一种大规模提取筋腱中胶原的方法及应用

1.本发明涉及胶原蛋白提取的技术领域，具体涉及一种大规模提取筋腱中胶原的方法及应用。


背景技术：

2.胶原蛋白是一种生物高分子，是动物内含量最多、分布最广的功能性蛋白，广泛应用于食品、医药、组织工程、化妆品等各个领域。由于胶原是细胞外间质成分，在体内以不溶性大分子结构存在，并与蛋白多糖、糖蛋白等结合在一起。因此，通常胶原制备包括材料选择、预处理、酸碱酶盐水法提取等方法。一般来说，高压辅助和热水抽提针对明胶的提取，而低温抽提和酶法针对胶原的提取，但其基本原理都是根据胶原蛋白的特性改变蛋白质所在的外界环境，把胶原蛋白从其他蛋白质中分离出来。
3.常用的提取胶原蛋白方法有酸法提取、碱法提取和酶法提取；利用酸法提取即使中等浓度酸液进行水解也会导致色氨酸全部被破坏，丝氨酸和酪氨酸也会部分被破坏，且设备腐蚀严重。而碱法提取易引起蛋白质变性，如胶原肽键水解，含羟基、疏基的氨基酸全部被破坏；所得产物等电点ph值较低，天冬酞胺和谷氨酞胺分别转变为天冬氨酸和谷氨酸，得到的水解产物分子量较在酸性溶液中比低等问题，若比较严重的话，还会产生d、l-型氨基酸消旋混合物，若d型氨基酸含量高过l型氨基酸，则会抑制l-型氨基酸的吸收，有些d型氨基酸有毒，甚至有致癌、致畸和致突变的作用。而且碱法提取的含量较低，用氢氧化钠从鱿鱼皮中提取碱溶性胶原蛋白，其得率只有3％(以湿基计)。酶法提取存在以下不足：1)生产胶原过程中对工艺条件通常比较严格，提取效率低，不利于产业化；2)在提取胶原国产中，容易引起胶原变性、水解，产生有毒有害物质，但并未介绍去除的方法。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种大规模提取筋腱中胶原的方法，将碱法、酸法和酶法提取结合，在提取动物筋腱中胶原蛋白的同时还能去除胶原提取过程中所产生的小分子和有毒有害的物质；本发明的目的在于提供一种大规模提取筋腱中胶原的应用，得到的具有生物活性的胶原溶液并过滤无菌后用于细胞培养。
5.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
6.一种大规模提取筋腱中胶原的方法，包括以下步骤：
7.1)将动物筋腱去除脂肪和碎肉，切碎后绞碎；
8.2)配制碱液，再将绞碎后的动物筋腱置于碱液中浸泡，得到混合物；
9.3)分离步骤2)混合物中的固体和溶液，固体为胶原；
10.4)取出步骤3)的胶原继续加入碱液浸泡；
11.5)重复步骤3)和步骤4)，直至80～100％的固体完全发胀溶解，过滤后得到含胶原的溶液；
12.6)对步骤5)收集的含胶原的溶液进行过滤，得到胶原浓缩液；
13.7)在步骤6)的胶原浓缩液中加入缓冲液进行稀释，再进行过滤浓缩，得到浓缩的胶原溶液；
14.8)在胶原溶液中加入ph调节剂，调节ph为1～5，优选为2～3，再加入胃蛋白酶进行酶解；
15.9)对酶解后的胶原溶液进行过滤，再加入ph调节剂和缓冲液进行稀释，重复过滤和稀释，得到胶原蛋白溶液。
16.进一步，还包括步骤10)对胶原蛋白溶液进行胶原蛋白含量值的测定和过滤除菌，再验证胶原蛋白的生物活性。
17.再进一步，步骤1)中，将动物筋腱切碎至0.1～1cm，再用绞肉机进行绞碎，重复1～5次，最好不低于2次。
18.进一步，所述碱液选用浓度为10～300nm的naoh溶液，优选浓度为 10～100m。
19.再进一步，步骤2)中，动物筋腱与所述碱液的质量比为1：(1～50)，优选质量比为1：(1～10)，浸泡温度为2～25℃，最好不高于15℃。浸泡时间为24～48 小时，优选48小时。
20.进一步，步骤5)中，重复对碱液浸泡动物筋腱和过滤步骤至少2次；过滤选用50～300目的不锈钢筛网。
21.进一步，步骤7)中，采用缓冲液将胶原浓缩液稀释3～40倍，再过滤使得胶原溶液浓缩3～40倍，重复稀释和过滤步骤1～10次。
22.再进一步，步骤8)中，胃蛋白酶的加入量为0.01～0.1g/100ml胶原溶液；酶解的温度为15～25℃，时间为1～3天。
23.进一步，所述缓冲液选用浓度为0.05～0.1mol/l的pbs溶液，所述ph调节剂选用5～50mmol/l的乙酸溶液。
24.再进一步，步骤9)中，对酶解后的胶原溶液采用纱布过滤；所述缓冲液和 ph调节剂加入的体积量为所述胶原溶液的5～40倍；采用孔径为10～300k的中空纤维柱孔进行过滤，孔径优选为10～30k，浓缩5～40倍，重复稀释和过滤步骤2～10次，最好不低于3次。
25.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
26.一种大规模提取筋腱中胶原的应用，所述胶原由上述的方法提取得到，所述胶原用于细胞培养。
27.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
28.(1)本发明的提取方法中，首先将动物筋腱绞碎，先将动物筋腱置于碱液中浸泡，过滤，收集筋腱，重复浸泡和过滤若干次后，过滤得到含有胶原的溶液，再进行过滤，得到胶原浓缩液；在胶原浓缩液中加入缓冲液进行稀释，重复过滤稀释和浓缩步骤若干次，过滤浓缩后得到胶原溶液，再加入ph调节剂(酸液)调节ph，然后加入胃蛋白酶进行酶解，酶解后进行过滤；再加入ph调节剂和缓冲液进行稀释，继续重复过滤浓缩和稀释步骤若干次，过滤后得到胶原蛋白溶液。本发明的提取方法将碱法提取、酸法提取和酶法提取结合，能有效提取动物筋腱中的胶原蛋白且不损害胶原蛋白中的有效成分，得到具有生物活性胶原，还能去除胶原提取过程中所产生的小分子和有毒有害的物质。利用本发明的提取方法能回收70％以上的胶原蛋白，且不含胶原降解后所产生的小分子或有毒有害的物质，适合产业化大规模提取
29.(2)利用上述提取方法得到胶原蛋白生物活性高，能够很好地促进细胞贴壁和延
伸，适用于细胞培养。
具体实施方式
30.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
31.实施例1
32.一种大规模提取筋腱中胶原的方法，包括以下步骤：
33.1)首先把市场购买的500g牛筋腱，去除脂肪和碎肉后，用刀切碎至1cm 左右，然后用绞肉机对已经切碎的筋腱进行绞碎，绞3次。
34.2)配制50mm naoh溶液，再将牛筋腱与naoh溶液按照质量比体积为1： 40混匀，放置于10℃条件下。每48小时用50目的不锈钢筛网过滤，去除旧溶液，收集牛筋腱，然后再加入适量的50mm naoh，重复4次。用不锈钢筛网，孔径大小为200目，分离发胀的牛筋腱固体和溶液，固体为胶原；
35.4)在未溶解的胶原固体中再次加入50mm naoh溶液，胶体固体与naoh 溶液的质量比为1：20，混匀后放置于15℃。重复上述步骤，直到80～100％的胶原发胀溶解，分离，收集含胶原溶液；
36.5)对含胶原的溶液用孔径为30k中空纤维柱过滤，浓缩10倍，得到胶原浓缩液；
37.6)在胶原浓缩液中加入0.1m的pbs溶液，对胶原浓缩液稀释20倍然后再过滤将其浓缩20倍，重复3次，收集浓缩的胶原溶液；
38.7)在胶原溶液中加入乙酸调节ph值，使ph值为2。在胶原溶液中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的加入量为0.05g/100ml胶原溶液，搅拌混匀后放置15℃，酶解2天。对收集含有胶原的溶液用5层纱布过滤后，再用孔径为10k中空纤维柱过滤，浓缩20倍。在胶原溶液中加入20mm的乙酸-0.1m pbs溶液，加入体积为胶原溶液的20倍，然后在进行浓缩，浓缩20倍，稀释和浓缩步骤重复3 次，得到胶原蛋白溶液；
39.8)测定胶原蛋白溶液中胶原蛋白值含量，再进行过滤除菌，使用293t细胞验证胶原蛋白促进细胞贴壁情况，同时通过在培养基中加入胶原溶液研究其是否对293t细胞(人胚胎肾细胞)有毒害作用。结果见表1和表2。
40.表1胶原提取量和促进293t细胞贴壁和延伸情况
[0041][0042]
表2胶原对293t细胞传代和生长影响
[0043][0044]
其中， 表示细胞生长状态良好； 表示细胞生长状态稍差一些；1:3表示细胞按照1:3比例传代分瓶；1:2表示细胞按照1:2比例传代分瓶。
[0045]
由表1可知，胶原提取量为85％，90％293t贴壁时间提前30分钟，80％细胞贴壁后出现延伸现象的时间提前2小时。由表2可知，在293t细胞培养过程中，每次细胞传代加入不超过50ug/ml的胶原时不影响细胞传代和生长，对细胞没有毒性。
[0046]
实施例2
[0047]
一种大规模提取筋腱中胶原的方法，包括以下步骤：
[0048]
1)首先把市场购买的1000g牛筋腱，去除脂肪和碎肉后，用刀切碎至1cm 左右，然后用绞肉机对已经切碎的筋腱进行绞碎，绞2次。
[0049]
2)配制100mm naoh溶液，再将牛筋腱与naoh溶液按照质量比体积为1： 30混匀，放置于15℃条件下。每48小时用100目的不锈钢筛网过滤，去除旧溶液，收集牛筋腱，然后再加入适量的100mm naoh，重复3次。用不锈钢筛网，孔径大小为100目，分离发胀的牛筋腱固体和溶液，固体为胶原；
[0050]
4)在未溶解的胶原固体中再次加入100mm naoh溶液，胶体固体与naoh 溶液的质量比为1：30，混匀后放置于15℃。重复上述步骤，直到90％以上的胶原发胀溶解，分离，收集含胶原溶液；
[0051]
5)对含胶原的溶液用孔径为10k中空纤维柱过滤，浓缩10倍，得到胶原浓缩液；
[0052]
6)在胶原浓缩液中加入0.1m的pbs溶液，对胶原浓缩液稀释20倍然后再过滤将其浓缩20倍，重复4次，收集浓缩的胶原溶液；
[0053]
7)在胶原溶液中加入乙酸调节ph值，使ph值为1.5。在胶原溶液中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶的加入量为0.1g/100ml胶原溶液，搅拌混匀后放置15℃，酶解3天。对收集含有胶
原的溶液用5层纱布过滤后，再用孔径为10k中空纤维柱过滤，浓缩20倍。在胶原溶液中加入20mm的乙酸-0.1m pbs溶液，加入体积为胶原溶液的10倍，然后在进行浓缩，浓缩10倍，稀释和浓缩步骤重复5 次，得到胶原蛋白溶液；
[0054]
8)测定胶原蛋白溶液中胶原蛋白值含量，再进行过滤除菌，使用293t细胞验证胶原蛋白促进细胞贴壁情况，同时通过在培养基中加入胶原溶液研究其是否对293t细胞有毒害作用。结果见表3和表4。
[0055]
表3胶原提取量和促vero细胞贴壁和延伸情况
[0056][0057][0058]
表4胶原对vero细胞传代和生长影响
[0059][0060][0061]
其中， 表示细胞生长状态良好； 表示细胞生长状态稍差一些；1:3表示细胞按照1:3比例传代分瓶；1:2表示细胞按照1:2比例传代分瓶。
[0062]
由表3可知，胶原提取量为89％，90％vero贴壁时间提前60分钟，90％细胞贴壁后出现延伸现象的时间提前2小时。由表4可知，在vero细胞培养过程中每次细胞传代加入不超过150ug/ml的胶原时不影响细胞传代和生长，对细胞没有毒性。
[0063]
对比例1
[0064]
对比例1是采用酸法提取1000g牛筋腱的胶原蛋白，选用0.1m的乙酸，进行水解，再测定胶原蛋白溶液中胶原蛋白值含量，再进行过滤除菌，使用293t 细胞验证胶原蛋白促进细胞贴壁情况，同时通过在培养基中加入胶原溶液研究其是否对293t细胞有毒害作用。结果见表5和表6。
[0065]
表5胶原提取量和促vero细胞贴壁和延伸情况
[0066][0067][0068]
表6胶原对vero细胞传代和生长影响
[0069][0070]
其中， 表示细胞生长状态良好； 表示细胞生长状态稍差一些；1:3表示细胞按照1:3比例传代分瓶；1:2表示细胞按照1:2比例传代分瓶。
[0071]
由表5可知，胶原提取量为48％，90％vero贴壁时间无提前，90％细胞贴壁后出现延伸现象的时间提前1小时。由表6可知，在vero细胞培养过程中每次细胞传代加入不超过50ug/ml的胶原时不影响细胞传代和生长，对细胞没有毒性。酸法提取会破坏胶原蛋白的色氨酸、丝氨酸和酪氨酸，影响胶原蛋白的生物活性。
[0072]
对比例2
[0073]
对比例2是采用碱法提取1000g牛筋腱的胶原蛋白，即实施例2的前6个步骤，得到胶原蛋白溶液，再测定胶原蛋白溶液中胶原蛋白值含量，再进行过滤除菌，使用293t细胞验证胶原蛋白促进细胞贴壁情况，同时通过在培养基中加入胶原溶液研究其是否对293t细胞有毒害作用。结果见表7和表8。
[0074]
表7胶原提取量和促vero细胞贴壁和延伸情况
[0075][0076]
表8胶原对vero细胞传代和生长影响
[0077]
[0078][0079]
其中， 表示细胞生长状态良好； 表示细胞生长状态稍差一些；1:3表示细胞按照1:3比例传代分瓶；1:2表示细胞按照1:2比例传代分瓶。
[0080]
由表7可知，胶原提取量为5％，90％vero贴壁时间无提前，90％细胞贴壁后出现延伸现象的时间提前1小时。由表8可知，在vero细胞培养过程中每次细胞传代加入不超过25ug/ml的胶原时不影响细胞传代和生长，对细胞没有毒性。
[0081]
对比例3
[0082]
对比例3是采用酶法提取1000g牛筋腱的胶原蛋白，具体方法为：将牛筋腱先在乙酸溶液中浸泡，再加入胃蛋白酶，其中，酶的浓度，酶与底物的比例、酶解时间、酶解温度、ph值和料液比均与实施例2相同，过滤后得到胶原蛋白溶液。
[0083]
再测定胶原蛋白溶液中胶原蛋白值含量，再进行过滤除菌，使用293t细胞验证胶原蛋白促进细胞贴壁情况，同时通过在培养基中加入胶原溶液研究其是否对293t细胞有毒害作用。结果见表9和表10。
[0084]
表9胶原提取量和促vero细胞贴壁和延伸情况
[0085]
[0086][0087]
表10胶原对vero细胞传代和生长影响
[0088][0089][0090]
其中， 表示细胞生长状态良好； 表示细胞生长状态稍差一些；1:3表示细胞按照1:3比例传代分瓶；1:2表示细胞按照1:2比例传代分瓶。
[0091]
由表9可知，胶原提取量为12％，90％vero贴壁时间无提前，90％细胞贴壁后出现延伸现象的时间提前2小时。由表10可知，在vero细胞培养过程中每次细胞传代加入不超过25ug/ml的胶原时不影响细胞传代和生长，对细胞没有毒性。
[0092]
综上所述，所以采用实施例1～2的提取胶原蛋白的方法能够回收70％以上的胶原蛋白，并且不含胶原降解后所产生的小分子或有毒有害的物质，而且胶原蛋白能够很好地促进vero细胞贴壁和延伸，即具有良好的生物活性。
[0093]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。