一种调节控制重建胶原蛋白分子量分布的方法与流程

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种调节控制重建胶原蛋白分子量分布的方法。


背景技术：

2.胶原蛋白是动物结缔组织细胞外基质的主要成分，存在于动物的多种组织与器官中，特别是皮肤、骨骼、肌腱及心包等中。目前为止，在动物体内已发现至少20种基因上不同的胶原蛋白分子，体内胶原蛋白（主要是纤维胶原蛋白分子）长约300 nm，直径1.5 nm，具有独特的由3条多肽链组成的不间断右手三螺旋结构，在生物体内具有结构支撑及特殊的生物学功能。
3.来源于动物组织的胶原及衍生物因制备方法不同，可以得到不同物理化学和生物学性能的产物。对于从动物组织制备胶原蛋白必须明确3个基本科学概念，胶原、明胶和水解胶原蛋白。有文献对这三者之间的结构与性能差异进行了详细比较，其中关于分子量及其分布的差异为：胶原的相对分子量约为30万，分子量分布很窄；明胶的相对分子量从几千到10万，分子量分布很宽；水解胶原蛋白相对分子质量从几千到数万，分子量分布也很宽。需要进一步明确的是，胶原蛋白（这里主要指酶切胶原蛋白）的相对分子质量大，分布很窄，具有特征性的三螺旋结构，在变性电泳中呈现特殊的条带分布（а1和а2条带，β条带，γ条带）；明胶是通过剧烈（强碱和强酸条件）的生物化学反应由胶原蛋白变性获得，在该反应过程中，胶原蛋白分子中链间范德华力、氢键及链中肽键随机断裂，产生宽分子量分布的胶原多肽，失去了特征的长程三螺旋结构，尽管明胶部分肽段有一定程度复性而具有一定凝冻强度，但已失去胶原蛋白生物学功能；相对于胶原和明胶而言，水解胶原蛋白相对分子质量很小，不具有大分子胶原的三螺旋结构甚至复性功能，更不具有胶原蛋白生物活性。
4.现有方法制备的胶原蛋白是一种窄分散生物大分子材料，具有保湿、美白、营养、修复及组织诱导等特有功能，但由于分子量大也容易自组装，导致溶解性、组织渗透性等极差，而限制其应用。因此，急需开发一种兼具胶原蛋白活性和分子量多分散分布特点的胶原蛋白。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种调节控制重建胶原蛋白分子量分布的方法，该方法获得的胶原蛋白既具有三螺旋结构，又具有多分散分子量分布，有别于典型的大分子胶原窄分散，也不同于明胶和水解胶原多肽等变性产物无胶原蛋白生物活性的新型胶原蛋白结构。
6.本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种调节控制重建胶原蛋白分子量分布的方法，所述重建胶原蛋白为具有三螺旋结构的多分散分子量分布的胶原蛋白，是将动物组织经脱糖脱脂处理、溶胀、酶消化、调节粘度和调节分子量分布后制得。
7.进一步地，所述动物组织为动物的皮肤、肌腱、骨骼、心包或腹膜中的任意一种。
8.进一步地，所述溶胀的具体操作为：将经脱糖脱脂处理后的动物组织放入反应容器中，加入酸性溶液并调节溶液的ph值为1.5～3，控制温度为4～30℃、搅拌速度为300
±
10rpm使动物组织充分溶胀。
9.作为优选方案，所述酸性溶液为盐酸、磷酸、醋酸、已二酸、甘蔗酸或枸橼酸中的任意一种。
10.进一步地，所述酶消化的具体操作为：将溶胀的动物组织中加入蛋白酶反应6～48h。
11.进一步地，所述调节粘度的具体操作为：控制温度在34～42℃，搅拌速度为60
±
60rpm，搅拌至酶消化后的溶液完全溶解失去粘度。
12.进一步地，所述调节分子量分布的具体操作为：（1）、将调节粘度后的溶液分成a和b两份，体积比为a:b=1:1～3:1；（2）、将a溶液调节ph值至1.5～3，在温度37
±
1℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入蛋白酶a反应2～8h，然后将溶液温度降至25
±
3℃，调节ph值至10.3
±
0.2，保持5h以上，再调节溶液ph值至7.3
±
0.2；其中，所述蛋白酶a为蛋白酶中的任意一种；（3）、将b溶液调节ph值至3～6，在温度45
±
5℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入蛋白酶b反应2～8h，然后温度降至25
±
3℃，调节ph值至10.3
±
0.2，保持5hr以上，再调节ph值至7.3
±
0.2；其中，所述蛋白酶b为蛋白酶中的任意一种，但蛋白酶b不同于蛋白酶a；（4）、将步骤（2）调节后的a溶液和步骤（3）调节后的b溶液混合，经过滤、浓缩和干燥后制得具有三螺旋结构多分散分子量分布的胶原蛋白。
13.进一步地，所述调节分子量分布的具体操作为：将调节粘度后的溶液调节ph值至2.5～3.3，在温度45
±
5℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入蛋白酶a反应2～8h，温度降至25
±
3℃，调节ph值至10.3
±
0.2，保持5hr以上，再调节ph值至7.3
±
0.2；再调节温度至37
±
1℃，搅拌速度60
±
60rpm，加入蛋白酶b反应2～8h，温度降至25
±
3℃，调节ph值至10.3
±
0.2，保持5hr以上，再调节ph值至7.3
±
0.2；最后溶液经过滤、浓缩和干燥后制得具有三螺旋结构多分散分子量分布的胶原蛋白；其中，所述蛋白酶a或蛋白酶b为蛋白酶中的任意一种，但蛋白酶a不同于蛋白酶b。
14.上述溶液与蛋白酶a的质量比为2
×
102:1～2
×
106:1；溶液与蛋白酶b的质量比为2
×
102:1～2
×
106:1；作为优选方案，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、复合蛋白酶、酸性蛋白酶或中性蛋白酶中的任意一种。
15.上述的方法制备的重建胶原蛋白，具有三螺旋结构和多分散分子量分布特点。
16.本发明具有以下优点：本发明提供了一种调节控制重建胶原蛋白分子量分布的方法，该方法通过对动物组织脱糖脱脂处理、溶胀、酶消化、调节粘度和调节分子量分布，最终获得的胶原蛋白具有三螺旋结构和多分散分子量分布。本发明方法使胶原蛋白原料兼具了胶原蛋白活性和分子量多分散分布的特点，保留了胶原蛋白良好的生物学功能，是有别于大分子胶原，明胶和水解胶原蛋白的第4种胶原蛋白，拓展了胶原蛋白的应用；该方法操作简单、制备方便、成本低、适用于工业化大规模生产。
附图说明
17.图1为胶原蛋白圆二色谱图，其中，a为医用级胶原蛋白，b为本发明方法制备的重建胶原蛋白。
18.图2为胶原蛋白凝胶渗透色谱图，其中，a为医用级胶原蛋白，b为本发明方法制备的重建胶原蛋白。
19.图3为胶原蛋白相对分子量范围分布图，其中1为marker，2，3，4为本发明方法制备的重建胶原蛋白，5和6为医用级胶原蛋白。
具体实施方式
20.下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：一种调节控制重建胶原蛋白分子量分布的方法，所述重建胶原蛋白为具有三螺旋结构的多分散分子量分布的胶原蛋白，是将动物组织经脱糖脱脂处理、溶胀、酶消化、调节粘度和调节分子量分布后制得。
21.实施例1：一种调节控制重建胶原蛋白分子量分布的方法，包括以下步骤：s1. 脱糖脱脂处理：将动物皮肤先去污、脱毛、清洗，冷冻切片后再脱糖脱脂处理；s2. 溶胀：将1000g经脱糖脱脂处理后的动物皮肤放入反应容器中，加入浓度为0.1mol/l盐酸10l并调节溶液的ph值为1.5，控制温度为4℃，搅拌速度为300
±
10rpm搅拌使动物组织充分溶胀0.5h；s3. 酶消化：将溶胀的动物组织中加入木瓜蛋白酶0.5g反应6h；s4. 调节粘度：控制温度在34℃，搅拌速度为60
±
60rpm，搅拌至酶消化后的溶液完全溶解失去粘度；s5. 调节分子量分布：（1）、将调节粘度后的溶液分成a和b两份，体积比为a:b=1:1；（2）、将a溶液调节ph值至1.5，在温度36℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入胃蛋白酶0.05g反应2h，然后将溶液温度降至22℃，调节ph值至10.1，保持5h以上，再调节溶液ph值至7.1；（3）、将b溶液调节ph值至3，在温度40℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入木瓜蛋白酶0.05g反应2h，然后温度降至22℃，调节ph值至10.1，保持5hr以上，再调节ph值至7.1；（4）、将步骤（2）调节后的a溶液和步骤（3）调节后的b溶液混合，经过滤、浓缩和干燥后制得具有三螺旋结构多分散分子量分布的胶原蛋白。
22.实施例2：一种调节控制重建胶原蛋白分子量分布的方法，包括以下步骤：s1. 脱糖脱脂处理：将动物肌腱先去污、清洗，冷冻切片后再脱糖脱脂处理；s2. 溶胀：将1000g经脱糖脱脂处理后的动物皮肤放入反应容器中，加入浓度为0.1mol/l磷酸20l并调节溶液的ph值为3，控制温度为30℃，搅拌速度为300
±
10rpm搅拌使动物组织充分溶胀2h；s3. 酶消化：将溶胀的动物组织中加入胃蛋白酶2g反应48h；s4. 调节粘度：控制温度在42℃，搅拌速度为60
±
60rpm，搅拌至酶消化后的溶液完全溶解失去粘度；
s5. 调节分子量分布：（1）、将调节粘度后的溶液分成a和b两份，体积比为a:b=2:1；（2）、将a溶液调节ph值至3，在温度38℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入胃蛋白酶1g反应8h，然后将溶液温度降至28℃，调节ph值至10.5，保持5h以上，再调节溶液ph值至7.5；（3）、将b溶液调节ph值至6，在温度50℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入木瓜蛋白酶2g反应8h，然后温度降至28℃，调节ph值至10.5，保持5hr以上，再调节ph值至7.5；（4）、将步骤（2）调节后的a溶液和步骤（3）调节后的b溶液混合，经过滤、浓缩和干燥后制得具有三螺旋结构多分散分子量分布的胶原蛋白。
23.实施例3：一种调节控制重建胶原蛋白分子量分布的方法，包括以下步骤：s1. 脱糖脱脂处理：将动物骨骼先去污、清洗，冷冻切片后再脱糖脱脂处理；s2. 溶胀：将1000g经脱糖脱脂处理后的动物皮肤放入反应容器中，加入浓度为0.25mol/l醋酸10l并调节溶液的ph值为2，控制温度为10℃，搅拌速度为300
±
10rpm搅拌使动物组织充分溶胀5h；s3. 酶消化：将溶胀的动物组织中加入菠萝蛋白酶20g反应12h；s4. 调节粘度:控制温度在36℃，搅拌速度为60
±
60rpm，搅拌至酶消化后的溶液完全溶解失去粘度；s5. 调节分子量分布：（1）、将调节粘度后的溶液分成a和b两份，体积比为a:b=1:1；（2）、将a溶液调节ph值至1.8，在温度37℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入胃蛋白酶10g反应4h，然后将溶液温度降至25℃，调节ph值至10.3，保持5h以上，再调节溶液ph值至7.3；（3）、将b溶液调节ph值至4，在温度45℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入菠萝蛋白酶5g反应3h，然后温度降至25℃，调节ph值至10.3，保持5hr以上，再调节ph值至7.3；（4）、将步骤（2）调节后的a溶液和步骤（3）调节后的b溶液混合，经过滤、浓缩和干燥后制得具有三螺旋结构多分散分子量分布的胶原蛋白。
24.实施例4：一种调节控制重建胶原蛋白分子量分布的方法，包括以下步骤：s1. 脱糖脱脂处理：将动物心包先去污、清洗，冷冻切片后再脱糖脱脂处理；s2. 溶胀：将1000g经脱糖脱脂处理后的动物皮肤放入反应容器中，加入浓度为0.4mol/l已二酸18l并调节溶液的ph值为2.3，控制温度为15℃，搅拌速度为300
±
10rpm搅拌使动物组织充分溶胀3h；s3. 酶消化：将溶胀的动物组织中加入胰凝乳蛋白酶50g反应20h；s4. 调节粘度:控制温度在40℃，搅拌速度为60
±
60rpm，搅拌至酶消化后的溶液完全溶解失去粘度；s5. 调节分子量分布：（1）、将调节粘度后的溶液分成a和b两份，体积比为a:b=3:1；（2）、将a溶液调节ph值至2.5，在温度37℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入胃蛋白酶2g反应5h，然后将溶液温度降至26℃，调节ph值至10.3，保持5h以上，再调节溶液ph值至7.3；
（3）、将b溶液调节ph值至6，在温度45℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入酸性蛋白酶8g反应7h，然后温度降至25℃，调节ph值至10.3，保持5hr以上，再调节ph值至7.3；（4）、将步骤（2）调节后的a溶液和步骤（3）调节后的b溶液混合，经过滤、浓缩和干燥后制得具有三螺旋结构多分散分子量分布的胶原蛋白。
25.实施例5：一种调节控制重建胶原蛋白分子量分布的方法，包括以下步骤：s1. 脱糖脱脂处理：将动物腹膜先去污、清洗，冷冻切片后再脱糖脱脂处理；s2. 溶胀：将1000g经脱糖脱脂处理后的动物皮肤放入反应容器中，加入浓度为0.2mol/l甘蔗酸16l并调节溶液的ph值为2.8，控制温度为22℃，搅拌速度为300
±
10rpm搅拌使动物组织充分溶胀2h；s3. 酶消化：将溶胀的动物组织中加入中性蛋白酶10g反应30h；s4. 调节粘度:控制温度在38℃，搅拌速度为60
±
60rpm，搅拌至酶消化后的溶液完全溶解失去粘度；s5. 调节分子量分布：（1）、将调节粘度后的溶液分成a和b两份，体积比为a:b=2:1；（2）、将a溶液调节ph值至2，在温度38℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入胃蛋白酶3g反应3h，然后将溶液温度降至28℃，调节ph值至10.5，保持5h以上，再调节溶液ph值至7.5；（3）、将b溶液调节ph值至3，在温度50℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入中性蛋白酶1g反应4h，然后温度降至28℃，调节ph值至10.5，保持5hr以上，再调节ph值至7.5；（4）、将步骤（2）调节后的a溶液和步骤（3）调节后的b溶液混合，经过滤、浓缩和干燥后制得具有三螺旋结构多分散分子量分布的胶原蛋白。
26.实施例6：一种调节控制重建胶原蛋白分子量分布的方法，包括以下步骤：s1. 脱糖脱脂处理：将动物皮肤先去污、脱毛、清洗，冷冻切片后再脱糖脱脂处理；s2. 溶胀：将1000g经脱糖脱脂处理后的动物皮肤放入反应容器中，加入浓度为0.2mol/l枸橼酸12l并调节溶液的ph值为2.5，控制温度为15℃，搅拌速度为300
±
10rpm搅拌使动物组织充分溶胀4h；s3. 酶消化：将溶胀的动物组织中加入胃蛋白酶10g反应40h；s4. 调节粘度:控制温度在42℃，搅拌速度为60
±
60rpm，搅拌至酶消化后的溶液完全溶解失去粘度；s5. 调节分子量分布：将调节粘度后的溶液调节ph值至2.5，在温度45℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入酸性蛋白酶5g反应2h，温度降至25℃，调节ph值至10.3，保持5hr以上，再调节ph值至7.3；再调节温度至37℃，搅拌速度60
±
60rpm，加入胰蛋白酶1g反应2h，温度降至25℃，调节ph值至10.3，保持5hr以上，再调节ph值至7.3；最后溶液经过滤、浓缩和干燥后制得具有三螺旋结构多分散分子量分布的胶原蛋白。
27.实施例7：一种调节控制重建胶原蛋白分子量分布的方法，包括以下步骤：s1. 脱糖脱脂处理：将动物皮肤先去污、脱毛、清洗，冷冻切片后再脱糖脱脂处理；s2. 溶胀：将1000g经脱糖脱脂处理后的动物皮肤放入反应容器中，加入浓度为0.5mol/l磷酸16l并调节溶液的ph值为1.5，控制温度为18℃，搅拌速度为300
±
10rpm搅拌使动物组织充分溶胀2h；
s3. 酶消化：将溶胀的动物组织中加入酸性蛋白酶2g反应22h；s4. 调节粘度：控制温度在42℃，搅拌速度为60
±
60rpm，搅拌至酶消化后的溶液完全溶解失去粘度；s5. 调节分子量分布：将调节粘度后的溶液调节ph值至3.3，在温度40℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入木瓜蛋白酶0.4g反应8h，温度降至22℃，调节ph值至10.1，保持5hr以上，再调节ph值至7.1；再调节温度至36℃，搅拌速度60
±
60rpm，加入胰蛋白酶4g反应8h，温度降至22℃，调节ph值至10.1，保持5hr以上，再调节ph值至7.1；最后溶液经过滤、浓缩和干燥后制得具有三螺旋结构多分散分子量分布的胶原蛋白。
28.实施例8：一种调节控制重建胶原蛋白分子量分布的方法，包括以下步骤：s1. 脱糖脱脂处理：将动物腹膜先去污、清洗，冷冻切片后再脱糖脱脂处理；s2. 溶胀：将1000g经脱糖脱脂处理后的动物皮肤放入反应容器中，加入浓度为0.1mol/l醋酸15l并调节溶液的ph值为3，控制温度为15℃，搅拌速度为300
±
10rpm搅拌使动物组织充分溶胀3h；s3. 酶消化：将溶胀的动物组织中加入复合蛋白酶5g反应33h；s4. 调节粘度：控制温度在34℃，搅拌速度为60
±
60rpm，搅拌至酶消化后的溶液完全溶解失去粘度；s5. 调节分子量分布：将调节粘度后的溶液调节ph值至3.3，在温度50℃、搅拌速度60
±
60rpm的条件下加入胰凝乳蛋白酶3g反应8h，温度降至28℃，调节ph值至10.5，保持5hr以上，再调节ph值至7.5；再调节温度至38℃，搅拌速度60
±
60rpm，加入中性蛋白酶4g反应8h，温度降至28℃，调节ph值至10.5，保持5hr以上，再调节ph值至7.5；最后溶液经过滤、浓缩和干燥后制得具有三螺旋结构多分散分子量分布的胶原蛋白。
29.以下通过实验说明本发明的有益效果：以下实验中医用级胶原蛋白采用以下方法制备：1. 新生犊牛皮的前处理将新鲜新生犊牛皮刮去毛和毛囊，去皮下组织和脂肪后细切，取200g切细的皮加入醇∶卤代烷＝0.5体积比的混合溶液2000ml，浸泡脱脂，每隔5小时更换一次上述溶液，15小时倒掉溶液；用浓度为98％的乙醇水溶液2000ml浸泡，5小时更换一次，10小时倒掉；用浓度为20％的乙醇水溶液2000ml清洗一次；再用0.1mol/l edta 溶液，ph＝10.5～11.5，于温度4℃浸泡6小时，然后，用超纯水2000ml洗涤3次；再用浓度为10％的nacl水溶液 2000ml浸泡，4小时更换一次，8小时倒掉溶液，用超纯水2000ml清洗2次，再将牛皮置入2000ml超纯水中浸泡过夜，将水倒掉。
30.2. 胃蛋白酶酶解在上述固体物质中，加入浓度为0.4mol/l的醋酸水溶液2000ml，然后加入湿牛皮∶胃蛋白酶＝2000质量比的胃蛋白酶0.1g，置于温度4℃冰箱中放置5天，每天摇动2次，用碱溶液调节溶液ph＝8-8.5，放置过夜，再用酸溶液调节溶液ph＝2-2.5，放置过夜，离心取上清液，去皮渣。
31.3. 盐析在上述清液加入固体nacl至浓度为15％，加完后置于4℃冰箱中放置过夜，离心取固体物质放入透析袋中以去离子水透析，脱盐，或者将上述清液用浓度为0.01mol/l的
na2hpo
4 溶液2000ml充分透析72小时，24小时更换一次，72小时后离心收集透析袋内固体物质用浓度为0.1mol/l的醋酸水溶液2000ml透析，溶解，再用去离子水透析，脱盐，制得医用级胶原蛋白。
32.圆二色谱实验实验对象：a-医用级胶原蛋白，b-本发明实施例3制备的重建胶原蛋白；实验仪器：采用圆二色谱仪；实验结果：两种蛋白的圆二色谱图如图1所示，从图1可知圆二色谱图显示两种胶原蛋白在198nm左右有较强的负峰，在220nm左右有较弱的正峰，这是典型的胶原蛋白圆二色谱峰。
33.凝胶渗透色谱实验实验对象：a-医用级胶原蛋白，b-本发明制备的重建胶原蛋白（实施例1、实施例3、实施例4、实施例7）；实验仪器：采用流动相0.1n nan
3 0.06%nan3水溶液；标准样品窄分布聚乙二醇（peo）；流动相流速0.6ml/min；柱温35℃；方法采用窄分布peo做标准曲线相对校正法；实验结果：两种蛋白的凝胶渗透色谱图如图2所示，b中不同的曲线分布代表一种采用本发明方法调节分子量后的多分散分子量分布胶原蛋白。由图2可知：由a和b对比可知该方法测定的医用级胶原蛋白的分子量在30kda左右，而本发明方法可以调节胶原蛋白的分子量使其呈现特定多分散分子量分布。
34.电泳实验实验对象：2-实施例1制备的重建胶原蛋白，3-实施例4制备的重建胶原蛋白，4-实施例7制备的重建胶原蛋白，5-医用级胶原蛋白样品1，6-医用级胶原蛋白样品2；实验方法：对上述蛋白进行sds-page电泳；将样品溶解于醋酸溶液（0.04m）中配制成浓度为4mg/ml溶液。采用垂直电泳仪进行，浓缩胶浓度5%，分离胶浓度12%，电压120v；实验结果：电泳图如图3所示，从图3可知：医用级胶原蛋白（5和6）具有β带和α1、α2，本发明发明制备的重建胶原蛋白（2、3和4）的分子量分布较宽，15kda～250kda。
35.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。