一种TGF-β3生长因子的亲和多肽及其应用

一种tgf-β
3生长因子的亲和多肽及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域的一种多肽及其应用，具体是涉及了一种转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3,tgf-β3)的亲和多肽及其应用。


背景技术：

2.关节软骨是覆盖关节表面由非血管结缔组织形成的特殊透明软骨，它主要由细胞外基质蛋白和少量高度分化的软骨细胞组成。关节软骨缺乏血管、神经等支持组织，只能通过关节滑膜分泌的滑液获取营养，因此软骨损伤后的自我修复能力十分有限。一旦软骨组织因运动等原因产生病损却没有及时干预或治疗，极容易发展成骨关节炎。事实上，因为软骨损伤而产生的骨关节炎患者在我国乃至全世界都数量庞大。对软骨再生医学来说，间充质干细胞(msc)是一种临床上非常有应用前景的干细胞资源，它能够在合适的生长因子刺激下分化成软骨细胞，并沉积软骨特异性的细胞质基质。其中，转化生长因子-β3 (transforming growth factor-β3,tgf-β3)是一种对msc成软骨分化非常关键的生长因子。另一方面，通过募集体内自带的msc和生长因子进行骨关节炎治疗与软骨再生是一种新型的极具应用价值的内源性再生医学策略。这种方式无需将外源的干细胞和生长因子输送到体内，能够减少可能的免疫排斥作用与二次伤害，提高再生的效果。因此，找到能够募集msc和成软骨分化关键生长因子的药物或材料，对内源性软骨再生疗法具有重要的意义和应用价值。


技术实现要素：

3.本发明利用丝状噬菌体随机展示文库对tgf-β3蛋白进行亲和优化处理，获得了与tgf-β3高亲和性的多肽序列，具有安全、实用、方便和高效的优势。同时，本发明将提供该亲和多肽在骨关节炎以及软骨损伤相关性疾病中的应用。
4.本发明采用以下技术方案。
5.一、一种亲和多肽：
6.所述亲和多肽的氨基酸序列选自seq id no.1～seq id no.6之一。
7.所述亲和多肽能够特异结合转化生长因子(tgf-β3)蛋白。
8.所述亲和多肽的氨基酸序列分别为：mqtpktm，vplfprt，fllessn， lqsvhpl，lmpnspi，akyeqph。如下表。
9.表1 tgf-β3亲和多肽氨基酸序列表
[0010][0011]
二、一种生物活性片段：
[0012]
所述的生物活性片段包含权利要求1所述亲和多肽，为生物活性片段中功能区的一部分；
[0013]
所述的生物活性片段也具有和所述亲和多肽一致的功能，即能够与生长因子tgf-β3结合。
[0014]
生物活性片段在制备药物中应用。
[0015]
三、一种核苷酸序列：所述核苷酸序列能编码所述亲和多肽。
[0016]
四、一种核苷酸序列：所述核苷酸序列能编码所述生物活性片段。
[0017]
五、一种治疗骨关节炎的药物复合物：所述药物复合物包含所述亲和多肽或者所述生物活性片段，也包含用于治疗骨关节炎的药物或药物载体。
[0018]
所述的多肽或生物活性片段作为生长因子募集试剂，与能够治疗骨关节炎的药物化学连接或混合作为治疗骨关节炎的药物复合物，也可以与包裹这些药物的载体化学连接或混合作为能够治疗骨关节炎的药物复合物。
[0019]
所述的药物为非甾体类消炎药(nsaids)、氨基葡萄糖等软骨保护剂、关节腔注射药物、抗抑郁药、阿片类镇痛药等药物中的任意一种；
[0020]
所述的药物载体为脂质体、天然高分子材料、人工合成的高分子材料、无机晶体材料、碳材料、聚合物囊泡、聚合物胶束中的任意一种。
[0021]
六、一种用于软骨再生的复合支架：
[0022]
所述复合支架同时包含所述亲和多肽或者所述生物活性片段和能用于软骨再生的支架材料。所述的多肽或生物活性片段作为生长因子募集原件，与能够用于软骨组织修复的生物材料化学连接或混合作为软骨再生的复合支架。
[0023]
所述的支架材料为天然高分子材料、人工合成的高分子材料、金属材料、无机非金属材料、碳材料中的任意一种或几种的复合材料。
[0024]
本发明在制备与生产用于骨关节炎、软骨损伤引起疾病的药物和生物医用材料中应用。
[0025]
本发明的多肽特异性强，亲和能力高，且操作相对简便，适用于用来寻找转化生长因子tgf-β3的结合多肽。
[0026]
本发明的多肽及包含该多肽的生物活性片段可以与其它能够治疗骨关节炎的药物形成药物复合物，也可以与软骨修复材料形成用于软骨再生的复合支架。本发明所述多肽与tgf-β3结合力强，特异性高，为关节炎药物与软骨再生支架的研发提供了新选择。
[0027]
与现有技术相比，本发明具有以下突出优势：
[0028]
(1)本发明使用噬菌体展示技术筛选与tgf-β3蛋白结合的小分子多肽，具有耗时较短，操作简便，成功率高的特点，为研制骨关节炎治疗药物与软骨再生支架材料提供新的选择。
[0029]
(2)本发明筛选出的能与tgf-β3蛋白结合的小分子多肽，可以利用标准化的化学合成工艺进行合成，相比重组蛋白或抗体类试剂，其生产、纯化、保存成本大大降低，而且不需要借助于动物，这使得它们与抗体开发技术相比更经济的同时没有伦理上的顾虑；
[0030]
(3)本发明提供的多肽与tgf-β3蛋白的特异结合作用，为进一步开发新的组织修复材料，研究生长因子对干细胞分化与软骨修复的相互作用，生产更有价值的骨关节炎治疗药物与软骨再生复合支架提供了参考。
附图说明
[0031]
附表2为噬菌体文库筛选获得亲和多肽频次统计结果。
[0032]
附图1为实施例1噬菌体酶联免疫吸附实验(elisa)结果统计图。
[0033]
附图2为实施例2噬菌体输入输出统计实验结果图。
具体实施方式
[0034]
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何更改和变化，均应当包括在本发明的保护范围之内。
[0035]
本发明的实施例如下：
[0036]
实施例1
[0037]
噬菌体酶联免疫吸附实验(elisa)验证并比较特异结合tgf-β3蛋白的亲和多肽的结合力大小。
[0038]
1)噬菌体文库筛选tgf-β3蛋白亲和多肽序列统计：对第3轮和第4轮噬菌体筛选得到的亲和噬菌体，铺平板后挑取单克隆扩增培养，提取质粒进行基因测序，从而获得噬菌体表面展示的亲和多肽序列。每轮多肽序列与频次统计如附表2所示。
[0039]
附表2第3和第4轮噬菌体文库筛选获得亲和多肽频次统计
[0040][0041]
上表中可见，有6种亲和多肽在第3轮和第4轮筛选后合计重复次数大于1，其中mqtpktm重复次数最高，达到66次，vplfprt和fllessn多肽重复次数均大于2。
[0042]
2)将附表2中涉及到的噬菌体进行扩增并纯化。
[0043]
噬菌体具体分别为包含有mqtpktm，vplfprt，fllessn，lqsvhpl， lmpnspi，
akyeqph序列的噬菌体。
[0044]
3)利用nahco3(0.1m,ph8.6)包被液对tgf-β3蛋白进行稀释，终浓度为1μg/ml；将tgf-β3蛋白稀释液加到96孔板中，放入湿盒，4℃包被过夜。
[0045]
4)准备好的tgf-β3蛋白用封闭液(pbs 0.5mg/ml bsa)封闭1小时。
[0046]
5)去掉封闭液，加入用封闭液稀释好的具有不同插入片段的亲和噬菌体(2
ꢀ×
109pfu)后室温孵育1小时。
[0047]
6)每个孔用pbst(pbs 0.5％(v/v)tween20)溶液洗涤5次，每次5分钟。
[0048]
7)加入用pbs溶液稀释好的抗m13噬菌体抗体，37℃孵育1小时。每个孔用pbst洗涤3次，每次5分钟。
[0049]
8)加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的相应二抗，37℃孵育30分钟。每个孔用pbst洗涤3次，每次5分钟。
[0050]
9)加入tmb显色液，室温孵育至充分显色后，加入2m硫酸终止液，酶标仪读取450nm波长处的吸光度值，统计所得结果见附图1。
[0051]
实施例2
[0052]
噬菌体输入(input)输出(output)统计实验比较噬菌体浓度对特异结合 tgf-β3蛋白的亲和噬菌体结合力大小的影响。
[0053]
1)将噬菌体扩增并纯化。
[0054]
噬菌体具体为包含有mqtpktm多肽序列的噬菌体。
[0055]
2)利用nahco3(0.1m,ph8.6)包被液对tgf-β3蛋白进行稀释，终浓度为1μg/ml；将tgf-β3蛋白稀释液加到96孔板中，放入湿盒，4℃包被过夜。
[0056]
3)准备好的tgf-β3蛋白用封闭液(pbs 0.5mg/ml bsa)封闭1小时。
[0057]
4)去掉封闭液，加入用封闭液稀释好的不同浓度的亲和噬菌体(2
×
10
11 pfu/ml，2
×
10
10
pfu/ml，2
×
109pfu/ml，2
×
108pfu/ml)50μl，室温孵育1 小时。
[0058]
5)每个孔用pbst(pbs 0.5％(v/v)tween20)溶液洗涤5次，每次5分钟。
[0059]
6)除去孔板中的洗涤液并拍干，加入甘氨酸洗脱液(0.2m的甘氨酸-盐酸， ph2.2，1mg/ml bsa)，冰上孵育10分钟，将亲和噬菌体洗脱下来。
[0060]
7)加入1m的tris-hcl(ph9.1)中和液，混匀后ph为中性。
[0061]
8)将收集的噬菌体溶液用pbs进行梯度稀释，然后加入到过夜培养的大肠杆菌中，室温孵育5分钟，加入顶层琼脂后铺到含有iptg/xgal的固体lb板上，轻轻摇晃均匀。待液体完全凝固后，倒置放入37℃培养箱过夜培养。次日对平板上出现的噬菌斑进行计数，根据稀释倍数得到噬菌体浓度。统计并比较不同浓度噬菌体输入的条件下，输出噬菌体浓度的差异，所得结果见附图2。
[0062]
本发明涉及的基因和蛋白序列如下：
[0063]
seq id no.1；
[0064]
名称：亲和多肽1的氨基酸序列
[0065]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0066]
mqtpktm
[0067]
seq id no.2；
[0068]
名称：亲和多肽2的氨基酸序列
[0069]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0070]
vplfprt
[0071]
seq id no.3；
[0072]
名称：亲和多肽3的氨基酸序列
[0073]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0074]
fllessn
[0075]
seq id no.4；
[0076]
名称：亲和多肽4的氨基酸序列
[0077]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0078]
lqsvhpl
[0079]
seq id no.5；
[0080]
名称：亲和多肽5的氨基酸序列
[0081]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0082]
lmpnspi
[0083]
seq id no.6；
[0084]
名称：亲和多肽6的氨基酸序列
[0085]
来源：人工序列(artificial sequence)
[0086]
akyeqph。