一种高通量快速筛选鱼鳞蛋白胶酪氨酸酶抑制肽的方法

1.本发明涉及动物源生物活性肽的制备筛选技术领域，特别涉及高 通量快速筛选鱼鳞蛋白胶酪氨酸酶抑制肽的方法。


背景技术：

2.胶原蛋白是皮肤结构蛋白的一种，所以外部补充胶原蛋白及其降 解产物对皮肤健康发挥着不可替代的作用。目前，对胶原蛋白肽的抗 氧化活性、血管紧张素转换酶抑制活性、抗肿瘤活性和抗菌活性等功 能活性进行了研究。最近的研究表明，许多活性肽含有一些疏水氨基 酸、不带电极性氨基酸、芳香氨基酸等，具有抑制黑色素产生的能力。
3.草鱼是我国产量最高的淡水鱼品种，2020年养殖产量超557万 吨，但在加工过程中鱼鳞的利用率不高，而鱼鳞中含有丰富的胶原蛋 白，是蛋白胶的优质资源。鱼鳞作为鱼类加工的副产物，往往被丢弃。 因此通过生物酶解技术，制备具有抗酪氨酸酶活性肽，可以有效提高 鱼鳞的资源利用。
4.由于酶水解的复杂性，其中含有数以千计的多肽和数量众多的具 有相同分子量或电荷数的多肽，传统的分离和纯化方法面临着分离纯 化困难、时间长、无活性等问题。由于选择较高酪氨酸酶抑制活性的 组分进行纯化的过程是逐步进行的，某些酪氨酸酶抑制肽不可避免地 会被省略，导致最终遗漏了活性较高的肽。因此，如何快速有效地获 得酪氨酸酶抑制肽仍然是一个复杂的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提 供高通量快速筛选鱼鳞蛋白胶酪氨酸酶抑制肽的方法，将生物亲和超 滤结合质谱技术筛选酪氨酸酶抑制肽，减少了分离纯化步骤和筛选过 程中酶和样品的用量，提高了制备效率。
6.本发明还提供具有上述高通量快速筛选鱼鳞蛋白胶酪氨酸酶抑 制肽的方法，包括以下步骤：
7.s1.提取鱼鳞蛋白胶
8.用组织粉碎机将洗净后的草鱼鱼鳞进行搅打，去除表面的羟基磷 灰石等灰银色物质，冲洗干净后加入盐酸溶液浸泡脱钙一段时间，期 间每隔20min搅动1min，浸泡后用流水洗至中性，将处理后的鱼鳞 加适量纯净水进行恒温水浴一段时间，过滤得到蛋白胶液进行浓缩、 冷冻干燥处理；
9.s2.制备蛋白胶水解物
10.取干燥的草鱼鱼鳞蛋白胶，根据其质量比加入适量的蛋白酶，在 恒温下酶解反应一段时间后沸水浴灭酶处理，然后离心取上清液并脱 盐冻干，即得到草鱼鱼鳞蛋白胶酶解粉；
11.s3.确定水解物与酪氨酸酶反应最佳浓度
12.将上述蛋白胶酶解粉配制成不同浓度的溶液后测定酪氨酸酶抑 制活性，以酪氨
酸酶抑制活性基本保持不变时的浓度为最佳浓度；
13.s4.生物亲和超滤
14.将酪氨酸酶与最佳浓度的蛋白胶水解物溶液共同孵育，在孵育一 段时间后进行超滤离心，利用乙腈对所述离心的截留物进行洗脱，收 集洗脱液后干燥得到多肽；
15.s5.进行液相色谱-质谱联用高通量鉴定
16.在活性酪氨酸酶结合的多肽中扣除无活性酪氨酸酶结合的多肽， 进一步筛选条件为：选择分子量小于1000da的多肽序列、同时满足 对酪氨酸酶抑制有贡献的氨基酸占比大于60％，得到所述酪氨酸酶抑 制肽。
17.根据本发明所述的高通量快速筛选鱼鳞蛋白胶酪氨酸酶抑制肽 的方法，所述s1中草鱼鱼鳞与盐酸溶液的质量比为1：10-20，所述 盐酸溶液的浓度为0.2-0.8mol/l，盐酸溶液浸泡脱钙时间为 40-90min，所述草鱼鱼鳞与纯净水的质量比为1：1-5，水浴温度为 60-90℃，水浴时间为1.5-2.5h。
18.根据本发明所述的高通量快速筛选鱼鳞蛋白胶酪氨酸酶抑制肽 的方法，所述s2中蛋白酶为碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、风 味蛋白酶、中性蛋白酶中的任意一种或多种混合，所述蛋白酶的添加 量为0.5-3％，所述反应温度为30-60℃，所述反应时间为1～5h。
19.根据本发明所述的高通量快速筛选鱼鳞蛋白胶酪氨酸酶抑制肽 的方法，所述s4中酪氨酸酶与蛋白胶水解物溶液的体积比为1：1-3； 所述酪氨酸酶浓度为5-15u/ml；所述孵育温度为37℃，孵育时间为 1-2h。
20.根据本发明所述的高通量快速筛选鱼鳞蛋白胶酪氨酸酶抑制肽 的方法，所述s4超滤离心的步骤：
21.1)利用分子量为10kda的超滤离心管，超滤离心3次，移除滤 液后利用体积百分含量为70％的乙腈溶液重悬；
22.2)重悬后的溶液再孵育后离心，分别收集结合活性酪氨酸酶和 结合灭活酪氨酸酶的两种多肽样品。
23.根据本发明所述的高通量快速筛选鱼鳞蛋白胶酪氨酸酶抑制肽 的方法，所述s5中得到酪氨酸酶抑制肽后，还包括在体外测定酪氨 酸酶抑制活性。
24.根据本发明所述的高通量快速筛选鱼鳞蛋白胶酪氨酸酶抑制肽 的方法，所述s5中液相色谱-质谱联用高通量鉴定方法中，质谱设置 参数为：正离子扫描模式；ms：质荷比扫描范围为200～1500；分辨 率为70000；根据一级质谱分析的信号强度选择前20个肽进行碎裂， 碎裂模式为hcd，能量为27％；用xcalibur软件分析母离子图，用peaksstudio7.0软件对denovo进行测序，得到肽的氨基酸序列。分 别对比结合活性酪氨酸酶和结合灭活酪氨酸酶的两种样品的差异性， 选择结合活性酪氨酸酶的样品中特有的肽为具有潜在酪氨酸酶抑制 活性的肽。
25.有益效果
26.本发明提供了一种高通量快速筛选鱼鳞蛋白胶酪氨酸酶抑制肽 的方法。具备以下有益效果：
27.1、本发明，将生物亲和超滤结合质谱技术筛选酪氨酸酶抑制肽， 减少了分离纯化步骤和筛选过程中酶和样品的用量，提高了制备效率。
28.2、本发明，以加工副产物鱼鳞为原料制备具有酪氨酸酶酶抑制 活性的生物活性多肽，促进了水产品加工副产物的高值化利用。
29.3、本发明基于小分子肽和大分子酶之间的相互作用进行纯化目 标肽段，使获得的肽段具有更高的纯度和准确度。
附图说明
30.下面结合附图和实施例对本发明进一步地说明；
31.图1为本发明的流程结构图；
32.图2为本发明的水解物(a)和超滤组分(b)的酪氨酸酶活性， pat(c)和pit(d)的总离子色谱图(tic)图；
33.图3为本发明的6条合成肽的二级质谱图；
34.图4为本发明的ftgml对斑马鱼头部黑色素的影响示意图。
具体实施方式
35.本部分将详细描述本发明的具体实施例，使人能够直观地、形象 地理解本发明的每个技术特征和整体技术方案，但其不能理解为对本 发明保护范围的限制。
36.本发明实施例高通量快速筛选鱼鳞蛋白胶酪氨酸酶抑制肽的方 法，其包括
37.s1.鱼鳞蛋白胶的提取
38.用组织粉碎机将洗净后的草鱼鱼鳞进行搅打，去除表面的羟基磷 灰石等灰银色物质，冲洗干净后按质量比1：15加入0.5mol/lhcl溶 液浸泡脱钙1h，期间每隔20min搅动1min，浸泡后用流水洗至中性， 将处理后的鱼鳞按质量比1：3加入纯净水进行80℃水浴2h，过滤得 到蛋白胶液进行浓缩、冷冻干燥处理。
39.s2.制备蛋白胶水解物
40.取干燥的草鱼鱼鳞蛋白胶1.25g，溶于10ml水中，调节ph至9， 碱性蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司)添加量为1％，水解温度60℃， 水解时间2h，水解结束后沸水浴灭酶，抽滤离心取上清液脱盐干燥， 之后进行模拟消化。
41.制备模拟胃液：0.2gnacl溶于70ml水，用12mol/lhcl调节ph 值至1.2。然后向溶液中加入0.06g胃蛋白酶(北京索莱宝科技有限 公司)，用超纯水调节体积至100ml；制备模拟肠液：将0.7gkh2po4溶解在19ml的0.2mol/lnaoh中，将ph值调整到7.5，然后加入0.12g 胰蛋白酶。最后用超纯水将体积调整到100ml；将3g上述酶解粉溶 于25ml胃液中，在37℃下孵育60min。然后用1mol/lnahco3将胃消 化液的ph值调至6.5。然后将25ml肠液加入到胃消化液(ph＝6.5) 中，在37℃下培养60min。孵化后，用1mol/lhcl将消化液的ph值 调至3.0，真空冷冻干燥后即得到草鱼鱼鳞蛋白胶酶解粉。
42.s3,确定水解物与酪氨酸酶反应最佳浓度
43.将上述蛋白胶酶解粉配制成不同浓度的溶液后测定酪氨酸酶抑 制活性，得出最佳结合浓度为5mg/ml(如图2中a所示)。
44.s4.生物亲和超滤
45.将酪氨酸酶(10u/ml)与最佳浓度的蛋白胶水解物溶液按照体积 比2:1混合后在37℃下孵育1h，同时以灭活的酪氨酸酶作为对照进 行同样操作。选择分子量为10kda的超
滤离心管，超滤离心3次(每 次4000rpm，20min)，每次离心结束后使用移液枪吸打，以防滤膜 被堵，离心结束后移除滤液。往超滤离心管中加入70％的乙腈，反复 吸打后孵育10min，再次进行离心(4000rpm，20min)，离心3次。 分别收集结合活性酪氨酸酶(pat)和结合灭活酪氨酸酶(pit)的两 种洗脱的样品，除盐后比较0.5mg/ml的pat、pit和水解物的酪氨酸 酶抑制活性(如图2中b所示)，其中pat的抑制率最高，为74.92％， 而pit和水解物的相应抑制率分别为51.37％和62.58％，这表明生物 亲和超滤是一种有效的酪氨酸酶抑制肽的筛选方法。
46.s5.进行液相色谱-质谱联用高通量鉴定序列
47.液相色谱柱：acclaimrpepmaprslc(50μm
×
150mm,c18,2μ m,)；上样量为5μl；流动相a：0.1％甲酸水溶液，流动相b： 0.1％甲酸乙腈溶液；柱流量为220nl/min；梯度洗脱条件如下：0-2 分钟，4-12％流动相b；2-25分钟，12-22％流动相b；25-32分钟，22-32％ 流动相b；32-37分钟，32-75％流动相b；37-40分钟，75％流动相b。 质谱设置参数为：正离子扫描模式；ms：质荷比扫描范围为200～1500； 分辨率为70000；根据一级质谱分析的信号强度选择前20个肽进行 碎裂，碎裂模式为hcd，能量为27％；用xcalibur软件分析母离子图， 用peaksstudio7.0软件对denovo进行测序，结果如图2中c所示及 图2中d所示。分别对比结合活性酪氨酸酶和结合灭活酪氨酸酶的两 种样品的差异性，选择结合活性酪氨酸酶的样品中特有的肽为具有潜 在酪氨酸酶抑制活性的肽。在活性酪氨酸酶结合的多肽中扣除无活性 酪氨酸酶结合的多肽，进一步筛选条件为：选择分子量小于1000da 的多肽序列、同时满足对酪氨酸酶抑制有贡献的氨基酸如缬氨酸、丙 氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、色氨酸、 苏氨酸占比大于60％，得到所述酪氨酸酶抑制肽，如表1。
48.表1.pat特异性肽
[0049][0050][0051]
注：以上肽段的分子质量均小于或等于1000da。标记为*表示酪 氨酸酶抑制的贡献氨基酸比例大于等于60％。
[0052]
(6)根据s5得到所述标记为*的六条肽段(图2)进行体外合 成，体外测定酪氨酸酶抑制活性(表2)。由于肽laglvgpa的体外 溶解度较差，无法在后续应用中得到更好的利用，所以没有进一步研 究。因此，对其余5条多肽进行了体外酪氨酸酶抑制活性测定。肽 ftgml显示出最高的酪氨酸酶抑制活性，ic50值为1.89mmol/l。
[0053]
表2.肽的酪氨酸酶抑制活性
[0054][0055]
实施例2
[0056]
实施例1得到的肽段ftgml在斑马鱼中降低黑色素的效果。
[0057]
斑马鱼在鱼水中饲养(在1l反渗透水中加入200mg速溶海盐， 其条件为：电导率为450-550μs/cm，ph值为6.5-8.5，水硬度为 50-100mg/lcaco3)，温度为28℃。野生型ab品系斑马鱼通过自然 交配成对繁殖。使用受精后6小时(6hpf)的斑马鱼评估美白、抑制 酪氨酸酶活性和抑制黑色素的效果。
[0058]
a.最大耐受浓度测定(mtc)
[0059]
随机选择野生型ab株斑马鱼(6hpf)，转移到6孔板，每孔30 条斑马鱼。在每个孔中分别给予3ml不同浓度的肽溶液，不加肽的孔 被设定为正常对照组。在28℃条件下，48h后观察斑马鱼的死亡情况， mtc被定义为没有观察到死亡的最大浓度。
[0060]
表3.ftgml对斑马鱼美白模型胚胎死亡率的影响(n＝30)
[0061][0062]
评估了不同浓度(62.5、125、250、500、1000和2000μg/ml) 的ftgml对斑马鱼死亡率的影响(表3)。浓度为2000μg/ml时， 斑马鱼的发育明显延迟，死亡率为100％。然而，当浓度低于250μg/ml 时，斑马鱼发育正常。因此，选择62.5、125和250μg/ml的ftgml 作为后续实验浓度范围。
[0063]
b.美白效果的测定
[0064]
随机选取6hpf野生型ab品系斑马鱼，每孔(实验组)30尾。 分别水溶给予不同浓度的肽溶液，阳性对照熊果苷3000μg/ml浓度， 同时设置正常对照组，每孔容量为3ml。28℃处理48h，从每个孔中 随机选择10条斑马鱼，在解剖显微镜下观察，并用电荷耦合器件(ccd) 相机拍照。使用imagej1.8.0图像处理软件对斑马鱼头部的总黑色素 光密度进行分析和计数，并以黑色像素数表示，以评价美白效果(图 3)。
[0065]
c.酪氨酸酶抑制能力的测定
[0066]
随机选取6hpf野生型ab品系斑马鱼，每孔(实验组)30尾。 分别水溶给予不同浓度的肽溶液，阳性对照熊果苷3000μg/ml浓度， 同时设置正常对照组，每孔容量为3ml。平行三
个孔。多巴胺氧化法 采用如下方法：将各实验组收集的斑马鱼磨碎，用300μl细胞裂解 液(ripa)(含1g/l苯甲磺酰氟)裂解2min，然后在14000
×
g离 心5min。上清液为斑马鱼粗制的酪氨酸酶提取液。将粗酪氨酸酶提 取液稀释至蛋白质浓度为2.5mg/l(通过使用bca试剂盒测定)，与 l-dopa以1:1的体积比结合，然后转移到96孔板中，在37℃下孵育 60min。测定a475来评估该肽对斑马鱼体内酪氨酸酶活性的抑制能力。
[0067]
d.黑色素抑制能力的测定
[0068]
将从各实验组收集的斑马鱼磨碎，用100μlripa(含0.1μg苯 甲基磺酰氟)裂解2min，混合物在14000
×
g下离心10min，分离含 有黑色素蛋白的沉淀物。将沉淀物溶解在1ml1mol/lnaoh中，并在 60℃的水浴中加热至溶解。用酶标仪测量a405，以量化斑马鱼体内 黑色素的含量，并评估该肽对斑马鱼体内黑色素的抑制能力。
[0069]
表4.ftgml美白功效评价实验结果
[0070][0071]
与正常对照组相比，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。
[0072]
与对照组相比，用ftgml处理的斑马鱼的黑色素生长有不同程度 的下降。随着ftgml浓度的增加，黑色素的总量首先减少，随后增加 (表4)。当斑马鱼被125μg/mlftgml处理后，其黑色素水平下降 到对照组的76.6％(p《0.001)。此外，为了验证ftgml是否影响斑 马鱼的酪氨酸酶活性，本研究测量了斑马鱼发育48h后的酪氨酸酶活 性，结果见表4。低浓度组斑马鱼的酪氨酸酶活性与对照组无明显差 异(p》0.05)。随着ftgml浓度的增加，酪氨酸酶的活性先下降后上 升。中等浓度(125μg/ml)组的数值最低(p＜0.01)，相对酪氨酸 酶抑制率(与空白组之比)为78.43％。在此浓度下，ftgml具有良好 的抑制酪氨酸酶的活性。斑马鱼的黑色素含量和酪氨酸酶的活性呈现 相同的趋势。中等浓度组(125μg/ml)的黑色素含量下降到对照组 的62.4％(p《0.001)。表4显示了不同浓度的多肽ftgml对斑马鱼 黑色素蛋白含量的影响，其变化趋势与酪氨酸酶活性相同，125μg/ml 组的黑色素蛋白含量最低(15.6
±
0.1μg/ml)，总之，中等浓度 (125μg/ml)可以有效地抑制斑马鱼黑色素的合成。
[0073]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于 上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还 可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。