一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法

一种环境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法
技术领域
1.本发明属于抗生素抗性基因检测技术领域，具体涉及一种环境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法。


背景技术：

2.环境微生物抗生素抗性的发展严重威胁人类健康，引起了人们极大的关注。i型整合子是携带抗生素抗性基因的重要遗传元件，也是引发多重抗生素抗性的重要原因，使用便捷的方法分析环境样品i型整合子携带的抗生素抗性基因特征十分必要。但目前缺乏方便快捷的i型整合子携带抗生素抗性基因的分析方法。
3.对基因定量常使用定量pcr，但单纯采用对抗生素抗性基因的定量pcr，难以区分是整合子还是在其他dna片段上携带的抗性基因。而单纯采用对整合子的pcr，又仅能对该样品是否存在整合子进行定性分析。如中国专利zl201010140309.2一种细菌i型、ii型、iii型整合子基因的pcr检测方法，公开了一种细菌i型、ii型、iii型整合子基因的pcr检测方法，采用i型、ii型、iii型整合酶基因的引物对对细菌是否含有i型、ii型、iii型整合子进行检测，该方法仅能进行是否存在整合子的初步定性判断，并不能对整合子是否含有目标抗生素抗性基因(args)以及目标args的丰度进行有效的定性和定量检测。
4.采用宏基因组分析的手段，可以在宏基因组数据中挖掘整合子所携带抗性基因的信息，但技术难度大，分析过程复杂，数据出现分析错误的概率较高，定量分析程度低，分析周期长，难以广泛应用。
5.通过传统的克隆文库方法进行整合子基因和序列的分析，又由于克隆文库整体分析通量较低，对于整合子的解析深度不够，其携带的抗生素抗性基因分析不够全面，也无法获得定量的数据。
6.因此，对于整合子携带抗生素抗性基因(args)的定量检测方法是本领域的重点研究方向，具有重要的前景意义。


技术实现要素：

7.发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种环境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，掌握抗生素抗性基因在i型整合子上的相对丰度特征。
8.技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
9.本发明的第一个目的是，提供一种环境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，包括以下步骤：
10.(1)提取样品的dna；
11.(2)所述dna的i型整合子进行pcr扩增，得i型整合子扩增产物；
12.(3)所述i型整合子扩增产物进行纯化回收，得纯化回收产物；
13.(4)以所述纯化回收产物为模板进行定量pcr定量检测；
14.(5)根据定量pcr定量检测结果，计算i型整合子在整合子上的相对丰度。
15.可选的，在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述提取样品的dna的方法包括：将样品在10000r/min下离心10min，倒干上清液，使用powersoil dna isolation kit提取dna。
16.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述样品包括污泥样品、污水样品、土壤样品、沉积物样品等环境样品。
17.可选的，在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述pcr扩增的反应体系包含2
×
transstart fastpfu pcr supermix(-dye)12.5μl，上下游引物各1μl，dna模板1μl，ddh2o 9.5μl。
18.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述上下游引物包括：上游引物ggcatccaagcagcaag，下游引物aagcagacttgacctga。
19.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述pcr扩增的温度程序为95℃10min；35
×
(94℃30s，55℃30s，72℃2min30s)，72℃10min。
20.可选的，在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述纯化回收的方法包括：所述i型整合子扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，再进行切胶纯化。
21.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述琼脂糖凝胶电泳的方法包括：1体积当量的质量体积分数为1％-1.5％(单位为g/ml)的琼脂糖凝胶完全融化，冷却但未凝固前加入0.0001体积当量的sybr safe dna gel stain，摇匀后倒入制胶板，待凝固后放入电泳槽中，将所述i型整合子扩增产物依次加入至凝胶孔内，在150v条件下跑胶30min。
22.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述切胶纯化的方法包括：使用产物切胶回收试剂盒将整合子条带从200bp-4500bp的位置切胶回收并纯化。
23.可选的，在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，所述定量pcr定量检测的体系包括：
[0024]1×
powerup sybr green master mix，
[0025]
1mg/ml牛血清白蛋白，
[0026]
500nm目标抗性基因前引物，
[0027]
500nm目标抗性基因后引物，
[0028]
10-20ng/l dna模板，所述dna模板为所述i型整合子扩增产物的纯化回收产物。
[0029]
可选的，在本发明的一种实施方式中，所述定量pcr定量检测的反应程序为：预热95℃，10min；变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，40s；共40个循环。
[0030]
可选的，在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中，所述i型整合子的相对丰度的计算方法包括：args定量pcr测试单位体积拷贝数/单位体积i型整合子浓度，单位为copie/ng i型整合子。
[0031]
本发明的第二个目的是，提供上述的方法的应用，具体为应用于抗生素抗性基因检测领域。
[0032]
有益效果：本发明提供的一种环境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，具有以下优势：
[0033]
(1)以pcr为基础，避免了使用宏基因组测序分析难度大、数据挖潜困难、定量分析
程度不足的问题；
[0034]
(2)通过对i型整合子进行扩增纯化并作为后续定量pcr模板的方式，克服了直接定量pcr无法区分args是否为i型整合子携带的困扰；
[0035]
(3)采用定量pcr分析，克服了克隆文库分析通量低，无法定量，基因分析不足的问题；
[0036]
(4)本发明为环境样品i型整合子抗生素抗性基因的相对丰度分析，提供了新的技术方法和研究方向。
附图说明
[0037]
图1为实施例1中i型整合子pcr扩增产物电泳图；
[0038]
图2为实施例1中样品i型整合子中检出args相对丰度图；
[0039]
图3为实施例2中i型整合子pcr扩增产物电泳图；
[0040]
图4为实施例2中样品i型整合子中检出args相对丰度图。
具体实施方式
[0041]
本发明首先对样品dna的i型整合子进行pcr扩增，对i型整合子的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化，而后以该切胶纯化产物为模板进行定量pcr的分析，从而对抗生素抗性基因进行检测，并进行基因在整合子上相对丰度的分析与比较，从而掌握抗生素抗性基因在i型整合子上的相对丰度特征。
[0042]
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0043]
实施例1污水处理系统i型整合子args相对丰度分析
[0044]
本实施例选取了9个污水处理厂的好氧池污泥作为实验样本，其中4个来自市政污水处理厂，5个来自工业废水处理系统(1个工业园区综合污水处理厂，2个制药工业废水处理系统，2个农药工业废水处理系统)，样品以污水厂名称缩写命名，具体信息如表2所示。
[0045]
表2实施例1的采样信息
[0046][0047]
在本发明实施例中，所采用的环境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法具体包括以下步骤：
[0048]
(1)提取样品的dna
[0049]
在本发明实施例中，样品采用的是污泥样品，具体是污水处理系统使用的活性污泥。在其他实施例中，还可以是其他的环境样品，如污水样品、土壤样品、沉积物样品等。
[0050]
将以上9个污泥样品在10000r/min下离心10min，倒干上清液，每个样品分别取0.25g污泥，使用powersoil dna isolation kit提取dna，操作步骤按照试剂盒说明书进行。
[0051]
(2)i型整合子扩增
[0052]
对提取到的样品dna的i型整合子进行pcr扩增，得i型整合子扩增产物。
[0053]
pcr扩增反应体系为25μl，包含2
×
transstart fastpfu pcr supermix(-dye)(北京，全式金生物技术有限公司)12.5μl，前后引物各1μl，dna模板1μl，ddh2o 9.5μl。使用的i型整合子引物和温度程序见表1。
[0054]
表1 i型整合子pcr引物序列与温度程序
[0055][0056]
(3)i型整合子扩增产物纯化回收
[0057]
对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳：制备1％琼脂糖凝胶，称取0.7g琼脂糖置于锥形瓶中，加入70ml1
×
tae，微波炉加热煮沸3次至琼脂糖完全融化，拿出冷却，待其未凝固前加入7μl的sybr safe dna gel stain(美国，thermo fisher)，摇匀后倒入制胶板，待凝固后放入电泳槽中，将样品pcr产物依次加入至凝胶孔内，在150v条件下跑胶30min，通过紫外凝
胶成像可清晰观察到pcr产物中整合子片段条带。如图1所示为本实施例i型整合子pcr扩增产物电泳图。图中显示的条带为扩增所得到的i型整合子片段，不同长度的条带表述携带不同长度基因盒阵列的i型整合子。图中显示，在各样品中均扩增到不同长度条带的i型整合子，说明本方法有效地实现了样品中不同长度i型整合子的扩增。
[0058]
使用产物切胶回收试剂盒(上海，生工生物工程有限公司)将各个样品的整合子条带从200bp-4500bp的位置切胶回收并纯化，用于后续定量pcr分析。
[0059]
(4)定量pcr定量检测
[0060]
本发明实施例进行qpcr检测的平台为abi公司生产的quantstudio 3定量pcr仪。
[0061]
检测基因包括ermb、teta、teto、tetq、suli、sulii、qaca，使用引物为文献已报道引物，包括：
[0062]
ermb(taaagggcatttaacgacgaaact和tttatacctctgtttgttagggaattgaa)、
[0063]
teta(ctcaccagcctgacctcgat和cacgttgttatagaagccgcatag)、
[0064]
teto(atgtggatactacaacgcatgagatt和tgcctccacatgatatttttcct)、
[0065]
tetq(cgcctcagaagtaagttcatacactaag和tcgttcatgcggatattatcagaat)、
[0066]
suli(cagcgctatgcgctcaag和atcccgctgcgctgagt)、
[0067]
sulii(tcatctgccaaactcgtcgtta和gtcaaagaacgccgcaatgt)、
[0068]
qaca(tggcaataggagctatggtgttt和aaggtaacactattttcggtccaaatc)。
[0069]
qpcr反应体系包括：
[0070]1×
powerup sybr green master mix，
[0071]
1mg/ml牛血清白蛋白，
[0072]
500nm目标抗性基因前引物，
[0073]
500nm目标抗性基因后引物，
[0074]
10-20ng/l dna模板，其中dna模板即为步骤(3)获得的i型整合子扩增产物的纯化回收产物。
[0075]
本发明实施例中，定量pcr定量检测的反应程序为：预热95℃，10min；变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，40s；共40个循环。
[0076]
(5)i型整合子相对丰度计算
[0077]
i型整合子相对丰度计算：args定量pcr测试单位体积拷贝数/单位体积整合子浓度，单位为copie/ng i型整合子。
[0078]
本实施例中，如表2所示的活性污泥样品i型整合子扩增产物进行args定量pcr的检出体积浓度，即为args定量pcr测试单位体积拷贝数，具体获得如下分析结果：
[0079]
表2活性污泥样品i型整合子扩增产物进行args定量pcr的检出体积浓度
[0080]
[0081][0082]
w1、w2、w3、w4、w5、w6、w7、w8、w9样品i型整合子扩增产物浓度(即为单位体积整合子浓度)分别为：13.4ng/μl、14.2ng/μl、19.8ng/μl、20.0ng/μl、20.0ng/μl、20.0ng/μl、20.0ng/μl、20.0ng/μl、20.0ng/μl。则根据args定量pcr测试单位体积拷贝数/单位体积整合子浓度可得到各污泥样品i型整合子携带args的相对丰度，如表3和图2所示。
[0083]
表3活性污泥样品i型整合子携带args的相对丰度
[0084][0085]
如图2所示为本实施例样品i型整合子中不同args的相对丰度，从图中可以看出，所检测的7种args在各样品整合子中的检测种类为3种至7种。通过计算args在i型整合子的相对丰度(表3)得出，所检出的args在污泥样品中的相对丰度范围为2.04
×
10
0-1.67
×
103copies/ng integron。其中，sulii在i型整合子上的相对丰度显著高于其他几个检测基因，其相对丰范围为2.74
×
10
2-1.67
×
103copies/ng integron。而qaca在i型整合子上的检出率最低，检测的相对丰度也最低，为2.04
×
10
0-4.75
×
100copies/ng integron。
[0086]
本方案应用于污水处理厂活性污泥i型整合子args相对丰度的检测，有效的检测得到目标args在i型整合子上的相对丰度。
[0087]
实施例2厌氧消化污泥i型整合子args相对丰度分析
[0088]
本实施例选取了厌氧消化污泥作为实验样本，其中，厌氧消化污泥来源于半连续
式污泥厌氧消化反应器，厌氧消化运行使用的厌氧消化底物为剩余污泥，取自某污水处理厂，总固体含量(ts)为24.4g/l，挥发性固体(vs)为13.3g/l，使用前污泥含水率调整为94％，于105℃烘箱中进行热预处理48h，取出后待冷却至室温方可向反应器中投加。接种污泥为厌氧颗粒污泥，ts为37.4g/l，vs为17.0g/l，使用前用去离子水调整含水率为94％。
[0089]
本实施例中，厌氧消化运行相关条件如下：
[0090]
(1)反应器有效容积：1000ml，实际反应体积：600ml；
[0091]
(2)底泥与接种污泥投加体积分别为480ml和120ml；
[0092]
(3)反应温度设置25℃、35℃和55℃分别代表低温、中温和高温；
[0093]
(4)反应器初始ph调节至7，通过调低每次投加底物的ph来维持反应器内部的ph，将ph稳定在较小的波动范围内；
[0094]
(5)运行反应器之前先曝氮气20min，以确保反应器内厌氧环境；
[0095]
(6)污泥停留时间(srt)：30天，每三天进行一次出料和进料，每次进出料体积均为60ml；
[0096]
(7)反应器内的ph控制在6.8～7.8。
[0097]
样品采集：取反应器运行第141天的3个温度反应器中的污泥样品以及厌氧消化运行前污泥样品进行i型整合子携带args分析，25℃、35℃和55℃下样品分别命名为pp、pm、pt，厌氧消化运行前初始样品命名为initial。
[0098]
采用如实施例1所示的境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，首先对pp、pm、pt及initial样品dna的i型整合子进行pcr扩增，对i型整合子的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化。如图3所示为本实施例i型整合子pcr扩增产物电泳图。图中显示的条带为扩增所得到的i型整合子片段，不同长度的条带表述携带不同长度基因盒阵列的i型整合子。图中显示，在各样品中均扩增到不同长度条带的i型整合子，说明本方法有效地实现了样品中不同长度i型整合子的扩增。此外，pt样品中条带数量和亮点均低于pp和pm，说明pt样品中的i型整合子数量低于pp和pm。
[0099]
而后以该切胶纯化产物为模板进行定量pcr的分析，从而对抗生素抗性基因进行检测，并进行基因在整合子上相对丰度的分析与比较，从而掌握抗生素抗性基因在i型整合子上的相对丰度特征。
[0100]
其中，检测的目标args为：ermb、ermf、tetm、tetg、suli、sulii、dfra，使用引物为文献已报道引物，包括：
[0101]
ermb(taaagggcatttaacgacgaaact和tttatacctctgtttgttagggaattgaa)、
[0102]
ermf(cagctttggttgaacatttacgaa和aaattcctaaaatcacaaccgacaa)、
[0103]
tetm(catcatagacacgccaggacatat和cgccatcttttgcagaaatca)、
[0104]
tetg(tcaaccattgccgattcga和tggcccggcaatcatg)、
[0105]
suli(cagcgctatgcgctcaag和atcccgctgcgctgagt)、
[0106]
sulii(tcatctgccaaactcgtcgtta和gtcaaagaacgccgcaatgt)、
[0107]
dfra(ggaatggccctgatattcca和agtcttgcgtccaaccaacag)。
[0108]
本实施例中，如表4所示的活性污泥样品i型整合子扩增产物进行args定量pcr的检出体积浓度，即为args定量pcr测试单位体积拷贝数，具体获得如下分析结果：
[0109]
表4污泥样品i型整合子扩增产物进行args定量pcr的检出体积浓度
[0110][0111]
initial、pp、pm、pt样品i型整合子扩增产物浓度(即为单位体积整合子浓度)分别为：10.0ng/μl、10.0ng/μl、10.0ng/μl、10.0ng/μl。则根据args定量pcr测试单位体积拷贝数/单位体积整合子浓度可得到各污泥样品i型整合子携带args的相对丰度，如表5和图4所示。
[0112]
表5污泥样品i型整合子携带args的相对丰度
[0113][0114]
如图4所示为本实施例样品i型整合子中不同args的相对丰度，从图中可以看出，所检测的7种args在各样品整合子中的检测种类为5种至7种。通过计算args在i型整合子的相对丰度(表5)得出，所检出的args在污泥样品中的相对丰度范围为8.47
×
10
0-1.87
×
105copies/ng integron。其中，suli和dfra在i型整合子上的相对丰度相对较高，其相对丰范围分别为7.21
×
10
3-8.65
×
104copies/ng integron和1.24
×
10
3-1.87
×
105copies/ng integron。而tetg在i型整合子上的检出率最低，检测的相对丰度也最低，为8.47
×
10
0-1.21
×
101copies/ng integron。
[0115]
本方案应用于厌氧消化污泥i型整合子args相对丰度的检测，有效的检测得到目标args在i型整合子上的相对丰度。
[0116]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。