一种生物素化抗溶菌酶金抗体及其构建方法

1.本发明涉及纳米医学领域，尤其是涉及一种多功能化的抗溶菌酶金抗体及生物素化金抗体的构建方法。


背景技术：

2.溶菌酶是一种分子量为14400da的蛋白质，其一级序列含有129个氨基酸。溶菌酶可以催化革兰氏阳性菌细胞壁的糖苷键水解从而破坏细菌的细胞膜，因此溶菌酶具有较强的杀菌作用。在人体中，溶菌酶不仅是一种天然的杀菌抗感染物质，具有消炎、抗病毒等作用，并且人体中溶菌酶的含量可以作为诊断多种疾病的指标之一。在食品工业中，溶菌酶作为防腐剂而被广泛使用，但是溶菌酶还是一种常见的过敏原，在生产及使用过程中需要对溶菌酶的含量进行检测。
3.目前已经开发出的检测溶菌酶的方法基本是仪器检测法及免疫分析法两种。仪器检测法通常使用高效液相色谱、液相色谱-质谱连用等仪器，这些方法需要进行较复杂的样品预处理，仪器本身价格昂贵，检测过程需要专业人员进行。以酶联免疫吸附法和侧向免疫层析法为主的免疫分析法，能够较快完成检测的同时，同样可以做到高准确度地检测低浓度样品，免疫分析法能够更好地满足现实生活中的需求。
4.免疫分析法是基于抗体与抗原相互作用而建立的一大类方法。所有免疫分析法的核心都是抗体，而目前使用的天然抗体普遍存在制备困难、易受温度变化而失活等缺点，这些缺点会对免疫分析法的应用产生一定的限制。因此，需要开发一种制备过程简单且热稳定性好的天然抗体替代物。
5.抗溶菌酶金抗体是通过“构象工程”方法构建的一种全新的人工抗体。将天然抗体的互补决定区(cdr)嫁接在金纳米粒子上，通过构象工程，cdr在天然抗体的构象得以重建，金抗体具有特异性结合溶菌酶的能力且具有极佳的热稳定性，具备成为天然抗体替代物的潜力。进一步通过聚乙二醇减少了金抗体上的多肽数量，降低了合成金抗体的成本并减少了金抗体表面偶联抗原的数量。但是单功能的金抗体难以应用于免疫分析法中。


技术实现要素：

6.本发明是在公开号为cn105884888a的专利基础上，为了解决金抗体的多功能化技术和成本问题，提供一种生物素化抗溶菌酶金抗体及其构建方法，在抗溶菌酶金抗体的基础上，加入生物素和聚乙二醇，构建出生物素化抗溶菌酶金抗体，其可以同时结合溶菌酶(lysozyme)和链霉亲和素(streptavidin)，并且制备过程简单、特异性强、热稳定性好，具备应用于免疫分析法检测溶菌酶的潜力。
7.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种生物素化的抗溶菌酶金抗体，将抗溶菌酶金抗体进行生物素化，该生物素化的抗溶菌酶金抗体可同时结合溶菌酶和链霉亲和素，用于免疫分析。本发明将取自溶菌酶天然抗体决定簇互补区的多肽偶联在金纳米粒子上制得抗溶菌酶金抗体。本发明在原抗溶
lys3的cdr3的多肽片段设计的pep1，通过s-au键嫁接到金纳米粒子上，制备出与天然抗体相同特异性的抗溶菌酶金抗体。在抗溶菌酶金抗体的基础上，将生物素通过聚乙二醇偶联在金纳米粒子上，使金抗体生物素化，同时使用聚乙二醇封闭金纳米粒子上的裸露位点，生物素化抗溶菌酶金抗体的结构示意图如图一所示，制备的生物素化抗溶菌酶金抗体具有特异性结合溶菌酶和链霉亲和素的能力。
24.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
25.以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
26.实施例一：
27.在本实施例中，生物素化抗溶菌酶金抗体的制备方法如下：
28.14nm金纳米粒子按如下方法合成：在500ml的圆底烧瓶中放入聚四氟乙烯搅拌子(25
×
9.5mm)，将240ml超纯水以及25ml 39.47mm柠檬酸三钠加入瓶中，将圆底烧瓶置于140℃的恒温油浴，冷凝回流20min后，迅速加入10ml 25mm氯金酸溶液，均匀搅拌直至溶液变为酒红色，自然冷却至室温。取出圆底烧瓶中的聚四氟乙烯搅拌子，将金纳米粒子通过0.22μm的滤膜过滤后，放入4℃备用。
29.生物素化抗溶菌酶金抗体的制备：在装有15
×
8mm的菱形聚四氟磁力搅拌子的10ml玻璃瓶中加入6ml金纳米粒子溶液，并以650rpm的转速下均匀搅拌，确保整个反应过程中无气泡产生。加入1ml巯基聚乙二醇巯基溶液(含有60μl 2mm氢氧化钠)，在室温下持续搅拌1h。加入500μl生物素溶液，在室温下持续搅拌1h。加入500μl多肽pep1溶液，在室温下持续搅拌1h后，取出搅拌子放入摇床(100rpm)室温反应12h。通过超滤离心将生物素化抗溶菌酶金抗体浓缩至10nm，金纳米粒子：巯基聚乙二醇巯基：生物素：多肽pep1＝1：500：5：10(最终摩尔浓度之比)。
30.实施例二：
31.本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
32.在本实施例中，使用动态光散射粒径检测仪(dls)测试生物素化抗溶菌酶金抗体对溶菌酶和链霉亲和素的结合，方法如下：
33.整个测试过程在室温下进行，缓冲溶液使用0.02m ph 9.2的碳酸盐缓冲液，分别配制浓度为14nm的溶菌酶溶液以及链霉亲和素溶液。先取1ml金抗体溶液进行测试，得到金抗体的平均水合粒径，然后将1ml金抗体(3.5nm)与1ml两种目标蛋白分别孵育15min后，取1ml混合溶液进行测试，得到金抗体的粒径变化；最后将金抗体与两种目标蛋白同时混合，孵育15min后进行测试，得到此时金抗体的平均水合粒径。
34.图2为得到的金抗体平均水合粒径变化图，从图中我们可以看出，金抗体与两种目标蛋白分别孵育后粒径均有不同程度的上升，说明金抗体可以与两种目标蛋白结合；与两种蛋白共同孵育后，粒径进一步上升，这可以初步说明金抗体可以与两种目标蛋白同时结合。
35.实施例三：
36.本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
37.在本实施例中，通过荧光淬灭实验证明生物素化抗溶菌酶金抗体对溶菌酶和链霉
亲和素的结合，方法如下：
38.溶菌酶和链霉亲和素分别预先标记了荧光异硫氰酸荧光素(fitc)和四甲基异硫氰酸罗丹明(tritc)。利用金纳米粒子可以淬灭其表面荧光基团的特性，若金抗体与两种目标蛋白结合，则目标蛋白标记的荧光基团会被淬灭。我们将0.5fitc-lysozyme与0.5ml streptavidin溶液在室温下混合孵育5min后，加入0.5ml金抗体溶液(10nm)充分振荡后继续孵育10min，取0.5ml混合溶液进行检测。同时，将0.5lysozyme与0.5ml tritc-streptavidin溶液在室温下混合孵育5min后，加入0.5ml金抗体溶液(10nm)充分振荡后继续孵育10min，取0.5ml混合溶液进行检测。以此来分别检测金抗体对两种目标蛋白的结合。当检测金抗体对于fitc-lysozyme的荧光淬灭时，激发波长设置为488nm；当检测tritc-streptavidin时，激发波长设置为547nm。整个实验过程中，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为5nm。
39.图3为荧光淬灭实验结果，对于lysozyme，无论streptavidin是否存在，金抗体都可以淬灭lysozyme上的荧光基团fitc，即streptavidin不影响金抗体对lysozyme的结合；对于streptavidin我们也可以得出相似的结论，即lysozyme不影响金抗体对streptavidin的结合。这可以进一步证明金抗体可以同时结合lysozyme和streptavidin。
40.实施例四：
41.本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
42.在本实施例中，模拟复杂环境下生物素化抗溶菌酶金抗体对于溶菌酶的结合，方法如下：
43.在实际应用中，往往存在许多非特异性蛋白，为此，我们选择了大小和性质与溶菌酶极其相似的核糖核酸酶a(rnase a)，并将其浓度设置为溶菌酶的5倍，通过溶菌酶活性测试实验来证明复杂环境下金抗体对溶菌酶的结合能力。同时，我们将金纳米粒子以及多肽pep1s(与pep1的氨基酸组成相同但排列顺序不同)作为对照组。图4为溶菌酶活性测试实验的结果，我们可以看出，与对照组相比，即使环境中出现高浓度的非特异性蛋白核糖核酸酶a，金抗体仍可以保持对溶菌酶活性较高的抑制率，这说明金抗体具有应用于现实复杂环境的潜力。
44.实施例五：
45.本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
46.在本实施例中，检测生物素化抗溶菌酶金抗体的热稳定性，方法如下：
47.天然抗体易受环境温度变化而失活，为了测试金抗体的热稳定性，我们将金抗体分别在60、80及100℃的水浴中预处理1h，待自然冷却后进行溶菌酶活性测试实验。图5为热稳定性实验测试结果，我们可以看出，生物素化抗溶菌酶金抗体即使在100℃的高温中预处理后，对溶菌酶活性的抑制率未下降太多仍保持在79％的高抑制率，这说明其具有极佳的热稳定性。
48.上述实施例生物素化抗溶菌酶金抗体的构建方法。以抗溶菌酶金抗体为基础，降低了多肽偶联数量，并将生物素通过聚乙二醇偶联在金纳米粒子上，完成金抗体的生物素化。该生物素化抗溶菌酶金抗体可以特异性结合溶菌酶和链霉亲和素，并且在复杂环境中金抗体仍可以结合溶菌酶，其具有应用于免疫分析法的潜力。并且，相较于易受环境温度影响而失活的天然抗体，金抗体可以在100的高温中预处理后保持对溶菌酶活性的高抑制率，
因此金抗体具备替代天然抗体进行应用的极大潜力。
49.上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。