna工程化改造至两个单独的aav表达质粒(paav-rsv-spcas9 paav-u6-sgrna-gfp))和(b)单一aav载体递送(将spcas9和sgrna工程化改造至一个aav表达质粒)。(c)通过读板器测量相对于空pcag-egxxfp载体的egfp荧光强度的量化。用在指示启动子的控制下的spcag-eg_i295del_fp和含有sgrna_i295del17nt和spcas9的aav质粒共转染hek293t细胞。
27.图10显示了计算设计的sgrna的优化。更具体地，显示了在hek293t细胞中sgrna特异性的优化。通过读板器测量相对于空pcag-egxxfp载体的egfp荧光强度的量化。用pcag-eg_on-target_fp sgrna_x或pcag-eg_non-target_fp sgrna_x转染hek293t细胞。x＝snp-变体390t(a)，snp-变体390c(b)，snp-变体429t(c)和snp-变体429c(d)。圈内数字标记的sgrna显示了强crispr/cas9活性对病理性等位基因的期望作用，而野生型等位基因保持不
受影响。
28.图11显示了计算设计的sgrna的优化。更具体地，显示了在hek293t细胞中sgrna特异性的优化。通过读板器测量相对于空pcag-egxxfp载体的egfp荧光强度的量化。用pcag-eg_on-target_fp sgrna_x或pcag-eg_non-target_fp sgrna_x转染hek293t细胞。x＝snp-变体534c(a)，snp-变体543a(b)，snp-变体517a(c)，snp-变体517c(d)，snp-变体542a(e)，snp-变体542t(f)和snp-变体581g(g)。圈内数字标记的sgrna显示了强crtspr/cas9活性对病理性等位基因的期望作用，而野生型等位基因保持不受影响。
29.图12显示了计算设计的sgrna的优化。更具体地，显示了在hek293t细胞中sgrna特异性的优化。通过读板器测量相对于空pcag-egxxfp载体的egfp荧光强度的量化。用pcag-eg_on-target_fp sgrna_x或pcag-eg_non-target_fp sgrna_x共转染hek293t细胞。x＝snp-变体749g(a)，snp-变体749a(b)，snp-变体756c(c)和snp-变体756t(d)。圈内数字标记的sgrna显示了强crispr/cas9活性对病理性等位基因的期望作用，而野生型等位基因保持不受影响。对seq id no：14的参考将由对seq id no：54的参考所替换，对seq id no：15的参考将由对seq id no：55的参考所替换，因为这些数据通过使用根据seq id no：54和55的sgrna生成。
30.图13显示了计算设计的sgrna的优化。更具体地，显示了在hek293t细胞中sgrna特异性的优化。通过读板器测量相对于空pcag-egxxfp载体的egfp荧光强度的量化。用pcag-eg_on-target_fp sgrna_x或pcag-eg_non-target_fp sgrna_x转染hek293t细胞。x＝snp-变体759t(a)，snp-变体759c(b)和snp-变体i295del(c)。圈内数字标记的sgrna显示了强crispr/cas9活性对病理性等位基因的期望作用，而野生型等位基因保持不受影响。
31.如本文所用，术语“sgrna分子”是指在单个rna分子中包含crispr rna(crrna)和tracr rna(tcrna)的单导向rna分子。crrna是通常为17至20个核苷酸的序列，它与靶dna互补，并且在本公开中也可以称为“靶向域”、“sgrna序列”或“sgrna”。tcrna通过充当cas核酸酶的结合支架负责cas9内切核酸酶的活性。sgrna分子优选通过简单的watson和crick碱基配对来靶向靶域的互补序列。crrna和tcrna优选通过四环连接，从而形成sgrna分子。优选地，tcrna是在其内部具有茎环结构的碱基对，并且附接至内切核酸酶。crrna识别特定的互补靶区，cas9在与crrna和tcrna结合后将切割靶区。随着sgrna分子的crrna序列中的修饰，可以改变结合位置、效率和特异性。
32.如本文所用，术语“cas9分子”是指编码crispr相关蛋白9的分子。cas9蛋白在某些细菌对dna病毒和质粒的免疫防御中起着重要作用。它的主要功能是切开dna，因此它可以改变细胞的基因组。更特别地，cas9是与例如酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)中的成簇规律间隔的短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，简称crispr)适应性免疫系统相关的rna引导的dna内切核酸酶。酿脓链球菌利用crispr来记忆，以及利用cas9随后询问和切割外来dna，如入侵的噬菌体dna。cas9通过解开外来dna并检查与导向rna中约17至20bp的间隔物区互补的位点来进行这种询问。如果dna底物与导向rna互补，则cas9切割入侵的dna。在分子生物学中，cas9被用于crispr/cas9介导的基因组编辑技术中。术语“cas9”可以用于天然存在的cas9，例如spcas9，或其可以用于与野生型cas9相比包含一个或多个突变的重组cas9。
33.如本文所用，术语“spcas9”是指酿脓链球菌的cas9蛋白。它可以用于天然存在的
spcas9或用于与野生型spcas9相比包含一个或多个突变的重组spcas9。
34.如本文所用，术语“前间隔区相邻基序(pam)”是指在靶dna序列之后优选2至6个碱基对的短序列基序，其对每个cas亚型具有特异性(例如spcas9的pam位点5`-ngg-3`)。此类pam序列不存在将导致cas9不能切割dna靶标，并因此是处理特定核苷酸序列的限制性因素。
35.如本文所用，术语“自限性多合一aav”是指腺病毒相关的病毒，其中spcas9和sgrna被工程化改造至单个aav表达质粒中。“多合一”载体优选包含用于spcas9表达的截短的cmv最小启动子序列和驱动sgrna域表达的截短的u6最小启动子序列。此外，将spcas9的自限性序列引入aav载体，以抑制持续的cas9表达和不必要的脱靶切割。因此，sgrna分子的靶向域加上相应的pam位点添加在spcas9序列之前和之后。在这种配置中，spcas9被引导用于靶向的基因组切割和aav质粒本身的切割以删除spcas9序列，从而限制spcas9蛋白的产生。因此，“自限性多合一aav载体”包含spcas9序列、sgrna分子和sgrna分子的自限性靶向域加上相应的pam位点。
36.如本文所用，术语“best1”是bestrophin-1的简称。它可以与术语“vmd2”同义使用。best1属于四个进化相关基因(best1-4)的bestrophin家族，其编码整合膜蛋白。在人中，它们的功能特别是作为钙激活的阴离子通道，尽管其各自在基因调控和蛋白质的组织分布方面具有特异性。
37.术语“best1相关视网膜病”涉及由best1基因(mim 607854)中的突变引起的视网膜病。best1蛋白最突出地定位于眼后部中rpe的基底侧质膜。best1基因中的突变影响best1的定位、蛋白质的稳定性和离子门控特性。因此，这些功能损伤导致best1通道功能特别是阴离子转运功能，更优选地氯化物转运功能的丧失，最终导致对视网膜的损害。
38.如本文所用，术语“best黄斑营养不良”也可以称为“best卵黄状黄斑营养不良(bvmd)”、“卵黄状黄斑营养不良-2(vmd2)”，或简称“best病
″
。它是涉及rpe/光感受器复合物的遗传性视网膜营养不良，其在疾病的早期阶段的特征在于在黄斑区中黄色“卵黄”样病变的出现。这是bestrophinopathy的疾病组中最常见的表型。患有分组在bestrophinopathy中的任何疾病的患者，特别是常染色体显性best黄斑营养不良的患者，具有best1基因中的突变，其导致通道功能丧失并最终导致视网膜变性。
39.如本文所用，术语“常染色体显性玻璃体视网膜脉络膜病(advirc)
″
是指脉络膜色素性病症。根据现有技术的状态，具体地，五个best1基因突变p.(gly83asp)、p.(val86met)、p.(val235ala)、p.(tyr236cys)和p.(val239met)是advirc的原因。该病的典型特征在于周边视网膜环状色素沉着带，有明确的后部分界，并能够与发育性眼部异常如小角膜、小眼(microphthalmos)、闭角型青光眼和白内障相关。
40.术语“恢复best1通道功能”特别是指best1阴离子转运功能特别是氯化物转运功能的修复，如果best1通道功能例如通过bestl基因中的一个或多个突变而受到损害。在相同条件下进行测试并与在best1基因中没有突变的对照的best1通道功能进行比较时，可以在crispr/cas处理的患者衍生的细胞系中进行的给定测定中相对于未处理细胞中的pestl通道功能的可测量水平确定best1通道功能的修复。如果可以恢复至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更多的best1通道功能，则根据本发明恢复best1通道功能。
41.如本文所用，术语“病理性等位基因”是指携带导致相应疾病例如本文所述的best1相关视网膜病的突变的best1基因的等位基因。特别地，如本文所用，术语“病理性等位基因”是指从一个亲代遗传的特定基因组位置处的一对基因序列或dna序列中的一个。更特别地，所述“病理性等位基因”负责致病性突变体best1基因转录物的表达，该转录物导致通道功能的丧失，并因此引起如本文所述的best1相关视网膜病。
42.如本文所用，术语“野生型best1基因”优选是指编码功能性best1基因转录物的best1基因，其确保best1阴离子转运功能。因此，携带两个拷贝的野生型best1等位基因的受试者不患有如本文所述的best1相关视网膜病。
43.如本文所用，术语“包含”不应被理解为仅限于“由......组成”的意思(即排除额外的其他物质的存在)。相反，“包含”意味着可以存在任选地额外的物质。作为特别预想的实施方案，术语“包含”涵盖落入其范围“由......组成”内(即排除额外的其他物质的存在)和“包含但不由其组成
″
(即需要额外的其他物质的存在)，前者更优选。
44.本发明的目的是提供用于治疗常染色体显性best1相关视网膜病的新手段，其通过使用crispr/cas9介导的基因组编辑技术消除病理性显性负性转录物的表达来恢复best1通道功能。这特别是best黄斑营养不良和advirc患者的可能治疗性干预。本发明提供了用于与常染色体显性best1相关视网膜病有关的靶核酸序列编辑的新手段。
45.在本发明的第一个目标中，设想提供包含靶向域的sgrna分子，其中所述靶向域包含选自由seq id no：1-20和39至55组成的组的序列。该靶向域优选与best1基因中的靶域结合。优选地，该靶向域具有17至20个核苷酸的长度。已经鉴定了根据seq id no：1至20和39至55的序列高效和特异性用于专门地抑制病理性best1等位基因，同时保持野生型等位基因完整，并在基因组中显示无脱靶效应。sgrna分子的靶向域优选与sgrna分子的crrna相对应。除了靶向域外，根据本发明的sgrna分子优选包含tcrna域。在优选的实施方案中，sgrna分子的tcrna域包含根据seq id no：21的核酸序列。
46.本发明进一步提供了sgrna分子，其包含用于特异性靶向病理性等位基因的best1编码区中的snp的靶向域，其中所述靶向域由选自seq id no：3-8、41-44、14-20和50-55的序列组成。
47.本发明进一步提供了两个sgrna分子即第一sgrna分子和第二sgrna的sgrna分子组合，其各自包含用于特异性靶向病理性等位基因的best1基因编码区中的snp或用于特异性靶向病理性等位基因的best1基因非编码区中的snp的靶向域，其中
48.(i)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：20或51-52的序列组成，则第二sgrna的靶向域由根据seq id no：1-19、39-50或53-55的序列组成；
49.(ii)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：1-2或39-40的序列组成，则第二sgrna的靶向域由根据seq id no：3-20或41-55的序列组成；
50.(iii)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：3-6或41的序列组成，则第二sgrna的靶向域由根据seq id no：1-2、39-40、7-20或42-55的序列组成；
51.(iv)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：7-8或42-44的序列组成，则第二sgrna的靶向域由根据seq id no：1-6、39-41、9-20或45-55的序列组成；
52.(v)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：9-10、45-46或53的序列组成，则第二sgrna的靶向域由根据seq id no：1-8、39-44、11-20、47-52或54-55的序列组成；
53.(vi)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：11-12或47-48的序列组成，则第二sgrna的靶向域由根据seq id no：1-10、39-46、13-20或49-55的序列组成；
54.(vii)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：13或49的序列组成，则第二sgrna的靶向域由根据seq id no：1-12、39-48、14-20或50-55的序列组成；
55.(viii)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：14-15或54-55的序列组成，则第二sgrna的靶向域由根据seq id no：1-13、39-53或16-20的序列组成；
56.(ix)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：16-17或50的序列组成，则第二sgrna的靶向域由根据seq id no：1-15、39-49、18-20或51-55的序列组成；或
57.(x)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：18-19的序列组成，第二sgrna的靶向域由根据seq id no：1-17、39-55或20的序列组成。
58.因此，优选的组合是seq id no：1与seq id no：3-20或41-55中的任一个；seq id no：2与seq id no：3-20或41-55中的任一个；seq id no：39与seq id no：3-20或41-55中的任一个；seq id no：40与seq id no：3-20或41-55中的任一个；seq id no：3与seq id no：1-2、39-40、7-20或42-55中的任一个；seq id no：4与seq id no：1-2、39-40、7-20或42-55中的任一个；seq id no：5与seq id no：1-2、39-40、7-20或42-55中的任一个；seq id no：6与seq id no：1-2、39-40、7-20或42-55中的任一个；seq id no：41与seq id no：1-2、39-40、7-20或42-55中的任一个；seq id no：7与seq id no：1-6、39-41、9-20或45-55中的任一个；seq id no：8与seq id no：1-6、39-41、9-20或45-55中的任一个；seq id no：42与seq id no：1-6、39-41、9-20或45-55中的任一个；seq id no：43与seq id no：1-6、39-41、9-20或45-55中的任一个；seq id no：44与seq id no：1-6、39-41、9-20或45-55中的任一个；seq id no：9与seq id no：1-8、39-44、11-20、47-52或54-55中的任一个；seq id no：10与seq id no：1-8、39-44、11-20、47-52或54-55中的任一个；seq id no：45与seq id no：1-8、39-44、11-20、47-52或54-55中的任一个；seq id no：46与seq id no：1-8、39-44、11-20、47-52或54-55中的任一个；seq id no：53与seq id no：1-8、39-44、11-20、47-52或54-55中的任一个；seq id no：11与seq id no：1-10、39-46、13-20或49-55中的任一个；seq id no：12与seq id no：1-10、39-46、13-20或49-55中的任一个；seq id no：47与seq id no：1-10、39-46、13-20或49-55中的任一个；seq id no：48与seq id no：1-10、39-46、13-20或49-55中的任一个；seq id no：13与seq id no：1-12、39-48、14-20或50-55中的任一个；seq id no：49与seq id no：1-12、39-48、14-20或50-55中的任一个；seq id no：14与seq id no：1-13、39-53或16-20中的任一个；seq id no：15与seq id no：1-13、39-53或16-20中的任一个；seq id no：54与seq id no：1-13、39-53或16-20中的任一个；seq id no：55与seq id no：1-13、39-53或16-20中的任一个；seq id no：16与seq id no：1-15、39-49、18-20或51-55中的任一个；seq id no：17与seq id no：1-15、39-49、18-20或51-55中的任一个；seq id no：50与seq id no：1-15、39-49、18-20或51-55中的任一个；seq id no：18与seq id no：1-17、39-55或20中的任一个；seq id no：19与seq id no：1-17、39-55或20中的任一个；seq id no：20与seq id no：1-19、39-50或53-55中的任一个；seq id no：51与seq id no：1-19、39-50或53-44中的任一个；seq id no：52与seq id no：1-19、39-50或53-55中的任一个。
59.特异性靶向病理性等位基因的best1基因中的snp意指本发明的sgrna或sgrna组合特异性靶向仅病理性等位基因。因此，野生型等位基因保持不受本发明方法的影响。如果
本发明仅提及单个sgrna分子，则所述单个sgrna靶向best1基因编码区(外显子序列)中的snp。如果本发明提及两个sgrna分子的sgrna分子组合，则两个sgrna分子都可以靶向best1基因编码区(外显子序列)中的snp，或两个sgrna分子都可以靶向best1基因非编码区(内含子序列)中的snp。可替代地，所述组合的第一sgrna分子可以靶向best1基因非编码区中的snp并且所述组合的第二sgrna分子可以靶向best1编码区中的snp，或者第一sgrna分子可以靶向best1基因编码区中的snp并且第二sgrna分子可以靶向best1非编码区中的snp。因此，本发明通过明确排除sgrna的使用来提供高度等位基因特异性的方法，该sgrna在best1基因组区内诱导双链断裂，对best1或在顺式或反式位置的其他基因的表达具有未知后果。
60.在优选的实施方案中，sgrna分子组合如下：
61.(xi)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：1或39的序列组成，则第二sgrna的靶向域由根据seq id no：13或49的序列组成；
62.(xii)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：9或45的序列组成，则第二sgrna的靶向域由根据seq id no：11、47、13或49的序列组成；
63.(xiii)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：11或47的序列组成，则第二sgrna的靶向域由根据seq id no：13或49的序列组成；
64.(xiv)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：10、46或53的序列组成，则第二sgrna的靶向域由根据seq id no：12或48的序列组成；或
65.(xv)如果第一sgrna的靶向域由根据seq id no：13的序列组成，则第二sgrna的靶向域由根据seq id no：15或55的序列组成。
66.在另一个优选的实施方案中，本发明涉及那些sgrna分子，其中靶向域具有17、18或19个核苷酸的长度，即根据seq id no：3-4、6-8、16-17、20、40、42、50和52。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及sgrna分子组合，其中第一和第二sgrna分子的靶向域具有17、18或19个核苷酸的长度，即本文公开的任何组合，但缺少与seq id no：39、41、43、44、45、46、47、48、49、14、15、18、19、51、54和55的组合。具有尽可能短的靶向域的sgrna分子的优点是减少基因组范围的脱靶，因为在短sgrna中非互补碱基的序列结合比在长sgrna中在能量上更不稳定。在短sgrna中，偏离的碱基具有更强的能量权重，因为更少的互补碱基有助于结合的稳定性。因此，截短的sgrna分子可以降低基因组范围的脱靶的风险。然而，随着靶向域长度的减少，靶向域的功效和特异性也可能下降。因此，解决特定snp的最有效的靶向域是不可预测的，但必须单独设计。
67.本发明还涉及包含根据本发明的sgrna域的核酸。根据本发明的sgrna域由编码根据本发明的sgrna分子的序列组成。因此，本发明还涉及包含编码根据本发明的sgrna分子的序列的核酸。本发明还涉及包括两个sgrna域的组合的核酸，其中第一sgrna域由编码本文所述的任何sgrna分子组合中的第一sgrna分子的序列组成，并且第二sgrna域由编码选定的sgrna分子组合中的第二sgrna分子的序列组成。
68.本发明还涉及两种核酸的核酸组合，其中
69.(i)第一核酸包含由编码根据本发明的任何sgrna分子组合的第一sgrna分子的序列组成的sgrna域，并且
70.(ii)第二核酸包含由编码根据本发明的选定sgrna分子组合的第二sgrna分子的序列组成的sgrna域。
71.根据本发明的核酸还包含优选编码cas9分子，更优选spcas9分子的序列。在根据本发明的核酸组合中，一种或两种核酸可以进一步包含编码cas9分子，特别是spcas9分子的序列。在优选的实施方案中，包含两种sgrna域的组合的根据本发明的核酸不进一步包含编码cas9分子的序列。
72.本发明提供的基因组编辑工具的体内翻译需要在体内将cas9/sgrna机制高效递送到有丝分裂后的rpe细胞中。例如，这可以通过使用合适的病毒，如重组腺病毒相关病毒(aav)来实现。
73.因此，本发明的另一方面提供了包含根据本发明的核酸的重组aav。优选地，该重组aav包括一个sgrna域和编码cas9分子特别是spcas9分子的序列两者。编码spcas9的基因优选具有约4.0至约4.2kb，更优选约4.1kb的大小。在优选的实施方案中，spcas9包含如seq id no：22所示的氨基酸序列。在进一步优选的实施方案中，spcas9由如seq id no：23所示的核酸序列编码。
74.本发明的另一方面提供了重组腺病毒相关病毒(aav)，其包含根据本发明的包含两种sgrna域的组合的核酸或核酸组合。在这种情况下，用于表达cas9特别是spcas9的序列优选在第二重组aav中提供，所述第二重组aav优选不包含任何sgrna域。
75.在又另一方面，本发明提供了两种重组腺病毒相关病毒(aav)的重组腺病毒相关病毒组合，其中
76.(i)第一重组腺病毒相关病毒(aav)包含根据本发明的任何核酸组合的第一核酸，以及
77.(ii)第二重组腺病毒相关病毒(aav)包含选定核酸组合的第二核酸。
78.根据本发明的重组aav可以设计成与第二重组avv组合，例如如图9a所示，其中域“i295del”是指特定的sgrna靶向域，其可以用根据本发明的任何sgrna靶向域替换，只要它们在一组相关联的avv中由相同的靶向域替换。特别地，在此类双载体系统中，用于spcas9表达的全长rsv启动子可以用于第一载体中，并且用于sgrna域表达的强全长u6启动子用于第二载体。
79.根据本发明的高度优选的实施方案，包含含有一个sgrna域(根据本发明的sgrna分子或sgrna分子组合的第一或第二sgrna域)的核酸的重组avv是包含用于cas9特别是spcas9表达的最小cmv启动子序列的“多合一”aav载体。最小cmv启动子序列优选是全长cmv启动子的片段，特别是全长cmv启动子的连续片段。优选地，其是如seq id no：24所示的全长cmv启动子的片段。全长cmv启动子的片段优选具有约90bp至约180bp，更优选地约100bp至约159bp的长度。特别优选的是100bp的最小cmv启动子，其包含如seq id no：25所示的序列。最优选的是159bp的最小cmv启动子，其包含如seq id no：26所示的序列。
80.此外，“多合一”avv优选包含与polya信号序列组合的用于驱动sgrna域表达的启动子。用于驱动sgrna域表达的合适启动子的实例是最小h1启动子序列。最小h1启动子序列优选是全长h1启动子的片段，特别是全长h1启动子的连续片段。优选地，其是如seq id no：27中所示的全长h1启动子的片段。全长h1启动子的片段优选具有约80bp至约120bp，更优选地约90bp至约100bp，最优选地约95bp的长度。特别优选的是95bp的最小h1启动子，其包含如seq id no：28所示的序列。
81.在本发明的高度优选的实施方案中，用于驱动sgrna域表达的启动子是缩短的u6
启动子。缩短的u6启动子序列优选是全长u6启动子的片段。它可以是全长u6启动子的连续片段或由全长u6启动子的两个连续片段组成的全长u6启动子的片段。如果片段由全长u6启动子的两个连续片段组成，它优选包含全长u6启动子的5’和3’末端，即它包含全长u6启动子序列内核酸的缺失。所述缺失优选具有约130至约150bp，更优选地约142bp的长度。优选地，缩短的u6启动子是如seq id no：29所示的全长u6启动子的片段。全长u6启动子的片段优选具有约80bp至约120bp，更优选地约90bp至约110bp，最优选地约99bp的长度。特别优选的是99bp的缩短的u6启动子，其包含如seq id no：30所示的序列。
82.polya信号序列优选是最小polya信号序列，其是全长polya信号序列的片段。全长poly a信号序列的片段优选具有约30bp至约60bp，更优选地约40bp至约55bp，最优选地约49bp的长度。特别优选的是49bp的最小poly a信号序列，其包含如seq id no：31所示的序列。
83.在优选的实施方案中，重组aav的以上所列域如图9b中所示排列。
84.在特别优选的实施方案中，本发明提供了自限性“多合一”aav载体，其包含：
85.(i)用于促进sgrna域表达的缩短的u6启动子序列，优选根据seq id no：30，其中缩短的u6启动子位于sgrna域的上游；
86.(ii)用于促进spcas9表达的最小cmv启动子序列，优选根据seq id no：26，其中cmv启动子序列位于编码spcas9分子的序列的上游；以及
87.(iii)第一和第二自限性序列，其各自包含其3’末端侧接pam位点序列的sgrna分子的靶向域，其中第一自限性序列位于spcas9序列的5`，并且第二自限性序列位于spcas9序列的3`。
88.取决于表达cas内切核酸酶的细菌物种，编码pam位点的序列优选具有3、4、5或6个核苷酸的长度。在进一步优选的实施方案中，pam序列包含氨基酸序列“ngg”或“nag”。在进一步优选的实施方案中，根据seq id no：1、2、5、6、7、9、10、11、12、13、14、54、15、55、16、17、18、19、20、39、40、42、43、45、53、46、47、48、49、50、51和52的sgrna靶向域与包含氨基酸序列“ngg”的pam组合，根据seq id no：3、41、4、8和44的sgrna靶向域与包含氨基酸序列“nag”的pam组合。
89.上述根据本发明的自限性“多合一”aav载体不包含任何全长u6启动子序列或全长cmv启动子序列。
90.在进一步优选的实施方案中，本发明涉及如图9b所示的重组aav。在图9b中，域“i295del”是指特定的sgrna靶向域(侧接pam序列)，其可以由根据本发明的任何sgrna靶向域替换，只要它们在多合一aav中由相同的靶向域替换。图9b中的术语“i295del sgrna”是指包含特定sgrna靶向域“i295del”的sgrna域(即完整的sgrna)。i295del sgrna”域可以由根据本发明的任何sgrna域替换，只要它是按照spcas9序列的5’和3’的sgrna靶向域的替换来替换。
91.在本发明的优选实施方案中，重组aav包含aav2-itr序列、缩短的u6启动子序列，优选根据seq id no：30、根据本发明的sgrna域、用于促进spcas9表达的cmv启动子序列，优选根据seq id no：26、第一sgrna靶向域，其(i)与所选sgrna域的sgrna靶向域相同，并且(ii)侧翼为pam位点序列，spcas9序列，优选根据seq id no：23，第二sgrna靶向域，其(i)与所选sgrna域的sgrna靶向域相同，并且(ii)侧翼为pam位点序列，以及avv2-itr序列。优选
地，所列域的顺序与aav中域在5’到3’方向的顺序相对应。在特别优选的实施方案中，sgrna靶向域包含如seq id no：1至20或39-55所示的序列。
92.优选地，根据本发明的多合一重组aav具有约4.5至约4.9kb，更优选地约4.6至约4.8kb的长度。
93.在根据本发明的腺病毒相关病毒(aav)组合中，该组合的一种或两种aav可以是本文所述的“多合一”aav载体或自限性“多合一”aav载体。
94.本发明还涉及
[0095]-根据上文概述的任何实施方案的sgrna分子，
[0096]-根据上文概述的任何实施方案的sgrna分子组合，
[0097]-根据上文概述的任何实施方案的核酸(即包括包含一种sgrna的核酸的实施方案和包含sgrna组合的核酸的实施方案)，
[0098]-根据上文概述的任何实施方案的核酸组合，
[0099]-根据上文概述的任何实施方案的重组aav(即包括包含一种sgrna的aav的实施方案，包含sgrna组合的avv的实施方案)，或
[0100]-根据上文概述的任何实施方案的重组aav组合，其用于通过手术或疗法对人或动物身体进行治疗的方法。
[0101]
此外，本发明涉及根据上文概述的任何实施方案的sgrna分子、根据上文概述的任何实施方案的sgrna分子组合、根据上文概述的任何实施方案的核酸、根据上文概述的任何实施方案的核酸组合、根据上文概述的任何实施方案的重组aav，或根据上文概述的任何实施方案的重组aav组合，其用于治疗或预防best1相关视网膜病的方法，所述best1相关视网膜病特别是常染色体显性best1相关视网膜病，优选地选自由best黄斑营养不良和advirc组成的组。待治疗的受试者优选是人或动物，特别是哺乳动物，最优选是人。
[0102]
在优选的实施方案中，可以由本发明提供的教导治疗的常染色体显性best1相关视网膜病是其中杂合子显性突变通过功能获得作用或以显性负性模式起作用的疾病。
[0103]
预防常染色体显性best1相关视网膜病优选地包括延迟best1相关视网膜病的发作和/或进展。
[0104]
治疗、预防和/或延迟常染色体显性best1相关视网膜病的发作或进展的方法优选包括向受试者施用根据本发明的任何实施方案的sgrna分子、sgrna分子组合、核酸、核酸组合、重组aav或重组aav组合。优选地，sgrna分子、sgrna分子组合、核酸、核酸组合、重组aav或重组aav组合以足以改善跨受试者rpe基底侧膜的氯化物电导的量施用。优选地以足以恢复best1通道功能的量施用。best1通道功能的恢复优选通过用crispr/cas9介导的基因组编辑技术消除或减少病理性显性负性best1基因转录物的表达，同时维持野生型bestl基因转录物的表达来实现。为了做到这一点，优选将sgrna分子、sgrna分子组合、核酸、核酸组合、重组aav或重组aav组合在体内递送至有丝分裂后rpe细胞。
[0105]
在特别优选的实施方案中，该方法包括以下步骤
[0106]
(i)在治疗前对受试者的视力进行评估。
[0107]
(ii)确定疾病相关的突变和整个个体基因组best1基因座的常见已知snp，以定义该受试者的两种单体型。
[0108]
(iii)将根据本发明的sgrna分子、sgrna分子组合、核酸、核酸组合、重组aav或重
组aav组合施用于受试者；和
[0109]
(iv)在步骤(iii)之后，评估受试者的视力。
[0110]
步骤(ii)可以通过获得受试者的血样并提取和分析其dna来进行。
[0111]
然后可以从提取的外周血dna中进行best1基因的分子遗传测试和带best1单体型标签的snp的分析。突变和snp分析可以通过sanger双脱氧链终止法完成，这是基于在体外dna复制期间通过dna聚合酶选择性地掺入链终止双脱氧核苷酸(ddntp)的dna测序的技术。具体地，(i)11个编码序列(外显子)和各自的侧翼内含子区(每个约20个碱基对)和(ii)已鉴定的22个snp(图3和4)的核苷酸序列将从受试者的best1基因和侧翼基因组best1区进行测序。
[0112]
在优选的实施方案中，步骤(iii)是通过视网膜下、玻璃体内或脉络膜上腔注射根据本发明的重组aav颗粒来进行。
[0113]
本发明还涉及药物组合物，其包含根据本发明的sgrna分子、sgrna分子组合、核酸、核酸组合、重组aav或重组aav组合，和药学上可接受的赋形剂和/或载体。本发明还涉及药物组合物的组合，其中第一药物组合物包含根据本发明的任何组合的第一组分，并且第二药物组合物包含根据本发明的选定组合的第二组分。此外，本发明涉及根据本发明的药物组合物或药物组合物的组合，其用于通过手术或疗法来治疗人或动物身体的方法。此外，本发明涉及根据本发明的药物组合物或药物组合物的组合，其用于治疗或预防常染色体显性best1相关视网膜病特别是选自由best黄斑营养不良和advirc组成的组的方法。
[0114]
根据本发明的药物组合物或药物组合物的组合可以另外含有一种或多种常规添加剂。
[0115]
根据本发明的sgrna分子、sgrna分子组合、核酸、核酸组合、重组aav、重组aav组合、药物组合物或药物组合物的组合优选配制成用于视网膜下、玻璃体内或脉络膜上腔注射。
[0116]
根据本发明的sgrna分子、sgrna分子组合、核酸、核酸组合、重组aav、或重组aav组合、药物组合物、或药物组合物的组合可以以有效量施用于有此需要的受试者。在临床前试验和临床试验期间，本领域的技术人员可以通过医师和临床医师熟悉的方法容易地确定待施用的化合物的有效量。优选的施用途径是网膜下、玻璃体内或脉络膜上腔注射。
[0117]
根据本发明的任何组合的单一组分的施用优选同时进行。它们可以在相同的药物制剂中施用。
[0118]
在另一个方面，本发明涉及药物组合物的制备方法，所述方法包括将根据本发明的sgrna分子、sgrna分子组合、核酸、核酸组合、重组aav或重组aav组合与药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体混合。
[0119]
本发明还涉及药物包，其包含一个或多个隔室，其中至少一个隔室包含根据本发明的sgrna分子、任何sgrna组合的每个第一和第二sgrna分子、核酸、任何核酸组合的每个第一和第二核酸、重组aav，或任何重组aav组合的每个第一和第二重组aav、本发明的药物组合物或任何药物组合物的组合中的每个第一和第二药物组合物。根据本发明的组合的第一和第二组分可以包含在药物包的同一隔室或两个单独隔室中。
[0120]
在本发明的具体实施方案中，根据本发明的sgrna分子、sgrna分子组合、核酸、核酸组合、重组aav、重组aav组合、药物组合物和/或药物组合物组合被用作药物，特别是用于
治疗常染色体显性best1相关视网膜病，特别是选自由best黄斑营养不良和advirc组成的组。
[0121]
在本发明的另一个具体实施方案中，根据本发明的sgrna分子、sgrna分子组合、核酸、核酸组合、重组aav、重组aav组合、药物组合物和/或药物组合物组合用于制造药物，所述药物特别是用于治疗常染色体显性best1相关视网膜病，特别是选自由best黄斑营养不良和advirc组成的组。
[0122]
本发明的另一个方面是通过向受试者，特别是向人或动物施用或应用根据本发明的sgrna分子、sgrna分子组合、核酸、核酸组合、重组aav、重组aav组合、药物组合物和/或药物组合物组合来治疗常染色体显性best1相关视网膜病特别是选自由best黄斑营养不良和advirc组成的组的常染色体显性best1相关视网膜病的方法。
[0123]
在又一个方面，本发明提供了通过编辑best1基因中的靶域，优选地通过改善有此需要的受试者的跨rpe基底侧膜的氯化物电导，来恢复best1通道功能的方法。这优选通过利用根据本发明的sgrna分子、sgrna分子组合、核酸、核酸组合、重组aav或重组aav组合通过基于crispr/cas9的基因编辑来完成。特别地，使用crispr/cas9介导的方法进行基因编辑导致致病突变体best1表达的抑制。优选地，crispr/cas9介导的方法进一步导致野生型best1的表达被维持。该方法包括向受试者施用有效量的根据本发明的sgrna分子、sgrna分子的组合、核酸、核酸的组合、重组aav、重组aav的组合、药物组合物和/或药物组合物的组合。
[0124]
下面的实施例解释本发明，但不被认为是限制性的。应该理解，本文公开的表明本发明的特定实施方案的详细描述和具体实施例，仅以说明的方式给出，因为本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域的技术人员来说将从本说明书中变得显而易见。
[0125]
实施例1——基于1000基因组计划(1000g)的数据的计算机snp分析
[0126]
通过基于1000基因组计划(ucsc人基因组浏览器2009年2月(grch37/hg 19))发布的snp数据的基因型填充(genotype imputation)，分析了欧洲人群中best1基因座加上5’末端处的15kb侧翼区的snp杂合性。该数据集包含来自欧洲人群的502名个体。为了过滤重复区和低复杂性dna序列中的snp，使用了软件repeatmasker。通过hapview软件估计单体型频率。
[0127]
实施例2——来自best黄斑营养不良患者的细胞系的生成和sanger测序分析
[0128]
从13名参与者收集皮肤活检，包括2名健康对照和11名携带已知best1突变的best黄斑营养不良(n11k、s108r、r218c、q238r、a243v和i295del)和advirc(v86m)患者。经由过表达转录因子oct3/4、sox2、klf4和c-myc，建立了成年人真皮成纤维细胞并将其重编程为人诱导多能干细胞(hipsc)(takahashi等人，2007)。如brandl等人(2014)所述，使这些细胞随后分化为hipsc衍生的rpe细胞。通过sanger测序用从患者和对照成纤维细胞中提取的基因组dna以及从三个受影响的家庭成员的血样中提取的基因组dna进行基因分型。
[0129]
实施例3——靶向sgrna的计算设计和评估
[0130]
为了计算预测高质量的sgrna序列，使用了两个预测程序，即zhang实验室(mit broad研究所，剑桥，美国)提供的“优化crispr设计工具”(http：//tools.genome-engineering.org)和benchling公司(美国旧金山)提供的“benchling”(http：//benchling.com)。在hek293t细胞中通过基于荧光的测定，体外验证sgrna的功效和等位基
因特异性(mashiko等人，2013)。将含有野生型(非靶)或突变相关(中靶)best1序列的250-500bp基因组片段克隆在pcag-egxxfp质粒的5’和3’egfp片段之间。为了表达cas9和sgrna，使用px330质粒(addgene，uk)。将pcag-egxxfp-靶标和px330-sgrna/cas9质粒共转染到hek293t细胞中，并在转染后72小时在读板器上测量重构的egfp荧光。
[0131]
实施例4——hipsc和hipsc-rpe中的基因组编辑
[0132]
使用amaxa nucleofector技术，通过电穿孔进行纯化的cas9蛋白/sgrna核糖核酸蛋白(rnp)复合物至hipsc和hipsc-rpe中的递送。用geneart精确grna合成试剂盒(thermofisher scientific，usa)生成全长的sgrna，该试剂盒使用编码靶序列和互补t7启动子序列的两个单链寡核苷酸。然后将合并的寡核苷酸进行pcr扩增，生成sgrna模板用于体外转录。纯化后，将所得sgrna与重组geneart truecut streptococcus cas9(spcas9)核酸酶复合以形成稳定的rnp复合物。
[0133]
实施例5——确定经处理的hipsc和hipsc-rpe的切割效率和特异性
[0134]
为了分析转染后hipsc的编辑效率，通过使用涵盖靶区的引物对进行提取的基因组dna的pcr扩增，来确定best1靶基因座处indel形成的百分比。将pcr产物亚克隆到pcr载体pgem-t中，并通过sanger测序分析40-50个单克隆。
[0135]
实施例6——从crispr-cas9处理的克隆细胞生成患者hipsc-rpe细胞系
[0136]
通过在96孔板中分离经编辑的hipsc来生成单细胞群。扩增克隆细胞以生成复制的板，用于在best1中靶区中进行indel筛选。选择证实有双链断裂导致移码突变和过早终止密码子的来自患者hipsc的单个克隆，用于分化成hipsc-rpe细胞，用于进一步表征。详细的程序已在之前描述(brandl等人，2014)。
[0137]
实施例7——蛋白质样品制备，sds page，定量western印迹分析
[0138]
全细胞蛋白质样品制备如milenkovic等人(2015)中所述进行。蛋白质样品通过sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳在10％凝胶上分离，并随后转移到immobilon-fl(li-cor bioscience，bad homburg，germany)膜(millipore，bedford，ma，usa)上。分别在4℃on下进行一抗和二抗的温育。使用odyssey fc成像系统通过荧光检测使蛋白质标记可视化，并用image studio软件对信号强度进行量化，并针对来自同一印迹的β-肌动蛋白进行归一化。
[0139]
实施例8——免疫荧光标记
[0140]
在转移小室(transwell)过滤器上生长6周的细胞单层在4％多聚甲醛(pfa)/pbs中固定10分钟，并用含有0.3％triton x-100和10％山羊血清的pbs封闭25分钟。用针对best1的一抗和荧光缀合的二抗在4℃on下进行温育。免疫标记的hipsc-rpe细胞在zeiss共聚焦显微镜lsm 510(zeiss，germany)上成像。
[0141]
实施例9——yfp-卤化物转运测定
[0142]
用慢病毒颗粒转导人hipsc-rpe细胞，该慢病毒颗粒是使用ca2 磷酸盐转染法用黄色荧光蛋白(yfph148q/i152l)-pljm1和辅助质粒pmd2.g和pspax2共转染hek293t细胞产生的。在96孔黑色微量滴定板中培养六周后，用70mm的含碘化物(i-)的溶液温育细胞，并在tecan微孔板读取器中测量基础yfp荧光。随后，用等体积的含cl的溶液替换含i-的溶液，并在60秒间隔内额外监测yfp强度的增加6分钟。
[0143]
实施例10——aav转移质粒的克隆策略
[0144]
从载体puc18-h1 rnai(#87355，addgene，uk)中pcr扩增95bp截短的h1启动子片
段。为了生成99bp u6启动子，从载体paav_u6_sgrna_cmv_gfp(#85451，addgene，uk)中pcr扩增全长u6启动子(241bp)的两个片段(5`末端的29bp和3`末端的70bp)，并使用gibson组装克隆方法(new england biolabs，germany)连接。从同一载体扩增sgrna支架，并分别与缩短的h1和u6片段连接。通过bbsi限制性克隆将i295dell7nt序列连接到sgrna支架上。从pcdna3载体(thermo fisher scientific，usa)的全长cmv启动子的3`末端pcr扩增截短的cmv启动子(100和150bp)，然后通过限制性克隆使所得片段替换载体paav_rsv_spcas9(＝paav_159_spcasp和paav_100_spcas9)的rsv启动子。然后将缩短的h1/sgrna支架和u6/支架片段分别克隆到paav_159_spcas9和paav_100_spcas9构建体中。使用gibson组装将sgrna_i295del的自限性序列引入spcas9序列的5`和3`。
[0145]
实施例11——全基因组测序分析以鉴定全基因组范围的脱靶
[0146]
全基因组测序由中国bgi在bgiseq-500测序平台上商业化完成。使用clc生物医学基因组学工作台(qiagen)在实验室内部进行全面的下一代测序(ngs)数据分析。
[0147]
实施例12——确定复发性best黄斑营养不良和advirc相关联的best1突变
[0148]
最初，检测了在雷根斯堡人遗传学研究所的分子诊断实验室测试的best黄斑营养不良和advirc患者中best1突变的频率(基于突变的方法)。虽然大多数突变是非复发性的，但患有常染色体显性best黄斑营养不良的所有患者中的约15％(115人中有17人)携带在best1基因的外显子8中884-886位处的框内3bp缺失(tca)，其导致密码子295的框内缺失(i295del)。为了用最广泛使用的crispr-cas核酸酶spcas9(5`-ngg-3`pam识别位点)靶向i295del-等位基因，认为四种可能的sgrna中的两种是高质量的(分数＞50＝1.标准)，在其他基因的编码序列中没有预测的脱靶(图1)。选择sgrna#1(命名为sgrna_i295del20nt)用于进一步的实验评估，因为3bp缺失位于sgrna种子区内(pam位点附近的8-12个碱基＝2.标准)，这是与靶序列特异性相互作用的关键序列。与pam位点的5`末端相邻的前10个核苷酸以外的错配耐受不良，并显著降低了靶向特异性。
[0149]
实施例13——鉴定best1基因组基因座内的常见(＞5％)snp
[0150]
为了设计独立于个体突变的等位基因特异性sgrna的最小集(基于单体型的方法)，根据1000基因组计划发布的snp数据进行基因型填充。在整个best1基因座内(包括在5’末端的15kb侧翼区)总共发现1.191个snp(图2)。其中，69个snp揭示了欧洲人群中的等位基因频率＞5％。69个snp中的47个被排除在分析之外，因为它们位于重复序列中或没有显示出有利的中靶和脱靶得分(得分＜50)。总的来说，可以为22个snp设计靶向每个snp的相反链的sgrna(图2和3，表1)。22个snp中的5个位于best1编码序列内(429外显子2、534外显子3、749外显子10、756外显子10和759外显子10)。
[0151]
表1计算机过滤过程后经鉴定的best1基因组基因座内的snp
[0152][0153]
实施例14——欧洲人群中频繁的best1单体型的鉴定
[0154]
通过hapview软件计算了欧洲人群基于鉴定的22个snp的单体型频率。这揭示了best1基因座处的30种单体型。其中，最频繁的5种单体型(＞5％)几乎占欧洲人群中发现的单体型的3/4(图3)。
[0155]
对从best黄斑营养不良和advirc患者衍生的成纤维细胞样品重编程的11个hipsc细胞系的队列中的选择的22个snp进行sanger测序，建立了最常见的欧洲单体型中的9个(图4)。11名患者中的6名(pat 1、2、5、6、7和9)具有在编码区中的一个或多个杂合子snp，并且可以因此通过单个sgrna进行靶向，而对于患者3、4和5，需要同时递送两种sgrna用于crispr/cas诱导的等位基因缺失。对于剩余三名患者，基于单体型的方法并不适用，因为患者10和11对所有22个snp均是纯合子，并且没有编码或跨越外显子的snp对于患者8是适用的。
[0156]
根据数据得出结论，大约70％的best黄斑营养不良患者有资格采用基于单体型的方法。为此，对染色体best1区的亲代来源的了解是至关重要的。
[0157]
实施例15——在hek293t细胞中对计算机设计的sgrna的实验评估
[0158]
为了评估计算设计的sgrna的功效和等位基因特异性，采用了基于荧光的测定法(mashiko等人，2013)，并在pcag-egxxfp质粒的增强型绿色荧光蛋白(egfp)片段之间克隆含有中靶或非靶序列的250-500bp的基因组片段，。将所得靶质粒与具有相应sgrna的表达spcas9的px330质粒共转染到hek293细胞。如果靶序列被内切核酸酶切割，则发生同源性依赖性修复以重构egfp表达盒(图5a)，并在72小时的转染后对重构的egfp荧光进行量化(图
5b)。第一步，分析具有天然20nt sgrna序列长度的所有sgrna(sgrna_20nt)，例如sgrna_581g20nt、sgrna_581t20nt、sgrna_749a20nt、sgrna_749g20nt、sgrna_756c20nt和sgrna_756t20nt。在显微镜检查和读板器测量后，测试的6个sgrna中的5个被鉴定为显示相比于非靶等位基因对中靶等位基因的特异性更高，但仍表现出在非靶等位基因处的过高程度的非特异性crispr/cas9切割事件。仅针对snp 581g的sgrna_581g20nt表现出显著的高效率和特异性。相反，针对snp 581t的sgrna_581t20nt表现出在相反等位基因上的意想不到的强荧光信号，从而使靶向非靶等位基因远优于中靶(图5a和b)。从这些结果得出结论，在许多情况下，20nt sgrna序列中的单个错配耐受良好，因此不适合明确区分两条dna链。
[0159]
实施例16——hek293t细胞中计算机设计的sgrna的优化
[0160]
为了增加等位基因特异性，测试了两种修饰：(1)将sgrna序列长度从20bp缩短到17bp，因为截短可以增加sgrna的特异性(fu等人，2014)和/或(2)将碱基错配引入sgrna中，从而将新的单个碱基对错配创建到中靶序列，并将额外的第二错配创建到脱靶等位基因。图6显示了sgrna 756c，756t，429c和i295del的示例结果。发现从20到17nt的sgrna756c和756t截短导致等位基因特异性的相当大的改善(图6a)或中等的改善(图6b)，而sgrna429c的缩短相当无效(图6d)。此外并与最近的研究结果一致(zhang等人，2016)，sgrna序列长度也显著影响cas9的切割功效。虽然观察到截短的sgrna 756c17nt与全长的sgrna相比核酸酶功效相等，但发现sgrna429c17nt连续降低到约40个百分点(图6d)。与之不同，对于截短的sgrnai295del18nt和i295del17nt，与最初的20nt sgrna相比，观察到cas9功效的显著提高(图6c)。为了增加sgrna756t和429c的等位基因特异性，在全长sgrna的不同位置上连续引入单个核苷酸交换。而在sgrna 429c中，在核苷酸位置20(相对于pam识别位点)的腺苷嘌呤到胸腺嘧啶的交换，与最初的sgrna 429c20nt相比，显著增加等位基因特异性，具有相当高的cas9功效，而在同一位置的胞嘧啶核苷酸交换或位置19的两个其他交换几乎耗尽cas9的功效(图6d)。相反，对于sgrna756t，仅在位置17的鸟嘌呤至胞嘧啶取代产生最佳效果。值得注意的是，在位置6的sgrna种子区内的核苷酸交换(sgrna_756t20nt_(6)g＞a)完全消除cas9的活性。这样，对于分析的19个序列变体中的18个，定义了至少一个揭示高等位基因特异性和功效的sgrna。表2中给出了所分析的所有sgrna序列的列表。
[0161]
综上所述，结果表明，根据sgrna的核苷酸组成，每个sgrna需要进行单独和高度复杂的测试，以达到最佳的等位基因特异性，而不伴随功效的丧失。
[0162]
[0163][0164]
实施例17——在从best黄斑营养不良患者生成的hipsc-rpe细胞系中优化的sgrna的评估
[0165]
接下来，测试了基于荧光的测定的初步结果是否可以在细胞背景下得到验证。为此，由重组spcas9和优化的sgrna形成的rnp复合物被电穿孔到选定的snp或best1突变i295del杂合子的患者衍生的hipsc-rpe细胞系中(参见图4)。48小时后收获细胞，并经由sanger测序分析来自40-80个单个克隆的中靶和非靶链上的indel频率。对12个sgrna的评估揭示，在任何非靶位点均没有双链断裂(dsb)，证实了每个测试的sgrna的高等位基因特异性。在这12个sgrna中，9个在中靶等位基因上显示出范围为25％到70％dsb的合理indel频率。仅对于sgrna429t和756t，频率相当低(分别为7％和5％)。另外九个sgrna进行进一步评估。值得注意的是，大多数sgrna的切割功效差异很大，并且很难从在hek293t细胞的共转染实验中获得的结果中预测。后一点强调了在进一步应用之前广泛地测试每个sgrna的必要性。表2给出了在hipsc-rpe细胞中分析的sgrna的汇总。
[0166]
实施例18——恢复best1功能的等位基因特异性基因编辑方法的概念验证
[0167]
为了评估所开发的基因编辑方法是否能够特异性地抑制突变体best1转录物的表达，用spcas9/sgrna_i295del17nt rnp电穿孔来自具有突变i295del( /i295del)的杂合子best黄斑营养不良患者的hipsc。随后，生成单个细胞群并分析dsb，选择了证实有dsb的两个基因组编辑的克隆( /1295delcrispr#16和 /i295delcrispr#19)，用于分化为crispr/spcas9编辑的rpe细胞系以进一步表征。虽然未经处理的患者细胞系的cdna样品显示出野生型和突变体转录物二者的存在，但spcas9处理的cdna患者样品仅显示出野生型转录物(图7a)。
[0168]
与未处理的和两个对照样品相比，在spcas9处理的hipsc-rpe中探讨了best1的定位、蛋白质表达和阴离子转运功能。虽然未经处理的患者细胞系表现出相当程度的错误定位的best1蛋白，但两个经编辑的hipsc-rpe显示出代表野生型等位基因的清晰细胞表面表达(图7b)。这反映在spcas9编辑的细胞系中best1蛋白表达的增加，与健康对照相比达到约一半的表达水平(图7c和d)。最后，从yfp荧光记录中分析了best1阴离子转运功能。用基于黄色荧光蛋白(yfp)的卤化物传感器yfp(h148q/i152l)病毒转导hipsc-rpe细胞系，并接种在黑色96孔板上，其显示对碘离子(i-)高度敏感的明亮且均匀的细胞荧光(图7e)。i-的应用导致特异性yfp随时间淬灭，其通过添加等摩尔的cl-来逆转。荧光强度的变化可以在读板器上监测。在六周的成熟期后，用含有72mm i-的溶液温育hipsc-rpe，并在6分钟后测量稳态yfp淬灭。随后，用等摩尔的cl-溶液替换i-，并通过在长达6分钟的时间过程中的best1介导的i-出口导致的递增荧光信号强度来监测阴离子的渗透性。对于两个来自健康对照的hipsc-rpe细胞系，观察到递增荧光信号的快速动力学高达40％，而未处理的vmd2患者细胞系由于离子通量受损而保持相当平稳。相反，两个crispr/spcas9处理的细胞系显示出与对照类似的递增荧光动力学(图7f)。
[0169]
总之，spcas9编辑的hipsc-rpe的免疫细胞化学和功能特征表明，i295del转录物的等位基因特异性破坏挽救best黄斑营养不良表型，这意味着best1野生型转录物的单倍体不足(haploinsufficiency)耐受良好。
[0170]
实施例19——通过全基因组测序进行基因组范围的crispr脱靶分析
[0171]
对于未来的临床应用，脱靶效应的基因组范围鉴定是至关重要的(ran等人，2013)。为了捕捉sgrna_i295del17nt的任何基因组范围的脱靶位点，对来自未处理和经编辑的hipsc-rpe样品的基因组dna进行全基因组测序(30倍覆盖)。全面的ngs数据分析显示，
在中靶位点但不在脱靶位点上具有许多含有相同的5’或3’末端的dna读段，这验证了截短的sgrna_i295del17nt的特异性。图8显示了过滤过程的示意图。
[0172]
实施例20——自限性“多合一”aav载体转移质粒的生成
[0173]
基因组编辑工具的体内翻译需要cas9/sgrna机制高效递送到体内有丝分裂后的rpe细胞中。编码spcas9的基因相对较大(4.1kb)，当与sgrna支架组合时，包装至单个aav载体的效率低(图9a)。为了规避这种受限的能力，生成并分析了若干aav“多合一”载体构建体，其携带用于spcas9表达的最小cmv(分别为100和159bp)启动子、分别地最小h1启动子(95bp)和缩短的u6启动子(99bp)以驱动sgrna表达，与最小poly a信号序列(49bp)组合(danzeiser等人，1993；myslinski等人，2001；senis等人，2014)(图9b)。经由连续克隆策略生成aav转移质粒，并与使用全长rsv启动子进行spcas9表达(载体1)和强全长u6启动子进行sgrna表达(载体2)的双载体系统相比，测试其切割功效。此外，根据ruan等人(2017)，将spcas9的自限性序列引入到载体中，原因有二：(i)spcas9的持续表达不是基因编辑所需要的；(ii)spcas9的长时间表达可能增加脱靶切割。因此，在spcas9序列之前和之后添加以sgrna_i295del为例的识别序列(sgrnai295del靶序列加上相应的pam位点)。在这种配置中，sgrna将引导spcas9进行靶向基因组切割和aav质粒本身的切割以删除spcas9序列两者，从而限制spcas9蛋白的产生。为此，与双载体应用相比较，分析了sgrna_i295del加上其相应的自限性类似物在四种不同的aav启动子构建体中的切割效率(图9c)。发现在与双载体应用相比较时，截短的cmv_159bp(minil59)显示出类似甚至更高的spcas9活性，而cmv_100bp(mini100)则相当低效。对于sgrna的活性，在与双重递送和h1启动子构建体相比较时，使用截短的u6启动子的“多合一”aav构建体显示出更强的gfp表达。然而，引入spcas9序列的5`和3`的自限性序列显著增强了所有测试构建体的切割活性，证明cmv启动子对sgrna_i295del表达的附加作用。因此，对于表2所列的所有sgrna，生成自限性“多合一”aav构建体，其由(i)用于sgrna表达的缩短的u6启动子(ii)用于驱动spcas9表达的cmv_159bp启动子和(iii)spcas9序列的5`和3`的自限性sgrna序列组成。
[0174]
实施例21——等位基因特异性crispr/spcas9切割的量化
[0175]
为了评估计算设计的sgrna的功效和等位基因特异性，我们采用了基于荧光的测定并在pcag-egxxfp质粒(addgene，uk)的egfp(增强型绿色荧光蛋白)片段之间克隆了含有中靶或非靶best1序列的约500bp的基因组片段。将所得靶质粒与表达spcas9的质粒pu6-(bbsi)_cbh-cas9-t2a-mcherry(addgene)和具有不同序列长度(20-17bp)的相应sgrna共转染到hek293细胞中。如果靶序列被内切核酸酶切割，则发生同源性依赖性修复，以重构egfp表达盒。荧光强度相对于pcag-egxxfp的基础荧光强度进行量化。结果显示于图10至13。
[0176]
实施例22——对基于单体型的方法的评价
[0177]
为了测试基于单体型的方法的功效，将两种质粒共转染到来自snp 581(g到t)和snp 749g至a杂合子的best病患者的成纤维细胞中，由此snp 581g和snp 749a位于单个单体型上。每个质粒携带特定的sgrna分子，一个靶向snp 581g并且一个靶向snp 749a。此外，携带sgrna 581g-17nt序列(seq id no：13)的px458质粒表达spcas9和红色荧光蛋白mcherry(addgene#64324)两者，而携带sgrna 749a-20nt(seq id no：55)的px458质粒表达spcas9以及绿色荧光蛋白gfp(addgene#48138)。用facs(荧光激活细胞分选)对表达绿色和
红色荧光信号两者的成纤维细胞进行分选。mcherry和gfp阳性细胞指示具有单体型特异性indel形成。
[0178]
为了控制成功indel形成
[0179]
在下一步，从mcherry和gfp阳性细胞中提取基因组dna。当snp 581和snp 749之间的约7kb的dna被成功切除并通过细胞nhej修复机制重新连接时，使用在snp 581和749位点两侧的定义的引物对扩增dna，从而产生560bp片段。
[0180]
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