含3,4,5-三取代基苯环的芳杂环化合物、药物组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一类含3,4,5-三取代基苯环的芳杂环化合物、药物组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着居民平均寿命的延长、体检意识的增强、检测水平的提高及生活环境、饮食习惯等因素的改变，恶性肿瘤已经成为全球最为常见的死亡率较高的疾病之一。随着医学的不断发展，目前已衍生出多种治疗方式，如化学药物治疗、内分泌治疗、分子靶向治疗、免疫基因治疗等。
3.微管在细胞生长过程中发挥着一系列的生物功能，包括构成细胞骨架、维持细胞形态、参与物质运输、参与细胞信号转导和调节细胞有丝分裂。尤其是在肿瘤细胞中，细胞有丝分裂比正常细胞更活跃，鉴于微管在细胞生长发育过程中发挥的重要作用，以微管蛋白为靶点治疗癌症已成为一个有效策略。目前已知的微管蛋白结合位点主要有三个：长春碱结合位点、紫杉醇结合位点与秋水仙碱结合位点。大多数与秋水仙碱结合位点结合的微管蛋白抑制剂都含有3,4,5-三甲氧基苯基，它对于药物分子与微管蛋白的结合和活性非常重要。在过去十年间，有许多含有3,4,5-三取代基苯环的微管抑制剂取得了成功，但到目前为止，还没有此类微管抑制剂被fda批准用于癌症的治疗，此类化合物仍然是抗癌药物的一个很有前途的方向。


技术实现要素：

4.为改善上述技术问题，本发明提供了一种式(i)所示的化合物，其消旋体、立体异构体、互变异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或它们药学上可接受的盐：
[0005][0006]
其中，r1、r2、r3、r4、r5相同或不同，彼此独立地选自h、卤素、nh2、oh、烷基、烷氧基；
[0007]
ar选自无取代或任选被一个、两个或更多个ra取代的亚杂芳基、亚烷基-杂芳基；
[0008]
l选自无取代或任选被一个、两个或更多个rb取代的nh、c(o)nh、亚烷基-氨基、亚烷基-氨基-烷基；
[0009]
每个ra、rb相同或不同，彼此独立地选自h、oh、nh2、卤素、烷基、烷氧基、环烷基、杂烷基、芳基、杂芳基。
[0010]
根据本发明的实施方案，r1、r2、r3、r4、r5相同或不同，彼此独立地选自h、卤素、nh2、oh、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基；
[0011]
ar可以选自无取代或任选被一个、两个或更多个ra取代的亚5-14元杂芳基、亚c
1-12
烷基-5-14元杂芳基；
[0012]
l可以选自无取代或任选被一个、两个或更多个rb取代的nh、c(o)nh、亚c
1-12
烷基-nh、亚c
1-12
烷基-nh-c
1-12
烷基；
[0013]
每个ra、rb可以相同或不同，彼此独立地选自h、oh、nh2、卤素、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
3-12
环烷基、3-12元杂环基、c
6-14
芳基、5-14元杂芳基。
[0014]
根据本发明的实施方案，r1、r2、r3可以相同或不同，彼此独立地选自h、卤素、c
1-8
烷氧基；
[0015]
r4、r5可以相同或不同，彼此独立地选自h、卤素、nh2、oh、c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基；
[0016]
ar可以选自亚5-10元杂芳基、亚c
1-8
烷基-5-10元杂芳基；
[0017]
l可以选自nh、c(o)nh、c(o)o、亚c
1-8
烷基-nh、亚c
1-8
烷基-nh-c
1-8
烷基。
[0018]
根据本发明的实施方案，r1、r2、r3可以相同或不同，彼此独立地选自h、f、cl、br、i、甲氧基；
[0019]
r4、r5可以相同或不同，彼此独立地选自h、f、cl、br、i、nh2、oh、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基；
[0020]
ar可以选自亚吡啶基、亚嘧啶基、亚吡嗪基、亚哒嗪基、亚吲哚基、亚吲唑基、亚噻唑基、亚噻二唑基、亚甲基-吲哚基、亚甲基-吲唑基；
[0021]
l可以选自nh、c(o)nh、亚甲基-nh。
[0022]
根据本发明示例性的实施方案，式(i)化合物选自如下结构：
[0023]
[0024][0025]
本发明还提供式(i)所示化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0026][0027]
其中，r1、r2、r3、r4、r5、ar、l独立地具有上文所述的定义，x选自卤素或nh2；
[0028]
化合物i-1与化合物i-2反应得到式(i)所示的化合物；
[0029]
根据本发明的实施方案，所述反应可以在碱作用下进行，所述碱可以为无机碱或有机碱，所述无机碱例如为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、磷酸钾中的至少一种；所述有机碱例如为三乙胺、n,n-二异丙基乙胺、n,n-二甲氨基吡啶中的至少一种；
[0030]
根据本发明的实施方案，所述反应可以在催化剂作用下进行；所述催化剂可以为钯催化剂，例如为醋酸钯；所述催化剂钯催化剂时，反应体系中还可以加入有机配体，例如为(
±
)-2,2'-双-(二苯膦基)-1,1'-联萘(binap)；
[0031]
根据本发明的实施方案，所述反应可以在有机溶剂存在下进行，所述有机溶剂可以例如为n,n-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、二氧六环、四氢呋喃、二氯甲烷中的至少一种。
[0032]
根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括以下方案中的至少一种：
[0033]
方案1：
[0034][0035]
其中，ar具有上文所述的定义，x1和x2选自卤素，r为甲基或h；
[0036]
化合物a1与4-甲基苯基硼酸反应得到化合物a2；
[0037]
化合物a2与3,4,5-三甲氧基苯胺反应得到化合物1-化合物11、化合物17-化合物23。
[0038]
方案2：
[0039][0040]
5-溴-1,3,4-噻二唑-2-胺与4-甲基苯基硼酸反应得到化合物m12；
[0041]
化合物m12与3,4,5-三甲氧基苯甲酸反应得到化合物12。
[0042]
方案3：
[0043]
[0044]
其中，x3选自n或c；
[0045]
化合物c1与4-甲基苄基氯反应得到化合物c2；
[0046]
化合物c2与3,4,5-三甲氧基苯胺反应得到化合物13-化合物15。
[0047]
方案4：
[0048][0049]
化合物6-溴-1h-吲唑与5-溴-1,2,3-三甲氧基苯反应得到化合物m16；
[0050]
化合物m16与4-甲基苯基硼酸反应得到化合物16。
[0051]
方案5：
[0052][0053]
其中，ar具有上文所述的定义；
[0054]
5-溴-2-甲基苯酚与苄氯反应得到苯基硼酸m24-1；
[0055]
中间体m24-1与联硼酸频那醇酯反应得到中间体m24-2；
[0056]
中间体m24-2先与化合物a1反应，得到的产物再与3,4,5-三甲氧基苯胺反应得到中间体e2；
[0057]
中间体e2再脱掉苄基得到化合物24-化合物29。
[0058]
方案6：
[0059][0060]
其中，ar为亚吡啶基或亚嘧啶基，r1、r2、r3具有上文所述的定义；
[0061]
3-硝基-4-甲基苯基硼酸与化合物a1反应，得到的产物再与反应得到中间体m30；
[0062]
中间体m30再还原硝基得到化合物30、32-35、37-39。
[0063]
方案7：
[0064][0065]
其中，r1、r2、r3具有上文所述的定义；
[0066]
3-硝基-4-甲基苯基硼酸与6-溴吲唑反应，得到的产物再与反应得到中间体j；
[0067]
中间体j再还原硝基得到化合物31、36。
[0068]
根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括下列步骤中的至少一步：
[0069]
步骤1：称取200mg化合物a1(1eq.)，与4-甲基苯基硼酸(1.1eq.)、四(三苯基膦)钯(0.05eq.)和碱(na2co3或者k2co3，2eq.)溶于水和thf的混合溶剂中，回流温度下加热过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，冷却至室温。真空除去体系内易挥发溶剂，用乙酸乙酯萃取反应混合物，收集合并的有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体a2。
[0070]
步骤2：当ar为亚吡啶基时，称取醋酸钯(0.04eq.)、binap(0.04eq.)溶于无水甲苯(或者1,4-二氧六环)中，体系在氩气保护下常温搅拌10分钟。然后加入中间体a(1eq.)、3,4,5-三甲氧基苯胺(1.2eq.)与碱(t-buok或者cs2co3，3eq.)，体系在氩气保护下加热回流过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，冷却至室温。用乙酸乙酯萃取反应混合物，收集合并的有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化。
[0071]
步骤3：当ar为亚嘧啶基时，向溶有中间体a2(1eq.)和3,4,5-三甲氧基苯胺(或3,4,5-三甲氧基苄胺，1.2eq.)的etoh与h2o的混合溶剂中缓慢滴加浓盐酸(4eq.)，将体系在回流温度下过夜。随着反应的进行，体系中不断有固体析出。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，冷却至室温，直接过滤得固体，并用冷却的乙醇溶液和dcm交替洗涤固体，干燥。
[0072]
步骤4：向溶有中间体m12(1eq.)的无水dcm溶液中加入3,4,5-三甲氧基苯甲酸(1.2eq.)，edci(1.2eq.)和hobt(1.2eq.)，将混合物加热回流8-10小时。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，冷却至室温。真空除去体系内dcm，用乙酸乙酯萃取反应混合物，收集合并的有机层，并分别用10％hcl溶液，饱和nahco3溶液和水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化。
[0073]
步骤5：将底物(6-溴吲哚或6-溴吲唑，1eq.)溶解在无水dmf中，并将所得混合物冷却至0℃。分批加入60％nah(1.5eq.)，并将所得混合物在室温下搅拌30分钟。然后将反应物冷却至0℃，加入4-甲基氯化苄(1.6eq.)，之后在室温下搅拌过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物。收集合并的有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体c2。
[0074]
步骤6：向6-溴-1h-吲唑(1eq.)、3,4,5-三甲氧基溴苯(1eq.)、n,n
’‑
二甲基乙二胺
(2.5eq.)和k3po4(2.2eq.)的无水dmf溶液中加入cui(2.5eq.)，混合物在80℃加热20小时。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物。收集合并的有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体m16。
[0075]
步骤7：向5-溴-2-甲基苯酚(1)和苄基氯(1.5eq.)的dmf溶液里加入碳酸钾(3eq.)并在室温下搅拌反应混合4小时。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物3次。收集合并的有机层，用饱和食盐水洗涤3次，然后用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体m24-1。
[0076]
步骤8：在氩气保护下，将溶有联硼酸频那醇酯(1.1eq.)、催化剂[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.05eq.)和醋酸钾(4.4eq.)的无水1,4-二氧六环溶液中加入中间体m24-1(1eq.)并在110℃下搅拌反应过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物3次。收集合并的有机层，用饱和食盐水洗涤3次，然后用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体m24-2。
[0077]
步骤9：将中间体e2(1eq.)溶于适量meoh/thf(1:1)中，加入10％钯碳(0.1eq.)，混合物在室温和氢气保护下搅拌过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入dcm稀释体系，用硅藻土过滤除去钯碳，收集滤液，真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化。
[0078]
步骤10：向溶有中间体i或j(1eq.)的乙醇溶液中加入二水合氯化亚锡(5eq.)和几滴浓盐酸，再将反应体系在回流温度下反应过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入适量饱和nahco3溶液调节体系的ph至中性(ph≈7)后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物3次。收集合并的有机层，用饱和食盐水洗涤3次，然后用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化。
[0079]
步骤11：在冰浴温度下，向溶有中间体i或j(1eq.)的乙醇与水的混合溶液中加入锌粉(4eq.)和冰乙酸(4eq.)，再将反应体系在回流温度下反应过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入适量饱和nahco3溶液调节体系的ph至中性(ph≈7)后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物3次。收集合并有机层，用饱和食盐水洗涤3次，然后用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化。
[0080]
本发明还提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的式(i)所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或它们药学上可接受的盐中的至少一种。
[0081]
根据本发明的实施方案，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的辅料。
[0082]
根据本发明的实施方案，所述药物组合物还可以进一步含有一种或多种额外的治疗剂。
[0083]
本发明还提供治疗肿瘤疾病的方法，包括给予患者预防或治疗有效量的式(i)所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或它们药学上可接受的盐中的至少一种。
[0084]
本发明还提供治疗肿瘤疾病的方法，包括给予患者预防或治疗有效量的上述药物组合物。
[0085]
所述肿瘤可以为白血病细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、宫颈癌
细胞、淋巴癌细胞；优选为u937细胞、mcf7乳腺癌细胞、hepg2肝癌细胞、a549肺癌细胞、mgc-803胃癌细胞和hela宫颈癌细胞。
[0086]
在一些实施方案中，所述患者哺乳动物，优选是人。
[0087]
本发明还提供式(i)所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物或它们药学上可接受的盐中的至少一种在制备药物中的用途。
[0088]
根据本发明的实施方案，所述药物为抗肿瘤药物，如微管蛋白抑制剂和/或vegfr-2抑制剂。
[0089]
根据本发明的实施方案，所述肿瘤可以为白血病细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、宫颈癌细胞、淋巴癌细胞；优选为u937细胞、mcf7乳腺癌细胞、hepg2肝癌细胞、a549肺癌细胞、mgc-803胃癌细胞和hela宫颈癌细胞。
[0090]
有益效果
[0091]
本发明提供了一种含3,4,5-三取代基苯环的芳杂环化合物及其制备方法和应用。本发明的化合物对包括但不限于a549(肺癌细胞)、hela(子宫颈癌细胞)、mcf-7(乳腺癌细胞)、mgc-803(胃癌细胞)、hepg2(肝癌细胞)、u937(淋巴瘤细胞、白血病细胞)在内的多种肿瘤具有有明显的抑制作用。通过体外抗增殖活性评价以及微管蛋白和vegfr-2的抑制作用评价，发明人发现本发明的化合物特别是化合物35是较为理想的微管蛋白和vegfr-2双靶点抑制剂。它能通过调控周期相关蛋白(cyclin-b1和p-cdc2蛋白)阻滞细胞周期于g2期，还通过调控凋亡相关蛋白(caspase-3/-7/-9和parp)、降低线粒体膜电位和产生活性氧来诱导细胞凋亡。免疫荧光实验和抑制微管聚合实验表明35可破坏细胞内微管组织并抑制微管蛋白聚合。对vegfr-2激酶活性抑制作用检测实验表明化合物35对vegfr-2有明显的抑制作用。
[0092]
本发明公开的化合物具有较好的生物活性、更高的选择性和更低的毒性。本发明的制备方法可重复性强，稳定性好，实验反应所需条件较简单，且实验环境温和，产率较好，可在较小投入情况下进行大量生产。
[0093]
术语定义与说明
[0094]
除非另有说明，本技术说明书和权利要求书中记载的基团和术语定义，包括其作为实例的定义、示例性的定义、优选的定义、表格中记载的定义、实施例中具体化合物的定义等，可以彼此之间任意组合和结合。这样的组合和结合后的基团定义及化合物结构，应当被理解为本技术说明书和/或权利要求书记载的范围内。
[0095]
除非另有说明，本说明书和权利要求书记载的数值范围相当于至少记载了其中每一个具体的整数数值。例如，数值范围“1-40”相当于记载了数值范围“1-12”中的每一个整数数值即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，以及数值范围“13-40”中的每一个整数数值即13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40。此外，当某些数值范围被定义为“数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点、该范围内的每一个整数以及该范围内的每一个小数。例如，“0～10的数”应当理解为不仅记载了0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的每一个整数，还至少记载了其中每一个整数分别与0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9的和。
[0096]
应当理解，本文在描述一个、两个或更多个中，“更多个”应当是指大于2，例如大于等于3的整数，例如3、4、5、6、7、8、9或10。
[0097]
术语“卤素”表示氟、氯、溴和碘。
[0098]
术语“烷基”应理解为表示具有1～40个碳原子，例如1-20个碳原子的直链或支链饱和烃基。“c
1-12
烷基”应理解为表示具有1～12个碳原子的直链或支链饱和一价烃基。例如，“c
1-10
烷基”表示具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的直链和支链烷基，“c
1-8
烷基”表示具有1、2、3、4、5、6、7、或8个碳原子的直链和支链烷基，“c
1-6
烷基”表示具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链和支链烷基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。
[0099]
术语“环烷基”应理解为表示饱和的单环、二环(如稠环、桥环、螺环)烃环或三环烷烃，其具有3～20个碳原子，优选“c
3-12
环烷基”，更优选优选“c
3-8
环烷基”。“c
3-12
环烷基”应理解为表示饱和的一价单环、二环(如稠环、桥环、螺环)烃环或三环烷烃，其具有3～12个碳原子，优选“c
3-10
环烷基”，更优选优选“c
3-8
环烷基”。术语“c
3-10
环烷基”应理解为表示饱和的一价单环、双环(如桥环、螺环)烃环或三环烷烃，其具有3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。所述c
3-10
环烷基可以是单环烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基或环癸基，或者是双环烃基如龙脑基、吲哚基、六氢吲哚基、四氢萘基、十氢萘基、二环[2.1.1]己基、二环[2.2.1]庚基、二环[2.2.1]庚烯基、6,6-二甲基二环[3.1.1]庚基、2,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚基、二环[2.2.2]辛基、2,7-二氮杂螺[3,5]壬烷基、2,6-二氮杂螺[3,4]辛烷基，或者是三环烃基如金刚烷基。
[0100]
除非另有定义，术语“杂环基”是指饱和或不饱和的非芳族的环或环系，其包含一个或多个独立选自n、o和s的杂原子且总成环原子数为3-20(如原子数为3、4、5、6、7、8、9、10等)。“3-12元杂环基”是指饱和的或不饱和的非芳族的环或环系，例如，其是4-、5-、6-或7-元的单环、7-、8-、9-、10-、11-或12-元的二环(如稠环、桥环、螺环)或者三环环系，并且含有至少一个，例如1、2、3、4、5个或更多个选自o、s和n的杂原子，其中n和s还可以任选被氧化成各种氧化状态，以形成氮氧化物、-s(o)-或-s(o)
2-的状态。优选地，所述杂环基可以选自“3-10元杂环基”。术语“3-10元杂环基”意指饱和的或不饱和的非芳族的环或环系，并且含有至少一个选自o、s和n的杂原子。所述杂环基可以通过所述碳原子中的任一个或氮原子(如果存在的话)与分子的其余部分连接。所述杂环基可以包括稠合的或桥连的环以及螺环的环。特别地，所述杂环基可以包括但不限于：4元环，如氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基；5元环，如四氢呋喃基、二氧杂环戊烯基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基；或6元环，如四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、二噻烷基、硫代吗啉基、哌嗪基或三噻烷基；或7元环，如二氮杂环庚烷基。任选地，所述杂环基可以是苯并稠合的。所述杂环基可以是双环的，例如但不限于5,5元环，如六氢环戊并[c]吡咯-2(1h)-基环，或者5,6元双环，如六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(1h)-基环。杂环基可以是部分不饱和的，即它可以包含一个或多个双键，例如但不限于二氢呋喃基、二氢吡喃基、2,5-二氢-1h-吡咯基、4h-[1,3,4]噻二嗪基、1,2,3,5-四氢噁唑基或4h-[1,4]噻嗪基，或者，它可以是苯并稠合的，例如但不限于二氢异喹啉基。所述3-12元杂环基与其它基团相连构成本发明的化合物时，可以为3-12元杂环基上的碳原子与其它基团相连，也可以为3-12元杂环基环上杂环原子与其它基团相连。例如当3-12元杂环
基选自哌嗪基时，可以为哌嗪基上的氮原子与其它基团相连。或当3-12元杂环基选自哌啶基时，可以为哌啶基环上的氮原子和其对位上的碳原子与其它基团相连。
[0101]
术语“芳基”应理解为优选表示具有6-20个碳原子(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个碳原子)的芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环。“c
6-14
芳基”应理解为优选表示具有6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环(“c
6-14
芳基”)，特别是具有6个碳原子的环(“c6芳基”)，例如苯基；或联苯基，或者是具有9个碳原子的环(“c9芳基”)，例如茚满基或茚基，或者是具有10个碳原子的环(“c
10
芳基”)，例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基，或者是具有13个碳原子的环(“c
13
芳基”)，例如芴基，或者是具有14个碳原子的环(“c
14
芳基”)，例如蒽基。当所述c
6-14
芳基被取代时，其可以为单取代或者多取代。并且，对其取代位点没有限制，例如可以为邻位、对位或间位取代。
[0102]
术语“杂芳基”应理解为包括这样的单环、二环(如稠环、桥环、螺环)或三环芳族环系：其具有5～20个环原子且包含一个或多个(例如1-5个)独立选自n、o和s的杂原子，例如“5-14元杂芳基”。“5-14元杂芳基”应理解为包括这样的一价单环、双环或三环芳族环系：其具有5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个环原子，特别是5或6或9或10个碳原子，且其包含1-5个，优选1-3各独立选自n、o和s的杂原子并且，另外在每一种情况下可为苯并稠合的。“杂芳基”还指其中杂芳族环与一个或多个芳基、脂环族或杂环基环稠合的基团，其中所述连接的根基或点在杂芳族环上。当所述5-14元杂芳基与其它基团相连构成本发明的化合物时，可以为5-14元杂芳基环上的碳原子与其它基团相连，也可以为5-14元杂芳基环上的杂原子与其它基团相连。当所述5-14元杂芳基被取代时，其可以为单取代或者多取代。并且，对其取代位点没有限制，例如可以为杂芳基环上与碳原子相连的氢被取代，或者杂芳基环上与杂原子相连的氢被取代。
[0103]
术语“螺环”是指两个环共用1个成环原子的环系。
[0104]
术语“稠环”是指两个环共用2个成环原子的环系。
[0105]
术语“桥环”是指两个环共用3个以上成环原子的环系。
[0106]
除非另有说明，杂环基、杂芳基或亚杂芳基包括其所有可能的异构形式，例如其位置异构体。因此，对于一些说明性的非限制性实例，可以包括在其1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-位等(如果存在)中的1、2个或更多个位置上取代或与其他基团键合的形式，包括吡啶-2-基、亚吡啶-2-基、吡啶-3-基、亚吡啶-3-基、吡啶-4-基和亚吡啶-4-基；噻吩基或亚噻吩基包括噻吩-2-基、亚噻吩-2-基、噻吩-3-基和亚噻吩-3-基；吡唑-1-基、吡唑-3-基、吡唑-4-基、吡唑-5-基。
[0107]
术语“亚*基”表示有两个键被取代的二价基团。
具体实施方式
[0108]
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0109]
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
[0110]
本发明的制备方法概括如下：
[0111]
步骤1：称取200mg双卤素取代的吡啶或嘧啶底物(1eq.)，与4-甲基苯基硼酸(1.1eq.)、四(三苯基膦)钯(0.05eq.)和相应的碱(na2co3或者k2co3，2eq.)溶于水和thf的混合溶剂中，回流温度下加热过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，冷却至室温。真空除去体系内易挥发溶剂，用乙酸乙酯萃取反应混合物，收集合并的有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体a2。
[0112]
步骤2：当ar为吡啶环时，称取醋酸钯(0.04eq.)、binap(0.04eq.)溶于无水甲苯(或者1,4-二氧六环)中，体系在氩气保护下常温搅拌10分钟。然后加入中间体a2(1eq.)、3,4,5-三甲氧基苯胺(1.2eq.)与相应的碱(t-buok或者cs2co3，3eq.)，体系在氩气保护下加热回流过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，冷却至室温。用乙酸乙酯萃取反应混合物，收集合并的有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到目标化合物1、4、5、7、8、10、11、17-21。
[0113]
步骤3：当ar为嘧啶环时，向溶有中间体a(1eq.)和3,4,5-三甲氧基苯胺(或3,4,5-三甲氧基苄胺，1.2eq.)的etoh与h2o的混合溶剂中缓慢滴加浓盐酸(4eq.)，将体系在回流温度下过夜。随着反应的进行，体系中不断有固体析出。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，冷却至室温，直接过滤得固体，并用冷却的乙醇溶液和dcm交替洗涤固体，干燥，得到目标化合物2、3、6、9、22、23。
[0114]
步骤4：向溶有中间体m12(1eq.)的无水dcm溶液中加入3,4,5-三甲氧基苯甲酸(1.2eq.)，edci(1.2eq.)和hobt(1.2eq.)，将混合物加热回流8-10小时。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，冷却至室温。真空除去体系内dcm，用乙酸乙酯萃取反应混合物，收集合并的有机层，并分别用10％hcl溶液，饱和nahco3溶液和水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到目标化合物12。
[0115]
步骤5：将底物(6-溴吲哚或6-溴吲唑，1eq.)溶解在无水dmf中，并将所得混合物冷却至0℃。分批加入60％nah(1.5eq.)，并将所得混合物在室温下搅拌30分钟。然后将反应物冷却至0℃，加入4-甲基氯化苄(1.6eq.)，之后在室温下搅拌过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物。收集合并的有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体c2。
[0116]
步骤6：向6-溴-1h-吲唑(1eq.)、3,4,5-三甲氧基溴苯(1eq.)、n,n
’‑
二甲基乙二胺(2.5eq.)和k3po4(2.2eq.)的无水dmf溶液中加入cui(2.5eq.)，混合物在80℃加热20小时。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物。收集合并的有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体m16。
[0117]
步骤7：向5-溴-2-甲基苯酚(1)和苄基氯(1.5eq.)的dmf溶液里加入碳酸钾(3eq.)并在室温下搅拌反应混合4小时。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物3次。收集合并的有机层，用饱和食盐水洗涤3次，然后用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体m24-1。
[0118]
步骤8：在氩气保护下，将溶有联硼酸频那醇酯(1.1eq.)、催化剂[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.05eq.)和醋酸钾(4.4eq.)的无水1,4-二氧六环溶液中加入中间体m24-1(1eq.)并在110℃下搅拌反应过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入大
量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物3次。收集合并的有机层，用饱和食盐水洗涤3次，然后用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体m24-2。
[0119]
步骤9：将中间体e2(1eq.)溶于适量meoh/thf(1:1)中，加入10％钯碳(0.1eq.)，混合物在室温和氢气保护下搅拌过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入dcm稀释体系，用硅藻土过滤除去钯碳，收集滤液，真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物24-29。
[0120]
步骤10：向溶有中间体i或j(1eq.)的乙醇溶液中加入二水合氯化亚锡(5eq.)和几滴浓盐酸，再将反应体系在回流温度下反应过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入适量饱和nahco3溶液调节体系的ph至中性(ph≈7)后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物3次。收集合并的有机层，用饱和食盐水洗涤3次，然后用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物30-39。
[0121]
步骤11：在冰浴温度下，向溶有中间体i或j(1eq.)的乙醇与水的混合溶液中加入锌粉(4eq.)和冰乙酸(4eq.)，再将反应体系在回流温度下反应过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入适量饱和nahco3溶液调节体系的ph至中性(ph≈7)后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物3次。收集合并有机层，用饱和食盐水洗涤3次，然后用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物30-39。
[0122]
实施例1：
[0123]
化合物1的制备
[0124][0125]
步骤1：称取200mg 2-氯-5-溴吡啶(1eq.)，与4-甲基苯基硼酸(1.1eq.)、四(三苯基膦)钯(0.05eq.)和相应的碱(na2co3，2eq.)溶于水和thf的混合溶剂中，回流温度下加热过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，冷却至室温。真空除去体系内易挥发溶剂，用乙酸乙酯萃取反应混合物，收集合并的有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体m1。
[0126]
步骤2：称取醋酸钯(0.04eq.)、binap(0.04eq.)溶于无水甲苯(或者1,4-二氧六环)中，体系在氩气保护下常温搅拌10分钟。然后加入中间体m1(1eq.)、3,4,5-三甲氧基苯胺(1.2eq.)与相应的碱(cs2co3，3eq.)，体系在氩气保护下加热回流过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，冷却至室温。用乙酸乙酯萃取反应混合物，收集合并的有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到目标化合物1。
[0127]
红棕色固体，收率61％；m.p.155.1-157.7℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.44(d,j＝2.3hz,1h),7.72(dd,j＝8.6,2.4hz,1h),7.43(d,j＝8.0hz,2h),7.25(d,j＝8.3hz,2h),6.90(d,j＝8.6hz,1h),6.63(s,3h),3.85(d,j＝6.7hz,9h),2.39(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ155.35,153.72,146.41,136.86,136.47,136.22,135.17,129.67,126.13,108.18,98.82,61.0,56.16,21.09.
[0128]
实施例2：
[0129]
化合物2的制备
[0130][0131]
步骤1：称取200mg 5-溴-2-氯嘧啶(1eq.)，与4-甲基苯基硼酸(1.1eq.)、四(三苯基膦)钯(0.05eq.)和相应的碱(na2co3，2eq.)溶于水和thf的混合溶剂中，回流温度下加热过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，冷却至室温。真空除去体系内易挥发溶剂，用乙酸乙酯萃取反应混合物，收集合并的有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体m2。
[0132]
步骤2：向溶有中间体m2(1eq.)和3,4,5-三甲氧基苯胺(1.2eq.)的etoh与h2o的混合溶剂中缓慢滴加浓盐酸(4eq.)，将体系在回流温度下过夜。随着反应的进行，体系中不断有固体析出。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，冷却至室温，直接过滤得固体，并用冷却的乙醇溶液和dcm交替洗涤固体，干燥，得到目标化合物2.白色固体，收率75％；m.p.183.6-185.7℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.65(s,2h),7.46(s,1h),7.41(d,j＝8.1hz,2h),7.30
–
7.26(m,2h),6.96(s,2h),3.89(s,6h),3.84(s,3h),2.40(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ155.92,153.41,129.93,125.89,97.53,56.14,21.13.
[0133]
实施例3：
[0134]
化合物3的制备
[0135][0136]
制备方法参考实施例2，区别在于将3,4,5-三甲氧基苯胺替换为3,4,5-三甲氧基苄胺。白色固体，收率42％；m.p.152.0-154.4℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.52(s,2h),7.37(d,j＝8.1hz,2h),7.25(d,j＝6.4hz,2h),6.61(s,2h),5.68(t,j＝5.5hz,1h),4.63(d,j＝5.9hz,2h),3.84(d,j＝7.2hz,9h),2.39(s,3h),1.71(s,2h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ161.44,156.10,153.41,134.79,132.48,129.85,125.71,124.12,104.45,60.82,56.10,45.92,21.11.
[0137]
实施例4：
[0138]
化合物4的制备
[0139][0140]
制备方法参考实施例1，区别在于将2-氯-5-溴吡啶替换为3-溴-2-氯吡啶。黄色固体，收率52％；m.p.109.8-112.0℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.21(dd,j＝5.0,1.9hz,1h),7.40(dd,j＝7.3,1.9hz,1h),7.34(q,j＝8.1hz,4h),6.82(dd,j＝7.3,5.0hz,1h),6.79(s,
2h),6.44(s,1h),3.84(s,6h),3.80(s,3h),2.44(s,3h)；
13
cnmr(101mhz,cdcl3)δ153.26,152.78,146.53,138.10,137.94,136.62,134.38,130.09,128.92,123.70,115.01,97.57,60.94,56.08,21.26.
[0141]
实施例5：
[0142]
化合物5的制备
[0143][0144]
制备方法参考实施例1，区别在于将2-氯-5-溴吡啶替换为2-溴-3-氯吡啶。黑棕色固体，收率55％；m.p.142.3-144.6℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.24(dd,j＝4.6,1.3hz,1h),7.58(d,j＝8.2hz,3h),7.29(d,j＝7.9hz,2h),7.13(dd,j＝8.3,4.6hz,1h),6.29(s,2h),5.70(s,1h),3.82(s,3h),3.80(s,6h),2.41(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ153.97,148.16,141.40,138.48,138.17,133.63,129.64,128.63,123.52,122.59,97.46,61.01,56.11,21.34.
[0145]
实施例6：
[0146]
化合物6的制备
[0147][0148]
制备方法参考实施例2，区别在于将5-溴-2-氯嘧啶替换为2,4-二氯嘧啶。黄色固体，收率70％；m.p.176.6-178.2℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.73(s,1h),8.32(d,j＝6.1hz,1h),8.05(d,j＝8.3hz,2h),7.35(d,j＝8.1hz,2h),7.25(d,j＝6.1hz,1h),7.04(s,2h),3.90(s,6h),3.86(s,3h),2.46(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ153.34,135.12,132.97,131.77,130.09,128.07,106.61,98.73,61.04,56.20,21.70.
[0149]
实施例7：
[0150]
化合物7的制备
[0151][0152]
制备方法参考实施例1，区别在于将2-氯-5-溴吡啶替换为2-溴-6-氯吡啶。黑青色固体，收率80％；m.p.174.7-176.0℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.92(d,j＝8.2hz,2h),7.55(t,j＝7.9hz,1h),7.25(d,j＝8.8hz,3h),7.18(d,j＝7.5hz,1h),6.81(s,2h),6.69(d,j＝
8.2hz,1h),6.52(s,1h),3.86(d,j＝11.7hz,9h),2.40(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ155.67,153.55,139.00,138.58,136.61,133.71,129.32,126.68,111.16,107.16,98.12,61.03,56.11,29.70,21.28.
[0153]
实施例8：
[0154]
化合物8的制备
[0155][0156]
制备方法参考实施例1，区别在于将2-氯-5-溴吡啶替换为2-溴-4-氯吡啶。黑棕色固体，收率75％；m.p.97.5-100.7℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.37(d,j＝5.6hz,1h),7.83
–
7.77(m,2h),7.25(d,j＝9.0hz,3h),7.18(d,j＝2.2hz,1h),6.73(dd,j＝5.7,2.3hz,1h),6.47(s,2h),6.06(s,1h),3.87(s,3h),3.84(s,6h),2.39(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ158.39,153.83,151.80,150.09,138.81,136.84,135.81,134.81,129.35,126.71,107.91,106.15,99.88,92.65,61.02,56.14,21.24.
[0157]
实施例9：
[0158]
化合物9的制备
[0159][0160]
制备方法参考实施例2，区别在于将5-溴-2-氯嘧啶替换为4,6-二氯嘧啶。黄色固体，收率63％；m.p.193.8-197.4℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ10.58(s,1h),8.65(s,1h),7.78(d,j＝8.2hz,2h),7.45(s,1h),7.16(d,j＝8.0hz,2h),6.99(s,2h),3.86(s,3h),3.84(s,6h),2.29(s,3h).
[0161]
实施例10：
[0162]
化合物10的制备
[0163][0164]
制备方法参考实施例1，区别在于将2-氯-5-溴吡啶替换为4-溴-2-氯吡啶。白色固体，收率93％；m.p.164.1-167.7℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.22(d,j＝5.3hz,1h),7.47(d,j＝8.1hz,2h),7.26(d,j＝7.9hz,2h),7.02(s,1h),6.96(dd,j＝5.3,1.5hz,1h),6.65(d,j
＝2.5hz,3h),3.85(d,j＝2.1hz,9h),2.40(s,3h).；
13
cnmr(101mhz,cdcl3)δ156.96,153.70,148.64,139.01,136.53,129.69,126.69,113.37,105.73,99.00,61.03,56.16,21.21.
[0165]
实施例11：
[0166]
化合物11的制备
[0167][0168]
制备方法参考实施例1，区别在于将2-氯-5-溴吡啶替换为3-溴-5-氯吡啶。白色固体，收率80％；m.p.163.0-165.8℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.43(d,j＝2.7hz,1h),7.82(d,j＝8.1hz,2h),7.58(d,j＝8.6hz,1h),7.41(dd,j＝8.6,2.8hz,1h),7.24(d,j＝8.1hz,2h),6.32(s,2h),6.05
–
5.96(m,1h),3.82(s,3h),3.78(s,6h),2.38(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ153.95,149.66,139.37,138.79,138.34,137.95,136.38,133.26,129.45,126.01,124.26,120.41,96.44,61.06,56.08,21.21.
[0169]
实施例12：
[0170]
化合物12的制备
[0171][0172]
按照实施例1中步骤1制备中间体m12，区别在于将2-氯-5-溴吡啶替换为5-溴-1,3,4-噻二唑。向溶有中间体m12(1eq.)的无水dcm溶液中加入3,4,5-三甲氧基苯甲酸(1.2eq.)，edci(1.2eq.)和hobt(1.2eq.)，将混合物加热回流8-10小时。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，冷却至室温。真空除去体系内dcm，用乙酸乙酯萃取反应混合物，收集合并的有机层，并分别用10％hcl溶液，饱和nahco3溶液和水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到目标化合物12，白色固体，收率63％；m.p.245.2-247.2℃；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.07(d,j＝4.5hz,1h),7.91
–
7.81(m,2h),7.53(s,2h),7.36(d,j＝8.0hz,2h),3.89(s,6h),3.76(s,3h),2.45
–
2.35(m,3h)；
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ152.74,129.87,126.81,126.20,105.96,60.13,56.12,20.95.
[0173]
实施例13：
[0174]
化合物13的制备
[0175][0176]
将底物6-溴吲唑(1eq.)溶解在无水dmf中，并将所得混合物冷却至0℃。分批加入60％nah(1.5eq.)，并将所得混合物在室温下搅拌30分钟。然后将反应物冷却至0℃，加入4-甲基氯化苄(1.6eq.)，之后在室温下搅拌过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物。收集合并的有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体m13。按照实施例1步骤2方法得目标化合物13，区别在于将中间体m1替换为中间体m13。化合物13为黄色油状液体，收率47％；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.75(s,1h),7.50(d,j＝8.9hz,1h),7.18(q,j＝8.1hz,4h),6.84
–
6.78(m,1h),6.38(s,2h),5.93(s,1h),5.69(s,1h),5.48(s,2h),3.82(s,3h),3.81(s,6h),2.34(s,3h).
[0177]
实施例14：
[0178]
化合物14的制备
[0179][0180]
制备方法参考实施例13，区别在于将6-溴吲唑替换为6-溴吲哚。深棕色油状液，收率43％；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.54(d,j＝8.4hz,1h),7.11
–
7.03(m,4h),6.96(d,j＝8.0hz,2h),6.85(dd,j＝8.4,1.8hz,1h),6.49(d,j＝3.1hz,1h),6.21(s,2h),5.60(s,1h),5.20(s,2h),3.78(s,3h),3.66(s,6h),2.30(s,3h)；
13
cnmr(101mhz,cdcl3)δ153.85,141.29,137.90,137.21,137.05,134.59,131.54,129.44,127.87,126.51,124.28,121.68,114.33,101.61,100.23,93.91,61.11,55.85,49.75,21.11.
[0181]
实施例15：
[0182]
化合物15的制备
[0183][0184]
制备方法参考实施例13。白色固体，收率52％；m.p.119.0-121.0℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.90(d,j＝0.9hz,1h),7.57(d,j＝8.6hz,1h),7.08
–
6.99(m,4h),6.92(s,1h),6.79(dd,j＝8.6,1.8hz,1h),6.31(s,2h),5.89(s,1h),5.42(s,2h),3.82(s,3h),
3.69(s,6h),2.28(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ153.83,142.94,140.79,138.78,133.97,133.20,129.32,126.88,122.02,119.28,114.48,96.66,94.25,61.02,55.91,52.45,21.03.
[0185]
实施例16：
[0186]
化合物16的制备
[0187][0188]
步骤1：向6-溴-1h-吲唑(1eq.)、3,4,5-三甲氧基溴苯(1eq.)、n,n
’‑
二甲基乙二胺(2.5eq.)和k3po4(2.2eq.)的无水dmf溶液中加入cui(2.5eq.)，混合物在80℃加热20小时。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物。收集合并的有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体m16。
[0189]
步骤2：按照实施例1步骤2可得到化合物16，区别在于将中间体m1替换为m16。化合物16为白色固体，收率57％；m.p.106.8-108.0℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.19(s,1h),7.88
–
7.81(m,2h),7.54(d,j＝8.1hz,2h),7.48(dd,j＝8.4,1.3hz,1h),7.32
–
7.24(m,2h),6.96(s,2h),3.92(d,j＝1.8hz,9h),2.41(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ153.81,140.79,139.63,137.53,137.01,135.93,135.02,129.65,127.41,121.80,121.49,108.17,101.04,61.05,56.39,21.11.
[0190]
实施例17：
[0191]
化合物17的制备
[0192][0193]
按照实施例步骤1可得到中间体m17，区别在于将4-甲基苯基硼酸替换为苯基硼酸，将2-氯-5-溴吡啶替换为2-溴-6-氯吡啶。按实施例1步骤2得到目标化合物17。白色固体，收率51％；m.p.128.7-131.3℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.06
–
7.99(m,2h),7.57(t,j＝7.9hz,1h),7.49
–
7.35(m,3h),7.20(d,j＝7.5hz,1h),6.81(s,2h),6.73(t,j＝9.8hz,2h),3.86(s,6h),3.84(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ155.78,155.55,153.55,139.10,138.58,136.62,133.73,128.95,128.59,126.81,111.46,107.53,98.13,61.04,56.11.
[0194]
实施例18：
[0195]
化合物18的制备
[0196][0197]
制备方法参考实施例17，区别在于将将2-溴-6-氯吡啶替换为5-溴-2-氯吡啶。棕色固体，收率47％；m.p.146.9-148.5℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.44(d,j＝2.1hz,1h),7.75(dd,j＝8.7,2.5hz,1h),7.53(dt,j＝8.1,1.7hz,2h),7.45(t,j＝7.7hz,2h),7.37
–
7.32(m,1h),6.92(d,j＝8.7hz,1h),6.77(s,1h),6.64(s,2h),3.87(s,6h),3.85(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ155.19,153.76,144.96,137.58,137.20,135.73,134.55,129.05,128.01,127.30,126.26,108.61,99.27,61.04,56.18.
[0198]
实施例19：
[0199]
化合物19的制备
[0200][0201]
制备方法参考实施例17，将2-溴-6-氯吡啶替换为4-溴-2-氯吡啶。白色固体，收率48％；m.p.134.5-137.8℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.17(d,j＝5.3hz,1h),7.53
–
7.45(m,2h),7.42
–
7.29(m,3h),6.96(s,1h),6.89(dd,j＝5.3,1.5hz,2h),6.58(s,2h),3.77(s,9h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ157.05,153.72,150.35,148.67,138.73,136.51,134.22,128.98,126.86,113.47,106.03,99.07,61.01,56.16,29.70.
[0202]
实施例20：
[0203]
化合物20的制备
[0204][0205]
制备方法参考实施例17，将2-溴-6-氯吡啶替换为2-溴-4-氯吡啶。棕色固体，收率46％；m.p.43.5-48.3℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.35(d,j＝5.7hz,1h),7.87(d,j＝7.7hz,2h),7.40(dt,j＝12.1,6.6hz,3h),7.20(d,j＝2.1hz,1h),6.77(dd,j＝5.7,2.2hz,2h),6.44(s,2h),3.86(s,3h),3.83
–
3.78(m,6h).
[0206]
实施例21：
[0207]
化合物21的制备
[0208][0209]
制备方法参考实施例17，将2-溴-6-氯吡啶替换为3-溴-5-氯吡啶。白色固体，收率43％；m.p.157.6-159.2℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.36(dd,j＝4.4,2.1hz,2h),7.54(dt,j＝3.9,1.9hz,3h),7.49
–
7.37(m,3h),6.40(s,2h),5.98(s,1h),3.84(s,3h),3.82(s,6h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ153.98,140.90,137.73,137.56,137.34,133.71,129.08,128.30,127.07,121.57,97.30,61.07,56.13.
[0210]
实施例22：
[0211]
化合物22的制备
[0212][0213]
制备方法参考实施例2，区别在于将4-甲基苯基硼酸替换为苯基硼酸，将5-溴-2-氯嘧啶替换为4,6-二氯嘧啶。白色固体，收率63％；m.p.175.1-179.1℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.78
–
8.72(m,1h),8.14(s,1h),7.97
–
7.90(m,2h),7.49
–
7.39(m,3h),7.09(s,1h),6.69(s,2h),3.88(s,3h),3.86(s,6h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ163.51,162.04,158.66,153.76,143.19,137.34,135.19,134.44,130.42,128.82,126.84,100.35,92.55,61.07,61.02,56.19,55.84.
[0214]
实施例23：
[0215]
化合物23的制备
[0216][0217]
制备方法参考实施例22，将4,6-二氯嘧啶替换为2,4-二氯嘧啶。白色固体，收率67％；m.p.131.7-1337.7℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.47(d,j＝5.2hz,1h),8.10(dd,j＝7.4,2.3hz,2h),7.54
–
7.44(m,3h),7.28(s,2h),7.17(d,j＝5.2hz,1h),7.07(s,2h),3.91(s,6h),3.84(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ164.85,160.26,158.62,153.30,137.13,135.88,133.35,130.89,128.79,127.06,108.34,96.95,61.05,56.08.
[0218]
实施例24：
[0219]
化合物24的制备
[0220][0221]
步骤1：向5-溴-2-甲基苯酚(1eq.)和苄基氯(1.5eq.)的dmf溶液里加入碳酸钾(3eq.)并在室温下搅拌反应混合4小时。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物3次。收集合并的有机层，用饱和食盐水洗涤3次，然后用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体m24-1。
[0222]
步骤2：在氩气保护下，将溶有联硼酸频那醇酯(1.1eq.)、催化剂[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.05eq.)和醋酸钾(4.4eq.)的无水1,4-二氧六环溶液中加入中间体m24-1(1eq.)并在110℃下搅拌反应过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物3次。收集合并的有机层，用饱和食盐水洗涤3次，然后用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到中间体m24-2。
[0223]
步骤3：参照实施例7得到中间体m24-3，区别在于将4-甲基苯基硼酸替换为中间体m24-2。
[0224]
步骤4：将中间体m24-3(1eq.)溶于适量meoh/thf(1:1)中，加入10％钯碳(0.1eq.)，混合物在室温和氢气保护下搅拌过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入dcm稀释体系，用硅藻土过滤除去钯碳，收集滤液，真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物24.棕色固体，收率67％；m.p.117.2-120.5℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.56
–
7.50(m,2h),7.43(dd,j＝7.8,1.6hz,1h),7.17(d,j＝7.9hz,1h),7.12(d,j＝7.4hz,1h),6.74(s,2h),6.70(d,j＝8.1hz,1h),6.61(s,1h),3.85(s,6h),3.84(s,3h),2.28(s,3h).
[0225]
实施例25：
[0226]
化合物25的制备
[0227][0228]
制备方法参考实施例6得到中间体m25-3，区别在于将将4-甲基苯基硼酸替换为中间体m24-2，参照实施例24步骤4制备得到化合物25，区别在于将m24-3替换为中间体m25-3。白色固体，收率73％；m.p.154.7-157.9℃；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.91(s,1h),9.56(s,1h),8.48(s,1h),8.26(s,1h),7.07(d,j＝7.6hz,1h),6.79(d,j＝1.8hz,1h),6.69(d,j＝7.5hz,1h),6.61(s,2h),3.78(s,6h),3.65(s,3h),2.10(s,3h).
[0229]
实施例26：
[0230]
化合物26的制备
[0231]
制备方法参考实施例24，区别在于将2-溴-6-氯吡啶替换为2-溴-4-氯吡啶。粉白色固体，收率76％；m.p.99.7-101.2℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.23(d,j＝5.8hz,1h),7.54
–
7.48(m,1h),7.11
–
7.01(m,2h),6.91(d,j＝2.2hz,1h),6.69(dd,j＝5.8,2.3hz,1h),6.55(s,1h),6.39(s,2h),3.85(s,3h),3.76(s,6h),2.18(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ158.50,155.42,153.78,152.11,149.27,138.08,135.56,134.74,131.07,126.08,118.17,114.30,107.72,107.06,99.72,61.03,56.08,15.99.
[0232]
实施例27：
[0233]
化合物27的制备
[0234]
制备方法参考实施例24，区别在于将2-溴-6-氯吡啶替换为3-溴-5-氯吡啶。白色固体，收率78％；m.p.214.2-217.0℃；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.53(s,1h),8.37(s,1h),8.29(d,j＝2.5hz,1h),8.21(d,j＝1.8hz,1h),7.57
–
7.50(m,1h),7.16(d,j＝7.7hz,1h),7.03
–
6.97(m,2h),6.45(s,2h),3.76(s,6h),3.63(s,3h),2.15(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ156.33,153.91,141.08,138.74,138.34,137.64,136.39,132.50,131.74,124.54,119.52,117.68,113.03,96.35,60.61,56.20,16.19.
[0235]
实施例28：
[0236]
化合物28的制备
[0237]
制备方法参考实施例24，区别在于将2-溴-6-氯吡啶替换为4-溴-2-氯吡啶。粉棕色固体，收率73％；m.p.199.0-202.6℃；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.61(s,1h),9.05(s,1h),8.18(d,j＝5.3hz,1h),7.19(d,j＝7.8hz,1h),7.09(d,j＝6.1hz,3h),7.03(dd,j＝7.7,1.7hz,1h),6.98(s,1h),6.92(dd,j＝5.4,1.5hz,1h),3.78(s,6h),3.63(s,3h),2.17(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ156.62,155.85,152.75,148.37,147.87,137.90,136.50,131.67,131.21,125.07,116.95,112.29,111.91,107.11,96.15,60.11,55.67,
15.75.
[0238]
实施例29：
[0239]
化合物29的制备
[0240]
制备方法参考实施例25，区别在于将2,4-二氯嘧啶替换为4,6-二氯嘧啶。白色固体，收率68％；m.p.172.2-173.7℃；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.74(s,2h),8.66(d,j＝0.9hz,1h),7.54(d,j＝1.6hz,1h),7.36(dd,j＝7.8,1.6hz,1h),7.19(d,j＝7.8hz,2h),7.11(s,2h),3.79(s,6h),3.64(s,3h),2.18(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ161.52,161.47,158.57,156.24,153.26,136.47,136.01,133.40,131.40,127.10,117.30,112.80,101.63,98.34,60.61,56.26,16.42.
[0241]
实施例30：
[0242]
化合物30的制备
[0243][0244]
步骤1：制备方法参考实施例1，区别在于将4-甲基苯基硼酸替换为3-硝基-4-甲基苯基硼酸，得到中间体m30。
[0245]
步骤2：向溶有中间体m30(1eq.)的乙醇溶液中加入二水合氯化亚锡(5eq.)和几滴浓盐酸，再将反应体系在回流温度下反应过夜。通过tlc监测反应，待原料反应完全后，加入适量饱和nahco3溶液调节体系的ph至中性(ph≈7)后，加入大量h2o，用乙酸乙酯萃取反应混合物3次。收集合并的有机层，用饱和食盐水洗涤3次，然后用无水硫酸镁干燥，过滤并真空除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物30.棕色固体，收率86％；m.p.154.6-159℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.41(d,j＝2.0hz,1h),7.69(dd,j＝8.6,2.4hz,1h),7.11(d,j＝7.7hz,1h),6.90
–
6.82(m,3h),6.67(s,1h),6.62(s,2h),3.85(s,6h),3.84(s,3h),3.70(s,2h),2.20(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ155.25,153.71,146.09,145.04,136.38,131.05,128.32,121.39,116.61,112.60,108.17,98.82,61.02,56.15,17.06.
[0246]
实施例31：
[0247]
化合物31的制备
[0248]
制备方法参考实施例16步骤1得到中间体m31，区别在于将4-甲基苯基硼酸替换为3-硝基-4-甲基苯基硼酸。再参考实施例30步骤2得到化合物30，红棕色油状液体，收率46％；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.19(d,j＝0.8hz,1h),7.86
–
7.79(m,2h),7.46(dd,j＝8.4,1.4hz,1h),7.15(d,j＝7.7hz,1h),6.95(s,3h),6.34(d,j＝3.9hz,1h),6.19(s,1h),3.92(s,9h),2.23(s,3h).
[0249]
实施例32：
[0250]
化合物32的制备
[0251]
制备方法参考实施例30，将区别在于将2-氯-5-溴吡啶替换为2-溴-6-氯吡啶。灰色固体，收率72％；m.p.160.9-162.4℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.48(t,j＝7.9hz,1h),7.39
–
7.31(m,2h),7.09(dd,j＝13.6,7.6hz,2h),7.05(s,1h),6.75(s,2h),6.67(d,j＝8.2hz,1h),3.82(s,3h),3.78(s,6h),3.64(s,2h),2.16(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ155.83,153.43,144.94,138.27,137.25,133.10,130.65,123.31,117.10,113.21,111.19,107.34,97.60,61.05,56.02,17.25.
[0252]
实施例33：
[0253]
化合物33的制备
[0254]
制备方法参考实施例30，将区别在于将2-氯-5-溴吡啶替换为4-溴-2-氯吡啶。橘色固体，收率44％；m.p.137.5-139.6℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.19(d,j＝5.3hz,1h),7.37(s,1h),7.09(d,j＝7.8hz,1h),7.00(s,1h),6.90(dq,j＝5.4,1.6hz,2h),6.84(d,j＝1.7hz,1h),6.65(s,2h),3.84(s,3h),3.81(s,6h),2.17(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ157.08,153.64,150.48,148.42,145.15,137.48,136.91,133.82,131.01,123.29,116.93,113.29,112.99,105.94,98.75,61.03,56.10,17.20.
[0255]
实施例34：
[0256]
化合物34的制备
[0257]
制备方法参考实施例30，将区别在于将2-氯-5-溴吡啶替换为4,6-二氯嘧啶。白色固体，收率40％；m.p.153.7-155.6℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.71(d,j＝1.0hz,1h),7.71(s,1h),7.34(d,j＝1.6hz,1h),7.20(dd,j＝7.8,1.7hz,1h),7.11(d,j＝7.8hz,1h),7.03(d,j＝1.0hz,1h),6.65(s,2h),3.88(s,3h),3.86(s,6h),2.20(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ163.81,161.95,158.57,153.82,145.08,136.09,135.49,134.19,130.84,125.06,116.89,113.11,100.72,99.42,61.03,56.24,29.70,17.34.
[0258]
实施例35：
[0259]
化合物35的制备
[0260]
制备方法参考实施例30，将区别在于将2-氯-5-溴吡啶替换为2,4-二氯嘧啶。黄色固体，收率78％；m.p.196.3-197.8℃；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.80(s,1h),8.59(d,j＝5.3hz,1h),8.20(d,j＝1.5hz,1h),8.09(dd,j＝8.0,1.6hz,1h),7.53(d,j＝8.2hz,1h),7.33(d,j＝5.3hz,1h),7.25(s,2h),3.79(s,6h),3.64(s,3h),2.45(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ164.55,157.93,141.29,140.92,140.25,137.74,137.23,137.14,131.46,126.65,112.85,102.25,65.35,60.95,22.40.
[0261]
实施例36：
[0262]
化合物36的制备
[0263]
制备方法参考实施例31，将区别在于将3,4,5-三甲氧基苯胺替换为3,4,5-三氟苯胺。白色固体，收率64％；m.p.123.5-126.2℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.22(d,j＝0.9hz,1h),7.86
–
7.83(m,2h),7.53
–
7.46(m,3h),7.19(d,j＝7.5hz,1h),7.03
–
6.97(m,2h),3.84(s,2h),2.27(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ145.02,142.04,139.89,139.16,136.48,131.06,124.73,122.57,122.25,121.66,117.98,113.92,107.77,106.98,106.91,106.81,106.73,17.12.
[0264]
实施例37：
[0265]
化合物37的制备
[0266]
制备方法参考实施例35，区别在于将3,4,5-三甲氧基苯胺替换为苯胺。白色固体，收率76％；m.p.168.2-170.1℃；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.60(s,1h),8.48(d,j＝5.2hz,1h),7.86(dt,j＝8.8,1.6hz,2h),7.41(d,j＝1.8hz,1h),7.36
–
7.29(m,2h),7.27(dd,j＝7.7,1.8hz,1h),7.20(d,j＝5.3hz,1h),7.09(d,j＝8.2hz,1h),6.95(tt,j＝7.5,1.1hz,1h),5.08(s,2h),2.13(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ164.97,160.56,158.94,147.41,141.21,135.54,130.83,128.99,124.85,121.57,119.16,115.35,112.45,108.09,17.95.
[0267]
实施例38：
[0268]
化合物38的制备制备方法参考实施例33，区别在于将3,4,5-三甲氧基苯胺替换为苯胺。棕色固体，收率73％；m.p.116.3-119.4℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.26(dd,j＝5.3,0.7hz,1h),7.43
–
7.35(m,5h),7.14(d,j＝7.7hz,1h),7.11(dd,j＝1.5,0.8hz,1h),7.11
–
7.06(m,1h),6.98
–
6.94(m,2h),6.89(d,j＝1.8hz,1h),3.74(s,2h),2.23(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ156.69,150.59,148.53,145.10,140.81,137.66,131.02,129.40,123.28,122.73,120.47,117.16,113.61,113.14,105.80,17.24.
[0269]
实施例39：
[0270]
化合物39的制备
[0271]
制备方法参考实施例35，区别在于将3,4,5-三甲氧基苯胺替换为3,4,5-三氟苯胺。白色固体，收率78％；m.p.217.6-221.0℃；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.02(s,1h),8.55(d,j＝5.3hz,1h),7.81(dd,j＝11.2,6.5hz,2h),7.36(d,j＝1.6hz,1h),7.30(d,j＝5.3hz,1h),7.25(dd,j＝7.6,1.7hz,1h),7.10(d,j＝7.9hz,1h),5.08(s,2h),2.13(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ165.33,159.94,158.99,147.51,135.25,130.90,125.11,115.32,112.49,109.36,102.79,102.54,17.94.
[0272]
实施例40：
[0273]
采取srb法和cck-8法来测试目标化合物的抗肿瘤增殖抑制活性。其中a549(肺癌细胞)、hela(子宫颈癌细胞)、mcf-7(乳腺癌细胞)、mgc-803(胃癌细胞)、hepg2(肝癌细胞)采用srb法测定，u937(淋巴瘤细胞、白血病细胞)采用cck-8法测定。
[0274]
1.实验用溶液的配制
[0275]
培养基的配制：500mlrpmi-1640(或dmem)加入50ml特级bi血清，10ml青链霉素混合液(100
×
)，配成含有10％血清，1％双抗的培养基。
[0276]
10
×
pbs的配制：分别称取na2hpo4·
12h2o 17.907g，kh2po
4 1.2248g，nacl40.03345g，kcl 1.00845g，加超纯水定容至500ml,调节ph至7.2-7.6。用时用超纯水稀释成1
×
。细胞培养中所用pbs需120℃，20min高压灭菌并放至常温后使用。
[0277]
20
×
tbs的配制：分别称取tris 24.23g，nacl 80.06g，加纯水溶解，定容至500ml，hcl调ph至7.6。4℃冰箱存放。使用时用纯水稀释成1
×
。
[0278]
tbst：500ml1
×
tbs加1ml 25％吐温20。
[0279]5×
阴极液的配制：分别称取tris 30.275g，tricine 44.8g，sds 2.5g，加纯水溶解，定容至500ml。4℃冰箱存放。使用时，用纯水稀释至1
×
。
[0280]5×
阳极液的配制：tris 60.55g，加纯水溶解，定容至500ml，ph调至8.9。
[0281]
4℃冰箱存放。使用时，用纯水稀释至1
×
。
[0282]
10
×
湿转液的配制：tris 15.2g，glycine 71.3g。加纯水溶解，定容至500ml。使用时，稀释为1
×
后，每400ml加100ml无水甲醇，4℃冰箱预冷后使用。
[0283]
ph计电极保护液的配制：取洁净烧杯称22.35g kcl，加适量超纯水溶解完全后倒入500ml容量瓶中定容即得，于4℃冰箱存放待用。
[0284]
丽春红染液：试剂瓶中称取2.5g丽春红粉末，适量超纯水溶液后加入2.5ml冰醋酸并混匀，溶液倒入500ml容量瓶中超纯水定容，重新转入试剂瓶中室温保存待用。
[0285]
5％牛奶的配制：称2g牛奶到40mltbst中，摇床摇匀。
[0286]
一抗二抗快速洗脱液的配制：称取sds 5g，甘氨酸1.875g，hcl调ph至2.0。
[0287]
10％过硫酸铵(ap)的配制：取1gap溶于1ml纯水中。
[0288]
10％tca的配制：称取50g三氯乙酸加超纯水定容至500ml，4℃保存。
[0289]
0.4％srb的配制：称取2g srb，用移液器吸取5ml冰乙酸，加超纯水定容至500ml，4℃保存。
[0290]
10mm tris的配制：称取tris 0.6057g，超纯水定容至500ml，ph调到10.5，室温放置。
[0291]
2.抗肿瘤细胞增殖实验
[0292]
(1)细胞培养
[0293]
人乳腺癌mcf-7，人胃癌细胞mgc-803,人宫颈癌细胞hela，人肝癌细胞hepg-2均在dmem中培养，人肺癌细胞a549，人白血病细胞u937均在rpmi1640中培养。实验中用与细胞培养的培养基均含10％的胎牛血清和1％的青链霉素双抗，细胞在37℃，含5％co2培养条件下培养，每隔两天更换新鲜培养基，每三天传一次代。取处于对数生长期的细胞进行实验。
[0294]
(2)细胞传代
[0295]
待细胞密度长至80％左右，进行细胞传代。对于贴壁细胞如mcf-7，首先弃上清，
pbs洗去残留培养基，加适量胰酶，37℃消化1-2min，显微镜下观察细胞状态，待细胞变圆后，加入新鲜培养基终止消化。收集细胞悬液至无菌ep管中，800-900r离心4-5min。弃上清，加新鲜培养基，调整细胞密度，1/3或1/4传代。对于悬浮细胞，收集细胞悬液于无菌ep管中，800-900r离心4-5min。弃上清，加新鲜培养基，调整细胞密度，1/3或1/4传代。
[0296]
(3)细胞复苏
[0297]
首先打开细胞室内水浴锅至37℃，从液氮罐中取出细胞，迅速放进37℃水浴锅快速融化，900r离心4min，弃上清，加新鲜培养基重悬后转移至无菌培养皿中培养，第二天换液，传2-3代后，细胞状态稳定，可开展实验。
[0298]
(4)细胞冻存
[0299]
将处于对数生长期的细胞收集后冻存，冻存细胞按照细胞悬液：血清：dmso＝7：2:1或者6:3:1配制，每支冻存管装1ml上述混合液。先放-80℃冰箱，次日转入液氮罐中储存。
[0300]
(5)细胞增殖抑制活力测定
[0301]
贴壁细胞增殖抑制活力测定
[0302]
收集处于对数生长期的细胞，计数后，按照4000个/孔，根据公式：c
1v1
＝c
2v2
计算出每个96孔板所需细胞悬液量，每孔加100微升细胞悬液，贴壁过夜后，弃去上层培养基，加入含不同药物，不同浓度梯度的培养基，培养72h后，srb法测试ic
50
值。
[0303]
悬浮细胞增殖抑制活力测定
[0304]
收集处于对数生长期的细胞，计数后，按照10000个/孔，根据公式：c
1v1
＝c
2v2
计算出每个96孔板所需细胞悬液量，每孔加50微升细胞悬液，配制2倍于不同浓度梯度的目标化合物溶液，每孔加50微升含药rpmi-1640，培养72h后，cck-8法测量ic
50
值。
[0305]
srb法
[0306]
先将处于对数生长期的mcf-7,hepg2,mgc-803,hela,a549细胞接种于96孔板中，3000-4000/孔，在37℃，5％co2培养箱过夜孵育使其贴壁，弃去上层培养基，加入不同浓度梯度的含药培养基，培养72h后，弃去上层培养液，每孔轻柔加入100μl10％(w/v)三氯乙酸后于4℃固定30min后弃去，用蒸馏水清洗残留试剂，65℃烘干，每孔加100μl 0.4％srb，室温下摇床染色20min,弃染液，用新配制的1％冰乙酸清洗多余染液，65℃干燥。每孔加150μl 10mm unbuffered trisbase平板振荡5min溶解染料，酶标仪测量560nm波长下处的吸光度值(optical density,od)。抑制率(％)＝(od
对照孔-od
加药孔
)/od
对照孔
×
100％，并计算出抑制率为50％时化合物的浓度。实验重复三次，数据以均值和标准差形式列出。
[0307]
cell counting kit(cck-8)法
[0308]
收集对数生长期的u937细胞，接种于96孔板中，8000/孔，将含药培养基和细胞悬液共同加入孔内。取三个孔，加入空白培养基，作为空白组。在37℃，5％co2培养箱孵育72h。每孔加10μl cck-8染液，继续孵育3～4h，酶标仪测量450nm波长下的吸光度值，无药物对照组od值控制在0.6～1.0之间为宜。增殖抑制率的计算公式：抑制率(％)＝od
对照孔-od
加药孔
)/(od
对照孔-od
空白孔
)
×
100％。
[0309]
半数抑制浓度(ic
50
)定义为当50％的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测定的光密度(od值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。
[0310]
测得的ic
50
见表1所示。
[0311]
表1
[0312][0313]
3次平行试验，实验结果取平均值。
[0314]
从上述实验可知：本发明对a549(肺癌细胞)、hela(子宫颈癌细胞)、mcf-7(乳腺癌细胞)、mgc-803(胃癌细胞)、hepg2(肝癌细胞)、u937(淋巴瘤细胞、白血病细胞)有明显的抑制作用。当ar环为六元环时，左右两侧环为间位取代时活性更高；当ar环为吲唑环时，其1位被取代后活性更高，左侧环的取代基中引入甲基、氨基对活性有一定改善；右侧环为三甲氧基取代时活性更高。
[0315]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。