一种利用静电相互作用实现生物分子快速吸附到阳离子型共价有机框架的方法

bfbim-icof和py-bpy
2 -cof中的任意一种。
8.进一步地，第二步中所述生物分子包括具有低等电点的蛋白质、氨基酸和核酸中的任意一种。
9.进一步地，第二步中所述缓冲液包括磷酸缓冲液(ph为6~8)、乙酸-乙酸钠缓冲液(ph为3.5~5)、磷酸二氢钠-柠檬酸钠缓冲液(ph为2~8)和碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(ph为9~11)中的任意一种。
10.进一步地，所述蛋白质包括牛血清蛋白(bsa)、脂肪酶(bcl)、葡萄糖氧化酶(gox)和乙醇脱氢酶(adh)中的任意一种。
11.进一步地，所述氨基酸包括天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)和色氨酸(trp)中的任意一种。
12.进一步地，所述核酸包括核糖核酸(rna)或脱氧核糖核酸(dna)。
13.本发明的原理如下：等电点是一个生物分子表面不带电荷时的ph值，是衡量酶表面电荷的一个重要的指标。当溶液的ph高于酶的等电点，此时酶表面带有大量的负电荷，与带有正电荷的材料存在强的静电相互作用，这将有利于酶紧密吸附至材料的表面。
14.本发明中，酶作为天然的催化剂，具有一些突出的优势，如高效性，能够将反应速率提高上百万倍；专一性，只催化特定的反应或产生特定的构型；且绿色无污染。固定化技术可以提高酶的化学和热稳定性，以及较好的重复利用性，提高经济效益，促进酶的工业化进程。
15.共价有机框架材料(cofs)是近年来非常热门的一种新型多孔框架材料，孔道规则、结构易于调控、稳定且生物相容性好，是一种理想的固定酶载体。
16.本发明的有益效果如下：1. 本发明的方法具有一定的普适性，无需考虑酶的尺寸与cofs的孔径是否匹配。通过调节缓冲液的ph值，使某些酶表面带适量负电荷，在静电作用的帮助下紧密地吸附到阳离子共价有机框架表面或孔内，实现对酶的保护，提高酶的重复使用性。
17.2. 本发明适用于大多数生物分子(前提是等电点较低)，不受限于生物分子尺寸大小，能够简便、快速形成生物分子-cofs生物催化系统。
18.3. 所吸附的生物分子，在某些表面活性剂的作用下能够从cofs表面完全洗脱，实现材料的重复使用。
19.4. 通过本发明的方法，制备生物分子-cofs生物催化系统，所制备的生物催化系统用于酶催化，生物分子的储存或运输。
附图说明
20.图1为bsa在eb-cofs的表面吸附量随时间变化曲线。
21.图2为eb-cofs、bsa与bsa /eb-cofs的zeta电位图。
22.图3为bcl在eb-cofs的表面吸附量随时间变化曲线。
23.图4为eb-cofs、bcl与bcl/eb-cofs的zeta电位图。
24.图5为eb-cofs(a)与bcl/eb-cofs(b和c)的sem图像（2μm）。
25.图6为bcl和bcl/eb-cofs在不同温度下的热稳定性。
26.图7为bcl和bcl/eb-cofs在不同ph缓冲液中的稳定性。
27.图8为bcl/eb-cofs的循环稳定性的测试。
28.图9为eb-cofs重复使用时对bcl吸附量的变化情况。
具体实施方式
29.下面结合实例对本发明进行阐述，但并不构成对本发明的限制。
30.实施例1阳离子型共价有机框架的制备，具体步骤如下：eb-cofs的制备：称取溴化乙锭(eb, 0.3mmol, 118mg)和2,4,6-三甲酰基间苯三酚(tfp, 0.2mmol, 42mg)移至玻璃管中，再加入1ml1,4-二氧六环、1ml均三甲苯和0.2 ml乙酸水溶液(6.0 m)。然后，进行冷冻-抽真空-解冻脱气循环三次，将管密封放入120℃烘箱反应3天。冷却至室温后，产物用thf洗涤4次，然后用200ml甲醇:thf(1:1)混合液索氏提取12h，最后在100℃真空干燥12h得到红色粉末。
31.im-cof-br的制备：称量1,3,5-三[3-(4-甲酰基苄基)-1h-咪唑-1-基]苯溴化物(tibbr, 0.08mmol, 70.17mg )和联苯胺(bz, 0.12mmol, 22.11mg)移至玻璃管中，再加入1.6 ml 1,4-二氧六环、0.4 ml无水甲醇和0.2 ml乙酸水溶液(3.0 m)。然后，进行冷冻-抽真空-解冻脱气循环三次，将管密封放入120℃烘箱反应7天。冷却至室温后，产物用thf和丙酮洗涤3次，最后在120℃真空干燥12h得到暗黄色粉末。
[0032]
实施例2生物分子的固定化：称取2~10mg的cofs溶解到2~10ml的缓冲溶液中超声分散，加入2~10ml的生物分子溶液，放置在25℃、200rpm摇床吸附。然后，离心收集材料，高纯水洗涤3次，除去吸附松散的生物分子，最后离心获得材料，在25℃真空干燥过夜。此处生物分子包括牛血清蛋白(bsa)，脂肪酶(bcl)。对于bsa(附图1)与bcl(附图3)固定化最优时间均为1h。固定化生物分子前后材料的zeta电位变化证实了bsa(附图2)与bcl (附图4) 的吸附。
[0033]
实施例3bsa的胺化实验。
[0034]
首先，超纯水（mq水）配制2 ml乙二胺（eda）(0.268 ml, 4.01 mmol)溶液，并用6 m hcl将ph值调节至4.5。然后加入20mg bsa和1-乙基
‑ꢀ
(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐（edc
•
hcl）（7.2mg, 0.038 mmol）。溶液在冰上搅拌120 min，超滤洗涤和浓缩，得到a-bsa。
[0035]
作为必要的对照实验：对bsa进行了胺化实验，提高其等电点，使其在缓冲溶液中表面带正电荷(12.0 mv)，与eb-cofs表面的正电荷相斥，测试a-bsa是否能成功吸附至eb-cofs表面。按照上述方法进行固定化，通过bradford法检测固定化前后溶液的a-bsa浓度，结果发现无a-bsa吸附至eb-cofs表面，证明了静电作用在cofs表面吸附的重大贡献。
[0036]
实施例4生物分子活性的检测。
[0037]
脂肪酶(bcl)的活性检测：游离及固定化的bcl活性的检测步骤如下：0.1~1.0 g对硝基苯棕榈酸酯(p-npp)溶于100 ml乙醇为底物。用分光光度法测定p-npp水解过程中对硝基苯酚(p-np)的释放引起的410 nm处吸光度的增加。对硝基苯酚的摩尔消光系数ε
410
=15,
000m
−1•
cm
−1。本实验条件下，酶活单位被定义为每分钟催化生成1 μmol对硝基苯酚(p-np)的酶的量(u)。
[0038]
实施例5固定化酶的稳定性测试。
[0039]
（1）固定化酶的酸碱稳定性测试。
[0040]
游离脂肪酶(bcl)和固定化脂肪酶(bcl/eb-cofs)置于不同ph (2.0~10.0)条件下，保持1h。然后按上述标准方法测试酶活。附图6表明，在ph=3的缓冲液中，bcl/eb-cofs能够为bcl提供一定程度的保护，剩余活性为原始活性的85%，而游离的bcl仅为15%。
[0041]
（2）固定化酶的热稳定性测试。
[0042]
游离脂肪酶(bcl)和固定化脂肪酶(bcl/eb-cofs)置于不同温度(30~80℃)条件下，保持1h。然后按上述标准方法测试酶活。附图7表明，当温度高于60℃时，bcl与bcl/eb-cofs活性均开始下降。温度达到80℃时，bcl残留相对活性仅为5%，而bcl/eb-cofs此时仍保留65%相对活性。
[0043]
（3）固定化酶的循环稳定性测试在测试材料循环稳定性时，在一次催化反应结束后，通过离心收集固体，然后直接用于下次催化反应，但出现了活性骤降的现象，经过多次实验，最终确定为简单的离心并不能完全回收材料，导致催化活性下降。于是，将材料溶于缓冲液中，通过注射器打入0.45μm孔径的微孔滤膜，来规避材料损失的问题，循环使用10次后仍保持75%的相对活性(附图8)。
[0044]
实施例7固定化酶的洗脱实现cofs的重复利用。
[0045]
通常，在一些表面活性剂的帮助下，能够实现酶在材料表面的洗脱。在这里，我们使用了triton x-100溶液(0.5%~10%)，0.5~2h内实现bcl/eb-cofs表面脂肪酶(bcl)的完全洗脱。有趣的是，triton x-100溶液对脂肪酶(bcl)有活化作用，解吸附后的脂肪酶(bcl)比活性达到原来的170%，经triton x-100孵育后的脂肪酶(bcl)也表现出同样的活化情况。且解吸附后的cofs经反复吸附/解吸脂肪酶(bcl)8次仍可达到初始吸附量的95%(附图9)。