鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物的制备及其用途

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物的制备方法与应用。


背景技术：

2.锌(zn)作为人体营养中必需的微量元素，对细胞代谢起着至关重要的作用。此外，锌还参与细胞介导的免疫和dna合成。缺锌可导致显著的生理问题，包括生长迟缓，免疫功能失调，皮肤病变和其他慢性疾病。缺锌的原因主要为:摄入不足、吸收减少、损失增加或需求增加，世界范围内最常见的锌缺乏原因是由于低锌或富含植酸盐的饮食从而导致摄入量不足。锌元素生理需求大的人群缺锌风险最大，其中孕妇和哺乳期妇女患有锌缺乏最为普遍，老年人因饮食不良和吸收下降也会面临缺锌风险。儿童患有锌缺乏疾病也十分常见，在儿童期间，身体生长发育速度快，对营养需求高，饮食不注意便会容易引发锌缺乏相关疾病。锌的吸收不良也是缺锌的主要原因，以往的补锌剂，补锌效率低、合成复杂并且会伴有轻度恶心、呕吐、便秘等不良反应。所以近年来，生产一款锌含量高，稳定性好，补锌效率高并且具有生物活性的新型补锌剂受到了国内外学者的广泛关注。目前补锌剂已经发展到第三个阶段，第三阶段补锌剂是以氨基酸或多肽为配体以锌离子为中心原子,经配位键连接而成的螯合锌。此类补锌剂具有化学稳定性好、安全无毒、有利于肠胃吸收、生物利用率高等优点。
3.国内外对鱼类产品做了很多的研究，而且很深入，包括鱼和鱼副产品的种类，胶原蛋白肽的提取方法。我国是家禽类养殖大国，肉鸡产量位居世界第二，然而在肉鸡加工中的下脚料鸡皮通常经过粗加工生产动物饲料或者被用来生产低档肉糜制品，经济利用价值不高。鸡皮中含有丰富的胶原蛋白，它不仅能提供人体生长发育所需的营养物质，而且还具有抗氧化、降血压等多种生物活性，因此，近年来研究和开发胶原蛋白肽类产品已成为一个热点。对于从家禽中提取胶原蛋白肽的研究也有少量报道，例如从鸡皮中提取明胶代替哺乳动物明胶，并对明胶的提取工艺和理化性质进行了研究；此外，有研究报道以鸡骨或鸡胚为原料制备胶原蛋白肽，并对其抗氧化性和分子量分布进行了探究。但是相关的研究还不够深入，具体应用也很少。


技术实现要素：

4.充分的利用鸡皮进行深加工，提高产品的附加值是本领域的一个普遍的技术问题。本发明利用锌离子存在与多肽、蛋白质形成稳定配合物的自然属性，通过生物技术对鸡皮这类禽类加工的下脚料进行鸡皮胶原蛋白多肽(chicken collagen peptide, ccp)资源的深加工，将多肽与无机锌进行结合制备成鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物(chicken collagen peptide-zinc，ccp-zn)，将无机锌转变成为有机锌。具体的，本发明提供了一种螯合肽，所述螯合肽是鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物，由鸡皮胶原蛋白多肽与含锌离子的化合物螯合而成，优选的所述锌离子的化合物为无机锌。优选的，本发明中所述的含锌化合物
为硫酸锌、氯化锌、醋酸锌、葡萄糖酸锌、柠檬酸锌。
5.本发明的一个方面，本发明提供了一种鸡皮胶原蛋白多肽的制备方法，所述方法包括如下步骤：（1）将鸡皮，洗净，除脂，除杂蛋白，绞碎；（2）采用分步双酶法酶解处理的鸡皮；（3）酶解结束后，酶解产物经灭酶、离心，浓缩得到含鸡皮胶原蛋白多肽产物；所述步骤（2）中分步双酶法酶解为前后采用两种不同的酶分两次水解，第一次所用的酶为风味蛋白酶，第二次所用酶为菠萝蛋白酶。
6.本发明的一个方面，本发明提供了一种鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物的制备方法，其所述方法包括如下步骤：s1、将鸡皮，洗净，除脂，除杂蛋白，绞碎，采用分步双酶法酶解处理的鸡皮，酶解结束后，酶解产物经灭酶、离心，浓缩、冷冻干燥处理得到鸡皮胶原蛋白多肽冻干粉；s2、鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物的制备：将步骤s1所得的鸡皮胶原蛋白多肽制备成合适浓度的多肽溶液，应用液体螯合法将多肽溶液和含锌离子的化合物制备成鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物，经除去多余的锌离子、浓缩、冷冻干燥的到鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物冻干粉。优选的，所述步骤s1中分步双酶法酶解为前后采用两种不同的酶分两次水解，第一次所用的酶为风味蛋白酶，第二次所用酶为菠萝蛋白酶。所述步骤s2中含锌离子的化合物为硫酸锌。
7.本发明的一个方面，本发明提供了一种鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：s1、鸡皮胶原蛋白多肽的制备：将鸡皮，洗净，除脂，除杂蛋白，绞碎，采用分步双酶法酶解处理的鸡皮，酶解结束后，酶解产物经灭酶、离心，浓缩、冷冻干燥处理得到鸡皮胶原蛋白多肽冻干粉；s2、鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物的制备：将所得的鸡皮胶原蛋白多肽制备成合适浓度的多肽溶液，应用液体螯合法将多肽溶液和含锌离子的化合物制备成鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物，经除去多余的锌离子、浓缩、冷冻干燥的到鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物冻干粉。
8.优选的，本发明步骤s1中所述分步双酶法酶解是将除杂蛋白的鸡皮碎末加入到清水中，鸡皮与水的比例为1:10 g/ml，将水的ph值调节至6.5-7.0，然后将水温保持在50-60℃，加入重量百分比为3%的蛋白酶i，水解200-350min；然后将水温调节至60-65℃，加入重量百分比为3%的蛋白酶ii，水解200-350min；优选的所述蛋白酶i为风味蛋白酶，蛋白酶ii为菠萝蛋白酶。
9.优选的，本发明步骤s2中多肽溶液是将鸡皮胶原蛋白多肽与超纯水制成5%浓度的溶液。进一步的，本发明步骤s2是按照多肽与硫酸锌质量比1-7 : 2的比例在多肽溶液中加入硫酸锌，搅拌均匀，调节ph值至6.5-7.0，在40-60℃的条件下持续反应0.5-2.5h后冷却，离心分离后除去杂质，然后加入上清液体积5-10倍、75-95wt%的乙醇，静置8-12h，离心除去上清液，获得鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物。
10.本发明的一个方面，本发明提供了通过本发明的鸡皮胶原蛋白多肽、鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物制备方法获得鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合物在制备食品、保健品、药品中的应用。
11.本发明的一个方面，本发明提供了鸡皮胶原蛋白多肽、鸡皮胶原蛋白多肽-锌螯合
物在制备食品、保健品、药品中的应用，其中所述保健品、药品中还含有药学上可以接受的辅料。进一步的，所述保健品和药品可以制备成为各种可接受的剂型，包括颗粒剂、胶囊、片剂、口服制剂。
12.有益效果本发明与现有技术相比，具有以下优点：（1）分步双酶法可以使每种酶在最合适的条件下发挥作用，其提取率高。本发明通过独立控制两种酶的酶解条件，可有效的控制酶解程度，得到具有活性高、螯合性高的生物活性多肽。本发明的制备工艺具有工艺操作简单、安全性高的优点。
13.（2）本发明通过将鸡皮胶原蛋白多肽与无机硫酸锌中的锌离子进行螯合，制备出的有机鸡皮胶原蛋白活性肽-锌螯合物及其产品具有独特的螯合机制和小肽转运途径，安全无毒、吸收率高、生物利用率高可同时补充胶原蛋白多肽和锌离子。
14.（3）本发明制备的鸡皮胶原蛋白多肽-锌离子螯合物及其产品因具有锌离子高生物利用率性、抗肿瘤和抗氧化性作用，在治疗因缺锌导致的相关疾病具有良好的效果。
15.（4）本发明为肉鸡生产时产生的鸡皮等下脚料的应用提供了一条新思路，为开发有机锌营养补充剂与功能性食品提供了理论依据和技术支持。
附图说明
16.图1 菠萝蛋白酶酶解鸡皮胶原蛋白水解程度单因素试验结果图。
17.图2 风味蛋白酶酶解鸡皮胶原蛋白水解程度单因素试验结果图。
18.图3本发明获得的鸡皮胶原蛋白分子量分布。
19.图4 鸡皮胶原蛋白肽清除自由基能力。
20.图5 鸡皮胶原蛋白肽与硫酸锌螯合单因素试验结果图。
21.图6 响应面优化鸡皮胶原蛋白肽与硫酸锌螯合试验结果图。
22.图7鸡皮胶原蛋白肽-锌螯合物结构表征图。
23.图8 缺锌果蝇模型构建和验证。
24.图9 鸡皮胶原蛋白肽锌螯合物生物利用率检测。
25.图10 znso4、ccp-zn 以及 ccp 抑制肿瘤生长效果和远处侵袭。
26.图11 鸡皮胶原蛋白肽锌螯合物抑制肿瘤微环境自噬和远处自噬。
27.图12 鸡皮胶原蛋白肽锌螯合物抑制肿瘤的氧化应激水平。
具体实施方式
28.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
29.首先对本发明主要材料来源和相关说明进行介绍，其他未特殊说明的试剂和原料均来自市售商品化常规产品。
30.胰蛋白酶：源叶生物货号：s10034木瓜蛋白酶：源叶生物货号：s10011风味蛋白酶：源叶生物货号：s10153菠萝蛋白酶：源叶生物货号：s10009果蝇：果蝇饲养和杂交均在 25
°
c 恒温、60%相对湿度恒湿的培养箱中。实验中果
蝇基础食物配方组成：称取100克玉米粉、10克大豆粉、14.5克白糖、40克红糖、25克酵母、8克琼脂，加入至1升双蒸水中搅拌均匀，放入微波炉中煮沸，待食物煮熟后，用保鲜膜覆盖、冷却，温度降至室温时加入2%防腐剂（由500 ml乙醇、125 ml乙酸、50 g对羟基苯甲酸甲酯混合而成），充分搅匀，并立即导入果蝇塑料管中，食物凝固后即可使用。znso4（cat#221376）购自sigma公司。使用的野生型对照果蝇 w1118 购买自商业果蝇库维也纳果蝇中心(vienna drosophila rnai centre 简称 vdrc)，货号为v#60000；mtnb-eyfp（mtnb 基因后带有 eyfp 荧光蛋白基因）果蝇来自于dr. walter schaffner实验室 (university of zurich, zurich, switzerland)；肿瘤模型来自于清华大学jose c.pastor-pareja副教授实验室，由其在许田教授实验室（laboratory of tian xu, dept. of genetics-hhmi yale school of medicine (usa)）读博士期间构建，基因型为:w; adv/cyo; uas-raf gof
frt82b scrib1/tm6b；自噬标志物果蝇atg8a-mcherry购买自vdrc，货号为v#37750。
31.本发明中 *表示 p 《 0.05，**表示 p 《 0.01，***表示 p 《 0.001。
32.实施例1：鸡皮胶原蛋白肽制备中酶种类和酶组合的选择为了使酶解的鸡皮胶原蛋白水解度高，多肽转化率高，本实验选用风味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶在适合的条件下进行酶解。首先，新鲜鸡皮除杂：鸡皮洗净，剔除可见脂肪，切块，乙醚石油醚浸泡24h，清洗至中性；然后，除杂蛋白：鸡皮碎块，5 % nacl 溶液浸泡12h，清洗干净，-20 ℃保存备用；最后，鸡皮酶解：除脂除杂蛋白鸡皮内加入超纯水，料液比 1:10（g/ml），按照酶的使用说明，调节ph和温度至酶的作用范围，酶解400min（如果是双酶水解则双酶水解时间合计为400min），85℃灭酶10min， 4℃条件下离心15min，取上清液浓缩、冷冻干燥，得到鸡皮胶原蛋白多肽，以鸡皮水解度（dh）和水解液中多肽含量为指标，分析不同酶的酶解效果。使用双指示剂甲醛滴定法测定氨基肽氮含量，凯氏定氮法测定总氮含量。水解度计算公式如下；使用 folin-酚比色法检测多肽转化率，计算公式如下：公式如下：结果如表1和表2所示。通过对各反应液的水解度和多肽转化率比较，发现风味蛋白酶和菠萝蛋白酶为较优的两种酶，而且以先采用风味蛋白酶、后采用菠萝蛋白酶组合水解效果最佳。
33.表1：不同蛋白酶酶解效果组别蛋白酶i水解度（dh）多肽转化率实验组1菠萝蛋白酶 9.03P.03%实验组2风味蛋白酶10.74G.56%实验组3胰蛋白酶4.15B.63%实验组4木瓜蛋白酶5.12C.55%表2：不同蛋白酶组合的酶解效果组别蛋白酶i蛋白酶ii水解度多肽转化率
1胰蛋白酶木瓜蛋白酶10.6548.362胰蛋白酶风味蛋白酶17.6949.633胰蛋白酶菠萝蛋白酶15.6751.554木瓜蛋白酶胰蛋白酶11.3548.135风味蛋白酶胰蛋白酶16.3249.866菠萝蛋白酶胰蛋白酶14.2750.487木瓜蛋白酶风味蛋白酶17.9650.748木瓜蛋白酶菠萝蛋白酶18.5651.879风味蛋白酶木瓜蛋白酶17.4549.7810菠萝蛋白酶木瓜蛋白酶16.9751.6311风味蛋白酶菠萝蛋白酶22.3553.4812菠萝蛋白酶风味蛋白酶20.12Q.96%实施例2：鸡皮胶原蛋白肽制备中风味蛋白酶和菠萝蛋白酶反应条件的选择为进一步优化鸡皮胶原蛋白肽制备中风味蛋白酶和菠萝蛋白酶最佳使用条件，将除脂、除杂蛋白的鸡皮碎块按照鸡皮与水1:10 (g/ml) 的比例将鸡皮加到ph值为中性的超纯水中，以鸡皮的水解度和多肽转化率为指标，分别考察菠萝蛋白酶和风味蛋白酶的最佳酶解条件，单因素条件设置具体如下：（1）酶解时间：分别考察菠萝蛋白酶和风味蛋白酶在合适的温度和同样的加酶量下，这两种酶在酶解 1、2、3、4、5、6 h 后的水解效果。
34.（2）加酶量：分别考察菠萝蛋白酶和风味蛋白酶在合适的温度和合适的酶解时间，添加鸡皮质量 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 %的菠萝蛋白酶或风味蛋白酶条件下的水解效果。
35.（3）酶解温度：分别考察菠萝蛋白酶和风味蛋白酶在合适的酶解时间和合适的加酶量，在 40、45、50、55、60、65
ꢀ°
c 条件下的水解效果。
36.由图1 中（a）可知，菠萝蛋白酶酶水解度和多肽转化率随着时间的增加而增加，当酶解 5 小时以后水解度和多肽转化率上升趋于平缓，这可能是由于随着酶解反应进行，反应底物减少从而减缓了酶解反应速度。考虑到时间成本，初步确定酶解反应时间为 5h。由图1中（b）可知，多肽转化率和水解度随着加酶量的增加而增加。随着加酶量超过 3%以后，多肽转化率和水解度的增长缓慢，这可能是受到底物浓度的限制。所以初步确定菠萝蛋白酶添加量为 3%。由图 1 中（c）可知，温度对酶解的影响很大，在温度低于 50 ℃时，温度的提升对多肽转化率影响不大，当酶解温度达到 55 ℃时，多肽转化率得到了大幅度的提升，并且水解度也达到了最大。随着温度的继续提升，多肽转化率和水解度都呈现下降的趋势。这是因为低温使酶活力降低，高温时酶容易变性，导致酶活力下降。因此采取 55 ℃为初步酶解温度。
37.由图2中（ a）可知，风味蛋白酶水解度和多肽转化率随着酶解时间的增加，呈现上升趋势。5 小时以后水解度和多肽转化率上升趋于平缓，考虑到时间成本，初步确定酶解反应时间为 5h。由图2 中（b）可知，随着酶添加量的增加，水解度和多肽转化率整体升高。当酶添加量高于 3 %后，水解度和多肽转化率的上升幅度有所减小，这可能是由于底物浓度限制了酶解速率。因此初步选取酶添加量为 3%。由图2中（c）可知，水解度和多肽转化率在
温度低于 60 ℃下时，随着温度的升高而增大，当温度达到 65 ℃时，水解度和多肽转率有所下降。所以选择 60 ℃为初步酶解温度。
38.实施例3：鸡皮胶原蛋白肽制备双酶解反应条件的选择在初步确定的酶解条件下，因为酶解最适温度受其他因素影响较小，所以选择风味蛋白酶和菠萝蛋白酶的添加量和酶解时间为因素，并以水解度和多肽转化率为指标进行正交试验，试验安排和结果见表3 所列。由表3中的 r 值可知，使用菠萝蛋白酶和风味蛋白酶水解鸡皮胶原蛋白时，各因素影响多肽转化率的程度为：b》a》c》d。各因素对水解度影响的程度为：a》d》c》b。选取最佳酶解条件为： a3b1c3d1，即料液比为 1:10 (g/ml) 的条件下，风味蛋白酶酶解温度为 60℃、风味蛋白酶添加量为 3 %、风味蛋白酶酶解时间为 4 h、菠萝蛋白酶酶解温度为 55℃、菠萝蛋白酶添加量为 3 %、菠萝蛋白酶酶解时间 4 h。通过实验验证此时的水解度为 25.37 %，多肽转化率为 55.74 %。表 3 正交实验结果
实施例4：鸡皮胶原蛋白肽制备基于实施例1-3的实验结果和优化的实验条件进行风味蛋白酶和菠萝蛋白酶水解制备鸡皮胶原蛋白。具体的，选择取鸡皮，洗净，除脂，除杂蛋白，绞碎，将预处理的鸡皮按料液比1:10(g/ml)的比例加水，调节ph至6.5-7.0，加入3 % (m/m) 的风味蛋白酶于60℃反应240min，酶解结束后85℃灭酶10min。再加入3 % (m/m) 的菠萝蛋白酶于55℃反应240min，酶解结束后85℃灭酶10min。6000 r/min，4℃条件下离心15min，取上清液浓缩、冷冻干燥，得到鸡皮胶原蛋白多肽。参见图3，酶解后的鸡皮胶原蛋白其分子量主要分布在4 kda左右，由此可知本发明获得的主要为小分子量多肽。对鸡皮胶原蛋白多肽（ccp ）的氨基酸成分进行检测，检测结果如表4所示，组成 ccp 主要为：脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸，符合胶原蛋白的基本构成。其中，必需氨基酸的含量高达 23.27 %，脯氨酸占 34.18 %。
39.表4.鸡皮胶原蛋白肽氨基酸成分表疏水氨基酸含量(%)亲水氨基酸含量(%)gly 8.52asp2.23ala12.57thr3.52val 4.92ser5.29leu 5.56arg4.09ile 3.35his2.50pro34.18cys0.39phe 1.46lys4.46met 2.37tyr1.91
ꢀꢀ
glu2.68实施例5：本发明制备的鸡皮胶原蛋白肽的自由基清除能力测试分别测定dpph 清除率及氧化自由基oh-清除率以反映鸡皮胶原蛋白肽（ccp）的自由基清除能力。方法如下：(1) dpph 清除：取鸡皮胶原蛋白肽冻干粉，配制成不同浓度胶原蛋白肽溶液，取 2 ml dpph 溶液与 2 ml 样品液混合摇匀在黑暗处反应 30 min，于 517 nm 波长处测定其吸光值。抑制率计算公式如下：式中：ai为 dpph 与样品的混合液；aj为乙醇与样品的混合液；a0为 dpph与水的混合液(2) oh-清除：取 16.0 ml 浓度为 6 mmol
·
l-1
水杨酸乙醇溶液，2.0 ml 浓度为 6 mmol
·
l-1
的硫酸亚铁溶液和 2.0 ml 浓度为 6 mmol
·
l-1
的 h2o2水溶液，与 5.0 ml不同浓度的多肽溶液混合。将混合物放在 37 ℃水浴锅中 15 min，在波长为 510 nm处测定吸光度(a
x
)。用5.0 ml蒸馏水代替多肽溶液，按照上述方法测定吸光值，记录作为空白(a0)。用2 ml 蒸馏水代替2.0 ml浓度为 6 mmol
·
l-1
的h2o2水溶液，按照上述方法测定吸光值，记录作为对照(a
x0
)。羟基自由基（oh-）清除率计算公式如下：
参见图4所示，ccp 浓度与 dpph的清除效率呈正相关。通过软件分析可得，dpph 清除率和 ccp 浓度符合线性方程 y = 0.0073x 0.2292， (r2= 0.9968) 。半抑制浓度 ic
50
为 37.09 mg/ml。ccp清除 oh-的能力如图4中（b）所示，ccp 与 oh-的清除率依然呈正相关，通过软件分析可得，oh-清除率和多肽浓度符合线性方程 y = 0.0649x 0.3013，(r2=0.9903) 。半抑制浓度 ic
50
为 3.06 mg/ml，由此可以看出，本发明制备的ccp对于 dpph以及oh-都有较好的清除效果，ccp 对 oh-的清除效果要优于 dpph。
40.实施例6：鸡皮胶原蛋白肽-锌螯合物的制备及反应条件选择将制备得到的鸡皮胶原蛋白多肽（ccp）溶于超纯水配置成5%的多肽溶液，进行多肽与含锌离子化合物的螯合，螯合条件ph6.5，螯合时间1h，肽锌比1:1，螯合温度37℃。采用 edta络合滴定法测定螯合率，结果如表5所示，znso4是理想的并且安全的可以用于与鸡皮胶原蛋白肽螯合的。螯合率计算公式如下：表5.不同化合物与鸡皮胶原蛋白多肽螯合的螯合率化合物znso4zncl2醋酸锌葡萄糖酸锌柠檬酸锌螯合率75.68g.54p.20e.16h.35%由表5可知，鸡皮胶原蛋白多肽与硫酸锌的螯合结合能力最强。为进一步提高鸡皮胶原蛋白肽与硫酸锌的螯合能力，本发明对相关的反应条件进行进一步的优化。将制备的鸡皮胶原蛋白肽粉末（ccp），溶于超纯水中，配制成 5 %的多肽溶液，进行多肽与znso4螯合，以鸡皮胶原蛋白肽与锌离子的螯合率为指标，探究最佳螯合条件，分析螯合 ph、螯合时间、不同肽锌质量比、螯合温度对螯合效果的影响，单因素条件设置具体如下：1) ph 值：考察在肽锌质量比 2:1、螯合温度 40 ℃、螯合时间 40 min 和溶液ph 值分别为 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 条件下的螯合效果。
41.2) 时间：考察在肽锌质量比 2:1、螯合温度 40℃、溶液 ph 值 6.5 和螯合时间分别为 30、40、50、60、70、80 min条件下的螯合效果。
42.3) 肽锌质量比：考察在螯合温度 40℃、溶液 ph 值 6.5、螯合时间 40 min和肽锌质量比分别为 0.1:1，0.2:1，0.5:1，1:1、3:2、4:2、5:2、6:2、7:2 条件下的螯合效果。
43.4) 螯合温度：考察在肽锌质量比 2:1、溶液 ph 值 6.5、螯合时间 40 min 和螯合温度分别为 30、40、50、60、70、80 ℃条件下的螯合效果。
44.结果如图5所示。螯合率随着 ph 值增大，呈现出先增大后减小的趋势。这是因为当 ph 值较小时，溶液呈酸性，多肽因较低的 ph 值会发生沉降，当 ph 达到 6.5时，螯合率最高。当 ph 值逐渐增大，znso4在碱性条件下会发生沉降，所以当 ph较大时也会阻碍螯合反应的发生。所以初步确定最佳螯合 ph 值为 6.5。随着时间的增加，螯合率整体呈现上升趋势，当螯合时间大于 40 min后螯合率的增长趋势有所减缓。这可能因为当螯合时间达到 40 min时，螯合反应已经基本完成，后续随着时间增加，螯合率增长缓慢。随着 ccp 所占的比例增加，螯合率呈现出整体上升的趋势，肽锌质量比从 1:5到 1:1这个阶段是螯合率激增的阶段，之后随着多肽占比的增加，螯合率增加的程度不高。螯合率在 30℃~50℃之间随着温度的升高而增加，当温度高于60℃时，螯合率开始缓慢下降。这是因为多肽与锌螯合时属于吸热反应，温度的升高有利于反应进行，但随着温度的持续升高，高温会破坏螯合
物的结构，50℃时螯合率最高。
45.选取肽锌质量比(x1)、温度(x2)、时间(x3)、ph(x4)为自变量，以螯合率为响应值。使用 design expert 软件选用 box-behnken 模型对 ccp 与 znso4螯合反应建立 4 因素 3 水平的响应面优化实验设计。变量因素编码水平见表6。
46.表6 响应面因素编码及水平响应面实验参数与设计结果见表7，将实验数据回归拟合后，得到的螯合率(y)回归方程为：y（螯合率）=87.38 5.84* x1 0.97* x2 3.67* x3 5.47* x4 0.17* x1x
2-1.64* x1x3 0.022* x1x
4-0.81* x2x3 3.37* x2x
4-1.022* x3x
4-5.45* x
12-3.21*x
22-10.096* x
32-5.18* x
42
表7 响应面实验参数与结果实验号x1x2x3x4螯合率/10-167.35200-1-165.7530-10183.74110086.375100188.756100-175.5770-1-1063.278-100-162.799-101070.8810-10-1061.6711000087.6512000086.371310-1075.8914-1-10073.5915010186.9516-100175.8817000088.5618000085.7719001178.5920-110074.75
21011081.2722000088.59231-10084.532400-1174.66250-10-177.5826001-173.77270-11075.062801-1072.7329101078.53对回归模型进行方差分析，结果见表 8 所列。从表 8 可以看出，模型 f 值为 14.15，prob》f 小于 0.0001，说明该模型极为显著。模型 r2=0.9340，说明模型预计结果与实际结果较为吻合，预测值与实际值之间有着较好的相关性，实验误差较小，可以用于鸡皮胶原蛋白肽与锌螯合工艺实验的分析和预测。另外，表 8结果也表明，有三个因素：肽锌比、ph 值和时间在实验中起着主要作用，并且 ph值和肽锌比的影响最为显著，表明两者对螯合率的影响最大，由结果可知温度变化对于螯合率的影响不大。经方差分析得 x1、x4、x
32
极为显著；x3、x
12
、x
42
对模型的影响较为显著； x
22
和 x2x4对模型的影响也有显著。由方差分析结果可知，各个因素对螯合率的影响不是线性的，而是呈着二次关系。
47.表8 回归模型方差分析
项平方和自由度均方f值prob》f显著性模型1803.6514128.8314.15《0.0001significantx
1-肽锌比409.271409.2744.95《0.0001***x
2-温度11.39111.391.250.2822 x
3-时间162.291162.2917.820.0009**x
4-ph359.931359.9339.53《0.0001***x1x20.1210.120.0130.9119 x1x310.79110.791.190.2947 x1x42.03e-0312.03e-032.22e-040.9883 x2x32.6412.640.290.5987 x2x445.43145.434.990.0423*x3x44.1814.180.460.509 x
12
193.071193.0721.210.0004**x
22
66.92166.927.350.0169*x
32
661.281661.2872.63《0.0001***x
42
174.61174.619.180.0006**残差127.46149.1
ꢀꢀꢀ
失拟项120.921012.097.390.0344notsignificant纯误差6.5441.64
ꢀꢀꢀ
总和1931.1128
ꢀꢀꢀꢀ
注：“***”为差异极显著，p 《0.001；“**”为差异高度显著，p 《0.01；“*”为差异显著，p《0.05。
mtnb引物序列如下：rp49-f：5
’‑
gcaccaagcacttcatcc-3’rp49-r：5
’‑
cgatctcgccgcagtaaa-3’mtnb-f：5
’‑
tcgcctcagccaagtgaaag-3’mtnb-r：5
’‑
cccattcttgcaaacgcact-3’表9 逆转录反应体系组分
ꢀꢀ
体积/质量总rna1μganchoredoligo(dt)
18
primer
ꢀꢀ
1μl2
×
esreactionmix 10μleasyscript
®
rt/rienzymemix 1μlgdnaremover
ꢀꢀꢀ
1μlrnase-freewater variabletotalvolume
ꢀꢀ
20μl表10 扩增反应体系组分终浓度 体积双蒸水
ꢀꢀ
variable模板dna1μgvariable引物混合物0.8μm1.6μleasy-load
™
pcrmastermix1
×
10μl总体积
ꢀꢀ
20μl结果参见图8所示，a: 缺锌果蝇模型体型小于正常果蝇,n≥10； b: 缺锌果蝇模型体长统计，n=20；c: 缺锌果蝇模型体重统计，n=30。由图8中a和b所示，缺锌果蝇幼虫其身体相比于正常食物(normal food，nf)喂养的果蝇幼虫更加瘦小，由图8 中c 可以看出缺锌模型果蝇体重更轻。这些结果说明缺锌果蝇模型也会出现体格瘦小、发育不良的问题。这些结果与锌缺乏影响大鼠的生长发育相一致。
54.结果如图8所示，d: rt-pcr 检测果蝇全身 mtnb 表达水平 n=10；e: 使用 zinpyr 染料处理果蝇脂肪体组织，检测果蝇脂肪体细胞质内的锌离子水平，n≥6；f: 果蝇脂肪体内锌离子水平量化，缺锌组（zd）果蝇脂肪体内锌离子水平显著低于正常组（nf）。由图 8 中d 可知，缺锌果蝇幼虫体内的 mtnb 表达水平相对于对照组有所下降。经 zinpyr染色，荧光显微镜拍摄后，由图 8中 e和 f 可以看出，相比于 nf 喂养的果蝇幼虫，缺锌食物上生长的果蝇幼虫脂肪体细胞质中的锌水平大幅度下降，大约降低了50 %。由此可知，喂养在添加 50μm tpen 食物上的果蝇幼虫体内锌离子水平要低于正常果蝇幼虫，缺锌果蝇模型造模成功。
55.（4）cpp-zn生物利用率测试：为了检测 cpp-zn 的生物利用率，将上述构建成功的果蝇缺锌模型子代三龄幼虫，转移到正常食物、添加 znso
4 (3 mm)、添加 ccp-zn（含有3 mm znso4）的食物中，喂养48h按照上述技术方法检测其体内的补锌效果。
56.结果参见图9所示，a: 使用 zinpyr 染料处理果蝇脂肪体组织，检测果蝇脂肪体细胞质内的锌离子水平，n≥6；b: 果蝇脂肪体内锌离子水平量化图；c: 果蝇全身 mtnb 表
达水平 n=10；d: mtnb 表达水平量化图。由图9 中a 和图 9 中b可以看出，将缺锌子代三龄幼虫转移喂养在添加 znso4和ccp-zn食物中时，果蝇幼虫脂肪体细胞内锌离子水平均有所大幅度提高。与znso4添加组相比，ccp-zn 添加组中的缺锌果蝇幼虫脂肪体细胞质内锌离子水平大约提升了 22.9 %。由图9中 c 和图 9中 d 可知，cpp-zn 膳食添加组中，缺锌果蝇全身mtnb 水平比 znso4膳食添加组要高。由此可以看出，cpp-zn 相比于无机锌有着更高的生物利用率，具有更好的补锌效果。
57.实施例9：鸡皮胶原蛋白肽-锌螯合物抗肿瘤活性检测肿瘤眼成虫盘或者脑复合体荧光成像: 选取肿瘤模型果蝇幼虫，喂养在基础膳食中加入 znso4(3mm)、ccp-zn含有3 mm znso4）、鸡皮胶原蛋白肽（chicken collagen peptide，ccp）的食物中，大约 7 d 或 12 d 收集肿瘤幼虫，在低温 1
×
pbs 缓冲液中解剖，将暴露出的眼-触角成虫盘（eye-antennal disc）或者脑复合体（cephalic complex）等组织迅速转移至 4%多聚甲醛缓冲液（1
×
pbs 配置），室温固定 10 min，于 pbs 中洗 3~4次，每次 10 min，以除去残留的甲醛，最后置于载玻片上利用nikon ti2荧光显微镜观察肿瘤表型。
58.结果如图10中a和d所示，观察 7 d ael (after egg laying )肿瘤果蝇的眼成虫盘和 12 d ael 脑复合体，与正常膳食相比，食物中添加 3 mm znso4、ccp-zn 和ccp多肽均具有良好的抑制肿瘤生长的效果。参见图10中b、c所示，利用 image j 软件，统计肿瘤的大小和荧光强度，与正常膳食相比，7 d 时添加 znso4、ccp 以及 ccp-zn ael 果蝇肿瘤大小分别下降了 32 %、29 %和 61 %。参见图10中e、f所示，12 d 时添加 znso4、ccp 以及 ccp-zn ael果蝇肿瘤大小分别下降了 21 %、12 %和 44 %。7 d 时添加 znso4、ccp 以及ccp-zn ael 果蝇肿瘤荧光强度分别下降了 18 %、12 %和 27 %。12 d ael时添加znso4、ccp 以及 ccp-zn果蝇肿瘤荧光强度分别下降了 16 %、13 %和 33 %。正常膳食，7 d，n≥20；znso4，7 d，n≥20；ccp-zn，7d，n≥20；ccp，7d，n≥20；正常膳食，12 d，n≥20；znso4，12d，n≥20；ccp-zn，12d，n≥20；ccp，12d，n≥20。综上所述，膳食中添加 znso4和ccp能够明显的抑制体内肿瘤生长，并且 ccp-zn 具有更佳的抑制体内肿瘤生长效果。
59.实施例10鸡皮胶原蛋白肽-锌螯合物的抗肿瘤侵袭（1）12 d肿瘤侵袭vnc程度分级：为了明确肿瘤侵袭程度，将12 d肿瘤侵袭腹神经索(vnc) 的程度按照由弱到强分为3 个等级，如图 10 中g 所示，其中 1 级表示在 vnc 中未发现肿瘤细胞，2 级表示vnc 有零星或很小部分肿瘤细胞，3 级表示 vnc 有部分肿瘤细胞。
60.参见图10中（g）所示，在 12 d ael 时，喂养在四组食物上的 raf
gof
scrib-/-模型的vnc都有不同程度的肿瘤细胞侵袭，znso4、ccp和ccp-zn能够改善恶性肿瘤的侵袭vnc的行为， ccp-zn的抑制肿瘤侵袭的效果优于znso4和ccp。
61.（2）肿瘤果蝇全身荧光成像: 为了观察肿瘤细胞远处迁移状况，利用整只肿瘤果蝇置于荧光显微镜下观察。具体操作步骤如下：收集 12 d ael 果蝇幼虫，在 1
×
pbs 缓冲液中清洗掉幼虫表面沾染的食物，将洗净的幼虫置于载玻片上，加上 1
×
pbs 缓冲液，再用载玻片压制，置于荧光显微镜下。注意：为了防止幼虫爬行，会影响荧光拍照，因此使用载玻片压制；盖上层载玻片时需要轻轻按压，否则会破坏幼虫全身或组织器官，并且每个载玻片上只放一只幼虫，利用nikon ti2荧光显微镜观察肿瘤侵袭表型。
62.参见图10中（h）所示，果蝇肿瘤模型全身可以很好地观察肿瘤细胞是否发生远处转移，果蝇肿瘤模型是通过遗传手段，在果蝇眼成盘发育早期形成肿瘤，随着时间的增长，肿瘤细胞会侵袭到周围的组织或器官，如脑子、腹神经索(vnc)等，或转移到远处组织或器官，如肠子、脂肪体及血淋巴等。图10中（h）展示了将肿瘤果蝇喂养在添加znso4、ccp 和 ccp-zn 食物中后肿瘤细胞的侵袭情况，在膳食中添加 znso4、ccp 和 ccp-zn 均可以明显的减少体内肿瘤细胞的远处侵袭。
63.实施例11鸡皮胶原蛋白肽锌螯合物抑制肿瘤微环境自噬和远处自噬自噬在肿瘤的发生发展过程中具有双向调控作用。在肿瘤发生发展的前期自噬具有抑制肿瘤形成的作用；在后期自噬又帮助肿瘤增值和侵袭。据文献报道，在果蝇ras
v12
scrib-/-恶性肿瘤模型中，会激活肿瘤细胞自噬及其微环境中正常细胞的非自主性自噬，主要激活的非自主性自噬能够促进肿瘤生长。
64.如图11所示，ras
gof
scrib-/-肿瘤模型同样激活了肿瘤细胞自主性自噬（黑色箭头标记）和微环境中非自主性自噬（白色箭头标记）；参见图11中（a）所示，利用atg8a-mcherry 信号，即点状的形成可被视为自噬体标记物，荧光显微镜下观察 7 d ael 眼成虫盘自主性自噬（黑色箭头所指）和非自主性自噬（白色箭头所指）n≥6。参见图11中（b）展示膳食中添加 znso4、ccp 和 ccp-zn 对12 d ael肿瘤果蝇自噬水平的影响，观察肿瘤果蝇脑复合体和 vnc 部位，n≥ 6。
65.由此可见，在膳食中添加znso4、ccp和ccp-zn可以明显抑制体内非自主性自噬。 ccp-zn 添加到膳食中可以抑制肿瘤的生长，同时也可以抑制肿瘤细胞引起的非自主性自噬。当肿瘤细胞转移至 vnc，自噬伴随着肿瘤细胞的形成；ccp-zn抑制肿瘤侵袭过程，自噬也相应减少，自噬始终伴随着肿瘤。肿瘤细胞的生长需要合适的环境，在肿瘤转移前，发生性肿瘤细胞可能会分泌细胞因子对靶器官进行改造，从而使肿瘤细胞适合生长。因此，我们猜测自噬是伴随着肿瘤细胞，帮助肿瘤细胞生长和侵袭，为肿瘤细胞提供能量和营养物质。当肿瘤细胞侵袭，自噬同样帮助新定植的肿瘤细胞生长和侵袭。
66.实施例12鸡皮胶原蛋白肽锌螯合物抑制肿瘤的氧化应激水平（1）选取12 d ael肿瘤模型果蝇，取10只果蝇幼虫，采用trizol 法提取全虫rna。按照全式金生物反转录试剂盒（easyscript
® first-strand cdna synthesis supermix，货号ae301-02）使用说明，对提取的 rna 逆转录。提取果蝇幼虫全身 rna，利用rt-pcr技术检测三龄幼虫全虫sod1、sod2 mrna水平。
67.引物序列：sod1-f：5
’‑
taagctgctctgctacggtc-3’sod1-r：5
’‑
gtaccgctgctctcctgttc-3’sod2-f：5
’‑
atctaaatgccgccgaggag-3’sod2-r：5
’‑
tcttgttgggcgagaggttc-3’(2) mda水平检测蛋白质提取：果蝇幼虫放入普通离心管中，加入pbst（含有蛋白酶抑制剂），置于冰上，经过研磨杵研磨，再用bca试剂盒测定蛋白浓度，并将样品蛋白浓度调成一致。
68.试剂盒准备工作：按照试剂盒说明配置储存液和工作液。
69.样品测定：样品加入mda工作液100 ℃水浴加热15分钟冷却至室温1000 g室温离心10分钟532 nm测定吸光度可参考表11设置检测反应体系：表11反应体系 空白对照标准品样品匀浆液、裂解液或pbs0.1ml－－标准品－0.1ml－待测样品－－0.1mlmda检测工作液0.2ml0.2ml0.2ml肿瘤细胞的侵袭和转移需要一系列细胞内适应和细胞外重塑，包括细胞粘附减少、细胞骨架破坏、迁移增加和细胞外基质变化等。ros有助于维持细胞骨架动力，参与肿瘤细胞的伪足形成，利于肿瘤细胞的侵袭和转移。ros水平升高引起的细胞自噬增加和肿瘤细胞转移密切相关。丙二醛（malondialdehyde，mda），在肿瘤细胞中检测mda可反映肿瘤引起的脂质过氧化程度，从而反映体内氧化应激水平。我们通过检测ccp-zn的添加对12 dael 肿瘤模型果蝇体内mda水平的影响，结果如图12 中a所示。在膳食中添加znso4后mda水平下降了50 %，添加ccp后mda水平下降了53 %，添加ccp-zn后mda水平下降了58 %。由此可知膳食中添加znso
4、
ccp和ccp-zn均可以降低肿瘤模型果蝇体内的氧化应激水平，其中ccp-zn效果最佳。
70.机体对氧化应激的感知以及代谢受到多种氧化还原相关基因的调控，例如超氧化物歧化酶 (sod) 在这一过程中起到了重要作用。我们利用rt-pcr实验检测肿瘤模型果蝇12 d ael时体内sod1、sod2的mrna水平。果蝇体内sod水平如图12 中b、c、d所示，在膳食中添加znso4、ccp和ccp-zn后，肿瘤果蝇体内的sod1和sod2 mrna水平均有所下降，（分别下降了sod1：12 %、14 %、18 %，sod2：6 %、13 %、19 %）。结合图12中 a的数据，肿瘤果蝇体内的表现出高氧化应激水平，添加znso
4、
ccp和ccp-zn后均可以降低肿瘤模型果蝇体内的氧化应激水平，我们推断肿瘤果蝇体内氧化应激水平下降后，抗氧化基因受到负反馈调节，所以sod1和sod2的mrna有所下降。由此我们得知，肿瘤果蝇体内氧化应激水平上升会引起细胞的自噬，从而促进肿瘤细胞的生长和侵袭，当膳食中添加ccp-zn等时，会降低肿瘤果蝇体内的氧化应激水平和细胞自噬水平，从而抑制肿瘤细胞的生长和侵袭。
71.综上所述，本发明制备了一种鸡皮胶原蛋白多肽锌螯合物，具有补充微量元素锌和氨基酸的双重功效。与无机锌相比，鸡皮胶原蛋白多肽锌螯合物具有更高的锌生物利用率，并具有良好的抗肿瘤和抗氧化特性，有很高的开发价值和应用前景，同时能够提高肉鸡生产过程中产生的下脚料的附加值，为禽类加工过程中产生的下脚料的利用开辟新的途径，具有广阔的市场前景。
72.以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。