棒状乳杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及棒状乳杆菌及其应用。


背景技术：

2.皮肤作为抵御外界不良因素侵扰的第一道防线，同时也维持着机体稳定。皮肤屏障由表皮和真皮构成，能够防止人体水分过多释放，并防止化学物质或微生物等有害物质进入我们的身体。表皮中的角质层所含有的天然保湿因子即氨基酸类，乳酸盐及糖类等，以及角质层本身所具有的亲水特性，使得角质层含有10~30%的水分，这种环境成为了皮肤自身微生物菌落生长的摇篮。但随着年龄的增长，角质层的含水量会逐渐减少，当水分含量低于10%的时候，就会导致皮肤产生各种问题，例如皮肤干燥, 皮肤老化、皮肤敏感以及出油过多等。当皮肤屏障受损，会导致金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）的定植以及增殖，使皮肤发炎红肿，同时导致痤疮丙酸杆菌（propionibacterium acne）增加，产生痤疮等慢性炎症性皮肤疾病。
3.阴道是由粘膜、肌层和外膜组成的肌性管道，富有伸展性，能够连接子宫和外生殖器。正常阴道有多种微生物群，包括革兰阳性或阴性的需氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌（如乳杆菌、大肠埃希菌、消化球菌等），以及支原体、假丝酵母菌等。各种微生物与宿主阴道之间相互依赖、相互制约，达到动态的生态平衡，并不引起病症。但当菌群失衡，会导致阴道微环境中的酸度改变，促进了妇科炎症以及细菌性阴道病的发生，此外，长期的炎症刺激可能会导致hpv感染，进一步诱发宫颈癌前病变。
4.目前，对于皮肤问题以及妇科疾病的治疗大多使用抗生素，而单独应用抗生素治疗疾病容易出现复发率高、治疗失败等问题，而用益生菌进行辅助治疗则能有效减少炎症反复发作。此外益生菌用在护肤品中，可显著抑制皮肤病原菌增殖，平衡皮肤表皮菌群，修复皮肤屏障。同时有效增加肌肤对营养物质的吸收，增强免疫力。因此提供一种利用微生态技术开发的益生菌相关产品，具有重要的现实意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供棒状乳杆菌及其在制备改善肌肤状况以及阴道菌群的产品中的应用。
6.本发明提供了保藏编号为 cctcc no: m 20221045的棒状乳杆菌（lactobacillus coryniformis）。
7.本发明所述棒状乳杆菌从朝鲜族发酵苏子叶中分离出来，命名为seuneu-116，革兰氏染色为阳性，显微镜下呈杆状；在固体培养基中生长，可形成边缘整齐、表面光滑圆润不透明的白色圆形小菌落；在液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀；经rrna基因序列分析为棒状乳杆菌（lactobacillus coryniformis）。
8.本发明提供了一种益生菌菌剂，其原料包括所述的棒状乳杆菌。
9.进一步的，所述菌剂的剂型包括液体、粉剂及颗粒，本发明对此不作限定；其中活
性成分可仅包括本发明所述的棒状乳杆菌，也可包括其他具有生理活性的益生菌和/或益生元，本发明对此亦不做限定。
10.本发明提供了所述所述棒状乳杆菌或所述益生菌菌剂在制备改善皮肤状况的产品中的应用。
11.本发明中，所述改善皮肤状况包括促进皮肤屏障修复、抗炎、调节皮肤微生物菌群中的一种或多种。
12.本发明中，所述促进皮肤屏障修复为正向调控屏障修护相关基因；所述屏障修护相关基因包括flg、ivl、ovol1和/或lor中至少一种。
13.进一步的，所述的棒状乳杆菌可促进皮肤屏障修复。所述皮肤屏障是由皮脂膜和角质层组成的物理屏障，可以抵御外界对皮肤的刺激。所述的促进皮肤屏障修复为促进人永生化角质形成细胞hacat屏障修护相关基因的表达。所述屏障修护相关基因包括flg、ivl、ovol1和/或lor中至少一种。
14.具体的，在一些实施例中，本发明利用所述棒状乳杆菌的上清液和灭活菌体，研究棒状乳杆菌对hacat屏障修护相关基因表达的影响，结果表明，所述棒状乳杆菌的上清液上调屏障修护相关基因flg、ovol1 和lor的表达，所述棒状乳杆菌的灭活菌体上调屏障修护相关基因flg、ivl 、ovol1 和lor的表达。
15.本发明中，所述抗炎为减少no生成量。
16.具体的，在一些实施例中，本发明利用所述棒状乳杆菌的上清液和灭活菌体，研究棒状乳杆菌对raw264.7细胞no生成量的影响，结果表明，所述棒状乳杆菌具有抗炎作用，能够降低lps诱导的raw264.7细胞no的生成量。
17.本发明中，所述调节皮肤微生物菌群包括如下a)~c)所示中至少一种：a）、抑制皮肤病原菌增殖；所述皮肤病原菌包括人葡萄球菌和/或溶血葡萄球菌；b）、降低痤疮丙酸杆菌的比例；c）、降低金黄色葡萄球菌的比例。
18.进一步的，所述棒状乳杆菌可抑制皮肤病原菌增殖，所述皮肤病原菌可导致人体皮肤、黏膜、毛发和指甲产生感染性疾病。所述皮肤病原菌包括人葡萄球菌和/或溶血葡萄球菌至少一种。
19.具体的，在一些实施例中，本发明利用所述棒状乳杆菌的上清液，研究所述棒状乳杆菌对皮肤病原菌的影响，结果表明，所述棒状乳杆菌抑制人葡萄球菌和溶血葡萄球菌的增殖。
20.进一步的，所述棒状乳杆菌可降低痤疮相关菌群比例，所述痤疮是一种常见的慢性炎症性皮肤疾病，主要与皮脂分泌过多、毛囊皮脂腺导管堵塞、细菌感染和炎症反应等因素密切相关。所述降低痤疮相关菌群比例包括抑制痤疮丙酸杆菌的生长，和/或促进或不影响表皮葡萄球菌的生长。
21.具体的，在一些实施例中，本发明利用所述棒状乳杆菌的上清液，研究所述棒状乳杆菌对痤疮相关菌群比例的影响，结果表明，所述棒状乳杆菌对痤疮丙酸杆菌有显著抑制作用，而促进或不影响表皮葡萄球菌的生长，从而改变痤疮相关菌群比例，达到治疗痤疮的目的。
22.进一步的，所述棒状乳杆菌可改善敏感肌相关菌群比例，所述敏感肌是皮肤受到
外界刺激后，产生的一种泛红，发热，瘙痒、刺痛的现象，进一步则会导致皮肤菌群失衡，发炎红肿。所述降低敏感肌相关菌群比例包括抑制金黄色葡萄球菌的生长，和/或促进或不影响表皮葡萄球菌的生长。
23.具体的，在一些实施例中，本发明利用所述棒状乳杆菌的上清液，研究所述棒状乳杆菌对痤疮相关菌群比例的影响，结果表明，所述棒状乳杆菌对金黄色葡萄球菌有显著抑制作用，而促进或不影响表皮葡萄球菌的生长。从而能够改变菌群比例，有效改善敏感肌菌群比例。
24.本发明还提供了所述棒状乳杆菌或所述益生菌菌剂在制备调节阴道菌群的产品中的应用。
25.进一步的，所述棒状乳杆菌可调节阴道菌群，包括促进詹氏乳杆菌、卷曲乳杆菌和/或加氏乳杆菌的增殖，阴道菌群由特定微生物组成，只有致病菌与益生菌二者处于动态平衡状态才能使阴道微环境酸碱平衡。
26.本发明还提供了改善皮肤状况或调节阴道菌群的产品，包括所述棒状乳杆菌的菌株或其灭活菌体。
27.进一步的，所述产品的剂型包括口服制剂、注射剂、滴剂或皮肤外用剂中的至少一种。
28.本发明公开的棒状乳杆菌seuneu-116，保藏编号为cctccno:m20221045，具有维持及修护皮肤屏障、抗炎、抑制皮肤病原菌、治疗痤疮、改善敏感肌及促进阴道乳酸菌增殖的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。
29.生物保藏说明棒状乳杆菌seuneu-116（lactobacilluscoryniformisseuneu-116），于2022年7月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctccno:m20221045。
具体实施方式
30.本发明提供了棒状乳杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
31.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
32.下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1seuneu-116的分离于朝鲜族发酵苏子叶中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于mrs固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为seuneu-116。
33.革兰氏染色镜检：菌株seuneu-116为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在mrs平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在mrs液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
34.实施例2seuneu-116的核酸鉴定1、16srrna基因序列分析：挑取单菌落置mrs液体培养基中，37℃培养过夜后，12000转离心1min收集菌体，按照dna提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27f,1492r，pcr扩增体系为50μl体系，95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。
35.2、结果pcr产物测序结果与genbank中已发表的标准序列进行同源性比较（blastn）后得出seuneu-116菌株为棒状乳杆菌（lactobacilluscoryniformis）。
36.实施例3seuneu-116促进hacat屏障修护相关基因表达实验1、seuneu-116上清液和灭活菌体制备挑取棒状乳杆菌seuneu-116单菌落于mrs液体培养基，37℃培养箱静置培养16~18h，酶标仪检测并以pbs稀释调整od
600
=0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。离心沉淀以适量pbs重悬，稀释调整od
600
=0.2，为灭活菌体。
37.2、促进hacat屏障修护相关基因表达实验接种人永生化角质形成细胞hacat（2ml/孔，内含5
×
105细胞）至6孔板，5%二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。分别加入上清液5%(v/v)，灭活菌体10%(v/v)，对照组分别以等体积pbs替代上清液/灭活菌体，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测flg、ivl、ovol1和lor基因的表达。以等体积pbs处理组为对照（基因相对表达倍数f=1）,利用2-δδct
法计算各样品f值。
38.公式：f=2-δδct
，其中：
△
ct
实验
=ct
实验-ct
内参（实验）
;
△
ct
对照
=ct
对照-ct
内参（对照）
;
△△
ct=
△
ct
实验
‑△
ct
对照
。
39.上清液上调屏障修护相关基因flg、ovol1和lor。结果见表1：表1seuneu-116上清液上调修复基因的表达灭活菌体上调屏障修护相关flg、ivl、ovol1和lor。结果见表2：表2seuneu-116灭活菌体上调修复基因的表达
结果显示seuneu-116上清液和灭活菌体具有促进皮肤屏障修护的作用。
40.实施例4seuneu-116降低raw264.7细胞no生成量1、seuneu-116上清液及灭活菌体制备制备方法参照实施例3。
41.2、raw264.7细胞制备将raw264.7细胞消化后以0.5ml/孔（内含2
×
105细胞）接种至24孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
42.3、seuneu-116添加及lps刺激将上清液5%(v/v)、灭活菌体10%(v/v)分不同组加入培养过夜的raw264.7细胞中，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的lps溶液，诱导raw264.7细胞发炎，20h后取细胞培养上清液，按照碧云天no检测试剂盒所述方法进行标准曲线绘制，计算样品中no的浓度及抑制率。计算公式及结果见表3：表3seuneu-116降低raw264.7细胞no生成量结果显示seuneu-116具有抗炎作用，能够降低lps诱导的raw264.7细胞no生成量，与lps对照组相比降低32.77%~55.52%。
43.实施例5seuneu-116抑制皮肤病原菌的作用1、seuneu-116上清液制备挑取棒状乳杆菌seuneu-116单菌落于mrs液体培养基，37℃培养箱静置培养16~18h，酶标仪检测并以mrs液体培养基稀释调整od
600
=2.0，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，上清液经0.22μm滤膜过滤为上清液。
44.2、病原菌菌液制备将2种病原菌：人葡萄球菌cgmcc1.493、溶血葡萄球菌cgmcc1.540分别挑取单菌
落于bhi液体培养基，37℃培养箱静置培养过夜，检测并以bhi液体培养基稀释调整od
600
=0.2。
45.3、抑制病原菌实验将灭活上清液以添加量10%(v/v)加入病原菌菌液中，以添加等体积mrs液体培养基为对照，37℃培养3h，检测菌液浓度（od
600
）并计算病原菌抑制率。计算公式及结果见表4：表4seuneu-116对皮肤病原菌抑制作用结果显示seuneu-116具有抑制皮肤病原菌增殖的作用，抑制率20.00%~31.71%。
46.实施例6seuneu-116改变菌群比例治疗痤疮的作用1、seuneu-116上清液制备制备方法参照实施例5。
47.2、痤疮相关菌群菌液制备将痤疮丙酸杆菌cgmcc1.5003和表皮葡萄球菌cgmcc1.4260分别挑取单菌落于bhi液体培养基，37℃培养箱静置培养过夜，检测并以bhi液体培养基稀释调整od
600
=0.2。
48.3、添加上清液影响痤疮相关菌群生长实验将上清液以10%(v/v)添加量分别加入两种皮肤菌群菌液中，以添加等体积mrs液体培养基为对照，37℃培养16h，以两种菌液相对浓度比值评价对痤疮相关菌群生长影响。计算公式及结果见表5：表5seuneu-116对痤疮相关菌群生长影响结果显示seuneu-116对痤疮丙酸杆菌有显著抑制作用，而促进或不影响表皮葡萄球菌。seuneu-116能够改变痤疮相关菌群比例，从而达到治疗痤疮的目的。
49.实施例7seuneu-116改变菌群比例改善敏感肌的作用1、seuneu-116上清液制备
制备方法参照实施例5。
50.2、敏感肌相关菌群菌液制备将金黄色葡萄球菌cgmcc1.8721和表皮葡萄球菌cgmcc1.4260分别挑取单菌落于bhi液体培养基，37℃培养箱静置培养过夜，检测并以bhi液体培养基稀释调整od
600
=0.2。
51.3、添加上清液影响敏感肌相关菌群生长实验将上清液以10%(v/v)添加量分别加入两种皮肤菌群菌液中，以添加等体积mrs液体培养基为对照，37℃培养16h，以两种菌液相对浓度（od
600
）比值评价对敏感肌相关菌群生长影响。计算公式及结果见表6：表6seuneu-116对敏感肌相关菌群生长影响结果显示seuneu-116对金黄色葡萄球菌有显著抑制作用，而促进或不影响表皮葡萄球菌。seuneu-116能够改变菌群比例，从而有效改善敏感肌菌群比例。
52.实施例8seuneu-116促进阴道乳酸菌增殖的作用1、seuneu-116上清液制备制备方法参照实施例5。
53.2、乳酸菌菌液制备将3种乳酸菌：詹氏乳杆菌atcc25258、加氏乳杆菌cgmcc1.3396、卷曲乳杆菌cicc24879分别用mrs培养基37℃培养18h，检测并调整詹氏乳杆菌菌液od
600
=0.1，加氏乳杆菌菌液与卷曲乳杆菌菌液od
600
=0.2。
54.3、促进乳酸菌增殖实验将灭活上清液以10%（v/v）加入乳酸菌液中，以添加等体积mrs液体培养基为对照，詹氏乳杆菌、卷曲乳杆菌37℃培养4h，加氏乳杆菌37℃培养5h，以促增殖率（测量菌液浓度od
600
）为指标评价灭活上清液对乳酸菌生长的促进作用。计算公式及结果见表7：表7seuneu-116对詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌、卷曲乳杆菌的生长影响
结果显示seuneu-116具有促进阴道乳酸菌增殖的作用，促增殖率29.23%~63.75%。
55.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。