一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体及其制备方法和用途

1.本发明涉及抗体药物领域，尤其涉及一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体及其制备方法和用途。


背景技术：

2.单链抗体是一种基因工程抗体，通过dna重组技术将抗体轻链可变区vl和重链可变区vh通过一段连接短肽linker首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体的表达形式主要有融合表达，胞内表达和分泌表达三种形式。和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点：1)分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；2)组织穿透力强，容易进入实体瘤周围的微循环；3)血液清除快，肾脏蓄积很少；4)无fc段，非特异结合低；5)易于通过基因工程大量生产；6)易于基因操作，更易构建重组免疫毒素。
3.奶牛乳腺炎是影响奶牛业发展，给乳品生产造成巨大损失的一种常见多发病。引起奶牛乳腺炎的致病菌很多，其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌之一，流行率达到了50％，导致严重的经济损失。因为金黄色葡萄球菌具有传染性，且治疗用的抗生素易产生耐药性，所以很难彻底治愈。目前针对金黄色葡萄球菌全菌和多种毒力因子的疫苗也用于奶牛乳腺炎的预防，但是效果均不理想。单链抗体等基因工程抗体，以其独特的抗病毒和抗细菌作用及其能够大规模工程化制备的优势，显示了巨大的研发抗细菌药物的潜力，受到该领域高度重视。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体及其制备方法和用途，该单链抗体能够与金黄色葡萄球菌溶血性毒力因子(hlb)特异性结合，且具有一定的抑制金黄色葡萄球菌hlb溶血活性，能够用于金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的研究。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
6.本发明首先提供一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体，包括轻链可变区vl、重链可变区vh、连接肽linker，并按照vl-linker-vh的顺序连接构成牛源单链抗体片段vl-linker-vh，所述体轻链可变区vl氨基酸序列如seq id no.1所示，所述重链可变区vh氨基酸序列如seq id no.2所示。
7.进一步地，所述牛源单链抗体片段vl-linker-vh氨基酸序列如seq id no.3所示。
8.本发明的第二个方面是提供一种抑制奶牛乳腺炎的药物，该药物包括所述牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体。
9.本发明的第三个方面是提供一种奶牛乳腺炎诊断试剂盒，其特征在于包括所述单链抗体，或者编码所述单链抗体的基因片段以及与之交联的探针。
10.本发明的第四个方面是提供牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体的制备方法，包括以下步骤：
11.步骤1、扩增轻链可变区vl基因和重链可变区vh基因
12.采用rt-pcr从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞rna中扩增出抗体编码基因的轻链可变区vl基因和重链可变区vh基因；
13.步骤2、合成scfv基因
14.利用soe-pcr法将中间连接肽linker、vh基因、vl基因相连，构建牛源性单链抗体基因，即scfv基因；
15.步骤3、构建重组表达质粒
16.将scfv基因和噬菌粒载体酶切后，构建重组表达质粒；
17.步骤4、建立初级单链抗体文库
18.将重组表达质粒转化入宿主细胞，培养并用辅助噬菌体扩增建立初级单链抗体文库；
19.步骤5、用原核表达的金黄色葡萄球菌hlb蛋白作为包被抗原，富集淘选3～5轮，得到克隆；优选地，富集淘选4轮，得到克隆；
20.步骤6、采用phage elisa筛选,用原核表达的金黄色葡萄球菌hlb蛋白作为包被抗原，筛选阳性克隆；
21.步骤7、构建单链抗体原核表达质粒
22.将筛选得到的阳性克隆酶切，回收单链抗体hlb-scfv-1编码基因，与同步酶切的原核表达载体pet32a( )混匀后，14～16℃连接过夜，连接产物转化dh5α感受态细胞后，挑取单克隆，菌落pcr和质粒双酶切验证正确的克隆进行测序；
23.步骤8、构建单链抗体原核表达质粒的菌株
24.将步骤7得到的测序正确的第一单克隆的重组质粒进行提取，获得第一重组质粒，将第一重组质粒转化到bl21感受态细胞后，挑取第二单克隆，对第二单克隆的菌落pcr扩增和提取第二质粒；第二单克隆的菌落pcr扩增产物和第二质粒分别经双酶切验证，对于经验证正确的第二单克隆进行测序，得到测序正确的第二单克隆；测序正确的第二单克隆中提取的质粒为构建成的单链抗体原核表达质粒pet32a-hlb-scfv-1，将第二单克隆菌落pet32a-hlb-scfv-1-bl21传代纯化，保存备用；
25.步骤9、表达纯化单链抗体蛋白
26.将步骤8构建成单链抗体原核表达质粒的菌株pet32a-hlb-scfv-1-bl21在37℃培养，当细菌od值为0.4～0.6时，加入0.6mm蛋白质诱导剂iptg，在28℃进行诱导表达16-20h后，对单链抗体蛋白进行纯化。
27.优选地，步骤2中所述scfv基因按照vl-linker-vh的顺序连接。
28.优选地，所述抗体可变区vl和重链可变区vh氨基酸序列如seq id no.1、seq id no.2所示，scfv氨基酸序列如seq id no.3所示，所述中间连接肽氨基酸序列为(gggggsggggs)，轻、重链的正反向引物分别为vl f、vl r、vh f和vh r，核苷酸序列如seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6和seq id no.7所示，vlf、vh r分别含有sfii和noti酶切位点，vh f、vl r含互补的linker序列，步骤7中所述菌落pcr引物分别为vl-f、vh-r，核苷酸序列如seq id no.8和seq id no.9所示。
29.优选地，所述噬菌粒载体为pcantab5e。进一步优化，步骤3中，所述酶切位点为sfi i和not i，其中sfi i：ggcccagccggcc，not i：gcggccgc。
30.优选地，步骤7中，与pet32a( )载体连接时，优选的酶切位点为ecori和xhoi，其中ecor i：gaattc，xho i：ctcgag。
31.优选地，步骤4中，所述宿主细胞为大肠杆菌tg1细胞。
32.本发明再一个目的是提供所述单链抗体的制备方法获得的单链抗体原核表达质粒pet32a-hlb-scfv-1和菌株pet32a-hlb-scfv-1-bl21。
33.本发明的有益效果在于：
34.首先是在构建重组牛源单链抗体scfv时，按照vl-linker-vh的顺序，将牛抗体轻链可变区vl和牛抗体重链可变区vh用中间的linker进行连接,构成的牛源单链抗体片段vl-linker-vh，这样连接被本发明证明构建重组牛源scfv比一般的文献报道都是按照vh-linker-vl的顺序连接更为有效；
35.其次本发明将筛选到的阳性克隆的单链抗体编码基因scfv克隆到原核表达质粒pet32a( )，构建成单链抗体原核表达质粒pet32a-hlb-scfv-1，将该单链抗体与金黄色葡萄球菌混合后加入2％牛红细胞，在lb培养基中孵育，可抑制金黄色葡萄球菌溶血性毒力因子hlb的凝血作用，该单链抗体用于金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的相关研究，具有良好的应用前景。
36.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
37.图1是噬菌粒载体pcantab5e的结构图；
38.图2是原核表达筛选到的scfv阳性克隆基因的扩增片段；
39.图3是scfv基因表达的蛋白sds-page检测图；
40.图4是scfv基因表达的蛋白western bloting检测图；
41.图5是hlb-scfv-1抑制金黄色葡萄球菌溶血性毒力因子hlb的溶血活性曲线图。
具体实施方式
42.以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
43.实施例1牛源噬菌体单链抗体库的构建
44.1、采集患乳腺炎的奶牛血液，elisa法检测血清抗体效价大于1:20000时，继续后续实验。用抗凝血提取牛外周血白细胞，用trizol法(trizol reagent购自takara公司)提取总rna。以提取的总rna为模版，采用oligo primer，根据反转录试剂盒(cdna第1链合成试剂盒购自takara公司)的产品说明操作步骤，合成第1链cdna。
45.2、分析已发表文献中的牛抗体编码基因可变区序列，根据其fr区设计扩增抗体轻、重链的引物(表1)，vh f和vh r用于扩增vh区；vl f和vl r用于扩增vl区。
46.vlf、vh r分别含有sfii和noti酶切位点；vh f、vl r含互补的linker序列(酶切位点和linker序列在表1中用下划线标示出)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
47.表1扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小
[0048][0049]
3、vh和vl基因的扩增
[0050]
以cdna为模版，vh f、vh r为引物扩增vh基因；vl f、vl r为引物扩增vl基因。
[0051]
pcr反应体系为25μl：2
×
pcr mix 12.5μl，模版cdna 2μl，上下游引物(25μm)各1μl，ddh2o 8.5μl。
[0052]
扩增程序如下：95℃预变性3min；94℃变性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
[0053]
1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定产物并回收目的基因(根据axygen公司提供的胶回收说明书操作)。
[0054]
4、scfv基因的获得
[0055]
通过重组链延伸反应(soe-pcr)将含有linker序列的vl和vh基因连接为scfv基因(vl-linker-vh)，并加入sfii和noti酶切位点。
[0056]
5、初级文库的构建
[0057]
如附图1噬菌粒载体pcantab5e的结构图所示，根据常规分子克隆方法(参照j.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》)，scfv基因和pcantab5e载体分别经sfii和noti双酶切后，将scfv基因插入pcantab5e载体，构建重组表达质粒，并将其电转化tg1感受态细胞，转化50次，合并所有电转化培养液，取一小部分系列稀释后涂布于2yt-ag固体培养板，30℃过夜培养计算库容量(挑取克隆进行菌落pcr和质粒双酶切验证，测序验证库的多样性)；
[0058]
通过菌落pcr计算阳性率，得到实际的库容量。将剩余的细菌培养液通过辅助噬菌体m13ko7拯救后建立初级文库。
[0059]
实施例2牛源抗金黄色葡萄球菌溶血性毒力因子单链抗体hlb-scfv-1的筛选
[0060]
1、富集淘选
[0061]
制备金黄色葡萄球菌(atcc25923)溶血性毒力因子hlb原核表达产物，将其作为抗原，4℃包被过夜；用含4％脱脂奶粉的pbst封闭96孔板，37℃孵育2h；向96孔板中加入上述步骤中制备好的单链抗体噬菌体抗体库，37℃孵育2h，用pbst和pbs各洗10次，洗掉未结合的游离噬菌体；每孔加入100ul 0.2mol/l gly-hcl缓冲液(ph＝2.2)洗脱特异性结合的噬菌体，加入50ul 1mol/l tris-hcl(ph＝9.1)中和洗脱液；将剩余部分洗脱液感染大肠杆菌tg1后，重复上述步骤。如此重复3-5轮，在第一轮过后，要增加洗涤的严谨性：洗脱前用pbst洗脱20次后用pbs洗涤20次。
[0062]
2、phage elisa筛选
[0063]
从第四轮中随机挑取96个克隆，用m13k07拯救后制备重组噬菌体。将纯化后的金黄色葡萄球菌溶血性毒力因子(hlb)原核表达蛋白用50mmol/l碳酸氢钠盐溶液(ph9.6)于4℃包被过夜，4％脱脂奶粉溶液封闭1h，用pbst(0.1％tween20，以下同)洗涤3次；加入上述制备好的噬菌体单链抗体，37℃反应2h，pbst和pbs各洗涤6次；加入hrp-antim13抗体100μl(1:4000)，37℃反应1h，pbst和pbs各洗涤6次；tmb显色，2mol/l硫酸终止反应，酶标仪读取od450值，同时设辅助噬菌体m13k07为阴性对照。elisa结果的判定以p/n(p为阳性孔的od450值，n为阴性孔的od450值)表示，p/n≥2.1为阳性；1.5≤p/n＜2.1为可疑；p/n＜1.5为阴性phage elisa筛选到的scfv阳性克隆结果如附图2所示，其中blank control为空白对照，negative control为阴性对照，scfv为阳性克隆，阳性克隆的od450值很高，接近2.6；而阴性对照的od450值小于0.4，两者比值大于2.1。
[0064]
实施例3pet32a-hlb-scfv-1单链抗体的原核表达及纯化
[0065]
1、重组质粒pet32a-hlb-scfv-1的构建
[0066]
以阳性克隆菌株为模板，用特异性引物(如表2所示，下划线为酶切位点)扩增hlb-scfv-1目的基因，选择限制性内切酶ecor i和xho i对目的基因和原核表达载体pet32a( )进行双酶切，酶切后连接获得重组质粒，将其转化到dh5α感受态，菌落pcr和质粒双酶切验证正确的克隆送至上海铂尚生物技术有限公司测序；
[0067]
表2扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小
[0068][0069]
测序正确的克隆进行质粒的提取，再将重组质粒转化到bl21感受态细胞后，挑取单克隆，菌落pcr和质粒双酶切验证正确的克隆送至上海铂尚生物技术有限公司测序，测序正确的即为构建成功的原核表达重组质粒pet32a-hlb-scfv-1，基因表达的蛋白sds-page检测图如附图3所示。
[0070]
2、单链抗体hlb-scfv-1蛋白的纯化
[0071]
pet32a( )载体表达的融合蛋白携带his-tag，故hlb重组蛋白可使用ni-nta预装重力柱his亲和纯化，具体实验方法如下：
[0072]
1)将纯化柱固定好，周围用冰袋保持低温，让保存液流出；
[0073]
2)加入5-10倍柱体积ni-native-0buffer平衡纯化柱，控制流速1ml/min左右；
[0074]
3)加入2.1.2中超声破碎低温离心后获得的上清液，控制流速为0.5ml/min左右；
[0075]
4)加入5-10倍柱体积ni-native-0buffer清洗纯化柱，控制流速1ml/min左右；
[0076]
5)依次加入5-10倍柱体积ni-native-30mm咪唑、ni-native-50mm咪唑、ni-native 100mm咪唑、ni-native-150mm咪唑、ni-native-200mm咪唑、ni-native-250mm咪唑竞争性洗脱目的蛋白，控制流速0.5-1ml/min；
[0077]
6)加入5-10倍柱体积ni-native-0buffer清洗纯化柱，控制流速1ml/min左右；
[0078]
7)加入5-10倍柱体积去离子水清洗纯化柱，控制流速1ml/min左右；
[0079]
8)加满20％乙醇，4℃保存纯化柱。
[0080]
分别取分别取50mm咪唑、100mm咪唑、150mm咪唑、200mm咪唑蛋白洗脱液，加入蛋白电泳loading buffer沸水浴煮样10min，使用sds-page进行可溶性鉴定。sds-page电泳条件：恒压模式调节电压为80v，电泳30min后增加电压至120v，继续电泳1h左右至loading buffer移动位置接近底部。电泳结束后，考马斯亮蓝染色45min后脱色12h，在凝胶成像系统观察电泳情况。用bca蛋白浓度测定试剂盒测定获得的蛋白浓度。
[0081]
实施例4重组scfv序列分析
[0082]
对获得的单链抗体编码基因进行测序，证明其按照正确的阅读框顺序插入到原核表达质粒pet32a( )载体中，所述氨基酸序列如seq id no.3所示，其序列顺序是vl-linker-vh。
[0083]
实施例5检测单链抗体hlb-scfv-1抑制金黄色葡萄球菌溶血性毒力因子(hlb)的溶血活性
[0084]
检测单链抗体hlb-scfv-1抑制金黄色葡萄球菌溶血性毒力因子(hlb)的溶血活性实验包括：
[0085]
1、实验材料和方法
[0086]
1)实验材料
[0087]
hlb原核表达抗原蛋白和hlb-scfv-1原核表达蛋白、4％奶牛红细胞购自南京泽维尔生物技术有限公司、96孔酶标板购自美国康宁公司、其他各类试剂均为国产分析纯或化学纯试剂。
[0088]
2)实验方法
[0089]
将纯化的重组hlb蛋白稀释至20ug/ml后与不同稀释度的hlb-scfv-1等体积混合，37℃孵育40min后加入2％牛红细胞,37℃孵育40min,10℃孵育40min，4000rpm离心2min取上清测定od450，每组实验重复三次。
[0090]
2、数据统计和实验结果
[0091]
结果如附图5显示，与未加scfv相比，单链抗体组可以显著的抑制重组hlb的溶血活性。
[0092]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。