一种利用离子交联的可食用细胞培养肉3D支架的制备方法

一种利用离子交联的可食用细胞培养肉3d支架的制备方法
技术领域
1.本发明涉及一种用于细胞培养肉的可食用生物支架的制造方法，具体涉及一种利用离子交联的可食用细胞培养肉3d支架的制备方法，属于生物材料和食品科学技术领域。


背景技术：

2.细胞培养肉技术是利用从动物身上提取的细胞，通过组织工程技术培养成肌肉和脂肪组织，并构造成肉制品，从而在不屠宰动物的情况下生产肉的新型技术。细胞培养肉能够在一定程度上解决传统肉类生产对环境造成的负面影响，降低人畜共患病和其他疾病的风险，除此之外，还可以实现肉制品营养、质地和口味等品质的精准调控。
3.目前，细胞培养肉的工业化仍处于萌芽阶段，研究人员仍在寻找提高生产效率和降低成本的方法。此外，如果细胞培养肉的最终形态是一块完整的肉，那么3d支架将是最好的选择。制备3d支架的关键技术在于模拟天然组织的结构和成分，使细胞能够在支架内实现三维分布并大量增殖分化形成完整的肌肉组织。目前大多数3d支架中需要加入一定量的动物源细胞外基质ecm来保证良好的细胞粘附性，如明胶、胶原蛋白、rgd肽等，然而这些成分通常存在提取工艺复杂、成本高的缺点，不利于细胞培养肉的工业化生产。
4.此外为了维持支架的机械强度和结构稳定性，大多数利用壳寡糖或海藻酸钠制备的3d支架中通常需使用交联剂，例如戊二醛、edc/nhs等，而这些交联剂具有一定的食用毒性，不适用于制备可食用的细胞培养肉3d支架。
5.因此需要一种制备方法简单、制作成本可控、不含动物源成分和有毒交联剂的3d支架，以此为细胞增殖和分化提供适宜的3d生长环境，从而生产具有组织结构的细胞培养肉产品，为利用3d支架制备细胞培养肉提供技术支撑。


技术实现要素：

6.本发明的目的是：克服现有技术中存在的问题，提供一种利用离子交联的可食用细胞培养肉3d支架的制备方法，不使用任何动物源成分和有毒交联剂制备出的细胞培养肉3d支架，具体良好的细胞粘附性和相容性，用于骨骼肌细胞培养，适用于生产可食用的细胞培养肉。
7.为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种利用离子交联的可食用细胞培养肉3d支架的制备方法，包括以下步骤：s1、将壳寡糖和海藻酸钠分别溶于水中，得到的壳寡糖溶液和海藻酸钠溶液均通过静电相互作用形成水凝胶；s2、在磁力搅拌器搅拌条件下将上述步骤s1中得到的海藻酸钠溶液逐滴加入到壳寡糖溶液中，其中海藻酸钠溶液和壳寡糖溶液的质量比为1:1，并采用均质机均质混合，得到混合溶液；s3、将上述步骤s2中得到的混合溶液于-50~-60℃条件下冷冻干燥，冷冻干燥后浸泡于质量浓度为0.1%~5%的离子溶液中进行离子交联，最终得到细胞培养肉3d支架。
8.所述步骤s1中，溶于水的壳寡糖溶液的质量浓度为0.5~5%，海藻酸钠的质量浓度为0.5~3%。
9.所述步骤s2中，采用磁力搅拌器的转速条件为200~300rpm。
10.所述步骤s2中，采用均质机的转速条件为12000~15000rpm，均质5次，每次15秒。
11.所述步骤s3中，离子溶液为氯化钙、碳酸钙、乳酸钙、柠檬酸钙、硫酸钙、氯化钡、硫酸钡、氯化钾、硫酸钾离子溶液中的一种或多种。
12.所述步骤s3中，进行离子交联时的溶液温度控制为25~30℃，并浸泡交联10~30min。
13.本发明的有益效果是：1）本发明方法通过壳寡糖和海藻酸钠之间的静电相互作用和离子交联得到结构稳固的3d支架，不使用任何动物源成分和有毒交联剂，并具有良好的细胞粘附性和相容性，用于进行骨骼肌细胞培养，适用于生产可食用的细胞培养肉等组织工程领域。
14.2）本发明的制备方法中未使用明胶、胶原蛋白等动物源的细胞外基质成分，制备方法简单、绿色，大大降低了细胞培养肉的制作成本，并在一定程度上减少了温室气体的排放和对环境的污染，为后期商业化的工业生产奠定了实验基础。
15.3）本发明方法利用壳寡糖和海藻酸钠之间的静电相互作用，再使用离子交联进一步稳固支架的结构，在室温搅拌条件下即可制备，无任何副产物，使得制备的细胞培养肉3d支架具有较高的食品安全性，且经离子交联后的3d支架具有较高的孔隙率和溶胀率，促进细胞增殖分化，达到细胞培养肉的高效生产。
附图说明
16.图1为本发明制备的氯化钙/海藻酸钠/壳寡糖细胞培养肉3d支架图片；图2为由实施例1-6制备的细胞培养肉3d支架的孔隙率图；图3为由实施例1-6制备的细胞培养肉3d支架的溶胀率图；图4为由实施例1-6制备的细胞培养肉3d支架的质构特性图；图5为利用实施例1-6制备的细胞培养肉3d支架培养c2c12细胞1d后的活/死细胞染色图；图6为利用实施例4制备的细胞培养肉3d支架培养c2c12细胞3d后的细胞骨架染色图；图7为利用实施例4制备的细胞培养肉3d支架培养鸡骨骼肌卫星细胞5d后的细胞骨架染色图。
具体实施方式
17.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的解释说明。
18.以下实施例中壳寡糖是由壳聚糖经特殊的生物酶技术降解得到的一种聚合度在2~20之间寡糖产品，海藻酸钠是从褐藻类海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，是一种阴离子多糖，壳寡糖和海藻酸钠由市场直接购买得到；离子溶液选择氯化钙离子溶液。
19.实施例1：一种利用离子交联的可食用细胞培养肉3d支架的制备方法，包括以下步骤：
s1、将壳寡糖和海藻酸钠分别溶于水中，得到质量浓度为5%的壳寡糖溶液和质量浓度为0.5%的海藻酸钠溶液，壳寡糖溶液和海藻酸钠溶液均通过静电相互作用形成水凝胶；s2、采用磁力搅拌器在200rpm条件下将上述步骤s1中得到的海藻酸钠溶液逐滴加入到壳寡糖溶液中，其中海藻酸钠溶液和壳寡糖溶液的质量比为1:5，并采用均质机在12000rpm条件下均质混合，均质5次，每次15秒，得到混合溶液；s3、将上述步骤s2中得到的混合溶液于-55℃条件下冷冻干燥，冷冻干燥后浸泡于30℃质量浓度为0.1%的离子溶液中进行离子交联10min，最终得到细胞培养肉3d支架。
20.实施例2：一种利用离子交联的可食用细胞培养肉3d支架的制备方法，包括以下步骤：s1、将壳寡糖和海藻酸钠分别溶于水中，得到质量浓度为4%的壳寡糖溶液和质量浓度为1%的海藻酸钠溶液，壳寡糖溶液和海藻酸钠溶液均通过静电相互作用形成水凝胶；s2、采用磁力搅拌器在250rpm条件下将上述步骤s1中得到的海藻酸钠溶液逐滴加入到壳寡糖溶液中，其中海藻酸钠溶液和壳寡糖溶液的质量比为1:3，并采用均质机在13000rpm条件下均质混合，均质5次，每次15秒，得到混合溶液；s3、将上述步骤s2中得到的混合溶液于-55℃条件下冷冻干燥，冷冻干燥后浸泡于28℃质量浓度为1%的离子溶液中进行离子交联15min，最终得到细胞培养肉3d支架。
21.实施例3：一种利用离子交联的可食用细胞培养肉3d支架的制备方法，包括以下步骤：s1、将壳寡糖和海藻酸钠分别溶于水中，得到质量浓度为3%的壳寡糖溶液和质量浓度为1.5%的海藻酸钠溶液，壳寡糖溶液和海藻酸钠溶液均通过静电相互作用形成水凝胶；s2、采用磁力搅拌器在300rpm条件下将上述步骤s1中得到的海藻酸钠溶液逐滴加入到壳寡糖溶液中，其中海藻酸钠溶液和壳寡糖溶液的质量比为1:1，并采用均质机在15000rpm条件下均质混合，均质5次，每次15秒，得到混合溶液；s3、将上述步骤s2中得到的混合溶液于-60℃条件下冷冻干燥，冷冻干燥后浸泡于25℃质量浓度为2%的离子溶液中进行离子交联20min，最终得到细胞培养肉3d支架。
22.实施例4：一种利用离子交联的可食用细胞培养肉3d支架的制备方法，包括以下步骤：s1、将壳寡糖和海藻酸钠分别溶于水中，得到质量浓度为1%的壳寡糖溶液和质量浓度为2%的海藻酸钠溶液，壳寡糖溶液和海藻酸钠溶液均通过静电相互作用形成水凝胶；s2、采用磁力搅拌器在300rpm条件下将上述步骤s1中得到的海藻酸钠溶液逐滴加入到壳寡糖溶液中，其中海藻酸钠溶液和壳寡糖溶液的质量比为1:1，并采用均质机在15000rpm条件下均质混合，均质5次，每次15秒，得到混合溶液；s3、将上述步骤s2中得到的混合溶液于-60℃条件下冷冻干燥，冷冻干燥后浸泡于26℃质量浓度为2%的离子溶液中进行离子交联10min，最终得到细胞培养肉3d支架。
23.实施例5：一种利用离子交联的可食用细胞培养肉3d支架的制备方法，包括以下步骤：s1、将壳寡糖和海藻酸钠分别溶于水中，得到质量浓度为2%的壳寡糖溶液和质量
浓度为2.5%的海藻酸钠溶液，壳寡糖溶液和海藻酸钠溶液均通过静电相互作用形成水凝胶；s2、采用磁力搅拌器在280rpm条件下将上述步骤s1中得到的海藻酸钠溶液逐滴加入到壳寡糖溶液中，其中海藻酸钠溶液和壳寡糖溶液的质量比为3:1，并采用均质机在14000rpm条件下均质混合，均质5次，每次15秒，得到混合溶液；s3、将上述步骤s2中得到的混合溶液于-58℃条件下冷冻干燥，冷冻干燥后浸泡于27℃质量浓度为3.5%的离子溶液中进行离子交联30min，最终得到细胞培养肉3d支架。
24.实施例6：一种利用离子交联的可食用细胞培养肉3d支架的制备方法，包括以下步骤：s1、将壳寡糖和海藻酸钠分别溶于水中，得到质量浓度为0.5%的壳寡糖溶液和质量浓度为3%的海藻酸钠溶液，壳寡糖溶液和海藻酸钠溶液均通过静电相互作用形成水凝胶；s2、采用磁力搅拌器在220rpm条件下将上述步骤s1中得到的海藻酸钠溶液逐滴加入到壳寡糖溶液中，其中海藻酸钠溶液和壳寡糖溶液的质量比为5:1，并采用均质机在13000rpm条件下均质混合，均质5次，每次15秒，得到混合溶液；s3、将上述步骤s2中得到的混合溶液于-50℃条件下冷冻干燥，冷冻干燥后浸泡于25℃质量浓度为5%的离子溶液中进行离子交联25min，最终得到细胞培养肉3d支架。
25.由本发明方法制备出的氯化钙/海藻酸钠/壳寡糖细胞培养肉3d支架图片如图1所示，由图1可看出细胞培养肉3d支架的外形规则圆润，具有一定厚度且结构稳固，能够为进一步的细胞繁殖分化提供有力支撑。
26.1、细胞培养肉3d支架的性能测定实验。
27.对本发明实施例1-6制备的细胞培养肉3d支架进行孔隙率、溶胀率以及质构特性进行测定，测定结果分别见图2~图4。
28.由图2可以看出，由实施例1-6制备的细胞培养肉3d支架均具有较高的孔隙率（》80%）；由图3可以看出，细胞培养肉3d支架在12小时后达到溶胀平衡，并且由实施例3和4得到的支架具有较高的吸水性能，较高的孔隙率和较高的吸水性能对于细胞迁移、增殖和营养供应至关重要。由图4可以看出，实施例3制备的3d支架具有较高的硬度、胶着性、咀嚼性和回复性，与肉的质构特性较为相似，能够为细胞的生长提供一定的机械支撑。
29.2、细胞培养肉3d支架的成肌细胞培养实验。
30.对本发明实施例1-6制备的细胞培养肉3d支架进行成肌细胞培养，培养步骤如下：1）将c2c12小鼠成肌细胞复苏离心并重悬于dmem/f-12培养基中，于37℃、5%的co2培养箱中培养至细胞汇合达到80%时，通过胰蛋白酶消化和离心获得细胞悬液。
31.2）将实施例1-6制备的细胞培养肉3d支架用pbs溶液洗涤三次后，加入培养基浸泡30min后弃去培养基，接种细胞后待细胞贴壁后补充培养基，在37℃、5%的co2培养箱中培养。
32.3）培养1d后将支架进行活/死细胞染色，并使用荧光显微镜进行观察，live组为活细胞，dead组为死细胞，merge组为合并组。
33.4）培养3d后将支架进行细胞骨架染色，并使用激光共聚焦显微镜进行观察，dapi组为细胞核，f-actin组为细胞骨架，merge组为合并组。
34.如图5所示，由实施例1-6制备的细胞培养肉3d支架进行的成肌细胞培养，根据活死细胞染色结果可以看出，培养1d后，实施例4制备的3d支架黏附细胞的能力较强，见亮色区域为活细胞，具有数量最多的活细胞。
35.根据上述实验结果，选择实施例4制备的细胞培养肉3d支架以进行后续成肌细胞的培养和鸡骨骼肌卫星细胞培养。
36.如图6所示，根据细胞骨架染色结果可以看出，培养3d后，小鼠成肌细胞（c2c12）在支架上大量增殖并伸展形成细长并相互连接的细胞骨架，见亮色区域为细胞骨架。
37.3、由实施例4制备的细胞培养肉3d支架进行鸡骨骼肌卫星细胞培养实验。
38.1）鸡骨骼肌卫星细胞复苏离心并重悬于dmem/f-12培养基中，于37℃、5%的co2培养箱中培养至细胞汇合达到80%时，通过胰蛋白酶消化和离心获得细胞悬液。
39.2）将实施例4制备的细胞培养肉3d支架用pbs溶液洗涤三次，接种细胞后待细胞贴壁后补充培养基，在37℃、5%的co2培养箱中培养。
40.3）培养5d后将支架进行细胞骨架染色，并使用激光共聚焦显微镜进行观察，dapi组为细胞核，f-actin组为细胞骨架，merge组为合并组。
41.如图7所示，根据细胞骨架染色结果可以看出，培养5d后，鸡骨骼肌卫星细胞在支架上大量增殖，并在细胞核周围观察到亮色区域的细胞骨架包围。
42.本发明提供了一种细胞培养肉3d支架的制备方法，解决了现有制备生物支架需要依赖动物源细胞外基质ecm来保证良好的细胞粘附性，进而导致提取工艺复杂、成本高的缺点，在不使用任何动物源成分和有毒交联剂的条件下，即可达到细胞培养肉3d支架的使用要求。
43.从成肌细胞培养实验结果可以得出，由实施例1-6制备出的细胞培养肉3d支架均有细胞增殖，且实施例4制备出的细胞培养肉3d支架具有较多的增殖数量，结合鸡骨骼肌卫星细胞培养实验结果进一步反应出由本发明方法制备的细胞培养肉3d支架具有良好的细胞粘附性和相容性，能够为骨骼肌细胞的培养提供良好的细胞增殖环境，有利于细胞培养肉和组织工程领域的应用和发展。
44.以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。