基因疗法的制作方法

基因疗法
发明领域
1.本发明涉及包含col4a3、col4a4或col4a5转基因和肾特异性启动子的病毒载体，以及该病毒载体在治疗alport综合征中的用途。
2.发明背景
3.alport综合征(as)是一种遗传病况，影响欧洲大陆和美国的所有个体中约5,000-10,000人中的1人。as又称家族性肾炎、遗传性肾炎、薄基底膜病和薄基底膜肾病。这种病况通常出现在儿童时期，并与一系列表型相关，包括进行性肾功能丧失，还可能包括听力丧失和眼睛异常。
4.as是由col4a3、col4a4和col4a5基因的致病变异引起的，这些变异导致基底膜的胶原蛋白ivα345网络异常。该病况可以以x连锁、常染色体显性或常染色体隐性模式传播，其中x连锁是常见的，而常染色体隐性和常染色体显性分别占病例的15％和20％左右。
5.在没有治疗的情况下，具有x连锁形式的所有男性以及具有常染色体隐性形式的所有男性和女性中，肾病从显微血尿(microhematuria)进展为蛋白尿、进行性肾功能不全和终末期肾病。
6.as可以通过遗传检测来诊断，并且目前的治疗包括血管紧张素转换酶(ace)抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂(arb)以延缓终末期肾病的发作。然而，目前还没有办法预防终末期肾衰竭，肾移植是唯一的选择。
7.在开发成功的as基因疗法方面存在重大挑战需要克服。首先是col4a5、col4a3和col4a4蛋白各自有1685、1670和1690个氨基酸，由于aav载货能力有限，使得这些蛋白通过腺相关病毒(aav)载体进行运输是有挑战的。第二个重大挑战是成功地将基因疗法递送至肾小球中的足细胞，这些细胞在肾小球基底膜中产生胶原iv。
8.本发明旨在提供新的基因疗法载体，其可以有效地将col4a3、col4a4或col4a5转基因递送至足细胞，从而提供治疗alport综合征的疗法。


技术实现要素：

9.本发明提供了病毒载体，其中该病毒载体包含col4a3、col4a4或col4a5转基因。可以使用该病毒载体以靶向肾小球内的足细胞，以便治疗alport综合征。
10.不受理论束缚，本发明人相信足细胞为肾病中的基因疗法方法提供高度易处理的靶标，并且通过将col4a3、col4a4或col4a5靶向到足细胞，可以改变肾小球基底膜的胶原蛋白ivα345网络并且在至少部分正常化。
11.在一方面，本发明提供了病毒载体，其中该病毒载体包含col4a3、col4a4或col4a5转基因。
12.col4a3转基因可以编码col4a3多肽或其片段，所述col4a3多肽包含与seq id no：1具有至少70％同一性的多肽序列，或由与seq id no：1具有至少70％同一性的多肽序列组成；col4a4转基因可以编码col4a4多肽或其片段，所述col4a4多肽包含与seq id no：2具有至少70％同一性的多肽序列，或由与seq id no：2具有至少70％同一性的多肽序列组成；
和/或col4a5转基因可以编码col4a5多肽或其片段，所述col4a5多肽包含与seq id no：3具有至少70％同一性的多肽序列，或由与seq id no：3具有至少70％同一性的多肽序列组成。在一些实施方案中，col4a3转基因编码全长col4a3多肽，col4a4转基因编码全长col4a4多肽；和/或col4a5转基因编码全长col4a5多肽。适当地，col4a3、col4a4或col4a5转基因是人的和/或包含血凝素(ha)标签。
13.优选地，病毒载体包含足细胞特异性启动子。适当地，足细胞特异性启动子是最小nephrin启动子nphs1或podocin启动子nphs2。在一些实施方案中，足细胞特异性启动子是最小nephrin启动子nphs1。
14.本发明人已经开发最小nephrin启动子，它比已知的最小nephrin启动子短并且令人惊讶地能够驱动足细胞中的转基因表达。启动子还令人惊讶地保留足细胞特异性。这种最小nephrin启动子可以用于最小化货物尺寸并帮助全长col4a3、col4a4或col4a5的包装。因此，最小nephrin启动子nphs1可以包含如seq id no：10所示的核苷酸序列或与seq id no：10至少70％相同的变体，或由如seq id no：10所示的核苷酸序列或与seq id no：10至少70％相同的变体组成。
15.适当地，病毒载体是腺相关病毒(aav)。适当地，aav载体是aav载体颗粒的形式。在一些实施方案中，aav载体颗粒是足细胞特异性aav载体。在一些实施方案中，aav载体是aav血清型2/9、lk03或3b。
16.在一些实施方案中，col4a3、col4a4或col4a5转基因是小基因(mini-gene)。
17.在一些实施方案中，病毒载体另外包含土拨鼠肝炎转录后调节元件(wpre)。在一些实施方案中，病毒载体不包含土拨鼠肝炎转录后调节元件(wpre)。
18.在一些实施方案中，病毒载体另外包含在启动子和col4a3、col4a4或col4a5转基因之间的kozak序列。
19.适当地，病毒载体另外包含多腺苷酸化信号，诸如牛生长激素(bgh)多腺苷酸化信号或早期sv40多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，多腺苷酸化信号是早期sv40多腺苷酸化信号。
20.在一方面，本发明提供了病毒载体基因疗法，其中病毒载体包含col4a3、col4a4或col4a5转基因。
21.在优选的实施方案中，病毒载体是根据本发明的病毒载体。
22.在一方面，本发明提供了病毒载体基因疗法，其中该基因疗法包括：
23.第一病毒载体，其包含col4a3、col4a4或col4a5转基因的至少一部分；和
24.第二病毒载体，其包含相应col4a3、col4a4或col4a5转基因的至少部分。
25.在优选的实施方案中，第一病毒载体是根据本发明的病毒载体，和/或第二病毒载体是根据本发明的病毒载体。
26.在一方面，本发明提供了根据本发明的病毒载体或病毒载体基因疗法，其用于治疗或预防alport综合征。
27.适当地，将病毒载体或病毒载体基因疗法施用于人患者。在一些实施方案中，病毒载体或病毒载体基因疗法是全身施用的。在一些实施方案中，病毒载体或病毒载体基因疗法通过静脉内注射施用。在一些实施方案中，病毒载体或病毒载体基因疗法通过注射至肾动脉中来施用。
28.病毒载体
29.腺相关病毒(aav)载体
30.病毒载体可以是腺相关病毒(aav)并且合适的aav载体血清型包括2/9、lk03和3b。
31.病毒载体可以是aav载体颗粒的形式。
32.aav载体颗粒可以由衣壳蛋白包囊。血清型可以促进足细胞的转导，例如足细胞的特异性转导。优选地，aav载体颗粒是足细胞特异性载体颗粒。aav载体颗粒可以由足细胞特异性衣壳包囊。aav载体颗粒可以包含足细胞特异性衣壳蛋白。在全身应用后，对足细胞的靶向转导应去除肝脏趋性(tropism)的影响。
33.适当地，aav载体颗粒可以是转衣壳(transcapsidated)形式，其中具有一种血清型的itr的aav基因组或衍生物被包装在不同血清型的衣壳中。aav载体颗粒还包括嵌合体(mosaic)形式，其中来自两种或更多种不同血清型的未修饰衣壳蛋白的混合物构成病毒衣壳。aav载体颗粒还包括携带吸附到衣壳表面的配体的化学修饰形式。例如，此类配体可以包括用于靶向特定细胞表面受体的抗体。
34.当衍生物包含衣壳蛋白，即vp1、vp2和/或vp3时，该衍生物可以是一种或多种天然存在的aav的嵌合、改组或衣壳修饰的衍生物。特别地，本发明涵盖在同一载体(即假型化载体)内提供来自不同血清型、进化枝、克隆或分离株(isolate)的aav的衣壳蛋白序列。aav载体可以是假型化aav载体颗粒的形式。
35.通常选择嵌合的、改组的或衣壳修饰的衍生物来为aav载体提供一种或多种期望的功能。因此，与包含天然存在的aav基因组的aav载体相比，这些衍生物可以展示出增加的基因递送效率、降低的免疫原性(体液或细胞)、改变的趋性范围和/或改善的足细胞靶向。基因递送效率的提高可以通过改善细胞表面的受体或共受体结合、改善内化、改善细胞内和进入细胞核的运输、改善病毒颗粒的脱壳(uncoating)和改善的单链基因组向双链形式的转化来实现。增加的效率也可能与改变的趋性范围或足细胞的靶向有关，因此载体剂量不因施用到不需要它的组织而被稀释。
36.嵌合衣壳蛋白包括由天然存在的aav血清型的两个或多个衣壳编码序列之间的重组生成的那些。这可以例如通过标志物挽救方法进行，其中一种血清型的非感染性衣壳序列与不同血清型的衣壳序列共转染，并且使用定向选择以选择具有期望特性的衣壳序列。不同血清型的衣壳序列可以通过细胞内的同源重组来改变，从而产生新的嵌合衣壳蛋白。
37.嵌合衣壳蛋白还包括通过工程化改造衣壳蛋白序列以在两种或更多种衣壳蛋白之间，例如在两种或更多种不同血清型的衣壳蛋白之间转移特定衣壳蛋白域、表面环或特定氨基酸残基而生成的那些。
38.改组或嵌合衣壳蛋白也可以通过dna改组或通过易错pcr来生成。杂交aav衣壳基因可以通过如下来创建：将相关aav基因的序列，例如编码多种不同血清型的衣壳蛋白的序列进行随机片段化，然后在自引发聚合酶反应中重组装这些片段，这也可能导致序列同源区域中的交叉。可以筛选以通过改组几种血清型的衣壳基因的方式创建的杂交aav基因文库，以鉴定具有期望功能性的病毒克隆。类似地，可以使用易错pcr以使aav衣壳基因随机突变，以创建多样化的变体库，这可以接下来针对期望特性进行选择。
39.衣壳基因的序列也可以经遗传修饰以引入相对于天然野生型序列的特定缺失、替换或插入。特别地，衣壳基因可以通过在衣壳编码序列的开放阅读框内或在衣壳编码序列
的n和/或c端处插入不相关的蛋白质或肽的序列来修饰。不相关的蛋白质或肽可以有利地是如下的蛋白质或肽，其充当特定细胞类型的配体，从而赋予改善的与靶细胞的结合或提高载体靶向特定细胞群的特异性。不相关的蛋白质也可以是作为生产过程的部分帮助病毒颗粒纯化的蛋白质，即表位或亲和标签。通常插入位点选择为不干扰病毒颗粒的其他功能，例如病毒颗粒的内化、运输。
40.衣壳蛋白可以是人工的或突变的衣壳蛋白。如本文所用，术语“人工衣壳”是指衣壳颗粒包含在自然界中不存在的氨基酸序列或包含已从天然存在的衣壳氨基酸序列工程化改造(例如，修饰)的氨基酸序列。换言之，人工衣壳蛋白与衍生其的亲本衣壳的序列相比包含氨基酸序列中的突变或变异，其中人工衣壳氨基酸序列和亲本衣壳氨基酸序列是对齐的。
41.衣壳蛋白可以包含相对于野生型衣壳蛋白的突变或修饰，其相对于未修饰或野生型病毒颗粒提高转导足细胞的能力。转导足细胞的能力提高可以例如通过测量由aav载体颗粒携带的转基因，例如gfp的表达来测量，其中转基因在足细胞中的表达与aav载体颗粒转导足细胞的能力相关。
42.aav9血清型
43.aav2/9血清型对新生和成年小鼠肾脏显示出显著的趋性，定位于肾小球和肾小管(luo等人，2011；picconi等人，2014；schievenbusch等人，2010)，并且aav2/9载体结合肾静脉注射已被证明适用于肾靶向基因递送(rocca等人，2014)。因此aav2/9是一种适用于本发明病毒载体的载体。
44.aav载体颗粒可以包含aav9衣壳蛋白。适当地，aav载体颗粒可以由aav9衣壳蛋白包囊。
45.aav载体颗粒可以包含aav9 vp1衣壳蛋白、aav9 vp2衣壳蛋白和/或aav9 vp3衣壳蛋白。适当地，aav载体颗粒可以由aav9 vp1衣壳蛋白、aav9 vp2衣壳蛋白和/或aav9 vp3衣壳蛋白包囊。适当地，aav载体颗粒可以由aav9 vp1、vp2和vp3衣壳蛋白包囊。
46.适当地，aav9 vp1衣壳蛋白可以包含如seq id no：31所示的氨基酸序列或与seq id no：31至少90％相同的变体，或由其组成。
47.示例性aav9 vp1衣壳蛋白(seq id no：31)：
[0048][0049]
适当地，变体可以与seq id no：31至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
[0050]
适当地，aav9 vp2和vp3衣壳蛋白可以是seq id no：31的n端截短，或与seq id no：31至少90％相同、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的变体的n端截短。
[0051]
aav lk03血清型
[0052]
诸如lk03的合成aav衣壳也可以是用于本发明病毒载体的合适载体。该载体已显示在体外和体内高效转导人原代肝细胞。然而，直到现在它尚未被用于肾靶向基因递送。令人惊讶的是，aav-lk03载体在体外可以在人足细胞中实现接近100％的高转导，并且可以用于在体外特异性转导足细胞(参见pct/gb2020/050097)。
[0053]
aav-lk03 cap序列由来自七种不同野生型血清型(aav1、2、3b、4、6、8、9)的片段组成，并在lisowski，l.，et al.，2014.nature，506(7488)，pp.382-386中描述，尽管aav-3b占cap基因序列的97.7％和氨基酸序列的98.9％。
[0054]
aav载体颗粒可以包含lk03衣壳蛋白。适当地，aav载体颗粒可以由lk03衣壳蛋白包囊。
[0055]
aav载体颗粒可由包含lk03 vp1衣壳蛋白、lk03 vp2衣壳蛋白和/或lk03 vp3衣壳蛋白。适当地，aav载体颗粒可以由lk03 vp1衣壳蛋白、lk03 vp2衣壳蛋白和/或lk03 vp3衣壳蛋白包囊。适当地，aav载体颗粒可以由lk03 vp1、vp2和vp3衣壳蛋白包囊。
[0056]
适当地，lk03 vp1衣壳蛋白可以包含如seq id no：32所示的氨基酸序列或与seq id no：32至少90％相同的变体，或由如seq id no：32所示的氨基酸序列或与seq id no：32至少90％相同的变体组成。
[0057]
示例性lk03 vp1衣壳蛋白(seq id no：32)：
[0058][0059]
适当地，变体可以与seq id no：32至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
[0060]
适当地，lk03 vp2和vp3衣壳蛋白可以是seq id no：32的n端截短，或与seq id no：32至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的变体的n端截短。
[0061]
aav3b血清型
[0062]
aav-3b还因其人肝细胞趋性而闻名，并且是另一种用于本发明病毒载体的合适载体。迄今为止，它尚未被用于肾靶向基因递送。
[0063]
aav载体颗粒可以包含aav3b衣壳蛋白。适当地，aav载体颗粒可以由aav3b衣壳蛋白包囊。
[0064]
已经克隆两种不同的aav3分离株(aav3a和aav3b)。与基于其他aav血清型的载体相比，认为aav3载体无法有效地转导大多数细胞类型。然而，aav3b可以有效地转导足细胞。aa3b已在rutledge，e.a.，et al.，1998.journal of virology，72(1)，pp.309-319中描述。
[0065]
aav载体颗粒可以包含aav3b vp1衣壳蛋白、aav3b vp2衣壳蛋白和/或aav3b vp3衣壳蛋白。适当地，aav载体颗粒可以由aav3b vp1衣壳蛋白、aav3b vp2衣壳蛋白和/或aav3b vp3衣壳蛋白包囊。适当地，aav载体颗粒可以由aav3b vp1、vp2和vp3衣壳蛋白包囊。
[0066]
适当地，aav3b vpl衣壳蛋白可以包含如seq id no：33所示的氨基酸序列或与seq id no：33至少90％相同的变体，或由如seq id no：33所示的氨基酸序列或与seq id no：33至少90％相同的变体组成。
[0067]
示例性aav3b vp1衣壳蛋白(seq id no：33)：
[0068][0069][0070]
适当地，变体可以与seq id no：33至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
[0071]
适当地，aav3b vp2和vp3衣壳蛋白可以是seq id no：33的n端截短，或与seq id no：33至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的变体的n端截短。
[0072]
aav基因组
[0073]
aav载体或aav载体颗粒可以包含aav基因组或其片段或衍生物。
[0074]
aav基因组是多核苷酸序列，它可以编码产生aav颗粒所需的功能。这些功能包括在宿主细胞中aav的复制和包装循环中(包括将aav基因组包囊在aav颗粒中)起作用的功能。天然存在的aav是复制缺陷的，并且依赖于反式提供辅助功能来完成复制和包装循环。因此，本发明中使用的aav基因组通常是复制缺陷的。
[0075]
aav基因组可以是单链形式，可以是正链或负链，也可以是双链形式。使用双链形式允许绕过靶细胞中的dna复制步骤，并因此可以加速转基因表达。单链形式的最大包装容量大于双链形式。适当地，aav基因组是单链形式。
[0076]
自然界中发生的aav可以根据各种生物系统进行分类。aav基因组可以来自任何天然衍生的aav血清型、分离株或进化枝。
[0077]
aav可以根据其血清型来指代。血清型对应于aav的变体亚种，其由于其衣壳表面抗原的表达谱而具有独特的反应性，这可以用于将其与其他变体亚种区分开来。通常，具有特定aav血清型的aav载体颗粒无法有效地与对任何其他aav血清型具有特异性的中和抗体发生交叉反应。aav血清型包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10和aav11。在一些实施方案中，本发明的aav载体可以是aav3b、lk03、aav9或aav8血清型。
[0078]
aav也可以根据进化枝或克隆来指代。这是指天然衍生的aav的系统发育关系，并通常是指可以追溯到共同祖先的aav的系统发育组，并且包括其所有后代。此外，aav可以根据特定的分离株，即自然界中发现的特定aav的遗传分离株来指代。术语遗传分离株描述了如下的aav群体，其与其他天然存在的aav进行有限遗传混合，从而在遗传水平上定义了在可识别上不同的群体。
[0079]
通常，aav的天然衍生血清型、分离株或进化枝的aav基因组包含至少一个反向末端重复序列(itr)。itr序列以顺式作用提供复制的功能起点，并允许从细胞基因组整合和切除载体。itr可能是治疗性基因旁边顺式所需的唯一序列。
[0080]
aav基因组还可以包含包装基因，诸如编码aav颗粒包装功能的rep和/或cap基因。启动子可以与包装基因中的每一个可操作地连接。此类启动子的具体实例包括p5、p19和p40启动子。例如，通常使用p5和p19启动子以表达rep基因，而通常使用p40启动子以表达cap基因。rep基因编码蛋白质rep78、rep68、rep52和rep40或其变体中的一种或多种。cap基因编码一种或多种衣壳蛋白，诸如vp1、vp2和vp3或其变体。这些蛋白质构成aav颗粒的衣壳，这决定aav血清型。vp1、vp2和vp3可以通过交替mrna剪接产生(trempe，j.p.and carter，b.j.，1988.journal of virology，62(9)，pp.3356-3363)。因此，vp1、vp2和vp3可以具有相同的序列，但是其中vp2相对于vp1在n端截短，而vp3相对于vp2在n端截短。
[0081]
aav基因组可以是天然存在的aav的全基因组。例如，可以使用包含完整aav基因组的载体以制备aav载体或载体颗粒。
[0082]
优选地，出于施用于患者的目的，使aav基因组衍生化。此类衍生化是本领域的标准，并且本发明涵盖使用任何已知的aav基因组衍生物，以及可以通过应用本领域已知技术生成的衍生物。aav基因组可以是任何天然存在的aav的衍生物。适当地，aav基因组是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10或aav11的衍生物。适当地，aav基因组是aav2的衍生物。
[0083]
aav基因组的衍生物包括aav基因组的任何截短或修饰形式，其允许来自本发明的aav载体的转基因在体内表达。通常，可以显著截短aav基因组以包括最小病毒序列，但仍保留上述功能。出于安全原因，这是优选的，以降低载体与野生型病毒重组的风险，并同样避免因靶细胞中存在病毒基因蛋白而触发细胞免疫应答。
[0084]
因此，在本发明的衍生物中可以去除以下部分：一个反向末端重复(itr)序列、复制(rep)和衣壳(cap)基因。然而，衍生物可以另外包括一个或多个rep和/或cap基因或aav基因组的其他病毒序列。天然存在的aav在人19号染色体上的特定位点以高频率整合，并显示出可忽略不计的随机整合频率，因此在治疗环境中可以耐受aav载体中整合能力的保留。
[0085]
本发明另外涵盖以与天然aav基因组不同的顺序和构型提供aav基因组的序列。本发明还涵盖用另一种病毒的序列或由来自超过一种病毒的序列构成的嵌合基因替换一个或多个aav序列或基因。此类嵌合基因可以由来自不同病毒种类的两种或更多种相关病毒蛋白的序列构成。
[0086]
小基因(mini-gene)方法
[0087]
col4a3、col4a4和col4a5具有近1700个氨基酸，由于aav包装的限制，其以全长形式包装成aav载体中是挑战性的。然而，本发明人开发了最小nephrin启动子，其比已知的最小nephrin启动子更短并且令人惊讶地能够驱动足细胞中的转基因表达。可以使用此类最小nephrin启动子以最小化货物尺寸并帮助全长col4a3、col4a4或col4a5的包装。
[0088]
包装全长col4a3、col4a4或col4a5的一种替代选择可以是以小基因提供col4a3、col4a4或col4a5转基因。小基因方法已成功用于开发治疗杜氏肌营养不良的基因疗法(kodippili等人，2018)。在这种方法中，转基因被截短以便适合载体，而不丧失由转基因编码的蛋白质的活性。
[0089]
col4a3、col4a4和col4a5蛋白是大约170-185kda的同源多肽，含有由非胶原序列频繁间隔并形成三重螺旋重复的胶原gly-x-y重复序列。每个多肽还在羧基末端含有大的球状非胶原域。应从col4a3、col4a4和col4a5多肽的每一个中去除大约200-300个氨基酸，以产生适用于小基因方法的截短转基因。可以从三重螺旋重复中去除氨基酸。优选地，不从非胶原区去除氨基酸。
[0090]
具有n端ha标签或n端myc标签的col4a5小基因可以连接到含有人最小nephrin启动子(nphs2)的aav2/9、aav lk03和aavl3载体中。
[0091]
病毒载体基因疗法
[0092]
本发明提供了病毒载体基因疗法，其中病毒载体包含col4a3、col4a4或col4a5转基因。
[0093]
用于病毒载体基因疗法的病毒载体可以是本文所述的本发明的任何病毒载体。因此，应当理解，当本文提及病毒载体时，这也可以指病毒载体基因疗法，除非上下文另有说明。
[0094]
双载体方法
[0095]
病毒载体基因疗法的替代选择可以是使用双载体方法。在该方法中，病毒载体基因疗法包括第一病毒载体以及第二病毒载体，所述第一病毒载体包含col4a3、col4a4或col4a5转基因的至少部分；和任选的足细胞特异性启动子；所述第二病毒载体包含相应col4a3、col4a4或col4a5转基因的至少部分；和任选的足细胞特异性启动子。换言之，将转基因分成两个单独的序列，其中每一个可以被整合到如本文所述的病毒载体基因疗法中。aav双载体方法在例如，mcclements和maclaren 2017中描述，通过引用并入本文。双载体方法中使用的转基因序列可以具有重叠的外显子或内含子序列，当被转导时，它们将通过例如同源重组而组合以重新形成单个转基因序列。替代地，这两个序列可能不重叠，而是将通过例如内含肽蛋白反式剪接方法组合。也有可能在两个载体之一中掺入剪接供体信号，并在第二载体中掺入剪接接受体信号，这允许在itr介导的头对尾多联体化后进行反式剪接，从而产生成熟的mrna。进一步有可能将这些方法组合成各种混合方法，例如其将重组与反式剪接组合。
[0096]
第一病毒载体可以是如本文所述的根据本发明的病毒载体，和/或第二病毒载体可以是如本文所述的根据本发明的病毒载体。在优选的实施方案中，第一病毒载体和第二病毒载体均是如本文所述的根据本发明的病毒载体。
[0097]
col4a3、col4a4和col4a5转基因
[0098]
col4a3、col4a4或col4a5转基因可以包含内含子或内含子序列，其可以用于改善基因表达。内含子或内含子序列可以用于小基因或双载体方法。在双载体方法中，这可以允许转基因的第一和第二部分通过内含子的同源序列进行重组。这在双载体方法与剪接供体和接受体方法组合时特别有用，因为使用外显子序列将导致部分蛋白质被剪接出来，这通常是不期望的。
[0099]
col4a3、col4a4或col4a5转基因可以编码col4a3、col4a4或col4a5多肽，或其片段或衍生物。
[0100]
col4a3、col4a4或col4a5多肽或其片段或衍生物可以能够形成胶原蛋白ivα345网络。适当地，该片段的约200-300个氨基酸被去除。
[0101]
在一些实施方案中，col4a3、col4a4或col4a5多肽是全长多肽。
[0102]
优选地，col4a3、col4a4或col4a5多肽是人的。示例人col4a3是具有uniprotkb登录号q01955的col4a3。示例人col4a4是具有uniprotkb登录号p53420的col4a3。示例人col4a5是具有uniprotkb登录号p29400的col4a5。
[0103]
适当地，col4a3肽可以包含如seq id no：1所示的多肽序列或与seq id no：1至少70％相同的变体或由其组成。适当地，该变体可以与seq id no：1至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同。
[0104]
适当地，col4a4肽可以包含如seq id no：2所示的多肽序列或与seq id no：2至少70％相同的变体或由其组成。适当地，该变体可以与seq id no：2至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同。
[0105]
适当地，col4a5肽可以包含如seq id no：3所示的多肽序列或与seqid no：3至少70％相同的变体或由其组成。适当地，该变体可以与seq id no：3至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同。
[0106]
示例性col4a3氨基酸序列(seq id no：1)
[0107][0108][0109]
示例性col4a4氨基酸序列(seq id no：2)
[0110][0111]
示例性col4a5氨基酸序列(seq id no：3)
[0112][0113]
[0114]
编码col4a3的示例核苷酸序列是nm_000091.5。编码col4a4的示例核苷酸序列是nm_000092.5。编码col4a5的示例核苷酸序列是nm_000495.5。
[0115]
适当地，col4a3转基因可以包含如seq id no：4所示的多核苷酸序列或与seq id no：4至少70％相同的变体或由其组成。适当地，该变体可以与seq id no：4至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同。
[0116]
适当地，col4a4转基因可以包含如seq id no：5所示的多核苷酸序列或与seq id no：5至少70％相同的变体或由其组成。适当地，该变体可以与seq id no：5至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同。
[0117]
适当地，col4a5转基因可以包含如seq id no：6所示的多核苷酸序列或与seq id no：6至少70％相同的变体或由其组成。适当地，该变体可以与seq id no：6至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同。
[0118]
示例性col4a3转基因序列(seq id no：4)
[0119]
[0120]
[0121][0122]
示例性col4a4转基因序列(seq id no：5)
[0123]
[0124][0125]
示例性col4a5转基因序列(seq id no：6)
[0126]
[0127]
[0128][0129]
col4a3、col4a4或col4a5转基因可以是密码子优化的。不同细胞对特定密码子的选择不同。这种密码子偏好性对应于细胞类型中特定trna相对丰度的偏好性。通过改变序列中的密码子，使得它们经定制以与相应trna的相对丰度相匹配，而有可能增加表达。出于同样的原因，有可能通过有意选择已知相应的trna在特定细胞类型中很少见的密码子来减少表达。因此，可获得额外程度的翻译控制。哺乳动物细胞(例如人)以及多种其他生物体的密码子选择表在本领域中是已知的。
[0130]
调控序列
[0131]
启动子
[0132]
本发明的病毒载体可以包含促进col4a3、col4a4或col4a5多肽表达的启动子。适当地，启动子可以与col4a3、col4a4或col4a5转基因可操作地连接。
[0133]
优选地，启动子在足细胞中是可操作的。优选地，启动子能够驱动足细胞中的转基因表达。优选地，本发明的病毒载体包含足细胞特异性启动子。适当地，col4a3、col4a4或col4a5转基因与足细胞特异性启动子可操作地连接。
[0134]
如上所述，本发明人开发了最小nephrin启动子，其比已知的最小nephrin启动子更短，并且令人惊讶地能够驱动足细胞中的转基因表达。启动子还令人惊讶地保留足细胞特异性。可以使用此类最小nephrin启动子以最小化货物尺寸并帮助全长col4a3、col4a4或col4a5的包装。
[0135]
使用足细胞特异性启动子，诸如最小nephrin启动子，允许病毒载体特异性靶向足细胞(moeller等人，2002；picconi等人，2014)。合适的最小nephrin启动子包括nphs1和podocin启动子nphs2。这使得转基因表达能够特异性地靶向肾脏肾小球基底膜中的足细胞，并最大限度地减少脱靶表达。由于足细胞是终末分化的非分裂细胞，它们可以被靶向用于转基因稳定表达，并减少或避免任何载体稀释效应的风险。在本发明的优选实施方案中，启动子是nphs1。nphs1启动子的合适dna序列的一个实例显示于图1。与转基因一样，启动子的物种优选与患者物种匹配。例如，在治疗人患者时，通常会使用人nhps1或人nphs2。
[0136]
如本文所用，“足细胞特异性启动子”可以是优先促进转基因在足细胞中表达的启动子。适当地，与其他细胞类型相比，足细胞特异性启动子可以促进转基因在足细胞中的更高表达。例如，与其他细胞类型中的表达水平相比，足细胞特异性启动子可以是促进足细胞中的转基因表达水平高至少10％、高至少20％、高至少30％、高至少40％、高至少50％、高至少100％、高至少200％、高至少300％、高至少400％、高至少500％或高至少1000％的启动子。
[0137]
转基因表达可以通过本领域已知的任何合适的方法来测量。例如，通过测量可操作地连接到启动子的报告基因转基因，例如gfp的表达，其中报道基因转基因的表达与启动子促进基因表达的能力相关。报告基因转基因例如gfp的表达可以通过任何合适的方法来确定，例如facs。例如，与其他细胞类型例如肾小球内皮细胞相比，足细胞特异性启动子可以促进报告基因转基因在条件性永生化足细胞中的更高表达。合适的足细胞系将是本领域技术人员熟知的，例如cihp-1。生成永生化足细胞的方法将是本领域技术人员熟知的。合适的方法描述于ni，l.，et al.，2012.nephrology，17(6)，pp.525-531。
[0138]
适当地，启动子可以是最小足细胞特异性启动子。启动子可以具有约1.2kb或更短的长度。适当地，启动子具有约1.18kb或更短、约1.17kb或更短、约1.16kb或更短、约1.15kb或更短、约1.14kb或更短、约1.13kb或更短、约1.12kb或更短，约1.11kb或更短，或约1.10kb或更短的长度。适当地，启动子具有约1.15kb或更短的长度。启动子可以具有约1.1kb或更短的长度。在一些实施方案中，启动子具有约1.1kb或更短、1.0kb或更短、约0.9kb或更短、约0.8kb或更短、约0.7kb或更短、约0.6kb或更短、约0.5kb或更短，约0.4kb或更短，或约0.3kb或更短的长度。
[0139]
在一些实施方案中，启动子具有约0.8kb或更短、约0.7kb或更短、约0.6kb或更短、约0.5kb或更短、约0.4kb或更短、或约0.3kb或更短的长度。在一些实施方案中，启动子具有818bp或更短的长度。在一些实施方案中，启动子具有800bp或更短的长度。在一些实施方案中，启动子具有约0.5kb或更短、约0.4kb或更短，或约0.3kb或更短的长度。在一些实施方案中，启动子具有约0.3kb或更短的长度。
[0140]
启动子可以具有约250bp或更长的长度。在一些实施方案中，启动子具有约250-1100bp、250-1000bp、250-900bp、250-800bp、250-700bp、250-600bp、250-500bp、250-400bp、250-300bp的长度。启动子可以具有约265bp或更长的长度。在一些实施方案中，启动子具有约265-1100bp、265-1000bp、265-900bp、265-800bp、265-700bp、265-600bp、265-500bp、265-400bp、265-300bp的长度。在一个实施方案中，启动子具有250-300bp、250-280bp、255-275bp、260-270bp或约265bp的长度。在一个实施方案中，启动子具有800-850bp、800-840bp、810-830bp、815-825bp或约819bp的长度。
[0141]
最小nephrin启动子
[0142]
本发明的病毒载体可以包含最小nephrin启动子。适当地，最小nephrin启动子可以与col4a3、col4a4或col4a5转基因可操作地连接。
[0143]
最小nephrin启动子可以是最小nphs1启动子。例如，nphs1启动子可以具有1.2kb或更短的长度。nphs1基因编码nephrin，其在足细胞中选择性表达。
[0144]
最小人nphs1启动子已经描述于moeller et al.2002j am soc nephrol，13(6)：1561-7和wong ma et al.2000am j physiol renal physiol，279(6)：f1027-32中。这个最
小nphs1是1.2kb的片段，并且似乎是足细胞特异性的。1.2kb启动子区缺少tata框，但具有其他转录因子，例如pax-2结合元件、e-box和gata共有序列的识别基序。
[0145]
适当地，最小nephrin启动子可以包含如seq id no：7所示的核苷酸序列或与seq id no：7至少70％相同的变体(也显示于图1)或由其组成。
[0146]
示例性最小nphs1启动子(seq id no：7)：
[0147][0148]
适当地，变体可以与seq id no：7至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同。
[0149]
适当地，最小nephrin启动子可以包含如seq id no：8所示的核苷酸序列或与seq id no：8至少70％相同的变体或由其组成。
[0150]
示例性最小nphs1启动子(seq id no：8)：
[0151][0152]
适当地，变体可以与seq id no：8至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同。
[0153]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子包含如seq id no：9所示的核苷酸序列或与seq id no：9至少70％相同的变体或由其组成。
[0154]
示例性最小nephrin启动子-819bp(seq id no：9)
[0155][0156]
适当地，变体可以与seq id no：9至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同。
[0157]
在优选的实施方案中，最小nephrin启动子包含如seq id no：10所示的核苷酸序列或与seq id no：10至少70％相同的变体或由其组成。
[0158]
示例性最小nephrin启动子-265bp(seq id no：10)
[0159][0160]
适当地，变体可以与seq id no：10至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同。
[0161]
适当地，最小nephrin启动子衍生自seq id no：8或与seq id no：8具有至少70％同一性的变体。适当地，最小nephrin启动子与seq id no：8或与seq id no：8具有至少70％同一性的变体相比具有一个或多个缺失。适当地，该变体可以与seq id no：8至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同。示例性变体是seq id no：7。
[0162]
适当地，最小nephrin启动子包含根据seq id no：8并且具有一个或多个缺失，例如一个或两个缺失的核苷酸序列，或与其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少至少98％，或至少99％同一性的的核苷酸序列，或由其组成。适当地，最小nephrin启动子包含根据seq id no：8并且具有两个或更多个缺失的核苷酸序列或与其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，或由其组成。缺失可以是任何大小。适当地，缺失的大小各自为至少50bp、至少100bp、至少150bp、至少200bp、至少250bp、至少300bp、至少350bp或至少400bp。适当地，缺失的大小各自为50至500bp、100至500bp、150至500bp、200至500bp、250至500bp、300至500bp、350至500bp或400至500bp。
[0163]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子包含或组成为根据seq id no：8的核苷酸序列，但是其中：
[0164]
(i)删除seq id no：8的位置1至位置n1，其中n1为1至430的整数；和/或
[0165]
(ii)删除seq id no：8的位置n2至位置n3，其中n3≥n2，n2为508至1061的整数，并且n3为508至1061的整数；
[0166]
或与其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
[0167]
例如，最小nephrin启动子可以包含或组成为与如下的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列是根据seq id no：8的核苷酸序列，但其中：
[0168]
(i)删除seq id no：8的位置1至位置n1，其中n1为1至430的整数；和/或
[0169]
(ii)删除seq id no：8的位置n2至位置n3，其中n3≥n2，n2为508至1061的整数，并且n3为508至1061的整数。
[0170]
适当地，n1为50至430、100至430、150至430、200至430、250至430、300至430、350到430或400至430的整数。在一些实施方案中，n1为100至430的整数。在一些实施方案中，n1＝430，即删除seq id no：8的位置1至位置430。
[0171]
n3和n2之间的差异指定删除的大小。适当地，n3≥n2 49、n3≥n2 99、n3≥n2 149、n3≥n2 199、n3≥n2 249、n3≥n2 299、n3≥n2 349、n3≥n2 399、n3≥n2 449、n3≥n2 499或n3≥n2 549。在一些实施例中，n3≥n2 49。
[0172]
n2和n3采用的值确定删除的位置。适当地，n2和n3各自为550至1050的整数，n2和n3各自为600至1000的整数，n2和n3各自为650至950的整数，n2和n3各自为700至900的整数，n2和n3为从750至850的整数。在一些实施方案中，n2＝508并且n3＝1061，即删除seq id no：8的位置508至1061。
[0173]
最小nephrin启动子区
[0174]
本发明人已经确定驱动转基因表达的nephrin启动子的区域。
[0175]
启动子通常包含“核心”和“近端”区。“核心启动子区”可以包含转录起始位点、rna聚合酶结合位点和一般转录因子结合位点。“近端启动子区”可以包含例如促进有效和可控转录所需的初级调节元件和特异性转录因子结合位点。核心和近端启动子区的大小和组分通常以基因特异性方式变化。启动子还可以包含核心启动子区下游且起始密码子上游的5’非翻译区(5’utr)(也称为前导序列)。
[0176]
最小nephrin启动子可以是杂交启动子。如本文所用，“杂交启动子”包括衍生自不同启动子的元件的组合。例如，杂交启动子可以包含衍生自一个预先存在的启动子的近端启动子区和来自另一个预先存在的启动子的核心启动子，以实现期望的转基因表达。肌肉杂交启动子描述于piekarowicz，k.，et al.(2019).methods&clinical development，15，157-169。
[0177]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子包含(i)如seq id no：12所示的核苷酸序列，或与seq id no：12至少70％相同的变体。不希望受理论束缚，认为与seq id no：12具有至少约70％同一性的核苷酸序列可以提供近端启动子区。
[0178]
示例性近端启动子区(seq id no：12)
[0179]
[0180]
适当地，变体可以与seq id no：12至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同。最小nephrin启动子可以包含seq id no：12的变体，如seq id no：13所示。
[0181]
示例性变体近端启动子区(seq id no：13)
[0182][0183]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子包含(ii)如seq id no：14所示的核苷酸序列，或与seq id no：14至少70％相同的变体；如seq id no：15所示的核苷酸序列，或与seq id no：15至少70％相同的变体；和/或如seqid no：16所示的核苷酸序列，或与seq id no：16至少70％相同的变体。
[0184]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子包含(ii)如seq id no：14所示的核苷酸序列，或与seq id no：14至少70％相同的变体。不希望受理论束缚，认为与seq id no：14具有至少约70％同一性的核苷酸序列可以提供核心启动子区。
[0185]
示例性核心启动子区(seq id no：14)
[0186][0187]
适当地，变体可以与seq id no：14至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同。最小nephrin启动子可以包含seq id no：14的变体，如seq id no：17所示。
[0188]
示例性变体核心启动子区(seq id no：17)
[0189][0190]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子包含(ii)如seq id no：15所示的核苷酸序列，或与seq id no：15至少70％相同的变体。不希望受理论束缚，认为与seq id no：15具有至少约70％同一性的核苷酸序列可以提供5’utr。
[0191]
示例性5’utr(seq id no：15)
[0192][0193]
适当地，变体可以与seq id no：15至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同。最小nephrin启动子可以包含seq id no：15的变体，如seq id no：18所示。
[0194]
示例性变体5’utr(seq id no：18)
[0195][0196]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子包含(ii)如seq id no：16所示的核苷酸序列，或与seq id no：16至少70％相同的变体。不希望受理论束缚，认为与seq id no：16具有至少约70％同一性的核苷酸序列可以提供核心启动子区和5’utr。
[0197]
示例性核心启动子区和5’utr(seq id no：16)
[0198][0199]
适当地，变体可以与seq id no：16至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同。最小nephrin启动子可以包含seq id no：16的变体，如seq id no：19所示。
[0200]
示例性变体核心启动子区和5’utr(seq id no：19)
[0201][0202]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子包含(iii)与seq id no：20具有至少70％同一性的核苷酸序列或其一个或多个片段。适当地，最小nephrin启动子包含与seq id no：20具有至少约70％同一性的核苷酸序列或其一个或多个片段，其紧邻近端启动子区的下游和/或紧邻核心启动子区的上游。
[0203]
最小nephrin启动子可以包含与seq id no：20具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列或其一个或多个片段。最小nephrin启动子可以包含seq id no：20的核苷酸序列，或其一个或多个片段。
[0204]
示例性的任进启动子区域(seq id no：20)
[0205][0206]
适当地，该一个或多个片段是(a)5’端片段；和/或(b)3’端片段。适当地，5’端片段可以紧邻近端启动子区的下游。适当地，3’端片段可以紧邻核心启动子区的上游。例如，最小nephrin启动子可以包括：
[0207]
(a)与seq id no：20的位置1至x具有至少70％的核苷酸序列；和/或
[0208]
(b)与seq id no：20的位置y至554具有至少70％同一性的核苷酸序列；
[0209]
其中x和y是整数，并且y＞x。
[0210]
seq id no：20的片段可以是任何长度。适当地，片段可以具有约500bp或更短、450bp或更短、400bp或更短、350bp或更短、300bp或更短、250bp或更短、200bp或更短、150bp或更短、100bp或更短、50bp或更短、40bp或更短、30bp或更短、20bp或更短、或10bp或更短的长度。
[0211]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子不包含seq id no：20。
[0212]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子包含(iv)与seq id no：21或其片段具有至少70％同一性的核苷酸序列。适当地，最小nephrin启动子包含与seq id no：21或其片段
具有至少约70％同一性的核苷酸序列，其紧邻启动子区的上游。
[0213]
最小nephrin启动子可以包含与seq id no：21或其片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。最小nephrin启动子可以包含seq id no：21的核苷酸序列，或其一个或多个片段。
[0214]
示例性任选上游启动子区(seq id no：21)
[0215][0216]
适当地，片段是3’端片段。例如，最小nephrin启动子可以包含与seq id no：21的位置z至430具有至少70％同一性的核苷酸序列，其中z是整数。
[0217]
seq id no：21的片段可以是任何长度。适当地，该片段可以具有约400bp或更短、350bp或更短、300bp或更短、250bp或更短、200bp或更短、150bp或更短、100bp或更短、50bp或更短、40bp或更短、30bp或更短、20bp或更短、或10bp或更短的长度。
[0218]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子不包含seq id no：21。
[0219]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子从5’至3’包含以下各项或由以下各项组成：
[0220]
(i)与seq id no：12具有至少70％同一性的核苷酸序列；
[0221]
(iii)任选地与seq id no：20具有至少70％同一性的核苷酸序列或其一个或多个片段；和
[0222]
(ii)与seq id no：14具有至少70％同一性的核苷酸序列，与seq id no：15具有至少70％同一性的核苷酸序列，和/或与seq id no：16具有至少70％同一性的核苷酸序列。
[0223]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子从5’至3’包含以下各项或由以下各项组成：
[0224]
(i)与seq id no：12具有至少70％同一性的核苷酸序列；
[0225]
(iii)任选地(a)与seq id no：20的5’端片段具有至少70％同一性的核苷酸序列；和/或(b)与seq id no：20的3’端片段具有至少70％同一性的核苷酸序列；和
[0226]
(ii)与seq id no：14具有至少70％同一性的核苷酸序列，与seq id no：15具有至少70％同一性的核苷酸序列，和/或与seq id no：16具有至少70％同一性的核苷酸序列。
[0227]
最小nephrin启动子元件
[0228]
本发明人已经确定驱动转基因表达的nephrin启动子的功能元件。
[0229]
最小nephrin启动子可以包含以下元件中的一个或多个：(a)视黄酸受体结合位点；(b)wt1结合位点；(c)增强子盒；(d)转录因子结合区；和(e)转录起始位点。
[0230]
适当地，最小nephrin启动子包含以下元件中的全部：(a)视黄酸受体结合位点；
(b)wt1结合位点；(c)增强子盒；(d)转录因子结合区；和(e)转录起始位点。
[0231]
视黄酸受体(rar)结合位点是指能够结合rarα、rarβ和/或rarγ的多核苷酸序列。rar结合位点可以包含如seq id no：22所示的核苷酸序列或与seq id no：22相比具有一个或两个取代、缺失或插入的核苷酸序列或由其组成。取代、缺失或插入可以是单个核苷酸的任何取代、缺失或插入，使得rar结合位点保留其内源性功能中的至少一种。
[0232]
示例性rar结合位点(seq id no：22)
[0233][0234]
wt1结合位点是指能够结合由wilms肿瘤抑制基因wt1编码的锌指多肽的多核苷酸序列。wt1结合位点可以包含如seq id no：23所示的核苷酸序列或与seq id no：23相比具有一个、两个或三个取代、缺失或插入的核苷酸序列或由其组成。取代、缺失或插入可以是单个核苷酸的任何取代、缺失或插入，使得wt1结合区保留其内源性功能中的至少一种。
[0235]
示例性wt1结合位点(seq id no：23)
[0236][0237]
增强子盒是指在一些真核生物中发现的充当蛋白质结合位点的dna反应元件。增强子盒可以包含如seq id no：24所示的核苷酸序列或与seq id no：24相比具有一个或两个取代、缺失或插入的核苷酸序列或由其组成。取代、缺失或插入可以是单个核苷酸的任何取代、缺失或插入，使得增强子盒保留其内源性功能中的至少一种。
[0238]
示例性增强子盒(seq id no：24)
[0239][0240]
(a)视黄酸受体结合位点；(b)wt1结合位点；(c)增强子盒中的一个或多个可以存在于近端启动子区。适当地，(a)视黄酸受体结合位点；(b)wt1结合位点；(c)增强子盒中的每一个存在于近端启动子区。
[0241]
在一些实施方案中，以下元件中的一个或多个存在于(i)与seq id no：12具有至少70％同一性的核苷酸序列中：(a)在大约对应于seq id no：12的位置7至位置13的位置处的rar结合位点；(b)在大约对应于seq id no：12的位置14至位置30的位置处的wt1结合位点；(c)在大约对应于seq id no：12的49位至53位的位置处的增强子盒。在一些实施方案中，元件中的每一个存在于(i)与seq id no：12具有至少70％同一性的核苷酸序列中。
[0242]
在一些实施方案中，以下核苷酸序列中的一个或多个存在于(i)与seq id no：12具有至少70％同一性的核苷酸序列中：(a)在对应于seq id no：12的位置7至位置13的位置处的ggggtca；(b)在对应于seq id no：12的位置14至位置30的位置处的cggaggctggggaggca；(c)在对应于seq id no：12的位置49至位置53的位置处的atgtg。在一些实施方案中，核苷酸序列中的每一个存在于(i)与seq id no：12具有至少70％同一性的核苷酸序列中。
[0243]
适当地，最小nephrin启动子可以包含转录因子结合区，该转录因子结合区包含如seq id no：25所示的核苷酸序列或与seq id no：25相比具有1、2、3、4或5个取代、缺失或插入的核苷酸序列或由其组成。取代、缺失或插入可以是单个核苷酸的任何取代、缺失或插入，使得转录因子结合区保留其内源性功能中的至少一种。
[0244]
示例性转录因子结合区(seq id no：25)
[0245]
[0246]
其他合适的转录因子结合区将是本领域技术人员熟知的。例如，其他合适的转录因子结合区包括tacgat(seq id no：36)、tataat(seq id no：37)、gatact(seq id no：38)、tatgat(seq id no：39)和tatgtt(seq id no：40)。
[0247]
适当地，最小nephrin启动子可以包含转录起始位点，该转录起始位点包含“ag”二核苷酸或由“ag”二核苷酸组成。
[0248]
适当地，转录因子结合位点与转录起始位点可操作地连接。适当地，转录因子结合位点可以直接位于转录起始位点的上游。不希望受理论束缚，认为转录因子结合位点和转录起始位点可以提供核心启动子区。
[0249]
适当地，最小nephrin启动子可以包含5’非翻译区。5’非翻译区可以包含与seq id no：15具有至少约70％、80％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列或由其组成。5’非翻译区可以包含seq id no：15或由seq id no：15组成。
[0250]
适当地，5’非翻译区与转录起始位点可操作地连接。适当地，5’非翻译区可以直接位于转录起始位点的下游。
[0251]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子从5’至3’包含以下各项或由以下各项组成：
[0252]
(i)与seq id no：12具有至少70％同一性的核苷酸序列，其中存在以下元件中的每一个：(a)在大约对应于seq id no：12的位置7至位置13的位置处的rar结合位点；(b)在大约对应于seq id no：12的位置14至位置30的位置处的wt1结合位点；(c)在大约对应于seq id no：12的位置49至位置53的位置处的增强子盒；
[0253]
(iii)任选地与seq id no：20或其一个或多个片段具有至少70％同一性的核苷酸序列；和
[0254]
(ii)与seq id no：14具有至少70％同一性的核苷酸序列，与seq id no：15具有至少70％同一性的核苷酸序列，或与seq id no：16具有至少70％同一性的核苷酸序列。
[0255]
示例性最小nephrin启动子
[0256]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子包含如seq id no：9所示的核苷酸序列或与seq id no：9至少70％相同的变体或由其组成。
[0257]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子包含如seq id no：9所示的核苷酸序列，或与seq id no：9至少70％相同的变体并且其中该启动子具有约1.1kb或更短的长度。
[0258]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子由如seq id no：9所示的核苷酸序列或与seq id no：9至少70％相同的变体组成。
[0259]
适当地，变体可以与seq id no：9至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同。最小nephrin启动子可以包含如seq id no：34所示的seq id no：9的变体或由其组成。
[0260]
示例性最小nephrin启动子变体-819bp(seq id no：34)
[0261][0262]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子包含如seq id no：10所示的核苷酸序列或与seq id no：10至少70％相同的变体或由其组成。
[0263]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子包含如seq id no：10所示的核苷酸序列，或与seq id no：10至少70％相同的变体并且其中该启动子具有约1.1kb或更短的长度。
[0264]
在一些实施方案中，最小nephrin启动子由如seq id no：10所示的核苷酸序列或与seq id no：10至少70％相同的变体组成。
[0265]
适当地，变体可以与seq id no：10至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同。最小nephrin启动子可以包含如seq id no：35所示的seq id no：10的变体或由其组成。
[0266]
示例性最小nephrin启动子变体-265bp(seq id no：35)
[0267][0268]
最小podocin启动子
[0269]
本发明的病毒载体可以包含最小podocin启动子。适当地，最小podocin启动子可以与col4a3、col4a4或col4a5转基因可操作地连接。
[0270]
最小podocin启动子可以是最小nphs2启动子。例如，nphs2启动子可以具有0.6kb或更短的长度。nphs2基因编码在足细胞中选择性表达的podocin。
[0271]
最小人nphs2启动子描述于oleggini r，et al.，2006.gene expr.13(1)：59-66中。这个最小nphs2是630bp的片段，其已显示在体外足细胞中表达。
[0272]
适当地，最小podocin启动子可以包含如seq id no：11所示的核苷酸序列或与seq id no：11至少70％相同的变体或由其组成。
[0273]
示例性最小nphs2启动子(seq id no：11)：
[0274][0275][0276]
适当地，变体可以与seq id no：11至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同。
[0277]
其他启动子
[0278]
用于本发明的其他非足细胞特异性启动子将为本领域技术人员所熟知。在一些实施方案中，启动子可以具有约300bp或更短的长度。在一些实施方案中，启动子具有约290bp或更短、280bp或更短、270bp或更短、260bp或更短、250bp或更短、240bp或更短、230bp或更短、220bp或更短、210bp或更短，或者200bp或更短的长度。使用长度为约300bp或更短的启动子可能有助于将col4a3、col4a4和col4a5转基因以其全长形式包装到aav载体中。
[0279]
长度为约300bp或更短的示例性启动子描述于wang，d.，et al.，1999.gene therapy，6(4)，pp.667-675中。wang等人描述了四个短启动子，其具有显著高于单独的aav itr的活性并且大小为102bp至200bp。这些启动子是aav-p5(150bp)、sv40e(200bp)、tk1(110bp)以及在远端和近端元件之间具有额外的10bp缺失的第二tk启动子(tk2)(102bp)。
[0280]
土拨鼠肝炎转录后调节元件
[0281]
病毒载体可以另外包含土拨鼠肝炎转录后调节元件(wpre)。适当地，wpre可以与col4a3、col4a4或col4a5转基因可操作地连接。wpre是在转录时创建增强表达的三级结构的dna序列。包含wpre可以增加由载体递送的转基因的表达。可以对wpre序列进行突变以降低致癌性，而不显著丧失rna增强活性(schambach等人，2005，通过引用并入本文)。合适的wpre序列的一个示例显示于图2。
[0282]
适当地，wpre可以包含如seq id no：26所示的核苷酸序列，或与seq id no：26至少70％相同的变体(也显示于图2)或由其组成。
[0283]
示例性wpre(seq id no：26)
[0284][0285]
适当地，变体可以与seq id no：26至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同。
[0286]
在一些实施方案中，本发明的病毒载体不包含wpre序列。
[0287]
蛋白质标签
[0288]
col4a3、col4a4或col4a5转基因可以包含蛋白质标签，诸如血凝素(ha)标签。ha可以用作表位标签，并且已显示不干扰已添加它的蛋白质的生物活性或生物分布。蛋白质标签可以促进转基因的检测、分离和纯化。其他合适的蛋白质标签可以包括myc标签、多组氨酸标签和flag标签。
[0289]
在一些实施方案中，col4a3、col4a4或col4a5转基因包含一个或多个flag标签。在一些实施方案中，col4a3、col4a4或col4a5转基因包含三个flag标签。
[0290]
kozak序列
[0291]
病毒载体可以另外包含在启动子和col4a3、col4a4或col4a5转基因之间的kozak序列。已知kozak序列在翻译过程的启动中起主要作用，并因此可以增强col4a3、col4a4或col4a5转基因的表达。合适的kozak序列将为本领域技术人员所熟知。
[0292]
适当地，kozak序列可以包含如seq id no：27所示的核苷酸序列或与seq id no：27至少65％相同的变体或由其组成。
[0293]
示例性kozak序列(seq id no：27)
[0294][0295]
适当地，该变体可以与seq id no：27至少75％、至少85％或至少90％相同。
[0296]
在一些实施方案中，本发明的病毒载体不包含kozak序列。
[0297]
多聚腺苷酸化信号
[0298]
病毒载体可以另外包含多腺苷酸化信号，诸如牛生长激素(bgh)多腺苷酸化信号，例如，如图3中所示。适当地，聚腺苷酸化信号可以与col4a3、col4a4或col4a5转基因可操作地连接。多聚腺苷酸化是向信使rna添加poly(a)尾。poly(a)尾由多个一磷酸腺苷组成；换句话说，它是一段只有腺嘌呤碱基的rna。poly(a)尾对于mrna的核输出、翻译和稳定性很重要。因此，包含多腺苷酸化信号可以增强col4a3、col4a4或col4a5转基因的表达。
[0299]
合适的多腺苷酸化信号包括早期sv40多腺苷酸化信号(sv40pa)、鸡β-珠蛋白多腺苷酸化信号、牛生长激素多腺苷酸化信号(bgh)或可溶性神经纤毛蛋白-1多腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，多腺苷酸化信号是早期sv40多腺苷酸化信号(sv40pa)或鸡β-珠蛋白多腺苷酸化信号。优选地，多腺苷酸化信号是早期sv40多腺苷酸化信号(sv40pa)。
[0300]
适当地，多腺苷酸化信号可以包含如seq id no：28所示的核苷酸序列或与seq id no：28至少70％相同的变体(也显示于图3)或由其组成。适当地，该变体可以与seq id no：28至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同。
[0301]
示例性bgh poly(a)信号序列(seq id no：28)：
[0302][0303]
适当地，多腺苷酸化信号可以包含如seq id no：29所示的核苷酸序列或与seq id no：29至少70％相同的变体或由其组成。适当地，该变体可以与seq id no：29至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同。
[0304]
示例性于溶性神经纤毛蛋白-1多腺苷酸化信号(seq id no：29xx)：
[0305][0306]
适当地，多腺苷酸化信号可以包含如seq id no：30所示的核苷酸序列或与seq id no：30至少70％相同的变体或由其组成。适当地，该变体可以与seq id no：30至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同。
[0307]
示例性sv40pa信号序列(seq id no：30)：
[0308][0309]
适当地，多腺苷酸化信号可以包含如seq id no：41所示的核苷酸序列或与seq id no：41至少70％相同的变体或由其组成。适当地，该变体可以与seq id no：41至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同。
[0310]
示例性鸡β-珠蛋白多腺苷酸化信号(seq id no：41)
[0311][0312]
反向末端重复序列
[0313]
病毒载体可以另外包含在载体的任一末端的反向末端重复(itr)序列。例如，载体结构可以按顺序为：itr-启动子-转基因(具有任选的蛋白质标签)-任选的wrpe-多聚腺苷酸化信号-itr。
[0314]
itr可以充当启动子(flotte，t.r.，et al.1993.journal if biological chemistry，268(5)，pp.3781-3790)。
[0315]
通常，aav基因组将包括至少一个反向末端重复序列(itr)，优选多于一个itr，诸如两个itr或更多。itr中的一个或多个可以衍生自具有不同血清型的aav基因组，或者可以是嵌合的或突变的itr。优选的突变itr是具有trs(末端解离位点，terminal resolution site)缺失的突变itr。这种缺失允许基因组继续复制以生成含有编码和互补序列的单链基因组，即自身互补的aav基因组。这允许绕过靶细胞中的dna复制，因此能够加速转基因表达。但是，scaav的最大包装容量降低。适当地，aav基因组不是scaav基因组。
[0316]
aav基因组可以包含来自任何天然衍生的aav血清型、分离株或进化枝或其变体的一个或多个itr序列。aav基因组可以包含至少一种，诸如两种aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10或aav11 itr，或其变体。适当地，aav基因组可以包含至少一种，诸如两种aav2 itr。
[0317]
优选包含一种或多种itr以帮助aav载体在宿主细胞核中形成多联体，例如在通过宿主细胞dna聚合酶的作用将单链载体dna转化为双链dna之后。这种游离型多联体的形成在宿主细胞的生命周期中保护aav载体，从而允许转基因在体内的延长表达。
[0318]
适当地，itr元件将是衍生物中从天然aav基因组保留的唯一序列。衍生物优选不包括天然基因组的rep和/或cap基因以及天然基因组的任何其他序列。这出于上述原因是优选的，并且对于降低载体整合到宿主细胞基因组中的可能性也是优选的。此外，减小aav基因组的大小允许提高在载体内掺入除转基因外的其他序列元件(诸如调节元件)的灵活性。
[0319]
变体、衍生物、类似物、同系物和片段
[0320]
除了本文提及的具体蛋白质和核苷酸之外，本发明还涵盖其变体、衍生物、同源物和片段。
[0321]
在本发明的上下文中，任何给定序列的“变体”是其中残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的特定序列已经以使得所讨论的多肽或多核苷酸保留其内源性功能中的至少一种的方式被修饰的序列。变体序列可以通过天然存在的多肽或多核苷酸中存在的至少一个残基的添加、缺失、取代、修饰、置换和/或变异来获得。例如，变体启动子序列保留其所获得自的启动子序列的至少一定水平的活性和特异性。
[0322]
如本文所用的与本发明的蛋白质或多肽相关的术语“衍生物”包括从或对序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何取代、变异、修饰、置换、缺失和/或添加，条件是所得蛋白质或多肽保留其内源性功能中的至少一种。
[0323]
通常，可以进行氨基酸取代，例如从1、2或3到10或20个取代，条件是修饰的序列保留所需的活性或能力。氨基酸取代可以包括使用非天然存在的类似物。
[0324]
本发明中使用的蛋白质还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，这产生沉默变化并产生功能等同的蛋白质。只要保留内源性功能，可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
[0325]
可以例如根据下表进行保守取代。第二列中同一块中的氨基酸，优选第三列中同一行中的氨基酸可以相互取代：
[0326][0327]
如本文所用，术语“同源物”是指与野生型氨基酸序列或野生型核苷酸序列具有一定同源性的变体。术语“同源性”可以等同于“同一性”。
[0328]
在本文中，同源序列理解为包括可以与目标序列至少50％、55％、65％、75％、85％或90％相同，优选至少95％、96％或97％或98％或99％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。尽管也可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性，但在本发明的上下文中，优选根据序列同一性来表达同源性。
[0329]
在本文中，同源序列理解为包括可以与目标序列至少50％、55％、65％、75％、85％或90％相同，优选至少95％、96％或97％或98％或99％相同的核苷酸序列。尽管也可以根据相似性考虑同源性，但在本发明的上下文中，优选根据序列同一性来表达同源性。
[0330]
优选地，提及与本文详述的seq id no中的任一个具有百分比同一性的序列是指在所提及的seq id no的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。
[0331]
同源性比较可以通过肉眼进行，或者更常见的是借助现成的序列比较程序进行。这些市售的计算机程序可以计算两个或多个序列之间的百分比同源性或同一性。
[0332]
可以计算连续序列内的百分比同源性，即一个序列与另一序列比对并且一个序列中的每个氨基酸或核苷酸直接与另一序列中的相应氨基酸或核苷酸进行比较，一次一个残基。这称为“无空位”比对。通常，此类无空位比对仅在相对较少数量的残基上进行。
[0333]
尽管这是一种非常简单和一致的方法，但它没有考虑到，例如，在其他相同的序列对中，氨基酸或核苷酸序列中的一个插入或缺失可能导致后续残基或密码子不能对齐，因此在执行全局对齐时可能导致百分比同源性大幅降低。因此，大多数序列比较方法旨在产生最佳比对，考虑可能的插入和缺失，而不过度惩罚整体同源性得分。这是通过在序列比对中插入“空位”以尝试最大化局部同源性来实现的。
[0334]
然而，这些更复杂的方法为比对中出现的每个空位分配“空位罚分”，因此，对于相同数量的同一氨基酸或核苷酸，序列比对具有尽可能少的空位，反映比较的两者之间更高的相关性序列，将实现比具有许多空位的序列更高的得分。“仿射空位成本”通常用于对空位的存在收取相对较高的成本，而对空位中的每个后续残基收取较小的惩罚。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生具有更少空位的优化比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。但是，在使用此类软件进行序列比较时，最好使用默认值。例如，当使用gcg wisconsin bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位罚分是空位-12和每个延伸-4。
[0335]
因此，计算最大百分比同源性首先需要产生最佳比对，同时考虑空位罚分。用于进行这种比对的合适的计算机程序是gcg wisconsin bestfit软件包(university of wisconsin，usa；devereux et al.(1984)nucleic acids research 12：387)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于blast软件包(参见ausubel等人(1999)出处同前-ch.18)、fasta(atschul et al.(1990)j.mol.biol.403-410)、emboss needle(madeira，f.，et al.，2019.nucleic acids research，47(w1)，pp.w636-w641)和geneworks比较工具套件。blast和fasta两者均可用于离线和在线检索(参见ausubel等人(1999)出处同前，第7-58页至第7-60页)。但是，对于一些应用程序，最好使用gcg bestfit程序。另一种工具blast 2 sequences也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(fems microbiol.lett.(1999)174(2)：247-50；fems microbiol.lett.(1999)177(1)：187-8)。
[0336]
尽管最终的百分比同源性可以根据同一性来衡量，但比对过程本身通常不是基于全有或全无的配对比较。相反，通常使用缩放的相似性评分矩阵，它根据化学相似性或进化距离为每个成对比较分配分数。此类矩阵常用的实例是blosum62矩阵(blast程序套件的默认矩阵)。gcg wisconsin程序通常使用公共默认值或自定义符号比较表(如果提供)(更多详细信息，参见用户手册)。对于一些应用程序，优选使用gcg软件包的公共默认值，或者在其他软件的情况下，使用默认矩阵，诸如blosum62。
[0337]
一旦软件已经产生最佳比对，就可能计算百分比同源性，优选百分比序列同一性。该软件通常将此作为序列比较的一部分并生成数字结果。百分比序列同一性可以计算为相同残基的数目占所参考的seq id no中总残基的百分比。
[0338]“片段”也是变体，并且该术语通常是指多肽或多核苷酸的选定区域，其在功能上或例如在测定中是感兴趣的。因此，“片段”是指作为全长多肽或多核苷酸的部分的氨基酸或核酸序列。
[0339]
此类变体、衍生物、同源物和片段可以使用标准重组dna技术诸如定点诱变来制备。在要进行插入的地方，可以制备编码插入的合成dna以及对应于插入位点任一侧的天然存在序列的5’和3’侧翼区。侧翼区将含有与天然存在序列中的位点相对应的方便的限制性位点，以便可以用适当的酶切割该序列并将合成dna连接到该切口中。然后根据本发明表达dna以制备编码的蛋白质。这些方法仅说明本领域已知的用于操作dna序列的众多标准技术，并且也可以使用其他已知技术。
[0340]
细胞
[0341]
在一方面，本发明提供了包含本发明的病毒载体的细胞。细胞可以是分离的细胞。细胞可以是人细胞，适当地是分离的人细胞。
[0342]
可以使用本领域已知的多种技术，诸如转染、转导和转化将病毒载体引入细胞中。适当地，本发明的载体通过转染或转导引入细胞。
[0343]
细胞可以是现有技术中已知的任何细胞类型。
[0344]
适当地，细胞可以是生产细胞。术语“生产细胞”包括在瞬时转染、稳定转染或载体转导产生病毒颗粒所必需的所有元件后产生病毒颗粒的细胞，或经工程化改造以稳定包含产生病毒颗粒所必需的元件的任何细胞。合适的生产细胞将是本领域技术人员熟知的。合适的生产细胞系包括hek 293(例如hek 293t)、hela和a549细胞系。
[0345]
适当地，细胞可以是包装细胞。术语“包装细胞”包括含有包装感染性重组病毒所
必需的一些或全部元件的细胞。包装细胞可能缺少重组病毒载体基因组。通常，此类包装细胞含有能够表达病毒结构蛋白的一种或多种载体。通过随后的每个额外所需元件的瞬时转染、转导或稳定整合的步骤，仅包含产生包膜病毒颗粒所需的一些元件的细胞可用作生成病毒颗粒产生细胞系的中间试剂。这些中间试剂包含在术语“包装细胞”中。合适的包装细胞将为本领域技术人员所熟知。
[0346]
适当地，细胞可以是肾细胞或肾小球细胞，例如足细胞。适当地，细胞可以是永生化的肾细胞或肾小球细胞，例如永生化足细胞。合适的足细胞系将是本领域技术人员熟知的，例如cihp-1。生成永生化足细胞的方法将是本领域技术人员熟知的。合适的方法描述于ni，l.，et al.，2012.nephrology，17(6)，pp.525-531。
[0347]
如上所述，尽管参照病毒载体对细胞进行描述，但应当理解，可以替代地使用病毒载体基因疗法。
[0348]
治疗或预防alport综合征的方法
[0349]
在一方面，本发明提供了根据本发明的病毒载体、细胞或药物组合物，用作药物。
[0350]
在一方面，本发明提供了根据本发明的病毒载体、细胞或药物组合物在制备药物中的用途。
[0351]
在一方面，本发明提供了将根据本发明的病毒载体、细胞或药物组合物施用于有需要的受试者的方法。
[0352]
在一方面，本发明提供根据本发明的病毒载体、细胞或药物组合物用于预防或治疗alport综合征。
[0353]
在一方面，本发明提供了根据本发明的病毒载体、细胞或药物组合物在制备用于预防或治疗alport综合征的药物中的用途。
[0354]
在一方面，本发明提供了预防或治疗alport综合征的方法，其包括将根据本发明的病毒载体、细胞或药物组合物施用于有需要的受试者。
[0355]
靶向足细胞病毒col4a3、col4a4或col4a5基因疗法可以改变as患者的肾小球基底膜并至少部分地使其正常化。可以使用野生型和alport综合征足细胞的人球体模型在体外测试构建体对肾小球基底膜的结构影响。可以检查球体模型的肾小球基底膜组成的变化。还可以使用芯片模型上的肾单位进行功能测试，该模型包括在通道的一侧共培养肾小球内皮细胞和足细胞以形成成熟的肾小球基底膜，其可以用于测量通过通道的蛋白质渗透性。可以在小鼠α3或α5 ko小鼠或α4自发小鼠突变体中测试构建体。可以通过尾静脉注射施用构建体，并且将通过蛋白尿水平和存活来测量功效。
[0356]
可以使用本发明的病毒载体基因疗法以治疗或预防alport综合征(as)。as患者通常表现为血尿，可能进展为蛋白尿。血尿可以通过显微镜下观察尿液中红细胞的存在来确定。低于30mg/天的基础微量白蛋白尿水平通常被认为是非病理性的。约30mg/天至约300mg/天的水平称为微量白蛋白尿，这被认为是病理性的。超过300mg/天的白蛋白水平称为大量白蛋白尿，并且超过3.5g/天的蛋白尿水平被认为是肾病范围蛋白尿。用本发明的病毒载体治疗的患者可能有血尿、微量白蛋白尿、大量白蛋白尿或肾病范围蛋白尿。
[0357]
在蛋白尿发作之前治疗患者可以减缓或预防蛋白尿的进展，从而延迟或预防终末期肾衰竭。也可以治疗肾病范围蛋白尿的患者。由于肾小球基底膜的胶原蛋白ivα345网络被转基因改变和正常化或修复，基因疗法治疗后蛋白尿水平应逐渐降低。
[0358]
患者可以另外或替代地检测出col4a3、col4a4或col4a5的致病性变体呈阳性。col4a3和col4a4的致病性变体可以是杂合子(常染色体显性)或双等位基因(常染色体隐性)。col4a5中的致病性变体是半合子或杂合子(x连锁)。患者优选用一种或多种病毒载体治疗，该病毒载体包含与患者具有致病性变体的基因相对应的转基因。例如，具有致病性col4a5变体的患者可以用包含col4a5转基因的病毒载体治疗。患者可能检测出col4a3、col4a4或col4a5的两种或更多种致病性变体呈阳性。此类患者可以用包含不同转基因的两种或更多种病毒载体治疗，即每种病毒载体包含对应于患者具有致病性变体的基因的转基因。
[0359]
特别是，患者可能患有x染色体连锁as，这通常与col4a5的致病性变体有关。
[0360]
如本文所用，术语“患者”可以包括任何哺乳动物，包括人。患者可以是成人或儿科患者，诸如新生儿或婴儿。患者可以是男性或女性。患者可以是患有x染色体连锁as的男性患者，特别是青少年男性患者。
[0361]
根据本发明的病毒载体、细胞或药物组合物可以胃肠外施用，例如静脉内或通过输注技术施用。载体、细胞或药物组合物可以以无菌水溶液的形式施用，该无菌水溶液可以含有其他物质，例如足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。水溶液可以适当缓冲(优选ph为3至9)。可以相应地配制药物组合物。在无菌条件下制备合适的胃肠外配制剂很容易通过本领域技术人员熟知的标准制药技术完成。
[0362]
病毒载体、细胞或药物可以全身施用，诸如通过静脉注射。
[0363]
根据本发明的病毒载体、细胞或药物组合物可以局部施用，例如通过靶向施用至肾脏。适当地，病毒载体、细胞或药物组合物可以通过注射到肾动脉中或通过输尿管或包膜下注射来施用。在本发明的实施方案中，病毒载体可以通过注射到肾动脉中来施用。在本发明的替代实施方案中，病毒载体可以通过逆行施用，例如，使用导尿管经由输尿管来施用。
[0364]
病毒载体、细胞或药物组合物可以作为单剂量施用，换言之，可能不需要载体的后续剂量。在需要重复剂量的情况下，可以在载体中使用不同的病毒血清型。例如，在第一剂中使用的载体可以包括aav-lk03或aav-3b，而在随后的剂量中使用的载体可以包括aav 2/9。
[0365]
病毒载体、细胞或药物组合物可以以不同的剂量(例如以载体基因组(vg)/kg测量)施用。在任何情况下，医生将确定最适合任何个体受试者的实际剂量，并且会随着特定受试者的年龄、体重和响应而变化。然而，通常，对于本发明的aav载体，可以施用10
10
至10
14
vg/kg或10
11
至10
13
vg/kg的剂量。
[0366]
任选地，病毒载体、细胞或药物组合物可以联合患者的临时免疫抑制施用，例如，通过在口服类固醇治疗的同时或之后施用病毒载体。在基因疗法治疗之前和/或期间可能需要免疫抑制以抑制患者对载体的免疫应答。然而，aav衣壳仅暂时存在于转导细胞中，因为它不由载体编码。因此，衣壳逐渐降解和清除，这意味着阻断对衣壳的免疫应答直到衣壳序列从转导细胞中清除的短期免疫调节方案可以允许转基因的长期表达。因此，在施用基因疗法后约六周的时期里，可能需要免疫抑制。
[0367]
病毒载体、细胞或药物组合物可以另外或替代地联合肾素-血管紧张素治疗策略(诸如血管紧张素转化酶(ace)抑制剂、醛固酮拮抗剂(例如螺内酯)或血管紧张素受体阻滞剂(arb))施用。
[0368]
药物组合物
[0369]
病毒载体可以药物组合物的形式施用。换言之，病毒载体可以与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂组合。合适的药物组合物优选是无菌的。
[0370]
用于治疗用途的可接受的载体、稀释剂和赋形剂在制药领域是众所周知的。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的施用途径和标准药学实践来选择。药物组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂或除此之外的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂或增溶剂。
[0371]
药学上可接受的载体的实例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯、石油醚脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
[0372]
药物组合物可以进一步包含一种或多种其他治疗剂。
[0373]
本发明进一步包括使用包含本发明的病毒载体、细胞和/或药物组合物的试剂盒。优选地，所述试剂盒用于方法中并如本文所述使用，例如本文所述的治疗方法。优选地，所述试剂盒包括试剂盒组分的使用说明。
[0374]
如上所述，虽然治疗或预防alport综合征的方法已经通过参考病毒载体进行描述，但是应当理解，可以替代地使用病毒载体基因疗法。
[0375]
附图简述
[0376]
图1显示了最小人nephrin启动子(nphs1)的示例dna序列。
[0377]
图2显示了wpre序列的示例dna序列。
[0378]
图3显示了bgh poly(a)信号序列的示例dna序列。
[0379]
图4显示了示例性aav转移质粒，其包含与mini nephrin启动子偶联的col4a3、col4a4和col4a5。
[0380]
(a)paav.265.的示意图，这是包含与mini nephrin启动子偶联的col4a3的aav质粒。显示了smai位点，并且在用smai限制化后预期以下片段：1.6238bp、2.2753bp、3.56bp、4.11bp、5.11bp。(b)paav.265.的示意图，这是包含与mini nephrin启动子偶联的col4a4的aav质粒。显示了smai位点，并且在用smai限制化后预期以下片段：1.4052bp、2.2753bp、3.2224bp、4.56bp、5.11bp、6.11bp。(c)paav.265.的示意图，这是包含与mini nephrin启动子偶联的col4a5的aav质粒。显示了smai位点，并且在用smai限制化后预期以下片段：1.4272bp、2.2753bp、3.2032bp、4.56bp、5.11bp、6.11bp。(d)用smai进行的限制性消化。mw＝1kb dna梯，泳道1、2和3分别对应于(a)、(b)和(c)中所示质粒的消化物。(e)显示了限制性消化的示意图。
[0381]
图5显示了用aav.col4.nephrin265.sv40病毒转导的足细胞
[0382]
(a)在用抗flag抗体拉下的人分化cipodocyte(条件性永生化)中进行的带flag标签的全长col4a3(lk03)或col4a5(lk03)的免疫沉淀实验。抗flag抗体沉淀col4a3和col4a5两者。人flag igg用作对照。(b)蛋白质裂解物的蛋白质印迹，其显示了人或小鼠分化的cipodocyte中col4a3(lk03衣壳血清型)、col4a5(lk03)和col4a5(2/9衣壳血清型)的表达水平。未感染的人和小鼠cipodocyte用作对照。(c)共聚焦图像，显示了人野生型
cipodocyte/col4a5 3xflag aav cipodocyte中转导的col4a5与f-肌动蛋白的免疫荧光染色。与野生型对应物相比，col4a5以细胞溶质水平存在于用col4a53xflag aav病毒感染的人分化足细胞中。
[0383]
图6显示了最小nephrin启动子的示意图
[0384]
(a)全长nephrin启动子长度为1249bp(不包括起始密码子)，以下简称“fl”nephrin启动子。(b)删除5’区的示例性最小nephrin启动子长度为819bp(不包括起始密码子)，以下称为“midi”nephrin启动子。(c)删除5’区和删除中心区的示例性最小nephrin启动子长度为265bp(不包括起始密码子)，以下称为“mini”nephrin启动子。(d)指示了nephrin启动子的以下区域：(i)人小鼠同源区，(ii)视黄酸受体(rar)结合位点，(iii)wt1结合位点，(iv)转录因子结合区，和(v)转录起始位点。
[0385]
图7显示了慢病毒载体的示意图，该载体包含与midi nephrin启动子可操作地偶联的gfp
[0386]
(a)使用pace_hnphs1启动子作为模板以引入bamh1和cla1限制性位点。(b)最终构建载体，包含与midi nephrin启动子可操作地偶联的gfp。
[0387]
图8显示了慢病毒载体的示意图，该载体包含与mini nephrin启动子可操作地偶联的gfp
[0388]
(a)使用pace_hnphs1启动子作为pcr的模板并凝胶提取启动子的两个部分。(b)最终构建载体，包含与mini nephrin启动子可操作地偶联的gfp。
[0389]
图9显示了用慢病毒载体转导后cipodocyte中gfp的表达
[0390]
使用慢病毒方法生成稳定表达带gfp标签的nephrin启动子的人cipodocyte。通过荧光显微法观察gfp表达。(a)未转导的cipodocyte。(b)稳定表达带gfp标签的mini nephrin启动子的cipodocyte。(c)稳定表达带gfp标签的fl nephrin启动子的cipodocyte。
[0391]
图10显示了用慢病毒载体转导后分化的cipodocyte中gfp的表达
[0392]
将包含与nephrin启动子可操作连接的gfp的慢病毒载体转导到分化的条件性永生化足细胞(cipodocyte)中。使用免疫沉淀(ip)以检测gfp表达。
[0393]
图11显示了用慢病毒-gfp.nephrin启动子(最小或265)转导的人肾小球细胞
[0394]
facs分析展示了使用novocyte分析仪的条件性永生化人足细胞(ly)和肾小球内皮细胞(genc)的所有活单峰的中值gfp荧光(afu)。将未转导的细胞(细胞对照)与用慢病毒构建体转导的细胞进行比较，这些慢病毒构建体携带由全长人nephrin启动子(hnphs1.gfp)或微小人nephrin启动子(265.gfp)控制的gfp表达盒。使所有细胞分化10天，胰蛋白酶处理(100ul)并在pbs、2％fbs、1∶1000 draq7(150ul)中稀释。数据和误差线代表3次技术重复(100ul，＞2500个细胞)
±
sem。
实施例
[0395]
alport综合征是一种影响肾小球基底膜胶原蛋白α3α4α5(iv)网络的疾病，缺乏肾小球特异性治疗策略。目前的主要治疗方法是针对血压升高。升高的肾小球滤过率和微量白蛋白尿是alport综合征的早期指标，均与肾小球基底膜中的变化有关。胶原蛋白α3α4α5(iv)由足细胞而非内皮细胞产生。
[0396]
本研究的目的是将治疗alport综合征的成功策略与安全且成功的基因递送方法
相结合，以便可以将col4a3、col4a4或col4a5基因表达递送至足细胞，优选是在疾病早期和蛋白尿发作之前。
[0397]
实施例1-与col4a3、col4a4和col4a5偶联的最小nephrin启动子的设计、构建和测试
[0398]
aav构建体的设计和构建
[0399]
设计和构建了包含与mini nephrin启动子偶联的col4a3、col4a4和col4a5的以下aav转移质粒(“265
”‑
有关mini nephrin启动子的设计、构建和测试的详细信息，参见实施例2)：
[0400]
·
paav.265.col4a3.3flag.sv40，aav质粒，包含与mini nephrin启动子偶联的col4a3(参见图4a)。
[0401]
·
paav.265.col4a4.3flag.sv40，aav质粒，包含与mini nephrin启动子偶联的col4a4(参见图4b)
[0402]
·
paav.265.col4a5.3flag.sv40，aav质粒，包含与mini nephrin启动子偶联的col4a5(参见图4c)
[0403]
进行smai消化以确认质粒的身份(参见图4d-e)。这表明col4a3、a4和a5成功克隆到aav中，所述aav具有265bp mini nephrin启动子和sv40polya尾。
[0404]
aav构建体的测试
[0405]
使用标准方法制备以下aav病毒载体：
[0406]
·
具有lk03血清型的aav.col4a3.nephrin265.sv40
[0407]
·
具有lk03血清型的aav.col4a5.nephrin265.sv40
[0408]
·
具有2/9血清型的aav.col4a5.nephrin265.sv40
[0409]
图5a显示了在用抗flag抗体拉下的人分化cipodocyte中进行的全长带flag标签的col4a3(lk03)或col4a5(lk03)的免疫沉淀实验。抗flag抗体沉淀col4a3和col4a5两者。人flagigg用作对照。
[0410]
图5b显示了蛋白质裂解物的蛋白质印迹，显示了人或小鼠分化的cipodocyte中col4a3(lk03衣壳血清型)、col4a5(lk03)和col4a5(2/9衣壳血清型)的表达水平。未感染的人和小鼠的cipodocyte用作对照。
[0411]
图5c显示了共聚焦图像，显示了人野生型cipodocyte/col4a53xflagaavcipodocyte中转导的col4a5与f-肌动蛋白的免疫荧光染色。与野生型对应物相比，col4a5以细胞溶质水平存在于用col4a53xflagaav病毒感染的人分化足细胞中。
[0412]
这些结果表明，出人意料地，我们用与mini nephrin启动子偶联的全长col4a3和col4a5成功地转导了人足细胞，并且mini nephrin启动子出人意料地驱动了全长col4a3或col4a5在人足细胞中的表达。
[0413]
实施例2——最小nephrin启动子的设计、构建和测试
[0414]
最小nephrin启动子的设计
[0415]
人nphs1启动子已经描述于moeller et al.2002j am soc nephrol，13(6)：1561-7和wong ma et al.2000am j physiol renal physiol，279(6)：f1027-32。这个nphs1启动子是1.2kb的片段，并且似乎是足细胞特异性的。这在下文中称为“fl”nephrin启动子并显示于图6a。
[0416]
通过删除n端序列，最初将fl nephrin启动子切割为822bp(819bp，不包括起始密码子)。这在下文中称为“midi”nephrin启动子并显示于图6b。
[0417]
通过从中心区去除假定的一般转录域，将midi nephrin启动子进一步切割至268bp(265bp，不包括起始密码子)。这在下文中称为“mini”nephrin启动子并显示于图6c。
[0418]
载体构建体的构建
[0419]
midi nephrin启动子
[0420]
使用pace_hnphs1启动子作为模板以引入bamhi和clai限制性位点，如图7a所示。然后凝胶提取片段并在37℃下用clai和bamhi消化1小时，然后连接到plenti gfp blast载体中。将连接物进一步转化到稳定的感受态大肠杆菌(e.coli)细胞中，提取dna并测序(midi启动子)。最终的慢病毒载体显示于图7b。
[0421]
mini nephrin启动子
[0422]
使用pace_hnphs1启动子以对突出端(oh)进行pcr，如图8a所示。将含有oh的启动子的两个部分进行凝胶提取，用于对plenti gfp blast载体进行nebuilder hifi assembly反应。然后使用dna清洁试剂盒清洁连接反应，然后将其转化到稳定的感受态大肠杆菌细胞中。提取dna并测序。最终的慢病毒载体显示于图8b。
[0423]
测试载体构建体
[0424]
使用最小nephrin启动子在体外细胞模型中表达gfp，以检查功效和足细胞特异性。
[0425]
使用plenti gfp blastnephrin启动子构建体(全长、midi和mini)以转染hek293t细胞48小时以制备病毒，该病毒进一步用于创建稳定表达带gfp标签的flnphs1、midi或mini启动子的人条件性永生化足细胞。
[0426]
用慢病毒载体转染条件性永生化人足细胞(cipodocyte)以确定最小启动子是否能够驱动gfp表达。midi和mini nephrin启动子均显示驱动gfp表达。图9显示了代表性的荧光显微法图像，显示了从mini nephrin启动子的gfp表达。图10显示了代表性的蛋白质印迹，显示了从mini nephrin启动子的gfp表达。这些结果表明，最小nephrin启动子能够驱动足细胞中的转基因表达。
[0427]
慢病毒载体也用于转导人肾小球细胞。用慢病毒转导cipodocyte和肾小球内皮细胞，该慢病毒包含与最小nephrin报告基因偶联的gfp。图11a-c显示了facs分析，展示了使用novocyte分析仪的条件性永生化人足细胞(ly)和肾小球内皮细胞(genc)的所有活单峰的中值gfp荧光(afu)。将未转导的细胞(细胞对照)与用慢病毒构建体转导的细胞进行比较，这些慢病毒构建体携带由全长人nephrin启动子(hnphs1.gfp)或mini人nephrin启动子(265.gfp)控制的gfp表达盒。将所有细胞分化10天，胰蛋白酶处理(100ul)并在pbs、2％fbs、1∶1000 draq7(150ul)中稀释。数据和误差线代表3次技术重复(100ul，＞2500个细胞)
±
sem。这些结果显示了在与肾小球内皮细胞相比时，最小nephrin启动子的足细胞特异性。
[0428]
实施例3-足细胞靶向基因疗法
[0429]
我们使用腺相关病毒(aav)在人和小鼠足细胞中开发了靶向基因递送系统(参见pct/gb2020/050097)。使用足细胞特异性启动子(nephrin)，aav血清型2/9在体内成功感染足细胞，诱导podocin表达。在使用cre-loxp系统(nphs2fl/fl)敲低podocin导致蛋白尿的动物中，aav治疗成功地恢复了podocin表达并改善了蛋白尿。此外，我们已经显示使用相同
启动子，在人足细胞中aav lk03(比aav2/9效率更高)对gfp的高效和特异性转导。
[0430]
参考文献
[0431]
kodippili k，hakim ch，pan x，yang ht，yue y，zhang y，shin jh，yang nn，duan d.dual aav gene therapy for duchenne muscular dystrophy with a 7-kb mini-dystrophin gene in the canine model.hum gene ther.2018 mar；29(3)：299-311.
[0432]
luo，x.，hall，g.，li，s.，bird，a.，lavin，p.j.，winn，m.p.，kemper，a.r.，brown，t.t.&koeberl，d.d.2011.hepatorenal correction in murine glycogen storage disease type i with a double-stranded adeno-associated virus vector.mol ther，19，1961-70.
[0433]
mcclements me，maclaren re.adeno-associated virus(aav)dual vector strategies for gene therapy encoding large transgenes.yale j biol med.2017 dec 19；90(4)：611-623
[0434]
moeller，m.j.，sanden，s.k.，soofi，a.，wiggins，r.c.&holzman，l.b.2002.two gene fragments that direct podocyte-specific expression in transgenic mice.j am soc nephrol，13，1561-7.
[0435]
picconi，j.l.，muff-luett，m.a.，wu，d.，bunchman，e.，schaefer，f.&brophy，p.d.2014.kidney-specific expression of gfp by in-utero delivery of pseudotyped adeno-associated virus 9.molecular therapy.methods&clinical development，1，14014.
[0436]
rocca，c.j.，ur，s.n.，harrison，f.&cherqui，s.2014.raav9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery：conclusion of a comparative study.gene therapy，21，618-628.
[0437]
schambach，a.，bohne，j.，baum，c.，hermann，f.g.，egerer，l.，von laer，d.&giroglou，t.2005.woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element deleted from x protein and promoter sequences enhances retroviral vector titer and expression.gene therapy，13，641.schievenbusch，s.，strack，i.，scheffler，m.，nischt，r.，coutelle，o.，m.，hallek，m.，fries，j.w.u.，dienes，h.-p.，odenthal，m.&h.2010.combined paracrine and endocrine aav9 mediated expression of hepatocyte growth factor for the treatment of renal fibrosis.molecular therapy，18，1302-1309.
[0438]
实施方案
[0439]
现在将参考以下编号的段落(para)来描述本发明的各种特征和实施方案。
[0440]
1.病毒载体基因疗法，其中所述病毒载体包含：
[0441]
col4a3、col4a4或col4a5转基因；和
[0442]
任选的足细胞特异性启动子。
[0443]
2.根据段落1的病毒载体基因疗法，其中所述足细胞特异性启动子是最小nephrin启动子nphs1或podocin启动子nphs2。
[0444]
3.根据段落1或2的病毒载体基因疗法，其中所述病毒载体是腺相关病毒(aav)。
[0445]
4.根据段落3的病毒载体基因疗法，其中所述aav载体是aav血清型2/9、lk03或3b。
[0446]
5.根据段落1至4中任一项的病毒载体基因疗法，其中所述col4a3、col4a4或col4a5转基因是小基因。
[0447]
6.根据段落1至4中任一项所述的病毒载体基因疗法，其中所述基因疗法包括：
[0448]
第一病毒载体，其包含col4a3、col4a4或col4a5转基因的至少部分；和
[0449]
任选的足细胞特异性启动子；和
[0450]
第二病毒载体，其包含相应col4a3、col4a4或col4a5转基因的至少部分；和
[0451]
任选的足细胞特异性启动子。
[0452]
7.根据段落1至6中任一项的病毒载体基因疗法，其中所述病毒载体另外包含土拨鼠肝炎转录后调节元件(wpre)。
[0453]
8.根据段落1至7中任一项的病毒载体基因疗法，其中所述col4a3、col4a4或col4a5转基因是人的和/或包含血凝素(ha)标签。
[0454]
9.根据段落1至8中任一项的病毒载体基因疗法，其中所述病毒载体另外包含在所述启动子和所述col4a3、col4a4或col4a5转基因之间的kozak序列。
[0455]
10.根据段落1至9中任一项的病毒载体基因疗法，其中所述病毒载体另外包含多腺苷酸化信号，诸如牛生长激素(bgh)多腺苷酸化信号。
[0456]
11.根据段落1至10中任一项的病毒载体基因疗法，其用于治疗或预防alport综合征。
[0457]
12.根据段落11使用的病毒载体基因疗法，其中所述病毒载体基因疗法待施用于人患者。
[0458]
13.根据段落11或12使用的病毒载体基因疗法，其中所述病毒载体基因疗法是全身施用的。
[0459]
14.根据段落11至13中任一项使用的病毒载体基因疗法，其中要通过静脉内注射施用所述病毒载体基因疗法。
[0460]
15.根据段落11至14中任一项使用的病毒载体基因疗法，其中要通过注射到肾动脉中来施用所述病毒载体基因疗法。