一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法

技术特征：
1.一种环境样品i型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样品的dna；(2)所述dna的i型整合子进行pcr扩增，得i型整合子扩增产物；(3)所述i型整合子扩增产物进行纯化回收，得纯化回收产物；(4)以所述纯化回收产物为模板进行定量pcr定量检测；(5)根据定量pcr的定量检测结果，计算i型整合子在整合子上的相对丰度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述pcr扩增的反应体系包含2
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transstart fastpfu pcr supermix(-dye)12.5μl，上下游引物各1μl，dna模板1μl，ddh2o 9.5μl。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述上下游引物包括：上游引物ggcatccaagcagcaag，下游引物aagcagacttgacctga。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的温度程序为95℃10min；35
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(94℃30s，55℃30s，72℃2min30s)，72℃10min。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述纯化回收的方法包括：所述i型整合子扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，再进行切胶纯化。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳的方法包括：1体积当量的质量体积分数为1％-1.5％的琼脂糖凝胶完全融化，冷却但未凝固前加入0.0001体积当量的sybr safe dna gel stain，摇匀后倒入制胶板，待凝固后放入电泳槽中，将所述i型整合子扩增产物依次加入至凝胶孔内，在150v条件下跑胶30min；所述切胶纯化的方法包括：使用产物切胶回收试剂盒将整合子条带从200bp-4500bp的位置切胶回收并纯化。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述定量pcr定量检测的体系包括：1
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powerup sybr green master mix，1mg/ml牛血清白蛋白，500nm目标抗性基因前引物，500nm目标抗性基因后引物，10-20ng/l dna模板，所述dna模板为所述i型整合子扩增产物的纯化回收产物。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述定量pcr定量检测的反应程序为：预热95℃，10min；变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，40s；共40个循环。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述i型整合子的相对丰度的计算方法包括：抗生素抗性基因定量pcr测试单位体积拷贝数/单位体积i型整合子浓度，单位为copies/ng i型整合子。10.根据权利要求1-9任一所述的方法，应用于抗生素抗性基因检测领域。

技术总结
本发明公开了一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，首先对样品DNA的I型整合子进行PCR扩增，对I型整合子的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化，而后以该切胶纯化产物为模板进行定量PCR的分析，从而对I型整合子携带的抗生素抗性基因进行检测，并进行基因在I型整合子上相对丰度的分析与比较，从而掌握抗生素抗性基因在I型整合子上的相对丰度特征。以PCR为基础，避免了使用宏基因组测序分析难度大、数据挖潜困难、定量分析程度不足的问题；本发明为环境样品I型整合子抗生素抗性基因的相对丰度分析，提供了新的技术方法和研究方向。新的技术方法和研究方向。新的技术方法和研究方向。


技术研发人员：张衍 刘和 邱旭阳 郑志永
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2022.09.06
技术公布日：2022/11/29