抗原呈递细胞模拟支架及其制备和使用方法

抗原呈递细胞模拟支架及其制备和使用方法
1.本技术是申请日为2017年7月13日和发明名称为“抗原呈递细 胞模拟支架及其制备和使用方法”的201780054844.6号发明专利申请 的分案申请。
2.相关申请
3.本技术要求2016年7月13日提交的美国临时专利申请号no. 62/361,891的优先权，将其完整内容特意按引用并入本文中。
[0004][0005]


背景技术：

[0006]
涉及t淋巴细胞(t细胞)的启动(priming)和扩增的免疫治疗 对癌症和传染病的治疗仍然抱有希望，特别是在人类中(melief等， immunol.rev.145:167-177(1995)；riddell等，annu.rev.immunol. 13:545-586(1995))。目前在病毒感染和/或癌症患者中的过继性转 移的研究涉及输注已经在自体同源的树突状细胞(dc)、病毒感染 的b细胞和/或同种异体的饲养细胞上体外刺激、克隆和扩增多周的t 细胞(riddell等，science 257:238-241(1992)；yee等，j.exp.med. 192:1637-1644(2000)，brodie等，nat.med.5:34-41(1999)；riddell 等，hum.gene ther.3:319-338(1992)，riddell等，j.immunol.methods 128:189-201(1990))。然而，由于过继性t细胞免疫治疗临床试验 常常需要数十亿的细胞(riddell等，1995)，现有的体外t细胞扩 增方案常常不足以满足这样的试验的需求。
[0007]
此外，最佳的移植在再灌注时需要使用功能性的t细胞，而不是 衰老的t细胞。对于临床应用，重要的是确保t细胞具有所需的功能 性，即，它们以所需的方式增殖、执行效应子功能和产生细胞因子 (liebowitz等，current opinion oncology，10，533-541，1998)。 在自然环境中，通过与抗原呈递细胞(apc)表面上的主要组织相容 性复合物(mhc)分子结合的肽-抗原的t细胞受体/cd3复合物 (tcr/cd3)的啮合来启动t细胞激活(schwartz，science 248:1349)。 尽管这是t细胞激活中的主要信号，但对于完全激活，还需要apc 和t细胞之间的其他受体-配体相互作用。例如，在没有其他分子相 互作用的情况下，tcr刺激可以诱导无能(anergy)状态，使得这些 细胞不能响应再刺激时的完全激活信号(schwartz，1990；harding 等，nature 356:607，1992；dudley等，clinical cancer research.，16， 6122-6131，2010；rosenberg等，clinical cancer research.，17， 4550-4557，2011)。在可选方式中，通过单独的tcr啮合激活时， t细胞可能通过程序化细胞死亡(凋亡)而死亡(webb等，cell 63:1249，1990；kawabe等，nature 349:245，1991；kabelitz等，int. immunol.4:1381，1992；groux等，eur j.immunol.23:1623，1993)。
[0008]
因此，通过使用第二信号传导分子，例如，膜结合蛋白或apc 的分泌产物，可以给予最佳的功能性。在膜结合蛋白的情况中，这样 的次级相互作用通常在性质上是粘附性的，加强了两个细胞之间的接 触(springer等，ann.rev.immunol.5:223，1987)。还可能涉及其他 信号传导分子，如其他激活信号从apc传导至t细胞(bierer等， adv.cancer res.56:49，1991)。例如，cd28是存在于人类中的80％ 外周t细胞上的表面糖蛋白并且存在
于静息和激活的t细胞上。cd28 结合b7-1(cd80)或b7-2(cd86)并且是已知的共刺激分子最有效 的之一(june等，immunol.today 15:321(1994)，linsley等，ann. rev.immunol.11:191(1993))。t细胞上的cd28连接与tcr啮合 结合诱导白细胞介素-2(il-2)的产生(june等，1994；jenkins等，1993；schwartz，1992)。分泌的il-2是用于离体t细胞扩增的重要 因子(smith等，ann.n.y.acad.sci.332:423-432(1979)；gillis等， nature 268:154-156(1977))。
[0009]
t细胞的共刺激已经显示出影响t细胞激活的多种方面(june等， 1994)。其降低了诱导培养物中的增殖响应需要的抗cd3的浓度 (gimmi等，proc.natl.acad.sci.usa 88:6575(1991))。cd28共 刺激也通过基因表达的转录和转录后调控显著增强了辅助t细胞的 淋巴因子产生(lindsten等，science 244:339(1989)；fraser等，science 251:313(1991))，并且可以激活细胞毒性t细胞的细胞溶解潜能。 体内cd28共刺激的抑制可以阻断异种移植排斥，并且同种异体移植 排斥显著延迟(lenschow等，science 257:789(1992)；turka等， proc.natl.acad.sci.usa 89:11102(1992))。
[0010]
更重要地，上述用于刺激/共刺激性刺激的效应子已经广泛用于体 外t细胞操纵的情况中。在这点上，抗cd3单克隆抗体(第一信号) 和抗cd28单克隆抗体(第二信号)的结合最常用于刺激apc。将抗 体固定于固体表面上时，抗cd3和抗cd28单克隆抗体提供的信号被 最佳地递送至t细胞，所述固体表面如塑料板(baroja等，cellularimmunology，vol.120,205-217，1989；damle等，the journal ofimmunology，vol.143，1761-1767，1989)或琼脂糖珠(anderson等， cellular immunology，vol.115，246-256，1988)。还参见授权于june 等的美国专利no.6,352,694。
[0011]
已经研发了含有抗cd3和抗cd28单克隆抗体的各种表面和试 剂，用于获得和扩增用于各种应用的t细胞。例如，levine等(thejournal of immunology，vol.159，no.12:pp.5921-5930，1997)公开 了含有抗cd3和抗cd28单克隆抗体的具有4.5微米(μm)直径的 甲苯磺酰基-激活的顺磁珠，其可以用于刺激和增殖t细胞并诱导它 们产生促炎性细胞因子。还已经证明，用这些珠子激活的t细胞呈现 出使其可能用于过继性免疫治疗的特性，如细胞因子产生(garlie等， j immunother 22(4):336-45，1999；shibuya等，arch otolaryngol headneck surg，vol.126,no.4:473-479，2000)。这些珠可以依据商品名 dynabeads cd3/cd28 t-细胞扩增从thermo-fisher scientific,inc. 购得。
[0012]
在细胞疗法中使用用于t细胞扩增的具有固定的单克隆抗体的 顺磁珠需要在患者输注前从t细胞分离和除去珠子。这是非常费力的 过程并且导致细胞损耗、细胞损伤、提高的污染风险和增加的加工成 本。由于珠子上固定的单克隆抗体与靶t-细胞表面上的相应配体的紧 密结合，从t细胞除去珠子是困难的。常常通过等待直至t细胞将靶 抗原内在化并且随后使用机械破坏技术来分离珠子与t细胞，从而分 离珠-细胞缀合物。这种技术可以引起t细胞的损伤并且还可以引起t 细胞上连接的抗原从细胞表面除去(rubbi等，journal of immunologymethods，166，233-241，1993)。此外，由于激活的t细胞对于用 于细胞治疗方案中常常是最需要的，并且在24-72小时等待时间期间 失去理想的细胞特性，因此顺磁分离在过继性细胞治疗情况中具有有 限的使用。
[0013]
用于分离和纯化粘附于顺磁珠的细胞的技术在临床情况中也是 不可用的。例如，与t细胞分离后取出顺磁珠的方法需要将细胞/珠 溶液通过磁铁。这个方法尽管在很大程
度上降低了保持与t细胞一起 的珠子数量，但没有完全消除珠子。将含有珠子的组合物植入患者中 可以引起毒性作用。珠除去过程也降低了可用于治疗的t细胞的数 量，因为许多t细胞保持与顺磁珠相结合，即使在机械解离后。对于 经操纵但没有另外结合于珠子的t细胞，也发生了一定的细胞损失， 因为这些细胞在内在化和/或机械去除步骤前洗掉了。
[0014]
因此，对于允许t细胞分离的组合物和方法存在着尚未满足的需 求，所述t细胞可以容易地用于人类疾病的治疗，如免疫缺陷障碍、 自身免疫障碍和癌症。以下详细描述的本发明的实施方式解决了这些 需求。


技术实现要素：

[0015]
本发明提供了用于操纵(例如，激活、刺激、扩增、增殖或赋能) t细胞的组合物和方法。在这一点上，本发明的实施方式提供了用于 产生大量激活的t细胞(或基本上纯的亚群)的方法，所述激活的t 细胞表达某些标志物和/或细胞表面受体或产生对于t细胞介导的免 疫应答最佳的某些细胞因子。这样操纵的t细胞可以用于许多疾病的 治疗和预防中，如癌症、传染病、自身免疫疾病、过敏、与衰老相关 的免疫功能障碍，或其中对于治疗需要t细胞的任何其他疾病状态。 本文中所述的另外的实施方式涉及通过利用具有最佳反应性的t细 胞有效地治疗上述任一疾病的方法和组合物，所述细胞使用本发明的 组合物和/或方法选择或筛选。本发明的组合物和方法比现有的组合物 和方法更有效，不仅是对于产生大量的激活的t细胞的能力而言，而 且还涉及这样的t细胞在体内环境中显著提高的有效性。因此，本发 明的组合物和方法对于产生用于移植、自体转移和用于治疗应用的高 度合乎需要的人t淋巴细胞是有用的。
[0016]
因此，在一个实施方式中，本发明提供了抗原呈递细胞模拟支架 (apc-ms)，其包括包含高表面积介孔二氧化硅微棒(msr)的基 底层；于msr基底层成层上的连续的、流体支撑的脂质双层(slb)； 吸附于支架上的多种t细胞激活分子和t细胞共刺激分子；和吸附于 支架上的多种t细胞稳态剂(homeostatic agent)。
[0017]
在一个实施方式中，本发明提供了抗原呈递细胞模拟支架 (apc-ms)，其隔离(sequester)选自自然杀伤(nk)细胞、cd3 t细胞、cd4 t细胞、cd8 t细胞和调节t细胞(treg)的t细胞， 或其组合。
[0018]
在一个实施方式中，本发明提供了含有多种吸附于slb层上的t 细胞稳态剂的抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)。
[0019]
在一个实施方式中，本发明提供了含有多种吸附于msr层上的 t细胞稳态剂的抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)。
[0020]
在一个实施方式中，本发明提供了含有多种以受控释放方式从支 架释放的t细胞稳态剂的抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)。在一 些实施方式中，所述t细胞稳态剂在1天、2天、3天、4天、5天、 6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、 16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25 天、30天、35天、40天、45天、50天、60天、1个月、2个月、3 个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或更长的时 间段内以受控释放方式从支架释放。
[0021]
在一个实施方式中，本发明提供了含有多种以持续方式从支架释 放长达15天的t细胞稳态剂的抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)。 在一些实施方式中，t细胞稳态剂以持续
方式从支架释放长达1天、 2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12 天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21 天、22天、23天、24天、25天、30天、35天、40天、45天、50 天、60天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个 月、8个月、9个月或更长。在一些实施方式中，t细胞稳态剂以持 续方式从支架释放至少30天。在一些实施方式中，t细胞稳态剂以 持续方式从支架释放至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、 8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17 天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、30 天、35天、40天、45天、50天、60天、1个月、2个月、3个月、4 个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或更长。
[0022]
在一个实施方式中，本发明提供了含有多种t细胞稳态剂的抗原 呈递细胞模拟支架(apc-ms)，所述t细胞稳态剂选自il-1、il-2、 il-4、il-5、il-7、il-10、il-12、il-15、il-17、il-21和转化生长因 子β(tgf-β)，或其激动剂，其模拟物，其变体，其功能性片段， 或其组合。
[0023]
在一个实施方式中，本发明提供了含有多种t细胞稳态剂的抗原 呈递细胞模拟支架(apc-ms)，所述t细胞稳态剂是il-2，其激动 剂，其模拟物，其变体，其功能性片段，或其与选自il-7、il-21、il-15 和il-15超激动剂的第二稳态剂的组合物。在一个实施方式中，所述t细胞稳态剂可以选自包含il-2的前30个氨基酸(p1-30)的n-末端 il-2片段、il-2superkine肽和il-2部分激动剂肽，或其组合。
[0024]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有多种激活和共刺激分子的 抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)，其中t细胞激活分子和t细胞 共刺激分子各自独立地吸附于流体支撑的脂质双层(slb)上。在一 个实施方式中，t细胞激活分子和t细胞共刺激分子可以通过亲和性 配对或化学偶联吸附。在一些实施方式中，化学偶联包括点击化学试 剂(例如，dbco或叠氮化物)。在一个实施方式中，t细胞激活分 子和t细胞共刺激分子可以通过亲和性配对吸附，所述亲和性配对包 括生物素-抗生物素蛋白链菌素对、抗体-抗原对、抗体-半抗原对、适 体亲和性对、捕获蛋白对、fc受体-igg对、金属-螯合脂质对、金属
‑ꢀ
螯合脂质-组氨酸(his)标记蛋白对，或其组合。在一个实施方式中， t细胞激活分子和t细胞共刺激分子可以通过化学偶联吸附，所述化 学偶联包括叠氮化物-炔烃化学(aac)反应、二苯并-环辛炔连接 (dcl)或四嗪-烯烃连接(tal)。
[0025]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有多种激活和共刺激分子的 抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)，其中t细胞激活分子和t细胞 共刺激分子各自独立地覆盖于流体支撑的脂质双层(slb)上。或者， 在另一个实施方式中，本发明涉及含有多种激活和共刺激分子的抗原 呈递细胞模拟支架(apc-ms)，其中t细胞激活分子和t细胞共刺 激分子各自独立地部分包埋在流体支撑的脂质双层(slb)上。
[0026]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有多种激活和共刺激分子的 抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)，其中t细胞激活分子和t细胞 共刺激分子各自独立地吸附于介孔二氧化硅微棒(msr)上。
[0027]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有多种激活和共刺激分子的 抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)，其中t细胞激活分子和t细胞 共刺激分子各自独立地是抗体分子或其抗原结合片段。
[0028]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有多种激活和共刺激分子的 抗原呈递细胞
模拟支架(apc-ms)，其中t细胞激活分子选自抗cd3 抗体或其抗原结合片段、抗cd2抗体或其抗原结合片段、抗cd47 抗体或其抗原结合片段、抗巨噬细胞清道夫受体(msr1)抗体或其 抗原结合片段、抗t细胞受体(tcr)抗体或其抗原结合片段、主要 组织相容性复合物(mhc)分子或其加载有mhc肽的多聚体及mhc
‑ꢀ
免疫球蛋白(ig)缀合物或其多聚体，或其组合。
[0029]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有多种激活和共刺激分子的 抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)，其中t细胞共刺激分子是抗体 或其抗原结合片段，其特异性地结合选自以下的共刺激抗原：cd28、 4.1bb(cd137)、ox40(cd134)、cd27(tnfrsf7)、gitr(cd357)、 cd30(tnfrsf8)、hvem(cd270)、ltβr(tnfrsf3)、dr3 (tnfrsf25)、icos(cd278)、cd226(dnam1)、crtam(cd355)、 tim1(havcr1、kim1)、cd2(lfa2、ox34)、slam(cd150、 slamf1)、2b4(cd244、slamf4)、ly108(ntba、cd352、 slamf6)、cd84(slamf5)、ly9(cd229、slamf3)、cd279 (pd1)和cracc(cd319、blame)。
[0030]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有多种激活和共刺激分子的 抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)，其中t细胞激活分子和t细胞 共刺激分子包括双特异性抗体或其抗原结合片段。
[0031]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有多种激活和共刺激分子的 抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)，其中t细胞激活分子和t细胞 共刺激分子包括选自cd3/cd28、任选与cd28一起的cd3/icos、 任选与cd28一起的cd3/cd27及任选与cd28一起的cd3/cd137， 或其组合的对。
[0032]
在另一个实施方式中，本发明涉及抗原呈递细胞模拟支架 (apc-ms)，其进一步包括特异性地结合fc-融合蛋白的免疫球蛋白 分子。
[0033]
在另一个实施方式中，本发明涉及抗原呈递细胞模拟支架 (apc-ms)，其进一步包括选自以下的募集化合物：粒细胞巨噬细 胞-集落刺激因子(gm-csf)、趋化因子(c-c基序)配体21(ccl-21)、 趋化因子(c-c基序)配体19(ccl-19)、c-x-c基序趋化因子配 体12(cxcl12)、干扰素γ(ifnγ)或fms-样酪氨酸激酶(flt-3) 配体，或其激动剂，其模拟物，其变体，其功能性片段，或其组合。 在一个实施方式中，支架进一步包括募集化合物，其是粒细胞巨噬细 胞集落刺激因子(gm-csf)，或其激动剂，其模拟物，其变体，或 其功能性片段。
[0034]
在另一个实施方式中，本发明涉及抗原呈递细胞模拟支架 (apc-ms)，其进一步包括抗原。在一个实施方式中，所述抗原包 括肿瘤抗原。在这个实施方式下更进一步地，所述肿瘤抗原选自 mage-1、mage-2、mage-3、cea、酪氨酸酶、midkin、bage、 casp-8、β-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、ca-125、cdk-1、 cdk4、eso-1、gp75、gp100、mart-1、muc-1、mum-1、p53、 pap、psa、psma、ras、trp-1、her-2、trp-1、trp-2、il13rα、 il13rα2、aim-2、aim-3、ny-eso-1、c9orf112、sart1、sart2、 sart3、brap、rtn4、glea2、tnks2、kiaa0376、ing4、hsph1、 c13orf24、rbpsuh、c6orf153、nktr、nsep1、u2af1l、cynl2、 tpr、sox2、golga、bmi1、cox-2、egfrviii、ezh2、licam、 livin、livinβ、mrp-3、巢蛋白、olig2、art1、art4、b-细胞周 期蛋白、gli1、cav-1、组织蛋白酶(cathepsin)b、cd74、e-钙粘蛋 白、epha2/eck、fra-1/fosl1、gage-1、神经节苷脂/gd2、gnt-v、 β1,6-n、ki67、ku70/80、prox1、psca、sox10、sox11、生存素、 upar、wt-1、二肽基肽酶iv(dppiv)、腺苷脱氨酶结合蛋白(adabp)、亲环蛋白b、结直肠相关抗原(crc)-c017-1a/ga733、t-细 胞受体/cd3-ξ链、肿瘤抗原的gage-家族、rage、lage-i、nag、 gnt-v、rcasl、α-甲胎蛋白、pl20ctn、pmel117、prame、脑糖
原 磷酸化酶、ssx-i、ssx-2(hom-mel-40)、ssx-i、ssx-4、ssx-5、 scp-i、ct-7、cdc27、腺瘤性结肠息肉蛋白(apc)、fodrin、p1a、 连接蛋白37、ig-独特型、pl5、gm2、gd2神经节苷脂、肿瘤抗原的 smad家族、1mp-1、ebv编码的核抗原(ebna)-i、ul16-结合蛋 白样转录物1(mult1)、rae-1蛋白、h60、mica、micb、c-erbb-2、 以患者特异性方式鉴定的新抗原，或其免疫原性肽，或其组合。
[0035]
在相关的实施方式中，本发明涉及抗原呈递细胞模拟支架 (apc-ms)，包括包含高表面积介孔二氧化硅微棒(msr)的基底 层；于msr基底层上成层的连续的、流体支撑的脂质双层(slb)； 吸附于支架上的多种t细胞激活分子和t细胞共刺激分子；和吸附于 支架上的多种t细胞稳态剂，其中支撑的脂质双层(slb)与介孔二 氧化硅微棒(msr)的重量比在约10:1至约1:20之间。在一个实施 方式中，重量比反映加载前的slb与msr的比例。在另一个实施方 式中，调节重量比以获得所需的支架组成。在一个实施方式中，slb 与msr的重量比可以在约9:1至约1:15，之间，约5:1至约1:10之 间，约3:1至约1:5之间，包括之间所有的比例，例如，约3:1，约 2:1，约1:1，约1:2，约1:3，约1:4，约1:5，约1:6，约1:7，约1:8， 约1:9，约1:10。
[0036]
在另一个实施方式中，本发明涉及抗原呈递细胞模拟支架 (apc-ms)，包括包含高表面积介孔二氧化硅微棒(msr)的基底 层；于msr基底层上成层的连续的、流体支撑的脂质双层(slb)； 吸附于支架上的多种t细胞激活分子和t细胞共刺激分子；和吸附于 支架上的多种t细胞稳态剂，其中连续的流体支撑的脂质双层(slb) 包括包含14至23个碳原子的脂质。在一个实施方式中，所述脂质是 磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酸(pa)、磷脂酰 丝氨酸(ps)或磷酸肌醇，或其衍生物。在一个实施方式中，apc-ms 包括流体支撑的脂质双层(slb)，其包含选自二肉豆蔻酰基磷酰基 胆碱(dmpc)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二硬脂酰基磷脂 酰胆碱(dspc)、棕榈酰基-油酰基磷脂酰胆碱(popc)、二油酰 基磷脂酰胆碱(dopc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二肉豆 蔻酰基磷脂酰乙醇胺(dmpe)和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(dppe) 或其组合的脂质。在一些实施方式中，脂质双层包括模拟哺乳动物细 胞膜(例如，人细胞质膜)的脂质组成的脂质组合物。许多哺乳动物 细胞膜的脂质组成已经被表征并且是本领域技术人员容易确定的(参 见，例如，essaid等，biochim.biophys.acta 1858(11):2725-36(2016)， 将其完整内容按引用并入本文中)。在一些实施方式中，脂质双层包 括胆固醇。在一些实施方式中，脂质双层包括鞘脂。在一些实施方式 中，脂质双层包括磷脂。在一些实施方式中，所述脂质是磷脂酰乙醇 胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷酸肌醇、具有包含6-20个碳的 饱和或不饱和尾的鞘磷脂，或其组合。
[0037]
在另一个实施方式中，本发明涉及抗原呈递细胞模拟支架 (apc-ms)，包括包含高表面积介孔二氧化硅微棒(msr)的基底 层；于msr基底层上成层的连续的、流体支撑的脂质双层(slb)； 吸附于支架上的多种t细胞激活分子和t细胞共刺激分子；和吸附于 支架上的多种t细胞稳态剂，其中介孔二氧化硅微棒-脂质双层 (msr-slb)支架保持连续的、流体架构至少14天。在一些实施方 式中，msr-slb支架保持连续的、流体架构1天、2天、3天、4天、 5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、 15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、25天、30天、35 天、40天、50天或更长。在一些实施方式中，msr-slb支架的msr 在约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、 11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20 天、21天、25天、30天、35天、40天、50天或更长时间内降解。 在一些实施方式
中，msr-slb支架的脂质双层在约1天、2天、3天、 4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、 14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、25天、30 天、35天、40天、450天或更长时间内降解。
[0038]
在另一个实施方式中，本发明涉及抗原呈递细胞模拟支架 (apc-ms)，包括包含高表面积介孔二氧化硅微棒(msr)的基底 层；于msr基底层上成层的连续的、流体支撑的脂质双层(slb)； 吸附于支架上的多种t细胞激活分子和t细胞共刺激分子；和吸附于 支架上的多种t细胞稳态剂，其中介孔二氧化硅微棒(msr)与t 细胞激活/共刺激分子的干重比在约1:1至约50:1之间。在一个实施 方式中，msr与t细胞激活/共刺激分子的比例是msr重量与用作t 细胞激活/共刺激分子的抗体的重量的反映。在另一个实施方式中，调 节msr:抗体重量比以获得所需的支架组成。在一个实施方式中，slb 与抗体组合物的重量比为约2:1至约20:1之间，约3:1至约10:1之间， 约4:1至约8:1之间，包括其中所有的比例，例如，约1:1，约2:1， 约3:1，约4:1，约5:1，约6:1，约7:1，约8:1，约9:1，约10:1，约 15:1，约20:1，约25:1，约30:1，约40:1。
[0039]
在另一个实施方式中，本发明涉及抗原呈递细胞模拟支架 (apc-ms)，包括包含高表面积介孔二氧化硅微棒(msr)的基底 层；于msr基底层上成层的连续的、流体支撑的脂质双层(slb)； 吸附于支架上的多种t细胞激活分子和t细胞共刺激分子；和吸附于 支架上的多种t细胞稳态剂，其中将支架堆叠以选择性地允许t细胞 渗入介孔二氧化硅微棒(msr)中。在一个实施方式中，本发明进一 步提供其中t细胞激活和/或共刺激分子以足以允许原位操纵t细胞 的浓度存在于支架上的apc-ms。
[0040]
在另一个方面中，本发明涉及包含抗原呈递细胞模拟支架 (apc-ms)和药物学上可接受载体的药物组合物，所述抗原呈递细 胞模拟支架包括包含高表面积介孔二氧化硅微棒(msr)的基底层； 于msr基底层上成层的连续的、流体支撑的脂质双层(slb)；吸 附于支架上的多种t细胞激活分子和t细胞共刺激分子；和吸附于支 架上的多种t细胞稳态剂。在一个实施方式中，本发明进一步提供了 配制用于静脉内给药、皮下给药、腹膜内给药或肌内给药的药物组合 物。
[0041]
在另一个方面中，本发明涉及包括抗原呈递细胞模拟支架 (apc-ms)和在其中成簇的t细胞的药物组合物，所述抗原呈递细 胞模拟支架包括包含高表面积介孔二氧化硅微棒(msr)的基底层； 于msr基底层上成层的连续的、流体支撑的脂质双层(slb)；吸 附于支架上的多种t细胞激活分子和t细胞共刺激分子；和吸附于支 架上的多种t细胞稳态剂。在一个实施方式中，本发明进一步提供含 有apc-ms和选自自然杀伤(nk)细胞、cd3 t细胞、cd4 t细 胞、cd8 t细胞和调节t细胞(treg)或其组合的t细胞的组合物。
[0042]
再进一步，本发明的实施方式涉及治疗需要的受试者中的疾病的 方法，包括将包含获自受试者的t细胞群体的样品接触抗原呈递细胞 模拟支架(apc-ms)，由此激活、共刺激和稳态地维持t细胞群体； 任选扩增t细胞群体；并将激活的、共刺激的、维持的和任选扩增的 t细胞给药于受试者，由此治疗受试者的疾病。在一个实施方式中， 本发明进一步提供了治疗需要的受试者中的疾病的方法，其中所述方 法进一步包括在给药步骤前，重新刺激t细胞群体。在一个实施方式 中，所述方法包括在接触支架2天至5天的时间段后扩增t细胞群体。
[0043]
在另一个治疗实施方式中，本发明涉及治疗需要的受试者中的疾 病的方法，包括
将样品接触抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)，所 述样品是包含获自受试者的t细胞群体的血液样品、骨髓样品、淋巴 样品或脾脏样品，由此激活、共刺激和稳态地维持t细胞群体；任选 扩增t细胞群体；并将激活的、共刺激的、维持的和任选扩增的t细 胞给药于受试者，由此治疗受试者中的疾病。在一个实施方式中，受 试者是人受试者。在一个实施方式中，所述方法提供了癌症的治疗， 并且所述支架包括至少一种细胞毒性t细胞特异性激活分子和至少 一种细胞毒性t细胞特性共刺激分子。
[0044]
在另一个治疗实施方式中，本发明涉及治疗需要的受试者中的癌 症的方法，包括将包含获自受试者的t细胞群体的样品接触抗原呈递 细胞模拟支架(apc-ms)，由此激活、共刺激和稳态地维持t细胞 群体；任选扩增t细胞群体；并将激活的、共刺激的、维持的和任选 扩增的t细胞给药于受试者，由此治疗受试者中的癌症。在一个实施 方式中，所述癌症选自头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、 食道癌、骨癌、睾丸癌、宫颈癌、胃肠癌、成胶质细胞瘤、白血病、 淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肺部的肿瘤前病变、结肠癌、黑素瘤和膀胱 癌。在一个实施方式中，所述方法可以进一步包括从样品和/或扩增的 细胞群体裁分选和任选富集细胞毒性t细胞。
[0045]
在再另一个治疗实施方式中，本发明涉及治疗需要的受试者中的 免疫缺陷障碍的方法，包括将包含获自受试者的t细胞群体的样品接 触抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)，由此激活、共刺激和稳态地 维持t细胞群体；任选扩增t细胞群体；并将激活的、共刺激的、维 持的和任选扩增的t细胞给药于受试者，由此治疗受试者中的免疫缺 陷障碍。在一个实施方式中，所述支架包括至少一种辅助t细胞(th) 特异性激活分子和至少一种辅助t细胞(th)特异性共刺激分子。在 一个实施方式中，所述方法可以用于治疗选自原发性免疫缺陷障碍和 获得性免疫缺陷障碍的免疫缺陷障碍。在一个实施方式中，所述方法 可以用于治疗获得性缺陷免疫综合征(aids)或选自digeorge综合 征(dgs)、染色体断裂综合征(cbs)、共济失调毛细血管扩张症 (at)和wiskott-aldrich综合征(was)，或其组合的遗传性障碍。
[0046]
在另一个实施方式中，本发明涉及治疗需要的受试者中的疾病的 方法，包括将包含获自受试者的t细胞群体的样品接触抗原呈递细胞 模拟支架(apc-ms)，由此激活、共刺激和稳态地维持t细胞群体； 任选扩增t细胞群体；进一步从样品和/或扩增的细胞群体分选和任 选富集t细胞；并将激活的、共刺激的、维持的和任选扩增的t细胞 给药于受试者，由此治疗受试者中的疾病。在一个实施方式中，t细 胞可以选自自然杀伤(nk)细胞、cd3 t细胞、cd4 t细胞、cd8 t细胞和调节t细胞(treg)，或其组合。
[0047]
在另一个实施方式中，本发明涉及治疗需要的受试者中的自身免 疫障碍的方法，包括将包含获自受试者的t细胞群体的样品接触抗原 呈递细胞模拟支架(apc-ms)，由此激活、共刺激和稳态地维持t 细胞群体；任选扩增t细胞群体；进一步任选从样品和/或扩增的细 胞群体分选和富集t细胞；并将激活的、共刺激的、维持的和任选扩 增的t细胞给药于受试者，由此治疗受试者中的自身免疫障碍。
[0048]
在另一个实施方式中，本发明涉及治疗需要的受试者中的疾病的 方法，包括将包含获自受试者的t细胞群体的样品接触抗原呈递细胞 模拟支架(apc-ms)，由此激活、共刺激和稳态地维持t细胞群体； 任选扩增t细胞群体；进一步任选从样品和/或扩增的细胞群体分选 和富集t细胞；并将激活的、共刺激的、维持的和任选扩增的t细胞 皮下或静脉内给
药于受试者，由此治疗受试者中的疾病。在一个实施 方式中，可以通过将样品接触支架约1天至约20天的时间段来激活、 共刺激、稳态地维持和任选扩增t细胞。
[0049]
在另一个实施方式中，本发明涉及用于操纵t细胞的方法，包括 将抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)接触受试者的生物样品，由此 激活、共刺激、稳态地维持和任选扩增样品内存在的t细胞群体，由 此操纵t细胞。在一个实施方式中，所述操纵可以包括t细胞的刺激、 激活、生活力的改变、生长的促进、分裂、分化、扩增、增殖、耗尽、 无能、休眠、凋亡、死亡。在一个实施方式中，所述操纵优选包括促 进t细胞的扩增或增殖。在其他的实施方式中，可以进一步转化操纵 的t细胞。在特定的实施方式中，可以转化t细胞以表达嵌合抗原受 体(car)。可以通过用含有对car t细胞特异性的抗原的抗原呈 递细胞模拟支架(apc-ms)孵育来进一步扩增car t-细胞产物。在 某些实施方式中，car t细胞特异性抗原选自cd19、cd22，或其片 段或其变体。在一些实施方式中，car t-细胞特异性抗原是肿瘤抗原。 肿瘤抗原是本领域公知的，并且包括，例如，神经胶质瘤相关抗原、 癌胚抗原(cea)、β-人绒毛膜促性腺激素、α甲胎蛋白(afp)、 凝集素-反应性afp、甲状腺球蛋白、rage-1、mn-ca ix、人端粒 酶逆转录酶、ru1、ru2(as)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、m-csf、 前列腺酶(prostase)、前列腺特异性抗原(psa)、pap、ny-eso-1、 lage-1a、p53、prostein、psma、her2/neu、生存素和端粒酶、前列 腺癌肿瘤抗原-1(pcta-1)、mage、elf2m、嗜中性粒细胞弹性蛋 白酶、蝶素(ephrin)b2、cd22、胰岛素生长因子(igf)-i、igf-ii、 igf-i受体和间皮素。在一些实施方式中，car t-细胞产物可以在产 生后多克隆地扩增，以产生较大的car t-细胞群体。
[0050]
在另一个实施方式中，本发明涉及用于操纵t细胞的方法，包括 接触抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)，其中与对照支架相比，所 述方法使得在接触支架约1周后给予t细胞群体扩增的提高，所述对 照支架包括包含高表面积介孔二氧化硅微棒(msr)的基底层和连续 的流体支撑的脂质双层(slb)，但不含t细胞激活分子和t细胞共 刺激分子。在一个实施方式中，与对照支架相比，所述方法使得在接 触支架约1周后t细胞群体的扩增提高约50倍至800倍，所述对照 支架包括包含高表面积介孔二氧化硅微棒(msr)的基底层和连续的 流体支撑的脂质双层(slb)，但不含t细胞激活分子和t细胞共刺 激分子。
[0051]
在另一个实施方式中，本发明涉及用于操纵t细胞的方法，包括 接触抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)，其中与包括t细胞激活分 子和t细胞共刺激分子的超顺磁性球形聚合物颗粒(dynabead) 相比，所述方法使得在接触支架约1周后给予t细胞群体扩增的提高。 在一个实施方式中，与包括t细胞激活分子和t细胞共刺激分子的超 顺磁性球形聚合物颗粒(dynabead)相比，所述方法使得在接触 支架约1周后t细胞群体的扩增提高约5倍至20倍。
[0052]
在另一个实施方式中，本发明涉及用于提高t细胞的代谢活性的 方法，包括将抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)接触受试者的生物 样品，由此激活、共刺激、稳态地维持和任选扩增样品内存在的t细 胞群体，由此提高t细胞的代谢活性。在一个实施方式中，与对照支 架相比，所述方法使得在接触支架约1周后给予t细胞群体代谢活性 的提高，所述对照支架包括包含高表面积介孔二氧化硅微棒(msr) 的基底层和连续的流体支撑的脂质双层(slb)，但不含t细胞激活 分子和t细胞共刺激分子。在一个实施方式中，与对照支架相比，所 述方法使得在接触支架约1周后t细胞群体的代谢活性提高约5倍至 20倍，所述对照
支架包括包含高表面积介孔二氧化硅微棒(msr) 的基底层和连续的流体支撑的脂质双层(slb)，但不含t细胞激活 分子和t细胞共刺激分子。在一个实施方式中，与包括t细胞激活分 子和t细胞共刺激分子的超顺磁性球形聚合物颗粒(dynabead) 相比，所述方法使得在接触支架约1周后给予t细胞群体代谢活性的 提高。在一个实施方式中，与包括t细胞激活分子和t细胞共刺激分 子的超顺磁性球形聚合物颗粒(dynabead)相比，所述方法进一 步使得在接触支架约1周后t细胞群的扩增提高约1倍至10倍。
[0053]
在另一个实施方式中，本发明涉及用于筛选代谢活性的t细胞的 方法，包括将抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)接触受试者的生物 样品，由此激活、共刺激、稳态地维持和任选扩增样品内存在的t细 胞群体；鉴定激活的、共刺激的、稳态维持的和任选扩增的t细胞群 体中的代谢活性细胞；由此筛选代谢活性的t细胞。在一个实施方式 中，扩增的t细胞保持代谢活性至少接触支架后约7天。在一个实施 方式中，扩增的t细胞形成聚集物至少接触支架后约7天。
[0054]
再在另一个实施方式中，本发明涉及用于产生多克隆t细胞群体 的方法，包括将抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)接触受试者的生 物样品，由此激活、共刺激、稳态地维持和任选扩增样品内存在的t 细胞群体；基于扩增的t细胞中多种标志物的表达从扩增的t细胞群 体鉴定特定的t细胞群体；任选分离或纯化鉴定的t细胞群体，由此 产生t细胞的多克隆群体。在一个实施方式中，所述方法可以用于产 生cd4 细胞或cd8 细胞的多克隆群体。在相关实施方式中，所述 方法可以用于产生cd4 /foxp3 t细胞的多克隆群体。再进一步， 所述方法可以适应于产生cd44 /cd62l-t细胞(效应子记忆和/或效 应子t细胞)的多克隆群体。在另一个实施方式中，所述方法可以用 于产生cd8 /cd69 t细胞(激活的t细胞)的多克隆群体。在另一 个实施方式中，所述方法可以用于产生颗粒酶b cd8 t细胞(分泌 细胞毒性的t细胞)的多克隆群体。在再另一个实施方式中，所述方 法可以用于产生ifnγ t细胞(分泌激活细胞因子的t细胞)的多克 隆群体。在再另一个实施方式中，所述方法可以用于产生 cd62l /ccr7 t细胞(记忆t细胞)的多克隆群体。
[0055]
在另一个实施方式中，本发明涉及用于产生t细胞的多克隆亚群 的方法，包括将抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)接触受试者的生 物样品，由此激活、共刺激、稳态地维持和任选扩增样品内存在的t 细胞群体；基于扩增的t细胞中多种标志物的表达从扩增的t细胞群 体鉴定特定的耗尽t细胞群体；任选除去鉴定的t细胞群体，由此产 生t细胞的多克隆亚群。在一个实施方式中，基于cd8 /pd-1 的细 胞表面表达来鉴定或分离耗尽的t细胞。在另一个实施方式中，基于 lag3 /tim3 的细胞表面表达来鉴定或分离耗尽的t细胞。
[0056]
在另一个实施方式中，本发明涉及用于离体操纵t细胞的方法， 包括将抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)离体接触受试者的生物样 品，由此激活、共刺激、稳态地维持和任选扩增样品内存在的t细胞 群体，由此离体操纵t细胞。在一个实施方式中，将样品接触支架约 1天至约20天的时间段。在一个实施方式中，所述方法可涉及检测由 操纵的t细胞产生的一种或多种细胞因子的产生。在一个实施方式 中，所述方法涉及进一步检测操纵的t细胞的选自干扰素γ(ifnγ)、 组织坏死因子α(tnfα)、il-2、il-1、il-4、il-5、il-10和il-13、 il-17或其组合的细胞因子的产生。
[0057]
在相关实施方式中，本发明涉及根据之前方法的用于离体操纵t 细胞的方法，其中操纵的t细胞是t辅助1(th1)细胞，并且所述 方法包括检测选自il-2、干扰素γ(ifnγ)
和组织坏死因子α(tnfα)， 或其组合的细胞因子的产生。或者，在相关实施方式中，本发明涉及 根据之前方法的用于离体操纵t细胞的方法，其中操纵的t细胞是t 辅助2(th2)细胞，并且所述方法包括检测选自il-4、il-5、il-10 和il-13，或其组合的细胞因子的产生。再进一步地在相关实施方式 中，本发明涉及根据之前方法的用于离体操纵t细胞的方法，其中操 纵的t细胞是细胞毒性t(tc)细胞，并且所述方法包括检测选自干 扰素γ(ifnγ)和淋巴毒素α(ltα/tnfβ)或其组合的细胞因子的产 生。在一个实施方式中，操纵的t细胞是细胞毒性(tc)细胞，并且 所述方法包括检测选自颗粒酶或穿孔素或其组合物的细胞毒素的分 泌。
[0058]
在相关实施方式中，本发明涉及根据之前方法的用于离体操纵t 细胞的方法，其中所述方法进一步包括检测操纵的t细胞中细胞表面 标志物的表达。在一个实施方式中，所述细胞表面标志物选自cd69、 cd4、cd8、cd25、cd62l、foxp3、hla-dr、cd28和cd134， 或其组合。可选地或另外地，在一个实施方式中，所述细胞表面标志 物是选自cd36、cd40和cd44，或其组合的非t细胞标志物。
[0059]
在另一个相关实施方式中，本发明涉及根据之前方法的用于离体 操纵t细胞的方法，其中所述受试者是人类受试者。
[0060]
在另一个相关实施方式中，本发明涉及根据之前方法的用于体内 操纵t细胞的方法，其中将支架施用于受试者以允许包含t细胞的生 物样品在体内接触支架。在一个实施方式中，支架可以在受试者中维 持约3天至约15天的时间段，优选约7天至约11天的时间段。在一 些实施方式中，所述支架可以在受试者中维持至少1天、至少2天、 至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、 至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14 天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、 至少20天、至少21天、至少25天、至少30天、至少35天、至少 40天、至少50天或更长的时间段。
[0061]
在再另一个实施方式中，本发明涉及用于制备抗原呈递细胞模拟 支架(apc-ms)的方法，包括(a)提供包括高表面积介孔微棒(msr) 的基底层；(b)任选将t细胞稳态剂加载于msr上；(c)将连续 的流体支撑的脂质双层(slb)于包括msr的基底层上成层，由此 产生msr-slb支架；(d)如果没有进行步骤(b)，将t细胞稳态 剂加载于msr-slb支架上；(e)任选用阻断剂阻断msr-slb支架 中的一个或多个非特异性整合位点；和(f)将t细胞激活分子和t 细胞共刺激分子加载于msr-slb支架上，由此制得apc-ms。在一 个实施方式中，所述方法可以进一步涉及组装多个支架以产生具有允 许t细胞渗入的足够的多孔性的堆叠。在一个实施方式中，所述方法 可以包括加载选自生长因子、细胞因子、白细胞介素、粘附信号传导 分子、整联蛋白信号传导分子，或其片段，或其组合的至少一种另外 的试剂。
[0062]
从以下详述和附图将清楚本发明的其他特征和优点。
附图说明
[0063]
图1显示了与介孔二氧化硅微棒(msr)结合的脂质的相衬和荧 光显微镜图像。上图显示了在1:20的脂质:msr比率下脂质和介孔二 氧化硅微棒的合并图(比例尺＝200μm)。中图显示了在1:4的脂 质:msr比率下脂质和介孔二氧化硅微棒的合并图(比例尺＝200μm)。 下图显示了在较高放大倍数下与msr结合的脂质的合并相衬显微镜 图像(比例尺＝20μm)。
[0064]
图2a、2b、2c和2d显示抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms) 的组装和特征取决于脂质的类型和脂质的含量。图2a显示了各种脂 质的化学结构。缩写：dopc-二油酰基磷脂酰胆碱；popc-棕榈酰
‑ꢀ
油酰基磷脂酰胆碱；和dspc-二硬脂酰基磷脂酰胆碱。图2b显示了 含有介孔二氧化硅微棒(msr)和流体支撑的脂质双层(slb)的各 种组合物中保留的脂质百分比。在这个实验中，将250μg脂质的有效 负载输入500μg msr组合物中。图2c显示了在磷酸盐缓冲盐水 (pbs)中含有dopc、popc或dspc的各种msr-slb组合物在 37℃下在两周(14天)内的相对荧光变化。图2d显示了在完全roswellpark memorial institute培养基(crpmi)中含有dopc、popc或dspc 的各种msr-slb组合物在37℃下在两周(14天)内的相对荧光变化。
[0065]
图3显示了各种msr-slb组合物在pbs中在第0天、第3天、 第7天和第14天的稳定性，如使用相衬和荧光显微镜分析的(脂质 涂层)。上图显示了dopc在msr-slb组合物中的稳定性；中图显 示了popc在msr-slb组合物中的稳定性；和下图显示了dspc在 msr-slb组合物中的稳定性。
[0066]
图4a、4b、4c、4d和4e显示出msr-slb流体结构的组装和 特征随着时间的变化。图4a显示了在脂质组合物漂白前(pre)、就 在漂白后(t＝0)和漂白后5分钟(t＝5min)，在高放大倍数(比例尺 ＝2μm)获取的与介孔二氧化硅微棒(msr)结合的脂质的相衬和荧 光显微镜图像。图4b显示了光漂白(frap)后随着时间的荧光恢复 的变化。在区域(2)中描绘了荧光“源”，在区域(3)中描绘了荧 光“沉降(sink)”，且通过区域(1)表示了标准化点。差异分布在接 种(seeding)后的早期时间点最佳地看到了并且在大约2min(120s) 时实现了平衡。图4c显示了描绘frap随着时间的平均变化的平滑
‑ꢀ
拟合曲线，如源自标准化图像的。图4d和4e显示出脂质组合物漂 白前(pre)，就在漂白后(t＝0)和漂白后3分钟(t＝3min)的msr-slb 流体结构的两组高分辨率图像。
[0067]
图5a和5b显示了含有各种不同部分的msr-s；b组合物的结构 和功能性质。基于使用b3z报告t细胞系的实验，当所有单个组分 存在于支架中时，观察到了apc-ms支架的最大功能性。图5a显示 了含有popc脂质双层的apc-ms的结构的示意图，所述popc脂质 双层含有藻红蛋白生物素(生物素pe)，其与抗生物素蛋白链菌素 分子(例如，抗生物素蛋白链菌素二聚体)缀合，其随后与生物素化 的抗体(例如，生物素化的抗cd3抗体或生物素化的抗cd28抗体或 另一种特异性的或非特异性的抗体)缀合。图5b显示了用mps(二 氧化硅)、popc(脂质)、mps-popc复合物、生物素化的mps-popc 复合物(在存在或不存在抗生物素蛋白链菌素的情况下)以及在存在 或不存在藻红蛋白生物素(生物素pe)和/或抗生物素蛋白链菌素的 情况下的mps-popc复合物与生物素化的抗体一起的组合处理后， b3z报告细胞β-半乳糖苷酶表达的分光光度分析。在含有所有单个组 分-通过抗生物素蛋白链菌素接头与生物素化的抗体缀合的磷酸乙醇 胺生物素(生物素pe)的msr-slb组合物中观察到了吸光度的显著 提高(暗色条；**表示统计学显著性(p《0.001，使用单因素anova， 接着tukey hsd post-hoc检验进行分析；数据表示三个实验重复的平 均
±
s.d.并且是至少两个独立实验的代表)。
[0068]
图6a和6b显示了il-2从含有il-2的msr-slb组合物的受控 释放。图6a显示了含有il-2的msr的多孔结构的电子显微照片(比 例尺＝100nm)。图6b显示了在15天时间段内il-2的累积释放水平 的曲线。
[0069]
图7a和7b显示了共焦显微镜图像，其显示出t细胞(球形) 渗透入含有msr-slb复合材料的抗原呈递细胞模拟支架中。图7a 显示了已经用两种不同染料染色的细胞。图7b显示了已经用单一染 料染色(表明是活细胞)的细胞。
[0070]
图8显示了结合用原代t细胞共培养的与介孔二氧化硅微棒 (msr)结合的脂质的相衬显微和荧光图像。观察到在t细胞激活信 号(cue)连接到材料的表面时，原代t细胞倾向于形成细胞/材料簇。 下图显示了含有缀合的抗体、il-2或缀合的抗体与il-2组合的 msr-slb复合材料中的脂质和介孔二氧化硅微棒的合并图。右侧的 图像显示了高放大倍数下的含有缀合的抗体和il-2两者的msr-slb 复合材料(比例尺＝20μm)。
[0071]
图9a和9b显示了小鼠脾脏t细胞中抗体诱导的变化的剂量-反 应图。图9a显示了用对照支架(模拟；无；仅popc脂质；以及popc 和il-2的组合)和实验支架(含有popc和il-2的组合，以及抗体) 刺激t细胞3天后t细胞的多克隆扩增。研究了抗体的三个不同剂量 (1:50、1:25和1:10的msr:抗体比率)。图9b显示了用对照支架 (模拟；无；仅popc脂质；以及popc和il-2的组合)和实验支架 (含有popc和il-2的组合，以及抗体)刺激t细胞3天后的ifnγ 分泌。研究了抗体的三个不同剂量(1:50、1:25和1:10的msr:抗体 比率)。
[0072]
图10和11显示本发明的抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)促 进了代谢活性t细胞的快速扩增。图10显示了用对照(模拟；无； slb il-2；dynabead il-2)或实验组合物孵育时原代t细胞的倍 数扩增。与模拟组合物或无slb的组合物相比，用本发明的组合物 孵育原代t细胞明显诱导t细胞扩增(使用或未用再刺激)。更重要 地，与dynabeads和il-2的组合物相比，用本发明的支架孵育原 代t细胞导致在第7天再刺激时可测量地更强的增殖。图11显示了 用加载了il-2的本发明的支架(slb/il2/abs)或加载了il-2的 dynabeads(dynabeads-il2)孵育的t细胞的细胞代谢活性(如 通过相对于细胞数标准化的alamar蓝还原的相对荧光单位(rfu) 测量的)的条形图。
[0073]
图12a和12b显示了本发明的支架(apc-ms)给予脾脏t细胞 (小鼠)的多克隆扩增并促进t细胞聚集物的形成。图12a显示了 在第0天、第3天和第7天，用dynabeads或apc-ms孵育时脾 脏t细胞的聚集物的显微照片(在4
×
放大倍数下)。图12b显示了 在第0天、第3天和第7天，用dynabeads或apc-ms孵育时脾 脏t细胞的聚集物的显微照片(在10
×
放大倍数下)。(白色比例尺 ＝100μm)。
[0074]
图13a和13b显示了用apc-ms或dynabeads孵育时小鼠脾 脏t细胞的多克隆扩增。图13a显示了用apc-ms或dynabeads 孵育(孵育7天后具有再刺激或il-2处理)后的各个不同时间点(t＝0 天、5天、7天、11天和13天)的t细胞群的流式细胞术(facs) 散点图，其中x轴上的值描绘了cd8 染色的强度，而y轴上的值描 绘了cd4 染色的强度。在每个时间点，针对每个样品将流数据相对 fluorescence minus one(fmo)对照进行门控。数据代表至少两个独 立实验。图13b是显示各个不同时间点(t＝0天、5天、7天、11天 和13天)用apc-ms(方块)或dynabeads(三角)孵育后cd4 vs.cd8 t细胞亚群的百分比变化的线图。孵育7天后，将细胞分成 两个亚群，其中第一亚群是再刺激的(虚线)，而第二亚群用il-2 处理(实线)。将apc-ms用于apc-ms条件的再刺激，dynabeads 用于再刺激dynabeads条件。
[0075]
图14显示了用apc-ms或dynabeads孵育时foxp3 小鼠脾 脏t细胞子集的多克隆扩增的测量。在用apc-ms或dynabeads (孵育7天后使用再刺激或il-2处理)后的各个不同时间点(t＝0天、 5天、7天、11天和13天)以t细胞群体的流式细胞术(facs)散 点图的形式描
绘了结果，其中x轴上的值描绘了foxp3 染色的强度， 而y轴上的值描绘了cd4 染色的强度。将矩形门控用于计数各个不 同部分中的foxp3 细胞的数量和/或比例。如所示的，使用特定的配 方，foxp3 小鼠脾脏t细胞存在有限的扩增或无扩增。
[0076]
图15显示了用apc-ms或dynabeads孵育时cd62l 小鼠脾 脏t细胞子集的多克隆扩增。在用apc-ms或dynabeads孵育(孵 育7天后使用再刺激或il-处理)后的各个不同时间点(t＝0天、5天、 7天、11天和13天)以t细胞群体的流式细胞术(facs)散点图的 形式描绘了结果，其中x轴上的值描绘了cd62l 染色的强度，而y 轴上的值描绘了cd44 染色的强度。cd62l 细胞出现在散点图的右 侧(上和下的右象限)。
[0077]
图16显示了用apc-ms或dynabeads孵育时cd8 /cd69 小鼠脾脏t细胞子集的多克隆扩增。在用apc-ms或dynabeads 孵育(孵育7天后使用再刺激或il-处理)后的各个不同时间点(t＝0 天、5天、7天、11天和13天)以t细胞群体的流式细胞术(facs) 散点图的形式描绘了结果，其中x轴上的值描绘了cd8 染色的强度， 而y轴上的值描绘了cd69 染色的强度。cd8 /cd69 细胞出现在散 点图的右上象限。
[0078]
图17显示了用apc-ms或dynabeads孵育时cd8 /颗粒酶 b 小鼠脾脏t细胞子集的多克隆扩增。以用apc-ms或dynabeads 孵育(孵育7天后使用再刺激或il-处理)后的各个不同时间点(t＝0 天、5天、7天、11天和13天)以t细胞群的流式细胞术(facs) 散点图的形式描绘了结果，其中x轴上的值描绘了cd8 染色的强度， 而y轴上的值描绘了颗粒酶b 染色的强度。cd8 /颗粒酶b 细胞出 现在散点图的右上象限。
[0079]
图18显示了用apc-ms(方块)或dynabeads(三角)后的 各个不同时间点(t＝0天、5天、7天、11天和13天)的ifnγ的t 细胞分泌(pg/细胞)。孵育7天后，将细胞分成两个亚群，其中第一 亚群进行再刺激(虚线)，而第二亚群用il-2处理(实线)。在本文 中，将apc-ms用于apc-ms孵育和dynabead孵育的细胞群体 的再刺激。
[0080]
图19显示了用apc-ms或dynabeads孵育时pd-1 小鼠脾脏 t细胞的水平。在用apc-ms或dynabeads孵育(孵育7天后使 用再刺激或il-处理)后的各个不同时间点(t＝0天、5天、7天、11 天和13天)以t细胞群体的流式细胞术(facs)散点图的形式描绘 了结果，其中x轴上的值描绘了cd8 染色的强度，而y轴上的值描 绘了pd-1 染色(耗尽的潜在标志物)的强度。
[0081]
图20a和20b显示了用各种不同的组合物孵育人外周血t细胞 的效果。图20a显示了在各个不同的时间点(t＝0天、5天、7天、 11天和13天)用对照支架或实验支架孵育的原代t细胞的多克隆扩 增的线图。对照支架包括假(“模拟”；黑线)组合物和无slb(“无”； 红线)的组合物。实验支架包括(1)dynabeads(蓝线)和(2) 本发明的脂质双层(slb)(绿线)。图20b显示了条形图，其显示 了在各个不同的时间点(t＝0天、5天、7天、11天和13天)用对照 支架或实验支架孵育的原代t细胞的代谢活性(用标准alamar蓝染 色分析测量的)。对照支架包括假组合物(“模拟”；“m”)和无 slb的组合物(“无”；“f”)。实验支架包括(1)dynabeads (“d”)和(2)本发明的脂质双层(slb)(“s”)。
[0082]
图21a和21b显示了用各种不同的抗cd3抗体孵育人外周血t 细胞的效果。用对照支架(“模拟”)或含有所列抗cd3抗体-莫罗 单抗(okt3)、识别cd3抗原/t细胞抗原受体(tcr)复合物(hit3a) 内的cd3的17-19kdε-链的抗体和识别cd3e(ucht1)内的tcr 复合物的20kda亚基的单克隆抗体的实验支架孵育获自受试者1(图 21a)和受试者2(图21b)的人
血液样品。研究了三个不同的剂量-5 μg(上载玻片)、1μg(针对受试者2的下载玻片)和0.5μg(针对 受试者1的下载玻片)。在每种情况中，提供了抗cd28抗体的共刺 激，其中抗cd3抗体:抗cd28抗体的比率维持在1:1。在各个不同时 间点(t＝0天、5天、7天、11天和13天)测量了t细胞的倍数扩增。
[0083]
图22显示了用对照支架(“模拟”)或含有所列抗cd3抗体-okt3、hit3a和ucht1的实验支架孵育时人t细胞的多克隆扩增。下图显 示了用含有作为刺激分子的抗cd3抗体和作为共刺激分子的抗cd28 抗体的每一种的apc-ms孵育后各个不同时间点(t＝8天、11天和14 天)的t细胞群体的流式细胞术(facs)散点图。散点图的x轴上 的值描绘了cd8 染色的强度，而y轴上的值描绘了cd4 染色的图。 曲线概括于上图的线图中，其显示了用含有上述抗cd3抗体-okt3 (圈)、hit3a(方块)和ucht1(三角)的apc-ms孵育后cd4 vs.cd8 t细胞亚群的百分比变化。研究了两个不同的抗体剂量-5μg (1
×
稀释)和0.5μg(1:10
×
稀释)。
[0084]
图23显示了在1
×
加载浓度(约5μg)下，使用含有il-2以及 1:1比率的上述抗cd3抗体-okt3(左图)、hit3a(中图)和ucht1 (右图)与抗cd28抗体的apc-ms扩增14天的活t细胞上的cd62l 和ccr7表达。在上图中显示了总的活细胞中的cd62l和ccr7的 表达，而在下图中显示了这些标志物在门控的cd8 细胞中的表达。 使用本发明的apc-ms扩增的大部分细胞在孵育14天后保持 cd62l ccr7 ，其证明对于人患者的体内功能性是重要的。另外， 含有okt3的apc-ms支架与含有ucht1和/或hit3a的支架相比， 在扩增和/或保持cd62l ccr7 t细胞中特别有效。
[0085]
图24略述了用于制备本发明支架的代表性方案。
[0086]
图25a和25b描绘了抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)的设计。 图25a描绘了用于制备apc-ms的示例性方法：1)合成介孔二氧化 硅微棒(msr)；2)msr吸附il-2；3)将吸附il-2的msr用脂 质体涂覆，形成msr-slb；4)将t细胞激活信号附着于msr-slb 的表面；5)msr-slb用t细胞培养；和6)将msr-slb沉降和堆 叠以形成被t细胞渗透的支架。加载有il-2并用t细胞激活信号表 面工程化的从msr-slb形成的支架称为apc-ms。图25b描绘了不 同的apc-ms配置的示例性结构和功能。随着时间，il-2从apc-ms 释放，导致il-2旁分泌递送至局部t细胞。将预定量的生物素化的 磷脂掺入脂质体制剂中使得能够通过抗生物素蛋白链菌素-生物素相 互作用精确地表面粘附生物素化的t细胞激活信号，模拟通过天然 apc对t细胞的信号细胞表面呈递。对于多克隆t细胞扩增，粘附 抗cd3(αcd3)和cd28(αcd28)的激活抗体(左)。对于抗原特 异性t细胞扩增，粘附肽加载的mhc(pmhc)和αcd28。
[0087]
图26a和26b描绘了用于组装msr-slb的组分的物理表征。图 26a显示了msr的代表性亮场显微镜图像。比例尺＝100μm。图26b 描绘了popc脂质体的大小分布，如通过动态光散射(dls)测量的。 图26b中的数据表示3个样品的平均大小分布。
[0088]
图27a和27b是脂质涂覆的msr的显微图像。图27a是显示了 低脂质:msr下的msr聚集的显微图像。脂质涂覆的msr(脂质:msr 1:20w/w)的代表性显微图像显示了msr的亮场图像(左)、荧光 团标记的磷脂(总脂质的1mol％；中)，以及msr和脂质的共同定 位(右)。比例尺＝200μm。图27b是脂质涂覆的msr(脂质:msr 1:4 w/w)的显微图像，显示了msr的亮场图像(左)、荧光团标记的 磷脂(总脂质的1mol％；中)，以及msr和脂质的共同定位(右)。 比例尺＝200μm。
[0089]
图28a-28e描绘了apc-ms的组装和表征。图28a描绘了在细 胞培养条件下维持的，
在pbs或含有10％血清的rpmi培养基 (crpmi)中，msr上的脂质涂层(含有1mol％荧光团标记的脂质) 随着时间保留。图28b是在标准细胞培养条件下的crpmi中维持的 脂质涂覆的msr随着时间的代表性覆盖荧光显微图像(msr，亮场； 脂质(1mol％荧光团标记的脂质)，绿色)。比例尺＝100μm。数据 表示三个实验重复的平均
±
s.d.，并且是至少两个独立实验的表示。图 28c是描绘了随着时间(数据点)在体外从msr-slb(500μg msr) 释放的il-2的定量的图，具有单相指数拟合(虚线；r2＝0.98)。数 据表示三个实验重复的平均
±
s.d.，并且是至少两个独立实验的表示。 图28d是描绘了生物素化igg的各种输入的粘附到涂覆含有0.01 mol％，0.1mol％或1mol％生物素化脂质的脂质制剂的msr上的定量 的图。条上方的值表示针对每种相应条件粘附的igg的浓度(μg)。 数据表示四个实验重复的平均
±
s.d.，并且是至少两个独立实验的代 表。图28e是显示了原代人t细胞与apc-ms紧密结合的sem图像。 比例尺＝10μm。
[0090]
图29显示了t细胞与apc-ms的结合。用原代小鼠t细胞培养 一天的，在低(左)和高(右)放大倍数下，没有呈递任何表面信号 (信号-)，或表面呈递αcd3和αcd28(信号 )的msr-slb的代 表性显微图像。细胞和材料在亮场图像中是可见的(上)，并且 msr-slb脂质涂层在绿色通道中是可见的(1mol％荧光团标记的脂 质；中)。合并图像显示于底部。低放大倍数比例尺＝500μm，高放 大倍数比例尺＝100μm。
[0091]
图30a、30b、30c、30d、30e、30f和30g显示了原代小鼠和 人t细胞的多克隆扩增。图30a是在低放大倍数(左)或使用apc-ms 的高放大倍数下(右)，在各个不同时间点，用dynabeads或 apc-ms培养的原代小鼠t细胞的代表性亮场显微图像。比例尺＝100 μm。图30b显示了未处理的(模拟)，或用游离信号(110nmαcd3、 110nmαcd28、1.3μg/ml il-2)、商业cd3/cd28小鼠t细胞扩增 珠和外源性il-2(dynabeads)、没有在双层表面上呈递的t细胞 信号的加载il-2的msr-slb(msr-slb(信号-))，或apc-ms (加载αcd3、αcd28、il-2)培养的原代小鼠t细胞的扩增。模拟 和游离的曲线可以与msr-slb(信号-)曲线区分开。图30c描绘了 在apc-ms或dynabead培养中，活的单细胞中随着时间的cd4 和 cd8 细胞的频率，使用facs测量的。使用双因素anova接着tukeyhds post-hoc检验分析数据。图30d是在各个不同时间点，用 dynabeads或apc-ms制剂培养的原代人t细胞的代表性亮场显 微图像。比例尺＝100μm。(f1)饱和1mol％生物素化脂质的呈递αcd3 和αcd28的apc-ms，在333μg/ml的msr下输入至初始培养物， (f2)饱和1mol％生物素化脂质的呈递αcd3和αcd28的apc-ms 在33μg/ml的msr下输入至初始培养物，(f3)饱和0.1mol％生物 素化脂质的呈递αcd3和αcd28的apc-ms在333μg/ml的msr下 输入至初始培养物，和(f4)饱和0.1mol％生物素化脂质的呈递αcd3 和αcd28的apc-ms在33μg/ml的msr下输入至初始培养物。图 30e显示了未处理的(模拟)，或用商业cd3/cd28人t细胞扩增珠 和外源性il-2(dynabeads)，或使用各种不同的apc-ms制剂 培养的原代人t细胞的扩增。图30f描绘了在用dynabeads或用 各种apc-ms制剂扩增14天的样品中，活的单一cd3 细胞中cd4 和cd8单阳性细胞的facs定量。图30g描绘了用dynabeads 或用各种不同的apc-ms制剂扩增的样品中，在活的单细胞中共表达 pd-1和lag-3的细胞的facs定量。图30f和30g中的数据表示三 个实验重复的平均
±
s.d.，并且是至少两个独立实验的表示。图30e中 的数据表示来自两个独立实验的至少三个不同供体样品的平均
±
s.d.。 图30f和30g中的数据表示三个不同供体样品的平均
±
s.d.，并且是至 少两个独立实验的表示。**p《0.01，***p《0.001。
[0092]
图31描绘了多克隆扩增的原代小鼠t细胞上的cd4和cd8表 达的代表性facs图。代表性的facs图显示了用apc-ms或 dynabeads多克隆扩增的活的单细胞上的cd4和cd8表达。在每 个时间点，针对每个样品将流数据相对fluorescence minus one (fmo)对照进行门控。
[0093]
图32a、32b、32c和32d描绘了多克隆扩增的原代小鼠t细胞 扩展的表型表征。图32a描绘了用dynabeads或用apc-ms扩增 的样品中，活的单cd8 细胞中颗粒酶b阳性细胞的facs定量(左)， 和代表性的facs图(右)。图32b描绘了在用dynabeads或用 apc-ms扩增的样品中，活的单cd4 细胞中foxp3阳性细胞的facs 定量。图32c和32d显示了代表性的facs图，其显示了作为cd8 表达的函数，活的单细胞上的pd-1表达。在每个时间点，对于每个 样品，将流数据相对fluorescence minus one(fmo)对照进行门控。 数据表示三个实验重复的平均
±
s.d.，并且是至少两个独立实验的表 示。
[0094]
图33显示了多克隆扩增的原代人t细胞上的粘附分子表达。在 用dynabeads或使用各种不同的apc-ms制剂扩增的样品中，共 表达cd62l和ccr7的活的单细胞的facs定量。(f1)饱和1mol％ 生物素化脂质的呈递αcd3和αcd28的apc-ms，在333μg/ml的 msr下输入至初始培养物，(f2)饱和1mol％生物素化脂质的呈递 αcd3和αcd28的apc-ms，在33μg/ml的msr下输入至初始培养 物，(f3)饱和0.1mol％生物素化脂质的呈递αcd3和αcd28的 apc-ms，在333μg/ml的msr下输入至初始培养物，和(f4)饱和 0.1mol％生物素化脂质的呈递αcd3和αcd28的apc-ms，在33μg/ml 的msr下输入至初始培养物。数据表示三个不同供体样品的平均
ꢀ±
s.d.，并且是至少两个独立实验的表示。
[0095]
图34a、34b、34c、34d和34e描绘了原代小鼠t细胞的抗原 特异性扩增。图34a显示了在h-2k(b)中用呈递无关肽(svydffvwl (seq id no:3)；左)或相关肽(siinfekl(seq id no:4)；右) 的apc-ms培养原代cd8 ot-i t细胞两天的代表性亮场显微图像。 比例尺＝100μm。图34b显示了未处理的(模拟)，或用各种apc-ms 制剂培养的原代cd8 ot-i t细胞的扩增。(f1)饱和1mol％生物 素化脂质的呈递siinfekl(seq id no:4)/h-2k(b)和αcd28的 apc-ms，在333μg/ml的msr下输入至初始培养物，(f2)饱和1mol％ 生物素化脂质的呈递siinfekl(seq id no:4)/h-2k(b)和αcd28 的apc-ms，在33μg/ml的msr下输入至初始培养物，(f3)饱和 0.1mol％生物素化脂质的呈递siinfekl(seq id no:4)/h-2k(b) 和αcd28的apc-ms，在333μg/ml的msr下输入至初始培养物， 和(f4)饱和0.1mol％生物素化脂质的呈递siinfekl(seq id no: 4)/h-2k(b)和αcd28的apc-ms，在33μg/ml的msr下输入至初始 培养物。图34c描绘了用各种apc-ms制剂扩增13天并且随后与 b16-f10细胞共培养的活的单cd8 ot-i t细胞的ifnγ和tnfα表 达的facs定量，所述b16-f10细胞模拟脉冲(-)，或用siinfekl (seq id no:4)肽脉冲( )。图34d描绘了通过用各种apc-ms 制剂扩增13天并随后在各种效应:靶细胞比率下共培养的cd8 ot-it细胞对模拟脉冲(-)或siinfekl(seq id no:4)脉冲的( ) b16-f10靶细胞的体外杀灭的定量。图34e描绘了用各种apc-ms制 剂扩增13天的cd8 ot-i t细胞响应于各种不同效应:靶细胞比率下 与模拟脉冲(pep-)或siinfekl(seq id no:4)肽脉冲(pep ) 的b16-f10细胞的共培养的ifnγ分泌的定量。图34b、34c、34d和 34e中的数据表示三个实验重复的平均
±
s.d.，并且是至少两个独立实 验的表示。
[0096]
图35a、35b、35c、35d和35e显示了用抗原特异性apc-ms 制剂扩增的原代人t细胞
的扩展表征。图35a显示了模拟处理的(30 u/ml il-2)或用呈递hla-a2中的clg或glc肽的apc-ms(加载 pmhc、αcd28、il-2)培养的原代人cd8 t细胞的总扩增。对于模 拟处理的细胞仅第0天和第7天的数据可用。图35b、35c和35d显 示了用未脉冲的(肽-)(图35b)、用clg肽脉冲的( clg肽) (图35c)或用glc肽脉冲的( glc肽)(图35d)的t2细胞共 培养后，模拟处理(30u/ml il-2)的或用呈递clg肽(apc-ms clg) 或glc肽(apc-ms glc)的apc-ms培养的cd8 t细胞分离物 的ifnγ分泌的定量。对于模拟处理的细胞仅第7天的数据可用。图 35e显示了代表性的facs图，其显示了在与用未脉冲的(无肽；上)、 用clg肽脉冲的( clg肽；中)或用glc肽脉冲的( glc肽； 下)的t2细胞共培养后，用呈递clg肽(apc-ms/clg)或glc 肽(apc-ms/glc)的apc-ms培养的cd8 t细胞分离物的ifnγ 和tnfα表达。图35a和35b中的数据表示三个实验重复的平均
±ꢀ
s.d.，并且是使用两个不同的供体样品的两个实验的表示。
[0097]
图36a、35b、36c、36d、36e、36f、36g、36h、36i、36j、 36k、36l、36m和36n显示了原代人t细胞的抗原特异性扩增。图 36a、36b、36c、36d、36e、36f、36g、36h、36i和36j描绘了来 自cd8 t细胞分离物的原代人t细胞的抗原特异性扩增。图36a、 36b和36d描绘了对ebv衍生的肽clgglltmv(seq id no:1) (clg；图36a和36b)和glctlvaml(seq id no:2)(glc； 图36d和36e)特异性的活的cd8 单细胞的四聚体分析。模拟处理 的(30u/ml il-2)或用呈递hla-a2中的clg或glc肽的apc-ms (加载pmhc、αcd28、il-2)培养的原代hla-a2 人cd8 t细胞 的代表性的facs图，门中的数字表示对于相应四聚体阳性的活的单 cd8 细胞的百分比(图36a和36d)，以及各个不同时间点的facs 数据的定量(图36b和36e)。对于模拟处理的细胞仅第0天和第7 天的数据可得。图36f显示了模拟处理的，或用呈递在hla-a2中的 clg或glc肽的apc-ms培养的，对clg(图36c)或glc(图 36f)特异性的原代人cd8 t细胞的扩增。对于模拟处理的细胞仅 第0天和第7天的数据可得。图36g、36h和36i描绘了在与未脉冲 的(肽-)(图36g)、用clg肽脉冲的( clg肽；图36h)或用 glc肽脉冲的( glc肽；图36i)的t2细胞共培养后，模拟处理(30 u/ml il-2)的或用呈递在hla-a2中的clg或glc肽的apc-ms 培养的活的单cd8 t细胞中的tnfα ifnγ 细胞的频率。对于模拟 处理的细胞仅第7天的数据可得。图36j显示了通过用呈递hla-a2 中的clg或glc肽的apc-ms扩增14天的原代人cd8 t细胞对 模拟脉冲的(无肽)或用clg肽( clg)或glc肽( glc)脉冲 的t2靶细胞的体外杀灭的定量。图36k、36l、36m和36n显示了 来自pbmc的原代人t细胞的抗原特异性扩增。图36k描绘了在30 u/ml il-2(模拟)中或用呈递hla-a2中的glc肽的apc-ms培养 7天的pbmc内的活的单cd8 t细胞中的glc特异性细胞的频率。 图36l显示了在30u/ml il-2(模拟)中或用呈递hla-a2中glc 肽的apc-ms培养7天的pbmc内的glc特异性cd8 t细胞的数 量。条上方的数字表示倍数扩增(平均
±
s.d.)。图36m和36n显示 了在与未脉冲的(无肽)、用clg肽脉冲的( clg)或用glc肽 脉冲的( glc肽)的t2细胞共培养后，来自在30u/ml il-2(模拟) 中或用呈递hla-a2中glc肽的apc-ms培养7天的pbmc的活的 单cd8 t细胞中的tnfα ifnγ细胞的频率(图36m)和ifnγ分泌 (图36n)。所有数据表示三个实验重复的平均
±
s.d.，并且是使用 两个不同的供体样品的两个实验的表示。
[0098]
图37描绘了apc-ms支架在体外的降解。用原代小鼠t细胞 (25
×
104t细胞/167μg apc-ms)培养呈递αcd3/αcd28(1％生物素 化的脂质)并释放il-2的apc-ms(167μg)。在各个不同时间点， 将培养物在700rcf下离心5min，并且通过电感耦合等离子体发射光 谱法
(icp-oes；galbraith laboratories)定量沉淀物中的si含量。直 至开始培养后1周，培养物沉淀物中si是不可检测的。
[0099]
图38显示了多样的可溶性免疫指导有效负载从apc-ms的受控 释放。产生了4种apc-ms，其在脂质涂覆前各自包含加载至500μgapc-ms中的2μg il-2、il-21、tgfβ或il-15sa。将样品彻底洗涤 以除去未结合的蛋白质，并随后在37℃下维持长达28天。通过elisa 评价随着时间的有效负载释放。
[0100]
图39a和39b描绘了使用含有头基标记的脂质中10％的羧基荧 光素的msr-slb的光漂白(frap)实验后的荧光恢复。图39a是 三个独立的frap事件的代表性图像。图像显示了光漂白前(左)、 紧接在光漂白后(中)和荧光恢复后(右)的荧光标记的msr-slb。 光漂白区域通过红色箭头来表示。图39b显示了随着时间的荧光恢复 的定量。用黑色虚线显示了不同的msr-slb上的8个独立的光漂白 的荧光恢复，并用实线显示了平均趋势。
[0101]
图40a、40b、40c和40d描绘了与dynabead相比，使用 apc-ms进行的t细胞扩增实验的结果，其中将dynabead的量标 准化以包含与apc-ms相同量的抗cd3和抗cd28抗体。图40a.进 行针对总蛋白质定量的二喹啉甲酸分析(bca)以测定商业的小鼠或 人cd3/cd28 t细胞激活剂dynabead表面上结合的蛋白质量。将 dynabead原液彻底洗涤，并且通过bca分析评价dynabead 抗体负载。发现靶向小鼠和人t细胞的dynabead具有相似的抗体 载荷(～20μg/ml)。按照每个细胞，5:1比率的dynabead:细胞(条 件d-b)对应于与16.7μg下呈递0.1％t细胞信号的apc-ms(条件 m-d)相同剂量的抗cd28/抗cd3。图40b.在13天的培养期间对于apc-ms观察到原代小鼠t细胞的剂量依赖性扩增，但在测试的剂量 范围内对于dynabead没有观察到。与呈递相同量的抗cd3和抗 cd28抗体的dynabead相比，apc-ms显著促进了增强的t细胞 扩增(参见条件m-d vs.d-b)。图40c.尽管具有较高的扩增，但 与使用呈递相同量的抗cd3和抗cd28抗体的dynabead(条件 d-b)相比，采用apc-ms条件m-d扩增的细胞没有显示出增强的 耗尽标志物pd-1和lag-3的共表达。图40d.用低至中等剂量的 dynabead扩增的t细胞显示出主要cd4-偏倚的偏斜(cd4-biasedskewing)(条件d-a，d-b)。当加入非常高剂量的dynabead时， 观察到了中等的cd8偏倚的偏斜(条件d-c)。相反，apc-ms倾向 于显示出重度的cd8偏倚的偏斜，偏斜的程度取决于apc-ms的配 方。图40b、40c和40d中的数据表示来自四只不同小鼠的样品的平 均
±
s.d.，并且是至少两个独立实验的表示。***p《0.001，(b)使用双 因素anova，接着tukey hsd post-hoc检验来分析。
[0102]
图41a和41b描绘了进行实验来评价与dynabead相比，il-2 剂量以及从apc-ms的持续释放对原代小鼠t细胞扩增的作用的结 果。图41a显示了用加载il-2的apc-ms(m-d)、加入培养基中 的apc-ms和il-2(m-d bil2)；dynabead(d-b)或加入培养 基的dynabead和il-2(d-b bil-2)处理的原代小鼠t细胞的扩 增。d-b：dynabead 5:1；d-b-bil-2：dynabead 5:1 il-2大丸； m-d：0.1％t细胞信号/1:10
×
材料/加载的il-2；m-s/bil-2：0.1％t 细胞信号/1l10
×
材料/il-2大丸。图41b显示了用加载il-2的apc-ms (m-d)、加入培养基中的apc-ms和il-2(m-d bil2)；dynabead (d-b)或加入培养基中的dynabead和il-2(d-b bil-2)扩增的 原代小鼠t细胞中耗尽标志物pd-1和lag-3的共表达。数据表示来 自四只不同小鼠的样品的平均
±
s.d.，并且是至少两个独立实验的表 示。***p《0.001，使用双因素anova，接着tukey hsd post-hoc检 验进行分析。
[0103]
图42a和42b描绘了叠氮化物-标记的igg与dbco-呈递msr-slb通过点击化学缀合
的连接。图42a.用含有不同量的dbco 修饰的脂质的msr-slb(如所示的)孵育不同量的叠氮化物修饰的 igg(如所示的)。条上方的值表示连接于msr-slb的叠氮化物修 饰的igg的ug数。图42b显示了对含有不同量的dbco修饰的脂质 的msr-slb的叠氮化物修饰的igg输入的较宽剂量滴定。nigg表示 未叠氮化物修饰的igg。条上方的值表示连接于msr-slb的叠氮化 物修饰的igg的μg数。
具体实施方式
[0104]
本发明提供了操纵t细胞的问题的解决方法。具体地，本发明提 供了抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)，其在这样的细胞操纵中是 有用的。所述支架包括介孔二氧化硅棒(msr)，其结合或覆盖有连 续的、流体支撑的脂质双层(slb)，由此形成msr-slb支架。 msr-slb支架进一步含有多种t细胞激活和t细胞共刺激分子，连 同多种t细胞稳态剂，其一起构成了模拟抗原呈递细胞(apc)并且 允许所述支架引发靶细胞(例如，t细胞)上的各种效应子作用的结 构。在一些实施方式中，所述支架通过靶细胞中存在的细胞表面分子 与支架呈递的各种结合伴体之间的直接或间接相互作用来介导这些 作用。根据使用支架的应用，所述支架通过支架自身的物理或化学特 征调节靶向的细胞的存活和生长。根据应用，所述支架组合物可以修 饰来含有特定的激活和共刺激信号，以及稳态信号传导分子，其一起 作用于介导各种效应子功能，例如，靶细胞的激活、分裂、促进分化、 生长、扩增、重编程、无能、休眠、衰老、凋亡或死亡。在这些应用 中，发现所述支架令人惊讶地提高了靶向的细胞的细胞代谢活性和生 长。此外，通过本发明的支架赋予的生长和代谢活性的提高出乎预料 地优于现有的平台，如磁珠。
[0105]
为了允许特定的细胞(如t细胞)的操纵，可以调节支架组合物 的渗透性，例如，通过针对更大或更小的孔径、密度、聚合物交联、 刚性、韧性、延展性或弹性来选择或工程化材料。所述支架组合物可 以含有物理通道或路径，靶向的细胞通过其与支架相互作用和/或移动 至支架的特定区室或区域中。为了促进区室化，所述支架组合物可以 任选组织成区室或层，其各自具有不同的渗透性，使得细胞被分选或 过滤以只允许特定的细胞亚群进入。支架中靶细胞群的隔离也可以通 过支架组合物的降解、脱水或再水合、氧合、化学或ph改变或正在 进行的自我组装来调节。捕获后，可以允许靶向的细胞在支架内借助 支架中存在的刺激分子、细胞因子和其他辅因子来生长或扩增。在其 他情况中，可以使用阴性选择剂排斥或除去另外渗入支架中的非靶向 细胞。
[0106]
本发明的支架内包含或隔离的细胞主要是免疫细胞。在某些实施 方式中，本发明涉及用于隔离和/或操纵t细胞的支架。在其他实施 方式中，本发明涉及其他淋巴细胞(例如，b细胞)可渗透的支架。 再在其他实施方式中，本发明涉及支架的组合，例如，t细胞支架和 b细胞支架的组合。任选收集和分析免疫细胞(例如，t细胞)来鉴 定在疾病的诊断或治疗中有用的不同亚群。还可以将收集的细胞重新 编程或扩增，用于研发用于治疗中的组合物或制剂。
[0107]
在以下分节中更详细地进一步描述本发明。
[0108]
i.抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)
[0109]
在一个实施方式中，本发明提供了抗原呈递细胞模拟支架 (apc-ms)。所述支架含有包含高表面积介孔二氧化硅微棒(msr) 的基底层；于msr基底层上成层的连续的、流体支
撑的脂质双层 (slb)；吸附于支架上的多种t细胞激活分子和t细胞共刺激分子； 和吸附于支架上的多种t细胞稳态剂。
[0110]
a.介孔二氧化硅
[0111]
在一个实施方式中，本发明的支架的组分包括介孔二氧化硅。介 孔二氧化硅是具有六边形密排的、圆柱形的均一孔隙的多孔体。通过 使用表面活性剂的棒状胶束作为模板来合成这种材料，其通过在酸或 碱催化剂的存在下，将二氧化硅源(如烷氧基硅烷、硅酸钠溶液、水 硅钠石(kanemite)、二氧化硅细粒)在水或醇中溶解和水合而在水 中形成。参见，美国公开no.2015-0072009和hoffmann等，angewandtechemie international edition，45，3216-3251，2006。许多种类的表面 活性剂，如阳离子、阴离子和非离子表面活性剂，已经研究作为表面 活性剂，并且已知一般而言，阳离子表面活性剂的烷基三甲铵盐导致 具有最大比表面积和孔体积的介孔二氧化硅。参见，美国公开no. 2013/0052117和katiyar等(journal of chromatography 1122(1
–
2): 13
–
20)。如本说明书中使用的术语“中尺度”、“介孔”、“介孔 的”等可以是指具有5nm至100nm范围中，特别是2nm至50nm的 范围中的特征尺寸的结构。因此，在一些实施方式中，介孔材料包括 具有5nm至100nm范围的直径的孔隙，其可以是有序或随机分布的。
[0112]
本发明支架中使用的介孔二氧化硅可以以各种形式来提供，例 如，微球、不规则颗粒、矩形棒、圆形纳米棒等，尽管特别优选结构 化的棒形式(msr)。所述颗粒可以具有各种预定的形状，包括，例 如，球形、椭球形、棒状或弯曲圆柱形。组装介孔二氧化硅以产生微 棒的方法是本领域已知的。参见，wang等，journal of nanoparticleresearch，15:1501，2013。在一个实施方式中，通过将原硅酸四乙酯 与胶束棒制得的模板反应来合成介孔二氧化硅纳米颗粒。结果是充满 规则排列孔隙的纳米大小的球或棒的集合。随后可以通过使用调节至 适当ph的溶剂洗涤除去模板。在这个实例中，除去表面活性剂模板 后，制得了特征在于均一、有序和连通的介孔性的亲水性二氧化硅纳 米颗粒，其具有例如约600m2/g至约1200m2/g，特别是约800m2/g 至约1000m2/g，并且尤其是约850m2/g至约950m2/g的比表面积。 在另一个实施方式中，可以使用简单的溶胶-凝胶法或喷雾干燥法来 合成介孔颗粒。还将原硅酸四乙酯与另外的聚合物单体(作为模板) 一起使用。在再另一个实施方式中，可以将一个或多个四烷氧基-硅 烷和一个或多个(3-氰基丙基)三烷氧基-硅烷共同缩合，以提供作为棒 的介孔硅酸盐颗粒。参见，美国公开no.2013-0145488、2012-0264599 和2012-0256336，将其按引用并入。
[0113]
介孔二氧化硅棒可以包括直径为2-50nm的孔隙，例如，2-5nm、 10-20nm、10-30nm、10-40nm、20-30nm、30-50nm、30-40nm、40-50nm 的孔隙。在特定的实施方式中，微棒包括直径大约为5nm、6nm、7nm、 8nm、9nm、10nm、11nm、12nm或更大的孔隙。孔径可以根据应用 的类型而改变。
[0114]
在另一个实施方式中，微棒的长度在微米范围中，范围从约5μ 至约500μm。在一个实例中，微棒包括5-50μm，例如，10-20μm， 10-30μm，10-40μm，20-30μm，30-50μm，30-40μm，40-50μm的长度。 在其他实施方式中，所述棒包括50μm至250μm，例如，约60μm， 70μm，80μm，90μm，100μm，120μm，150μm，180μm，200μm，225μm 或更长的长度。对于细胞的募集，可以优选使用具有较高纵横比的 msr组合物，例如，使用包括50μm至200μm长度，特别是80μm至 120μm的长度，尤其是约100μm或更长的长度的棒。
[0115]
在再另一个实施方式中，所述msr提供了用于连接和/或结合靶 细胞(例如，t细胞)的高表面积。获得高表面积介孔硅酸盐的方法 是本领域已知的。参见，例如，美国专利no.8,883,308和美国公开 no.2011-0253643，将其完整内容按引用并入本文中。在一个实施方 式中，高表面积是由于纳米颗粒的纤维形态引起的，这使其可以在表 面上获得高浓度的高度分散的且易于接近的部分。在某些实施方式 中，高表面积msr具有至少约100m2/g，150m2/g，或至少300m2/g 的表面积。在其他实施方式中，高表面积msr具有约100m2/g至约 1000m2/g的表面积，包括其中的所有值或子范围，例如，50m2/g， 100m2/g，200m2/g，300m2/g，400m2/g，600m2/g，800m2/g，100-500m2/g， 100-300m2/g，500-800m2/g或500-1000m2/g。
[0116]
b.脂质
[0117]
本发明的支架包括msr基底层上的连续的、流体支撑的脂质双 层(slb)。术语“脂质”通常表示与活的系统相结合的异质物质组， 其具有不溶于水的共性，可以通过低极性的有机溶剂(如氯仿和醚) 从细胞提取。在一个实施方式中，“脂质”是指包括长的脂肪酸链的任 何物质，优选含有10-30个碳单元，特别是含有14-23个碳单元，尤 其是含有16-18个碳单元。
[0118]
在一个实施方式中，脂质作为单层提供。在另一个实施方式中， 脂质作为双层提供。脂质双层是由两层脂质分子形成的薄极性膜。优 选，脂质双层是流体，其中单个脂质分子能够在单层内快速扩散。膜 脂质分子优选是两性的。
[0119]
在一个实施方式中，脂质层是连续的双层，例如，类似天然生物 膜(如细胞质膜)中发现的那些。在另一个实施方式中，以支撑的双 层(slb)的形式提供脂质。slb是安置在固体支持物(例如，介孔 二氧化硅棒(msr))上的平面状结构。在这样的配置中，支撑的双 层的上表面暴露，而支撑的双层的内面接触支持物。msr-slb支架 是稳定的并且很大程度上保持完整，即使经受高流速或振动时，并且 可以承受空洞，例如，与介孔二氧化硅基底层的孔对齐的空洞。由于 这种稳定性，使用支撑的双层将实验持续数周和甚至数月是可能的。 slb还易于修饰、衍生化以及与许多化学和/或生物部分化学缀合。
[0120]
在一个实施方式中，可以使用任何已知方法，包括共价和非共价 相互作用，将slb固定于msr基底层上。非共价相互作用的类型包 括，例如，静电相互作用、van der waals’相互作用、π-效应、疏水性 相互作用等。在一个实施方式中，将脂质吸附于msr基底层上。在 另一个实施方式中，将slb通过共价相互作用连接或栓系于msr基 底层上。用于将脂质连接硅酸盐的方法是本领域已知的，例如，表面 吸附、物理固定，例如，使用相变来捕获支架材料中的物质。在一个 实施方式中，将脂质双层于msr基底层上成层。例如，可以将脂质 膜(含有例如，氯仿中77.5:20:2.5摩尔比的dppc/胆固醇/dspe-peg 的溶液)点在介孔二氧化硅上，并且使用旋转蒸发仪蒸发溶剂。参见 meng等，acs nano，9(4)，3540-3557，2015。在一个实施方式中， 例如，可以使用标准方案，通过将水合的脂质膜通过具有例如约100nm孔径的滤器的挤出来制备脂质双层。随后可以将滤过的脂质双 层膜与多孔颗粒核心融合，例如，通过移液混合。
[0121]
或者，通过烷化剂或酰化剂的共价偶联可以用于在msr层上提 供稳定的、结构化的和长期保持的slb。在这样的实施方式中，可以 使用已知技术将脂质双层可逆或不可逆地固定于msr层上。例如， msr基底层可以是亲水性的并且可以进一步处理以提供更亲水的表 面，例如，使用氢氧化铵或过氧化氢。例如，使用已知的偶联术，可 以将脂质双层融合至
多孔msr基底层上，以形成msr-slb支架。 所述支架可以用其他部分进一步加工和衍生化，以允许其他次要试剂 连接和/或固定于所述结构上。
[0122]
因此，在一个实施方式中，本发明提供了msr-slb支架，其中 所述slb组分是磷脂。这样的脂质的代表性实例包括，但不限于， 美国专利no.9,066,867和8,367,628中所述的两性脂质体。例如，所 述脂质双层可以包括选自二肉豆蔻酰基磷酰基胆碱(dmpc)、二棕 榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)、棕 榈酰基-油酰基磷脂酰胆碱(popc)、二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、 二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺 (dmpe)和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(dppe)或其组合的脂质。在 一些实施方式中，所述脂质双层包括模拟哺乳动物细胞膜(例如，人 细胞质膜)的脂质组成的脂质组合物。许多哺乳动物细胞膜的脂质组 成已经得到表征并且是本领域技术人员容易获得的(参见，例如， essaid等，biochim.biophys.acta 1858(11):2725-36(2016)，将其完 整内容按引用并入本文中)。脂质双层的组成可以改变以改变脂质双 层的电荷或流动性。在一些实施方式中，所述脂质双层包括胆固醇。 在一些实施方式中，所述脂质双层包括鞘脂。在一些实施方式中，所 述脂质双层包括磷脂。在一些实施方式中，所述脂质是磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷酸肌醇、具有包含6-20个碳的饱和 或不饱和尾的磷酸鞘脂，或其组合。
[0123]
在另一个实施方式中，所述脂质是diyne pc脂质。这样的脂质 的代表性实例包括，但不限于，1-棕榈酰-2-10,12-二十三烷二炔酰基 (tricosadiynoyl)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-23:2diyne pc)和1,2
‑ꢀ
双(10,12-二十三烷二炔酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(23:2diyne pc)。
[0124]
在一个实施方式中，本发明的msr-slb支架保持连续的、流体 lks构至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少 6天，至少7天，至少8天，至少9天，至少10天，至少11天，至 少12天，至少13天，至少14天，至少15天，至少16天，至少17 天，至少18天，至少19天，至少20天，至少21天，至少25天， 至少30天，至少35天，至少40天，至少50天，或更长。
[0125]
可以使用任何已知技术，包括，以下实施例中说明的显微镜可视 化技术，来研究msr-slb支架的架构。
[0126]
c.功能性分子
[0127]
在本发明的一个实施方式中，所述msr-slb支架可以含有一种 或多种功能性分子。术语“功能性分子”包括具有生物学上所需的特 性的任何分子。在本发明的内容中，这样的功能性分子的实例包括蛋 白质、肽、抗原、抗体、dna、rna、碳水化合物、半抗原和其他小 分子，例如，药物。在一个实施方式中，所述功能性分子是t细胞激 活分子。在一个实施方式中，所述功能性分子是t-细胞共刺激分子。 再进一步，在一个实施方式中，所述功能性分子是t细胞稳态剂。在 某些实施方式中，所述msr-slb支架包括多种功能性分子，例如， 至少一种t细胞激活分子、至少一种t细胞共刺激分子和至少一种t 细胞稳态剂。
[0128]
t细胞激活分子
[0129]
在一个实施方式中，本发明提供了含有多种t细胞激活分子的 msr-slb支架。这些激活分子可以介导靶t细胞群体的直接、间接 或半直接激活。参见，benichou等，immunotherapy，3(6):757-770， 2011。优选，t细胞激活分子介导t细胞的直接激活。
[0130]
在一个实施方式中，本发明提供了含有直接激活t细胞的分子的 msr-slb支架，例
如，通过结合靶t细胞上的细胞表面受体。特别 地，直接激活可以通过分化簇3(cd3)介导，其是帮助激活细胞毒 性t细胞的t细胞共受体。在另一个实施方式中，t细胞可以直接激 活而没有cd3的伴随参与，例如，以非cd3依赖性方式激活。
[0131]
在一个实施方式中，以cd3依赖性方式激活靶t细胞。通常认 为t细胞激活需要t细胞受体(tcr)来识别其在mhc分子情况中 的同源肽。此外，cd3与tcr-肽-mhc复合物的结合将激活信号传 递至胞内信号传导分子，来启动t细胞中的信号传导级联。参见，ryan 等，nature reviews immunology 10，7，2010。t细胞上发现的cd3 受体复合物含有cd3γ链、cd3δ链和两条cd3ε链，其结合tcr和 ζ链(zeta-链；cd247)，以在t细胞中产生激活信号。tcr、ζ-链 和cd3分子一起构成t细胞受体(tcr)复合物。激活分子(例如， 抗体)与tcr复合物的一个或多个成员的结合可以激活t细胞。
[0132]
在一个实施方式中，t细胞激活分子是抗体或其抗原结合片段。 在t细胞激活分子以cd3依赖性方式起作用的情况中，t细胞激活 分子优选是抗cd3抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，t 细胞激活分子可以包括，例如，抗cd2抗体或其抗原结合片段、抗 cd47抗体或其抗原结合片段、抗巨噬细胞清道夫受体(msr1)抗体 或其抗原结合片段、抗t细胞受体(tcr)抗体或其抗原结合片段等。 在另一个实施方式中，t细胞激活分子是主要组织相容性复合物 (mhc)分子或其任选加载mhc肽的多聚体。再进一步，t细胞激 活分子是含有mhc和免疫球蛋白(ig)的缀合物或其多聚体。
[0133]
如本文中使用的，术语“抗体”，宽泛地是指由四条多肽链(两 条重(h)链和两条轻(l)链)组成的任何免疫球蛋白(ig)分子， 或保留ig分子的重要表位结合特征的其任何功能性片段、突变体、 变体或衍生物。这样的突变、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。 本文中讨论了其非限制性实施方式。在一个实施方式中，本公开的组 合物和方法中使用的t细胞激活抗体是抗cd3抗体，其选自莫罗单 抗(okt3)、otelixizumab(trx4)、替利珠单抗(hokt3γ1(ala-ala))、 visilizumab、识别cd3抗原/t细胞抗原受体(tcr)复合物(hit3a) 内的cd3的17-19kdε链的抗体和识别cd3e内的tcr复合物 (ucht1)的20kda亚基的抗体，或其抗原结合片段。其他抗cd3 抗体，包括其抗原结合片段，描述于美国专利公开no.2014-0088295 中，将其按引用并入。
[0134]
本发明的实施方式包括“全长”抗体。在全长抗体中，每条重链 由重链可变区(在本文中缩写为hcvr或vh)和重链恒定区组成。 重链恒定区由三个结构域ch1、ch2和ch3组成。每条轻链由轻链 可变区(在本文中缩写为lcvr或vl)和轻链恒定区组成。轻链恒 定区由一个结构域cl组成。vh和vl区可以进一步细分成超可变区， 称为互补决定区(cdr)，其散布着更保守的区域，称为框架区(fr)。 每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，以以下顺序从氨基末端 排列至羧基末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。 免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga 和igy)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2) 或亚类。
[0135]
如本文中使用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体 部分”)是指保留特异性地结合抗原(例如，il-13)的能力的抗体的 一个或多个片段。已经表明可以通过全长抗体的片段来执行抗体的抗 原结合功能。这样的抗体实施方式还可以是双特异性的、双重特异性 的或多特异性的形式；特异性地结合两个或更多个不同的抗原。术语 抗体的“抗原结合部分”内包括的结合片段的实例包括(i)fab片段， 由vl、vh、cl和ch1结构域的单价片
段；(ii)f(ab’)2片段，包 括在铰链区通过二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)fd片 段，由vh和ch1结构域组成；(iv)fv片段，由抗体的单臂的vl 和vh结构域组成，(v)dab片段(ward等(1989)nature 341:544-546， winter等，pct公开wo 90/05144a1，按引用并入本文中)，其包 括单个可变结构域；和(vi)分离的补体决定区(cdr)。此外，尽 管fv片段的两个结构域，vl和vh，通过分开的基因编码，但可以 使用重组方法，通过合成接头将它们连接，所述接头能使其作为单个 蛋白质链制得，其中vl和vh区配对形成单价分子(称为单链fv (scfv)；参见，例如，bird等(1988)science 242:423-426；和huston 等(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883)。这样的单链抗 体也打算包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。还包括单链抗体的 其他形式，如双抗体。双抗体是二价的、双特异性抗体，其中vh和 vl结构域在单个多肽链上表达，但使用太短以致不允许同一链上的 两个结构域之间配对的接头，由此迫使结构域与另一条链的互补结构 域配对，并且形成两个抗原结合位点(参见，例如，holliger等，proc. natl.acad.sci.usa 90:6444-6448(1993)；poljak等，structure 2:1121-1123(1994))。这样的抗体结合部分是本领域已知的 (kontermann和dubel编辑，antibody engineering(2001) springer-verlag.new york.790pp.(isbn 3-540-41354-5))。
[0136]“抗体片段”只包括完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留至 少一种并且通常大部分或全部正常与该部分存在于完整抗体中时相 关的功能。在一个实施方式中，抗体片段包括完整抗体的抗原结合位 点并且因此保留结合抗原的能力。在另一个实施方式中，抗体片段， 例如，包括fc区的，保留至少一种通常与fc区存在于完整抗体中时 相关的生物学功能，如fcrn结合、抗体半衰期调节、adcc功能和 补体结合。在一个实施方式中，抗体片段是具有与完整抗体基本上相 似的体内半衰期的单价抗体。例如，这样的抗体片段可以包括连接于 能够赋予所述片段体内稳定性的fc序列的抗原结合臂。
[0137]
如本文中使用的，术语“抗体构建体”是指包括与接头多肽或免 疫球蛋白恒定结构域连接的本公开的一个或多个抗原结合部分的多 肽。接头多肽包括两个或更多个通过肽键连接的氨基酸残基并且用于 连接一个或多个抗原结合部分。这样的接头多肽是本领域公知的(参 见，例如，holliger等，proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448(1993)； poljak等，structure 2:1121-1123(1994))。免疫球蛋白恒定结构域 是指重链或轻链恒定结构域。人igg重链和轻链恒定结构域氨基酸序 列是本领域已知的并且公开于美国专利no.7,915,388的表2中，将其 完整内容按引用并入本文中。
[0138]
再进一步，抗体或其抗原结合部分可以是较大的免疫粘附分子的 一部分，所述较大的免疫粘附分子通过抗体或抗体部分与一个或多个 其他的蛋白质或肽的共价或非共价结合形成。这样的免疫粘附分子的 实例包括使用抗生物素蛋白链菌素核心区域来制备四聚scfv分子 (kipriyanov等，human antibodies and hybridomas 6:93-101(1995)) 和使用半胱氨酸残基、标志物肽和c-末端多组氨酸标签来制备二价和 生物素化的scfv分子(kipriyanov等，mol.immunol.31:1047-1058 (1994))。可以分别使用常规技术例如完整抗体的分别木瓜蛋白酶 或胃蛋白酶消化从完整抗体制备抗体部分如fab和f(ab’)2片段。此 外，可以如本文中所述的使用标准重组dna技术，获得抗体、抗体 部分和免疫粘附分子。
[0139]
如本文中使用的，“分离的抗体”意欲指基本上不含具有不同抗 原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性地结合cd3的分离抗体 基本上不含特异性地结合cd3以外的其他
抗原的抗体)。然而，特 异性地结合cd3的分离抗体可以具有与其他抗原(如来自其他物种 的cd3分子)的交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其 他细胞材料和/或化学物质。
[0140]
如本文中使用的，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫 球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本公开的人抗体可以包括不是 由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或 定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如，在cdr中， 并且特别是在cdr3中。然而，如本文中使用的，术语“人抗体”不打 算包括其中源自另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系的cdr序列 已经嫁接至人框架序列上的抗体。
[0141]
如本文中使用的，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方式制 备、表达、形成或分离的所有人抗体，如使用转染至宿主细胞中的重 组表达载体表达的抗体(进一步描述于美国专利no.7,915,388，将其 内容按引用并入本文中)、从重组的组合人抗体文库分离的抗体 (hoogenboom等，tib tech.15:62-70(1994)；azzazy等，clin. biochem.35:425-445(2002)；gavilondo等，biotechniques 29:128-145 (2002)；hoogenboom等，immunology today 21:371-378(2000))、 从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体 (参见，例如，taylor等，nucl.acids res.20:6287-6295(1992)； kellermann等，current opinion in biotechnology 13:593-597(2002)； little等，immunology today 21:364-370(2002))或通过涉及将人免 疫球蛋白基因序列剪接至其他dna序列的任何其他方式制备、表达、 形成或分离的抗体。这样的重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序 列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方式，将这样的重组人抗体 接受体外诱变(或，使用对于人ig序列是转基因的动物时，体内体 细胞诱变)并且因此重组抗体的vh和vl区的氨基酸序列是如下序 列：尽管源自并且涉及人种系vh和vl序列，但可能没有天然存在 于体内人抗体种系库中。一个实施方式提供了能够结合人cd3的完 全人抗体，其可以使用本领域公知的技术来产生，如，但不限于，使 用人ig噬菌体文库，如jermutus等，pct公开no.wo2005/007699a2 中公开的那些。
[0142]
术语“嵌合抗体”是指包括来自一个物种的重链和轻链可变区序 列和来自另一个物种的恒定区序列的抗体，如具有连接人恒定区的小 鼠重链和轻链可变区的抗体。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知 的并且在实施例2.1中有详细讨论。参见，例如，morrison，science 229:1202(1985)；oi等，biotechniques 4:214(1986)；gillies等 (1989)，j.immunol.methods 125:191-202；美国专利no.5,807,715； 4,816,567和4,816,397，将其全部按引用并入本文中。此外，可以通 过本领域已知的技术来产生“嵌合抗体”。参见，morrison等，1984， proc.natl.acad.sci.81:851-855；neuberger等，1984，nature 312:604-608；takeda等，1985，nature 314:452-454，将其全部按引 用并入本文中。
[0143]
如本文中使用的，术语“特异性结合”或“特异性地结合”，关 于抗体、蛋白质或肽与第二个化学物质的相互作用，表示相互作用依 赖于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如， 抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是一般地结合蛋白质。如果 抗体对于表位“a”是特异性的，在包含标记的“a”和抗体的反应 中，含有表位a(或游离的，未标记的a)的分子的存在将降低标记 的a结合抗体的量。
[0144]
本发明的支架中使用的抗体可以是“单特异性的”、“双特异性 的”或“多特异性的”。如本文中使用的，本文中的表述“抗体”意 欲包括单特异性的抗体(例如，抗cd3抗体)
以及包括结合目标抗 原的一条臂(例如，cd3结合臂)和结合第二靶抗原的第二条臂的双 特异性抗体。cd3双特异性抗体的另一条臂结合的靶抗原可以细胞、 组织、器官、微生物或病毒之上或附近表达的任何抗原，相对其的靶 向免疫应答是所需的。在某些实施方式中，cd3结合臂结合人cd3， 并且诱导人t细胞增殖。该术语的含义内还包括结合cd3分子的不 同区域的抗体，例如，结合cd3抗原/t细胞抗原受体(tcr)复合 物(例如，源自hit3a)内的cd3的17-19kdε-链的臂，以及结合 cd3e的tcr复合物(例如，源自ucht1)的20kda亚基的臂。优 选，所述抗cd3抗体是okt3或其cd3结合片段。
[0145]
在一个实施方式中，本发明的支架中使用的抗体分子是双特异性 抗体。双特异性抗体可以用于本发明的情况中，使得目标细胞(例如， 癌细胞或病原体)接近本发明的靶效应细胞(例如，细胞毒性t细胞)， 使得在目标细胞上特异性地介导靶效应细胞的效应子功能。因此，在 一个实施方式中，本发明提供了含有双特异性抗体的支架，其中抗体 的一条臂结合cd3，而另一条臂结合靶抗原，其是肿瘤相关抗原。特 定的肿瘤相关抗原的非限制性实例包括，例如，afp、alk、bage 蛋白、β-连环蛋白、brc-abl、brca1、boris、ca9、碳酸酐酶ix、 半胱天冬酶-8、ccr5、cd19、cd20、cd30、cd40、cdk4、cea、ctla4、细胞周期蛋白-b1、cyp1 b1、egfr、egfrvlll、erbb2/her2、 erbb3、erbb4、etv6-aml、epcam、epha2、fra-1、folr1、gage 蛋白(例如，gage-1、-2)、gd2、gd3、globoh、磷脂酰肌醇蛋 白聚糖-3、gm3、gp100、her2、hla/b-raf、hla/k-ras、hla/mage-a3、htert、lmp2、mage蛋白(例如，mage-1、-2、-3、-4、
ꢀ‑
6和-12)、mart-1、间皮素、ml-iap、mud、muc2、muc3、muc4、 muc5、muc16(ca-125)、mum1、na17、ny-br1、ny-br62、 ny-br85、ny-es01、ox40、p15、p53、pap、pax3、pax5、pcta-1、 plac1、prlr、prame、psma(folhi)、rage蛋白、ras、rgs5、 rho、sart-1、sart-3、steap-1、steap-2、生存素、tag-72、tgf-β、 tmprss2、tn、trp-1、trp-2、酪氨酸酶和uroplakin-3。
[0146]
在一个特定的实施方式中，所述癌抗原是表皮生长因子受体 (egfr)家族的成员，例如，选自egfr(erbb-1)、her2/c-neu (erbb-2)、her3(erbb-3)和her4(erbb-4)或其突变体的受体。
[0147]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有双特异性t细胞啮合剂 (engager)(bite)分子的支架。bite分子特别是识别至少一种上 述肿瘤抗原和至少一种t细胞细胞表面分子(例如，cd3)的抗体。 这样的双特异性t细胞啮合剂分子的代表性实例包括，但不限于， solitomab(cd3
×
epcam)、blinatumomab(cd3
×
cd19)、mab mt-111 (cd3
×
cea)和bay-2010112(cd3
×
psma)。
[0148]
双特异性抗体还可以用于本发明的情况中以靶向效应细胞，如t 细胞或b细胞，来直接或间接介导对病原体的作用，所述病原体例如 为细菌、病毒、真菌、原生动物和其他微生物。在一个实施方式中， 所述病原体是病毒。在另一个实施方式中，所述病原体是细菌。双特 异性抗体已经用于治疗细菌感染，例如，抗药性铜绿假单胞菌 (pseudomonas aeruginosa)。参见，digiandomenico等，sci translmed.，6(262)，2014；kingwell等，nat rev drug discov.，14(1):15， 2015。已经研发了其他双特异性来重定向细胞毒性t淋巴细胞来杀灭 hiv(berg等，proc natl acad sci.，88(11):4723-7，1991)、保护对 抗hbv感染(park等，mol immunol.，37(18):1123-30，2000)和其 他原型病原体(taylor等，j immunol.,159(8):4035-44，1997)。
[0149]
因此，在一个实施方式中，本发明提供了含有双特异性抗体的支 架，其中抗体的
一条臂结合cd3，而另一条臂结合靶抗原，其是传染 病相关抗原(例如，细菌、原生动物、病毒或真菌抗原)。传染病相 关抗原的非限制性实例包括，例如，在病毒颗粒的表面上表达的，或 在感染了病毒的细胞上优先表达的抗原，其中所述病毒选自hiv、肝 炎(甲肝、乙肝或丙肝)、疱疹病毒(例如，hsv-1、hsv-2、cmv、 hav-6、vzv、epstein barr病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、 艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺 炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、htlv、 登革热病毒、乳头状瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病 毒、jc病毒和虫媒病毒性脑炎病毒。或者，靶抗原可以是在细菌表 面上表达的，或在感染细菌的细胞上优先表达的抗原，其中所述细菌 来自选自衣原体、立克次体、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、 pneumonococci、脑膜炎球菌、淋球菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙 雷氏菌、假单胞菌、军团菌、diphtheria、沙门氏菌、芽孢杆菌、梭 菌和钩端螺旋体的属。在一些实施方式中，所述细菌引起霍乱、破伤 风、肉毒梭菌中毒、炭疽、瘟疫或莱姆病。在某些实施方式中，靶抗 原是在真菌表面上表达的，或在感染真菌的细胞上优先表达的抗原， 其中所述真菌选自念珠菌属(例如，白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑 念珠菌、热带念珠菌等)、新生隐球菌、曲霉属(例如，烟曲霉、黑 曲霉等)、毛霉菌目(例如，m.mucor、m.absidia、m.rhizopus等)、 申克氏孢子丝菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和荚膜 组织胞浆菌。在某些实施方式中，靶抗原是在寄生物表面上表达的， 或在感染寄生物的细胞上优先表达的抗原，其中所述寄生物选自溶组 织内阿米巴、结肠小袋纤毛虫、福氏耐格里变形虫、棘阿米巴属、兰 伯氏贾第虫、隐孢子虫属、卡氏肺孢子虫、间日疟原虫、微小巴贝虫、 布氏锥虫、克氏锥虫、杜氏利什曼虫、刚地弓形虫、巴西日圆线虫、 肥头绦虫和马来丝虫。特定的病原体相关抗原的非限制性实例包括， 例如，hiv gp120、hiv cd4、乙肝糖蛋白l、乙肝糖蛋白m、乙肝 糖蛋白s、丙肝e1、丙肝c e2、肝细胞特异性蛋白、单纯疱疹病毒 gb、巨细胞病毒gb和htlv包膜蛋白。
[0150]
在一些实施方式中，本发明的支架可以用于治疗和/或预防过敏反 应或过敏应答。例如，在一些实施方式中，所述支架可以用于产生抑 制过敏应答或反应的t细胞(例如，treg)。例如，在一些实施方式 中，所述支架包括抗cd3抗体和tgf-β。在一些实施方式中，所述 支架包括抗cd3抗体和il-10。在一些实施方式中，所述支架包括抗 cd3抗体和雷帕霉素。在一些实施方式中，所述支架包括抗cd3抗 体、tgf-β、il-10和雷帕霉素。在一些实施方式中，所述支架包括抗 cd3抗体、tgf-β和il-10。在一些实施方式中，所述支架包括抗cd3 抗体和tgf-β和雷帕霉素。在一些实施方式中，所述支架包括抗cd3 抗体和il-10和雷帕霉素。
[0151]
在一些实施方式中，本发明的支架可以用于选择性地扩增过敏原 反应性t细胞(例如，treg)。在一些实施方式中，所述支架包括源 自过敏原的肽。在一些实施方式中，所述源自过敏原的肽在mhc分 子(例如，i类mhc或ii类mhc分子)上呈递(例如，与其复合)。 在一些实施方式中，所述mhc分子是单体。在一些实施方式中，所 述过敏原是食物过敏原(例如，香蕉、牛奶、豆类、贝类、树坚果、 核果、蛋类、鱼类、大豆或小麦过敏原)。在一个实施方式中，所述 过敏原选自食物过敏原、植物过敏原、昆虫过敏原、动物过敏原、真 菌过敏原、病毒过敏原、乳胶过敏原和霉菌孢子过敏原。在一个实施 方式中，过敏原多肽是昆虫过敏原。在一个实施方式中，昆虫过敏原 是尘螨过敏原(例如，来自粉尘螨或屋尘螨的过敏原)。在一个实施 方式中，所述过敏原多肽是卵白蛋白多肽。在一个实施方式中，所述 过敏原多
肽是食物过敏原多肽。在一些实施方式中，所述支架包括源 自过敏原的肽和th1-偏倚(skewing)细胞因子(例如，il-12或ifnγ)。 在一个实施方式中，所述过敏原多肽是食物过敏原多肽。在一些实施 方式中，所述支架包括源自在mhc分子上呈递的过敏原的肽和th1
‑ꢀ
偏倚细胞因子(例如，il-12或ifnγ)。
[0152]
根据某些示例性实施方式，本发明包括特异性地结合cd3和 cd28的双特异性抗原结合分子。这样的分子在本文中可以被称为例 如“抗cd3/抗cd28”，或“抗cd3
×
cd28”或“cd3
×
cd28”双特 异性分子，或其他相似的术语。
[0153]
如本文中使用的，术语“cd28”是指人cd28蛋白，除非特意指 出来自非人物种(例如，“小鼠cd28”、“猴cd28”等)。人cd28 蛋白具有genbank登录号no.np_001230006.1、np_001230007.1 或np_006130.1中所示的氨基酸序列。小鼠cd28蛋白具有 genbank登录号no.np_031668.3中所示的氨基酸序列。上述登录 号包括的各种不同多肽序列包括相应的mrna和基因序列，全部按 引用并入本文中。如本文中使用的，表述“抗原结合分子”表示包括 至少一个互补决定区(cdr)或由至少一个互补决定区(cdr)组成 的蛋白质、多肽或分子复合物，所述cdr单独地或与一个或多个另 外的cdr和/或框架区(fr)结合特异性地结合特定抗原。在某些实 施方式中，抗原结合分子是抗体或抗体的片段，如本文中别处限定的 那些术语。
[0154]
如本文中使用的，表述“双特异性抗原结合分子”表示至少包括 第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的蛋白质、多肽或分子复 合物。双特异性抗原结合分子内的每个抗原结合结构域包括至少一个 cdr，所述cdr单独地或与一个或多个另外的cdr和/或框架区(fr) 结合特异性地结合特定抗原。在本发明的内容中，所述第一抗原结合 结构域特异性地结合第一抗原(例如，cd3)，而第二抗原结合结构 域特异性地结合第二个不同的抗原(例如，cd28)。
[0155]
双特异性抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结构域可以彼 此直接或间接结合。或者，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构 域可以各自连接单独的多聚化结构域。一个多聚化结构域与另一个多 聚化结构域的结合促进了两个抗原结合结构域之间的结合，由此形成 双特异性抗原结合分子。如本文中所用的，“多聚化结构域”是具有 与相同或相似结构或构造的第二多聚化结构域结合的能力的任何大 分子、蛋白质、多肽、肽或氨基酸。例如，多聚化结构域可以是包括 免疫球蛋白ch3结构域的多肽。多聚化组分的非限制性实例是免疫 球蛋白的fc部分(包括ch2-ch3结构域)，例如，选自同种型igg1、 igg2、igg3和igg4以及每个同种型组内的任何同种异型的igg fc 结构域。
[0156]
本发明的双特异性抗原结合分子通常将包括两个多聚化结构域， 例如，各自单独地是独立的抗体重链的部分的两个fc结构域。第一 个和第二多聚化结构域可以是相同的igg同种型，如，例如， igg1/igg1、igg2/igg2、igg4/igg4。或者，第一和第二多聚化结构域 可以是不同的igg同种型，如，例如，igg1/igg2、igg1/igg4、igg2/igg4 等。
[0157]
在某些实施方式中，多聚化结构域是fc片段或含有至少一个半 胱氨酸残基的长度为1至约200个氨基酸的氨基酸序列。在其他实施 方式中，多聚化结构域是半胱氨酸残基或短的含半胱氨酸的肽。其他 多聚化结构域包括包含亮氨酸拉链、螺旋-环基序或卷曲-卷曲基序或 由其组成的肽或多肽。
[0158]
双特异性抗体形式或技术可以用于制备本发明的双特异性抗原 结合分子。例如，
具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段可以功能 性地连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他)一 个或多个其他分子实体，如具有第二抗原结合特异性的另一抗体或抗 体片段，以产生双特异性抗原结合分子。可以用于本发明的情况中的 特定示例性双特异性形式包括，不限于，例如，基于scfv或双抗体 的双特异性形式、igg-scfv融合体、双可变结构域(dvd)-ig、 quadroma、杵-臼(knobs-into-hole)、共同轻链(例如，具有杵-臼的 共同轻链等)、crossmab、crossfab、(seed)体、亮氨酸拉链、duobody、 igg1/igg2、双作用fab(daf)-igg和mab2双特异性形式(对于前述 的形式的概述，参见，例如，klein等，mabs 4:6，1-11，2012和其 中引用的参考文献)。
[0159]
多特异性抗体可以是对一个靶多肽的不同表位是特异性的或可 以含有对超过一个靶多肽是特异性的抗原结合结构域。参见，例如， tutt等，1991，j.immunol.147:60-69；kufer等，2004，trends biotechnol. 22:238-244。本发明的抗cd3抗体可以连接另一个功能性分子，或与 另一个功能性分子共表达，例如，另一个肽或蛋白质。例如，抗体或 其片段可以功能性地连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价 结合或其他)一个或多个其他分子实体，如另一抗体或抗体片段，以 产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。抗体的多特异 性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可 变结构域能够特异性地结合单独的抗原或同一抗原上的不同表位。可 以使用本领域可利用的常规技术，使任何多特异性抗体形式，包括本 文中公开的示例性双特异性抗体形式适用于本发明的抗体的抗原结 合片段的情况中。本发明的多特异性抗原结合分子源自嵌合的、人源 化的或全人抗体。用于制备多特异性抗体的方法是本领域公知的。例 如，使用velocimmune
tm
技术可以制备本发明的双特异性抗原结 合分子的一条或多条重链和/或轻链。使用velocimmune
tm
技术 (或任何其他人抗体产生技术)，最初分离了对特定抗原(例如，cd3 或cd28)的高亲和性嵌合抗体，其具有人可变区和小鼠恒定区。针 对所需特征，包括亲和性、选择性、表位等，表征和选择抗体。用所 需的人恒定区替代小鼠恒定区，以产生可以并入本发明的双特异性抗 原结合分子中的全人重链和/或轻链。
[0160]
在本发明的双特异性抗原结合分子的情况中，与野生型、天然产 生的fc结构域形式相比，多聚化结构域，例如，fc结构域，可以包 括一个或多个氨基酸改变(例如，插入、删除或置换)。例如，本发 明包括双特异性抗原结合分子，其在fc结构域中包括一个或多个改 变，导致具有改变的(例如，增强的或消除的)在fc和fcrn之间的 结合相互作用的修饰fc结构域。在一个实施方式中，双特异性抗原 结合分子包括ch2或ch3区中的修饰，其中所述修饰提高了酸性环 境中fc结构域对fcrn的亲和性(例如，在核内体中，其中ph范围 为约5.5至约6.0)。例如，在美国公开no.2014-0088295中提供了 非限制性实例。本发明还包括双特异性抗原结合分子，其包括第一 ch3结构域和第二ig ch3结构域，其中第一和第二ig ch3结构域彼 此有至少一个氨基酸不同，并且其中与缺乏氨基酸差异的双特异性抗 体相比，该至少一个氨基酸差异降低了双特异性抗体与蛋白a的结 合。在某些实施方式中，fc结构域可以是源自超过一个免疫球蛋白同 种型的嵌合的、组合的fc序列。
[0161]
在另一个实施方式中，t细胞激活分子是主要组织相容性复合物 (mhc)分子，其结合cd3。代表性实例包括，但不限于，结合tcr 和cd8的i型mhc或结合tcr和cd4的ii型mhc。mhc分子可 以任选加载有抗原，例如，生物素化的肽。在其他实施方式中，mhc 分子可以与免疫球蛋白缀合，例如，免疫球蛋白g(igg)链的fc部 分。在另一个实施方式中，可以使用多
个mhc-肽复合物。在后一种 情况中，可以将mhc-肽复合物的多个拷贝共价或非共价地连接多聚 化结构域。这样的mhc多聚体的已知实例包括，但不限于，mhc
‑ꢀ
二聚体(含有两个mhc-肽的拷贝；将igg用作多聚化结构域，并且 mhc蛋白的结构域中的一个共价连接igg)；mhc-四聚体(含有四 个mhc-肽的拷贝，其各自是生物素化的并且mhc复合物通过抗生 物素蛋白链菌素四聚体蛋白一起保持在复合物中，在抗生物素蛋白链 菌素单体和mhc蛋白之间提供非共价连接)；mhc-五聚体(含有 五个mhc-肽复合物的拷贝，通过自组装卷曲-卷曲结构域多聚化)； mhc dextramer(通常含有超过十个mhc复合物，其连接葡聚糖聚 合物)和mhc连锁状多聚体(streptamer)(含有8-12个连接抗生物素 蛋白链菌素的mhc-肽复合物)。mhc四聚体描述于美国专利no. 5,635,363；mhc五聚体描述于美国专利2004109295中； mhc-dextramer描述于专利申请wo 02/072631中。mhc连锁状多聚 体描述于knabel m等，nature medicine 6.631-637，2002中。
[0162]
还可以以非cd3依赖性方式激活靶t细胞，例如，通过cd3以 外的一个或多个细胞表面受体的结合和/或连接。这样的细胞表面分子 的代表性实例包括，例如，cd2、cd47、cd81、msr1等。
[0163]
在这种情况下，cd2实际上在所有t细胞(并且还有自然杀伤 (nk)细胞)上发现了，并且在t淋巴细胞功能中是重要的。cd2 与几种蛋白质相关，包括cd3、cd5和cd45。cd2-cd58相互作用 促进了t细胞和apc之间的细胞-细胞接触，由此通过tcr/cd3复 合物增强了抗原识别。cd2还起到信号传导作用。使用针对cd2的 抗体的共刺激阻断可能是器官移植中有效的免疫抑制策略。因此，在 一个实施方式中，通过使用特异性地结合cd2的抗体或其抗原结合 片段来激活t细胞。抗cd2抗体的代表性实例包括，例如，siplizumab (medi-507)和lo-cd2b(atcc登录号no.pta-802；于1999年6 月22日保藏)。
[0164]
cd47(iap)属于免疫球蛋白超家族并且是膜整联蛋白伴侣，以 及还结合配体血小板反应素-1(tsp-1)和信号调节蛋白α(sirpα)。 参见barclay等，curr.opin.immunol.21(1):47-52，2009；br.j. pharmacol.,167(7):1415-30，2012。cd47与信号调节蛋白α(sirpα) 相互作用，信号调节蛋白α(sirpα)是存在于骨髓细胞上的跨膜受 体。cd47/sirpα相互作用导致双向信号传导，导致不同的细胞-细胞 反应，包括吞噬作用的抑制、细胞-细胞融合的刺激和t细胞激活。 参见，reinhold等，j exp med.,185(1):1-12，1997。根据本发明，在 一个实施方式中，通过使用特异性地结合cd47的抗体或其抗原结合 片段激活t细胞。抗cd47抗体的代表性实例包括，例如，单克隆抗 体hu5f9-g4，在对抗骨髓性白血病的各种临床试验中对其进行了研 究，以及单克隆抗体mabl-1和mabl-2(ferm保藏号no.bp-6100 和bp-6101)。参见，例如，wo1999/12973，将其中的公开内容按引 用并入本文中。
[0165]
cd81是蛋白质的四跨膜蛋白超家族的成员。其在广泛的组织上 表达，包括t细胞和造血细胞。已知cd81起着免疫调节作用。特别 地，cd81的交联在体外增强cd3介导的αβ和γδt-淋巴细胞的激活 并且诱导γδt细胞的非tcr依赖性地细胞因子产生。根据本发明， 在一个实施方式中，通过使用特异性地结合cd81的抗体或其抗原结 合片段来激活t细胞。参见，menno等，j.clin.invest.，4:1265，2010。 抗cd81抗体的代表性实例包括，例如，单克隆抗体5a6。参见，例 如，maecker等，bmc immunol.，4:1，2003.，将其中的公开内容按 引用并入本文中。
[0166]
msr1(cd204)属于a类巨噬细胞清道夫受体的家族，其包括 通过交替剪接msr1基
细胞可以将第二信号递送至t细胞。
[0171]
实例包括可以结合其他细胞上的fc受体的接头，如某些免疫球 蛋白链或免疫球蛋白链的部分。特定的实例包括igg、iga、igd、ige 和igm。使用免疫球蛋白时，不需要整个蛋白质。例如，可以在铰链 区分裂免疫球蛋白基因，并且仅编码重链的铰链、ch2和ch3结构 域的基因用于形成融合蛋白。接头可以结合其他细胞表面结构。例如， 接头可以包括用于许多细胞表面抗原的同源部分，其可以用作将第二 细胞带至t细胞附近的桥。接头还可以独立地递送第二信号。例如， 对t细胞抗原cd28具有结合亲和性的接头可以递送第二信号。此外， 接头可以提高整个融合蛋白在体内的半衰期。可以通过使用不导致第 二信号递送的接头来构建具有t细胞抑制性质的融合蛋白。实例包括 不结合fc受体的ig链、ig f(ab’)2片段、锌指基序、亮氨酸拉链和非 生物物质。非生物物质的实例包括塑料微珠，或甚至是较大的塑料元 件，如塑料杆或管，以及其他可植入体内的生理上可接受的载体。
[0172]
在一些实施方式中，mhc分子没有连接接头。不希望受到任何 特定理论的束缚，据信脂质双层的流体性质允许t细胞识别膜并形成 多价簇。这些簇随后可以被分解，而如果信号传导分子与接头连接在 一起，则这是不可能的。无法分解这些多价簇可能潜在地导致过度刺 激和t细胞耗尽或无能(参见，例如，lee k-h等，science 302(5648): 1218-22(2003))。
[0173]
在一些实施方式中，apc-ms的脂质双层包括有利于脂质物质自 发分配到液体有序结构域(liquid-ordered domain)中的脂质组合物(参 见，例如，wang t-y等，biochemistry 40(43):13031-40(2001))。
[0174]
任选，mhc分子可以加载特定的肽(例如，源自病毒抗原、细 菌抗原或过敏原的肽)。制得融合蛋白后，融合蛋白的特定肽可以加 载至mhc分子中。所述肽随后还可以共价连接mhc，例如，通过 uv交联。或者，可以将肽序列并入编码融合蛋白的dna序列中， 使得肽在融合蛋白产生过程中加载至mhc分子中。在后一种情况中， 肽可以利用系链(tether)，如聚赖氨酸连接，这允许其与融合蛋白的 mhc部分复合。待加载至mhc分子中的特定肽实际上是无限的，并 且基于所需的应用来确定。例如，为了增强t细胞免疫性，可以使用 来自不同来源例如病毒、真菌和细菌感染或肿瘤的，的肽。为了抑制 自身免疫中的t细胞免疫性，可以使用自身反应性肽。为了抑制对移 植的组织的t细胞免疫性，可以使用通过同种异体抗原呈递的自身 肽。
[0175]
毒素，如蓖麻毒素和白喉毒素，以及放射性同位素可以与融合蛋 白复合(例如，使用5-甲基-2-亚氨基硫杂环戊烷)，来杀灭特定的t 细胞克隆。这些毒素可以与接头或融合蛋白的mhc部分化学偶联， 或它们可以结合至编码融合蛋白的dna序列中，使得毒素在融合蛋 白产生的过程中与融合蛋白复合。
[0176]
可以通过构建编码融合蛋白产生的基因来制备mhc-肽/免疫球 蛋白融合蛋白。或者，可以使用化学缀合方法来组装融合蛋白的组分。 编码mhc分子和接头的基因的来源可以获自各种数据库。在i类 mhc融合蛋白的情况中，mhc片段可以连接接头，并且可以允许β2 微球蛋白自我结合。或者，可以构建融合蛋白基因，使得β2微球蛋 白通过醚连接mhc片段。在ii类mhc融合蛋白的情况中，α或β 链可以连接接头并且可以允许另一条链自我结合。或者，可以构建融 合蛋白基因，使得α和β链通过系链连接。可以通过编码成融合蛋白 基因构建体来制备肽，或可选地，使用本领域普通技术人员可利用的 标准方法使用肽合成仪来制
备肽。可以使用常规技术来施用所得到的 完整融合蛋白。
[0177]
t细胞共刺激分子
[0178]
在一个实施方式中，本发明提供了含有多种t细胞共刺激分子的 msr-slb支架。这些共刺激分子可以介导靶t细胞群体的直接、间 接或半直接刺激。优选，在一种或多种t细胞激活分子的存在下，共 刺激分子介导t细胞的激活。
[0179]
术语“共刺激分子”根据本领域认知的其在免疫t细胞激活中的 意义用于本文中。具体地，“共刺激分子”是指一组免疫细胞表面受 体/配体，其在t细胞和抗原呈递细胞之间啮合，并且在t细胞中产 生刺激性信号，其与从抗原呈递细胞上抗原的t细胞受体(“tcr”) 识别产生的t细胞中的刺激信号结合(即，“共刺激”)。如本文中 使用的，“源自apc”的共刺激分子的可溶性形式是指通常通过b 细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞和其他apc表达的共刺激分 子。参见，huppa等，nature reviews immunology.3，973-983(2003)。
ꢀ“
t细胞激活的共刺激剂”是指共刺激配体结合并激活t细胞的能力， 该t细胞已经通过上述任一种机理或途径激活，例如，通过cd3依 赖性或非cd3依赖性t细胞激活。可以如公知的通过细胞因子的产 生和通过公知的增殖分析(例如，cfse染色)和/或按照以下实施例 中所述的，测量t细胞的共刺激激活。
[0180]
在一个实施方式中，本发明提供了含有特异性地结合共刺激抗原 的分子的msr-slb支架。特别地，msr-slb支架含有多种t细胞 共刺激分子，其特异性地结合cd28、4.1bb(cd137)、ox40(cd134)、 cd27(tnfrsf7)、gitr(cd357)、cd30(tnfrsf8)、hvem (cd270)、ltβr(tnfrsf3)、dr3(tnfrsf25)、icos(cd278)、 cd226(dnam1)、crtam(cd355)、tim1(havcr1、kim1)、 cd2(lfa2、ox34)、slam(cd150、slamf1)、2b4(cd244、 slamf4)、ly108(ntba、cd352、slamf6)、cd84(slamf5)、 ly9(cd229、slamf3)、cd279(pd-1)和/或cracc(cd319、 blame)。
[0181]
在一个实施方式中，共刺激分子是特异性地结合一种或多种上述 共刺激抗原的抗体或其抗原结合片段。在这点上，cd28是原型t细 胞共刺激抗原并且结合apc(如树突细胞和激活的b细胞)上表达 的b7家族的分子。在全部cd4 t细胞和约一半的cd8 t细胞上发 现人cd28。归因于cd28的t细胞活性包括能量的阻止、细胞因子 基因转录的诱导、细胞因子mrna的稳定和cd8 细胞毒性t淋巴细 胞的激活。鉴定为cd80(b7-1)和cd86(b7-2)的cd28配体分别 是60kd和80kd的免疫球蛋白超家族单体跨膜糖蛋白。
[0182]
在一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合cd28的抗体 或其抗原结合片段的msr-slb支架。抗cd28抗体的代表性实例包 括，例如，lulizumab pegol和tgn1412。还参见美国专利no.8,785,604。
[0183]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合icos (cd278)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。icos是在激 活的t细胞上表达的cd28超家族共刺激分子。其据认为特别是对于 th2细胞是重要的。抗icos抗体的代表性实例包括，例如，单克隆 抗体2c7，其识别在激活的t细胞上表达的icos分子并且诱导抗人 cd3单克隆抗体预刺激的t细胞的激活以及增殖。参见，deng等， hybrid hybridomics.，23(3):176-82，2004。
[0184]
在另一个实施方式中，本发明提供了含有特异性地结合cd152 (ctla4)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb。所述抗体优选是 中和抗体或阻断抗体。cd152在激活的cd4 和cd8 t细胞上以及 在调节t细胞(treg)上表达。其在t细胞生物学中起作用，在针对 感染的免疫应答过程中，并且作为癌症免疫治疗的靶标，已经得到了 充分描述(egen等，
nat.immunol.,3(7):611-618，2002)。ctla-4 是cd28的同源对应物，两者都结合apc上的cd80和cd86。ctla-4 对于免疫耐受性的重要性是清楚的(waterhouse等，science， 270(5238):985-988，1995)。这些包括对于配体结合比cd28分子显 著(out-competing)较低的亲和性以最小化t细胞共刺激、对tcr 复合物的抑制性磷酸酶的募集(以以破坏正向信号级联)和通过反内 吞作用从apc的表面除去cd80和cd86，由此消除apc正确地激 活另外响应性的t细胞的能力。因此，ctla-4受体/途径的利用是有 吸引力的调节t细胞免疫性的策略。实际上，抗ctla-4是fda批 准的第一种用于癌症患者的检查点阻断治疗的单克隆抗体 (ipilimumab)。根据本发明可以使用的ctla-4抗体的其他实例包 括tremelimumab及其抗原结合片段。
[0185]
在另一个实施方式中，本发明提供含有特异性地结合程序化死亡
ꢀ‑
1(pd-1；cd279)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。pd1 是与cd28和ctla-4相同的受体家族的成员，并且在淋巴和骨髓细 胞上广泛表达。pd-1唯一结合apc和其他周围组织上的b7配体 pd-l1和pd-l2，很大程度上影响了慢性感染情况中反应的cd8 t 细胞的命运。在t细胞上，pd-1在遇到抗原后表达，但几乎立即起 作用以通过pd-1细胞质尾中的信号基序募集磷酸酶shp-1和shp-2 来阻止t细胞激活，这降低了akt磷酸化并且降低了t细胞代谢、增 殖和存活。因此，所述抗体优选是中和抗体或阻断抗体。这样的抗 pd-1抗体的代表性实例包括，例如，纳武单抗(nivolumab)、 lambrolizumab(mk-3475)、pidilizumab(ct-011)和amp-224。
[0186]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合cd81的抗 体或其抗原结合片段的msr-slb支架。cd81的啮合降低了cd4 t 细胞中引发t细胞/cd3介导的前病毒dna需要的信号传导阈值 (tardif等，j.virol.79(7):4316-28，2005)。抗cd81抗体的代表 性实例包括，例如，单克隆抗体5a6。参见，例如，maecker等，bmcimmunol.,4:1，2003，将其中的公开内容按引用并入本文中。
[0187]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合cd137的 抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。cd137的交联增强了t细 胞增殖、il-2分泌、存活和细胞溶解活性。此外，其可以增强免疫活 性以消除体内肿瘤。因此，结合cd137的抗体优选是激动抗体。抗 cd137抗体的代表性实例包括，例如，单克隆抗体utomilumab，其是 目前在正临床试验中研究的人igg。参见国家临床试验id: nct01307267。
[0188]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合ox40 (cd134)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。ox40l结合 t细胞上的ox40受体，从而防止其死亡并且随后提高细胞因子产生。 ox40维持头几天后的免疫应答中具有关键作用，并且由于其增强存 活的能力，有助于记忆应答。ox40在体内的th1和th2介导的反应 中也都起着关键作用。因此，结合ox40的抗体优选是激动抗体。抗 ox40抗体的代表性实例包括，例如，抗ox40单克隆抗体utomilumab， 其正在各种临床试验中进行研究(参见国家临床试验id: nct01644968、nct01303705和nct01862900)。
[0189]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合cd27 (tnfrsf7)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。cd27是 tnf-受体超家族的成员并且是t细胞免疫性的产生和长期维持所需 的。其结合配体cd70，并且在调节免疫球蛋白合成中起着关键作用。 cd27支持天然t细胞的抗原特异性扩增(但没有效应细胞 成熟)，与cd28和il2的细胞
周期促进活性无关(hendriks等，natureimmunology 1，433-440，2000)。因此，本发明的msr-slb支架优 选包括结合cd27的激动抗体。抗cd27抗体的代表性实例包括，例 如，单克隆抗体varlilumab。参见，ramakrishna等，journal forimmunotherapy of cancer，3:37，2015。
[0190]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合糖皮质激素 诱导的tnf受体家族调节的基因(gitr或cd357)的抗体或其抗原 结合片段的msr-slb支架。gitr是25kd tnf受体超家族成员， 其在激活的淋巴细胞上表达。gitr通过t细胞受体啮合上调。gitr 的细胞质结构域与cd40、4-1bb和cd27同源。gitr信号传导已经 显示出调节t细胞增殖和tcr介导的凋亡，并且破坏免疫自身耐受 性。gitr进一步结合gitrl，并且涉及调节t细胞的发育和调节th1 子集的活性。用激动抗体调节gitr已经显示出能通过多重机制扩增 动物模型中的抗肿瘤免疫应答。设计抗gitr抗体来激活gitr受体， 由此提高效应t细胞的增殖和功能。同时，treg表面上的gitr连接 可以消除这些细胞对肿瘤特异性效应t细胞的抑制功能，因此进一步 增强t细胞免疫应答。抗gitr抗体的代表性实例包括，例如，人源 化的、fc失能的抗人gitr单克隆抗体trx518，其诱导肿瘤抗原特 异性t效应细胞的激活，以及消除由不当激活的t调节细胞诱导的抑 制。trx518正在各种临床试验中进行研究(参见国家临床试验id：nct01239314)。
[0191]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合cd30 (tnfrsf8)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。cd30抗 原是属于肿瘤坏死因子受体超家族的跨膜糖蛋白，其在受到刺激时， 对细胞生长和存活发挥多向性作用。在正常或发炎的组织中，cd30 表达限于中等/大的激活的b和/或t淋巴细胞。其通过激活的而不是 静止的t和b细胞来表达(guo等，infect.immun.，81(10)，3923-3934， 2013)。通过体内施用激动抗cd30单克隆抗体(mab)刺激 cd30l/cd30信号恢复了cd30l敲除小鼠中vγ1-vγ4-γδt细胞的 il-17a产生。抗cd30抗体的代表性实例包括，例如，brentuximabvedotin(adcetris)。
[0192]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合hvem (cd270)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。cd270是tnf
‑ꢀ
受体超家族的成员。这个受体鉴定为单纯疱疹病毒(hsv)进入的细 胞介质。这个基因中的突变已经重复地与弥散性大b-细胞淋巴瘤的病 例相关。抗cd270抗体的代表性实例包括，例如，单克隆抗体 hvem-122。参见，cheung等，j.immunol.,185:1949，2010；hobo 等，j immunol.，189:39，2012。
[0193]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合淋巴毒素β 受体(ltβr；tnfrsf3)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。 ltβr涉及cd4 t细胞启动(summers deluca等，j exp med.， 204(5):1071-81，2007)。抗ltβr抗体的代表性实例包括，例如，单 克隆抗体bbf6抗体。还参见wo2010/078526，将其按引用并入。
[0194]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合dr3 (tnfrsf25)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。据认为 dr3涉及控制由t细胞激活诱导的淋巴细胞增殖。具体地，dr3的 激活依赖于t细胞受体的预先啮合。结合tl1a后，dr3信号传导提 高了t细胞通过il-2受体对内源性il-2的敏感性并且增强了t细胞 增殖。因为受体的激活是t细胞受体依赖性的，体内dr3活性对于 遇到同源抗原的那些t细胞是特异性的。静止时，并且对于没有基础 自身免疫的个体，规律地遇到同源抗原的大部分t细胞是foxp3 调 节t细胞。tnfrsf25的刺激，在不存在任何其他外源信号的情况下， 刺激明显的并且高度特异性的
foxp3 调节t细胞的增殖，在5天内 从全部cd4 t细胞的8-10％到全部cd4 t细胞的35-40％。dr3激 动剂的代表性实例包括，例如，特异性地结合dr3的抗体(reddy 等，j.virol.，86(19)10606-10620，2012)和激动剂4c12(wolf等， transplantation，27；94(6):569-74，2012)。
[0195]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合cd26 (dnam1)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。cd226是 在天然杀伤细胞、血小板、单核细胞和t细胞子集的表面上表达的～65 kda糖蛋白。其是免疫球蛋白超家族的成员并且介导细胞粘附于带有 其配体cd112和cd155的其他细胞。cd226与抗体的交联引起细胞 激活，并且cd226和lfa-1与其各自的配体的连接在引发t和nk 细胞的细胞毒性和细胞因子分泌中合作(tahara等，int.immunol.16 (4):533-8，2004)。
[0196]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合crtam (cd355)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。ctram是i 类mhc限制的t细胞相关分子，其调节一些cd4 t细胞中的晚期 细胞极性。ctram还调节干扰素-γ(ifnγ)和白细间介素-22(il-22) 产生。在一个实施方式中，msr-slb支架包括单克隆抗ctram抗 体。crram抗体的代表性实例包括例如小鼠抗人ctram抗体21a9 (gentex inc.usa，irvine，ca)。
[0197]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合tim1 (havcr1，kim1)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。tim 基因属于i型细胞表面糖蛋白，其包括n-末端免疫球蛋白(ig)-样 结构域、具有不同长度的粘液素结构域、单跨膜结构域和c-末端短细 胞质尾。tim基因的定位和功能在每个成员之间是发散的。tim-1优 选在th2细胞上表达并且已经鉴定为用于t细胞激活的刺激分子(umetsu等，nat.immunol.6(5):447-54，2005)。在一个实施方式 中，msr-slb支架包括单克隆抗tim1抗体。tim1抗体的代表性实 例包括，例如，兔抗人tim1抗体ab47635(abcam，cambridge， ma)。
[0198]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合slam (cd150，slamf1)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。 slam(cd150)是自身配体和细胞表面受体，其起到共刺激分子的 作用并且还是控制巨噬细胞杀灭革兰氏阴性细菌的微生物传感器。特 别地，slam调节nadph氧化酶nox2复合物的活性和在进入吞噬 体后(在与细菌外膜蛋白相互作用后)的吞噬溶酶体成熟(berger等， nature immunology 11，920-927，2010)。slamf1在激活的和记忆t 细胞的表面上以及在激活的b细胞、树突细胞、巨噬细胞和血小板上 表达(calpe等，adv.immunol.2008；97:177)。在一个实施方式中， msr-slb支架包括单克隆抗slam1抗体或其抗原结合片段。slam1 抗体的代表性实例包括，例如，兔抗人slam1抗体600-401-en3 (rockland antibodies，limerick，pa)。
[0199]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合2b4 (cd244，slamf4)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。 cd244是在介导非主要组织相容性复合物(mhc)限制性杀灭的自 然杀伤细胞(nk细胞)(和一些t细胞)上表达的细胞表面受体。 据认为nk细胞和靶细胞之间通过这种受体的相互作用介导了nk细 胞溶细胞活性。cd244是共抑制slam家族成员，其在存在选择性 cd28阻断的免疫调节的情况下，削弱了初级抗原特异性cd8( )t细 胞应答。最近的研究揭示了在其中cd28信号传导被阻断的动物中， 2b4对抗原特异性cd8( )t细胞的特异性上调(liu等，j exp med. 2014年2月10日；211(2):297-311)。在一个实施方式中，所述 msr-slb支架包括单克隆抗cd244抗体或其抗原结合片段。cd244 抗体的代
表性实例包括，例如，抗2b4抗体c1.7或pe缀合的抗2b4(c1.7)，其已经在sandusky等中进行了表征(eurjimmunol.2006年12月；36(12):3268-76)。
[0200]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合ly108(ntba、cd352、slamf6)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。slamf6是i型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族的cd2亚家族，其在自然杀伤(nk)、t和b淋巴细胞上表达。与标准cd28途径相比时，t淋巴细胞通过slamf3/slamf6途径的共刺激介导了更有效的对il-17a表达的作用。slamf3/slamf6信号传导介导了提高的核丰度并将rorγt募集至附近的il17a启动子，导致提高的反式激活和基因表达(chatterjee等，jbiolchem.,287(45):38168-38177，2012)。在一个实施方式中，msr-slb支架包括单克隆抗cd244抗体或其抗原结合片段。cd244抗体的代表性实例包括，例如，在flaig等(j.immunol.2004.172:6524-6527)和stark等(j.immunol.methods2005.296:149-158)中表征的抗ntb-a抗体。
[0201]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合cd84(slamf5)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。cd84是免疫球蛋白受体超家族的cd2亚组的成员。这个家族的成员涉及t细胞和nk细胞的激活。cd84提高了激活的t细胞的增殖反应，并且同亲型(homophilic)相互作用增强了淋巴细胞中的干扰素γ分泌。cd84还可以作为用于造血祖细胞的标志物。参见具有pubmedidnos.11564780、12115647、12928397、12962726、16037392的参考文献中的公开内容，其表示它是延长的t细胞:b细胞接触、最佳th功能和生发中心形成所需的。在一个实施方式中，msr-slb支架包括单克隆抗cd84抗体或其抗原结合片段。cd84抗体的代表性实例包括，例如，pe抗人cd84抗体cd84.1.21，其能够增强cd3诱导的ifn-γ产生并部分阻断cd84-ig与淋巴细胞的结合(biolegend，sandiego，ca；目录号no.326008)
[0202]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合ly9(cd229，slamf3)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。cd229通过同亲型相互作用参与t淋巴细胞和副卫细胞之间的粘附反应。其还促进t细胞分化成辅助t细胞th17表型，导致提高的il-17分泌；共刺激活性需要sh2d1a(chatterjee等，jbiolchem.，287(45):38168-38177，2012)。特别地，cd229和tcr与固定的cd229-his蛋白和抗cd3抗体的同时连接以剂量依赖性方式显著增强了鼠cd3 脾细胞中的细胞增殖和ifn-γ分泌(wang等，thejournalofimmunology,188(增补1)176.7，2012年5月)。因此，在一个实施方式中，msr-slb支架包括单克隆抗cd229抗体或其抗原结合片段。cd229抗体的代表性实例包括，例如，pe抗人cd229抗体hly-9.1.25(biolegend，sandiego，ca；目录号no.326108)或小鼠抗人cd229抗体(r&dsystems目录号no.af1898)。
[0203]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合cd279(pd-1)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。pd-1作为免疫检查点发挥功能并且通过防止t细胞的激活(这随后降低了自身免疫并促进自身耐受性)在免疫系统下调中起着重要作用。通过促进淋巴结中的抗原特异性t细胞的凋亡(程序化细胞死亡)同时降低调节t细胞(抑制性t细胞)中的凋亡的双重机制来完成pd-1的抑制作用。cd229抗体的代表性实例包括，例如，纳武单抗、派姆单抗、pidilizumab(ct-011，curetech)、bms936559和atezolizumab。
[0204]
在另一个实施方式中，本发明涉及含有特异性地结合cracc(cd319，blame)的抗体或其抗原结合片段的msr-slb支架。cd319通过非sh2d1a依赖性的胞外信号调节的erk介
导的途径介 导nk细胞激活(bouchon等，j immunol.2001年11月15日； 167(10):5517-21)。cd319还正向地调节nk细胞功能并且可能有助 于nk细胞的激活。因此，在一个实施方式中，msr-slb支架包括 单克隆抗cd319抗体或其抗原结合片段。cd319抗体的代表性实例 包括，例如，埃罗妥珠单抗(elotuzumab)或其抗原结合片段。
[0205]
在某些实施方式中，本发明提供了含有结合对的msr-slb支架， 所述结合对含有至少一种t细胞激活分子和至少一种t细胞共刺激分 子。这样的对的代表性实例包括，但不限于，例如，结合cd3/cd28、cd3/icos、cd3/cd27和cd3/cd137的抗体，或其组合。在这点上， 根据所需的共刺激分子的活性的调节，可能期望使用对于第一组分 (cd3)的激动抗体和对于第二组分的激动或拮抗抗体。
[0206]
在某些实施方式中，本发明提供了含有结合对的msr-slb支架， 所述结合对含有至少一种t细胞激活分子(其是结合cd3的抗体) 和至少一种t细胞共刺激分子(其是结合cd28的抗体)，任选与第 二共刺激分子(其是结合选自icos、cd27和cd137的抗原的抗体) 一起。在一个实施方式中，msr-slb支架含有选自以下组合的功能 性分子的组合：(a)结合cd3、cd28和icos的抗体，(b)结合 cd3、cd28和cd27的抗体，(c)结合cd3、cd28和cd137的抗 体，(d)结合cd3、cd28、icos和cd27的抗体。在这点上，实 验数据表明这些第二t细胞共刺激因子的刺激在与合适的激活刺激 物(如cd3 cd28)一起施用时，可以刺激某些类型的t细胞的分 化。例如，icos刺激与cd3 cd28 刺激配合时有助于th效应细胞 的分化，而在共刺激信号不足时其支持调节t细胞的分化。参见， mesturini等，eur j immunol.,36(10):2601-12，2006。相似地，抗cd27 抗体可以用于微调该系统。在这点上，抗cd27抗体1f5(与抗cd3 抗体一起使用时)没有潜在地引发危险的多克隆t细胞激活-使用共 刺激cd28特异性超激动抗体观察到的现象。参见，thomas等， oncoimmunology，3:e27255，2014。
[0207]
在一个实施方式中，所述结合对包括单特异性抗体，其中第一抗 体结合所述对的第一成员(例如，cd3)和第二抗体结合所述对的第 二成员(例如，cd28)。在另一个实施方式中，所述对包括双特异 性抗体，其中单个抗体结合单个对成员，例如，结合cd3和cd28 的双特异性抗体。在这点上，由于其给予增强的t细胞激活的能力， 双特异性抗体是优选的。参见，willems等，cancer immunolimmunother.2005年11月；54(11):1059-71。
[0208]
或者，所述结合对包括单特异性抗体，其中第一抗体结合cd3 和第二抗体结合icos。在抗体结合icos的情况中，在分子涉及移植 抗宿主病的病因学时(参见，sato等，transplantation,96(1):34-41， 2013)，可以优选使用中和icos的拮抗抗体。可以使用含有激动性 cd3结合抗体片段和拮抗性icos结合抗体片段的双特异性抗体。
[0209]
或者，所述结合对包括单特异性抗体，其中第一抗体结合cd3 和第二抗体结合cd27。在这个实施方式中，两种抗体都优选是刺激 或激动抗体。已经报道了cd27共刺激增强了体内重新定向的人t细 胞的存活和抗肿瘤活性(song等，blood，119(3):696-706，2012)。 还可以使用含有激动cd3结合抗体片段和激动cd27结合抗体片段的 双特异性抗体。
[0210]
或者，所述结合对包括单特异性抗体，其中第一抗体结合cd3 和第二抗体结合cd137。在这个实施方式中，两种抗体都优选是刺激 或激动抗体。已经报道了cd137共刺激提高了用于过继性t细胞治 疗的cd8( )黑素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞的扩增和功能(chacon等， plos one.2013；8(4):e60031，2013)。还可以使用含有激动cd3结 合抗体片段和激动
cd27结合抗体片段的双特异性抗体。
[0211]
t-细胞稳态剂
[0212]
在一个实施方式中，msr-slb支架和/或抗原呈递细胞模拟支架 含有选自il-1、il-2、il-4、il-5、il-7、il-10、il-12、il-15、il-17、 il-21和转化生长因子β，或其激动剂，其模拟物，其变体，其功能性 片段，或其组合的稳态剂。在一些实施方式中，msr-slb支架和/或 抗原呈递细胞模拟支架含有选自il-1、il-2、il-4、il-5、il-7、il-10、 il-12、il-15、il-17、il-21和转化生长因子β，或其激动剂，其模拟 物，其变体，其功能性片段，或其组合的多种稳态剂。还可以使用这 些稳态剂的功能性片段，其特征在于其调节靶细胞活性的能力。表1 中提供了稳态剂的代表性类型，包括，其人和/或小鼠同源物的ncbi 登录号。
[0213]
表1.可以用于支架中的t细胞稳态剂的类型
[0214]
[0215][0216]
上述t细胞稳态剂的片段和变体是本领域已知的。例如，上述每 种稳态剂的uniprot数据库条目列出了“天然变体”，包括变体和 野生型生物标志物之间的结构关系。纯粹作为代表，人il-1β蛋白 (uniprot：p01584)包括在推定的人il-1β蛋白质序列的氨基酸残 基141具有e
→
n氨基酸置换的天然变体(var_073951)。如果已 知，将片段相似地列于该部分下。
[0217]
优选，t细胞稳态剂是白细胞介素-2(il-2)或其激动剂、其模 拟物、其变体、其功能性片段，或其与表1中所列的一种或多种t细 胞稳态剂的组合。il-2激动剂的实例包括，例如，bay 50-4798 (margolin等，clin cancer res.2007年6月1日；13(11):3312-9)。 il-2模拟物的实例包括，例如，肽1-30(p1-30)，其与il-2协同作 用(eckenberg等，j immunol 2000；165:4312-4318)。il-2片段的实 例包括，例如，含有il-2的头100个氨基酸的稳定器(ballast)部分 (参见，美国专利no.5,496,924)。il-2变体的实例包括，例如，天 然变体var_003967和天然变体var_003968。还包括含有il-2的融 合蛋白，例如，f16-il2，其是对抗肌腱蛋白-c的额外结构域a1的 scfv，其通过短的5-氨基酸接头与人il-2的重组形式融合。f16-il2 融合蛋白的单克隆抗体部分结合表达肿瘤相关抗原(taa)肌腱蛋白
ꢀ‑
c的肿瘤细胞。随后，融合蛋白的il-2部分刺激天然杀伤(nk)细 胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞，并诱导t细胞抗肿瘤细胞免疫应答。 根据本发明可以使用的其他il-2模拟物包括，例如，il-2superkine 肽(levin等，nature 484，529-533，2012)和il-2部分激动剂肽 (zurawski等，embo journal，9(12):3899-3905，1990和美国专利 no.6,955,807)，或其组合。
[0218]
本发明的实施方式进一步包括msr-slb支架，包括，从这样的 支架制得的apc-ms支架，其进一步包括多种上述的t细胞稳态剂。 因此，在一个实施方式中，本发明提供了含有为il-2的第一t细胞 稳态剂和为il-7、il-21、il-15或il-15超激动剂的第二t细胞稳态 剂的msr-slb支架。在这点上，il-15超激动剂(il-15sa)是il-15 与可溶性il-15受体-α的组合，其具有高于单独的il-15的生物活性。 由于其选择性地扩增nk和记忆cd8 t(mcd8 t)淋巴细胞的能 力，il-15sa被认为是有吸引力的抗肿瘤和抗病毒剂。参见，guo 等，j immunol.2015年9月1日；195(5):2353-64。
[0219]
本发明的实施方式进一步涉及包括多种t细胞刺激分子、t细胞 共刺激分子和t细胞稳态剂的支架。典型的支架可以包括至少2种、 至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、 至少9种、至少10种、至少11种或更多种的上述t细胞刺激分子、 t细胞共刺激分子和t细胞稳态剂。
[0220]
在本发明的支架中，可以使用常规技术，将任何功能性分子，例 如，抗原、抗体、蛋白质、酶，包括其片段，直接或间接地固定于 msr基底层和/或slb上。在某些实施方式中，功能性分子可以在细 胞器(例如，高尔基膜或质膜)、细胞、细胞簇、组织、微生物、动 物、植物或其提取物中提供，随后将其固定于msr层或slb层上。 还可以通过在所需位置(例如，slb层的外表面)的遗传工程化或化 学反应来合成功能性分子。
[0221]
本文中所述的支架包括并释放信号传导分子，例如，t细胞稳态 剂，以引发功能性t细胞应答。在一个实施方式中，释放的t细胞稳 态剂是从内源性来源分离的或在体内或体外合成的多肽。例如，内源 性il-2多肽可以从健康的人组织分离。或者，合成的功能性分子可以 通过将模板dna转染或转化至宿主生物体或细胞(例如，培养的人 细胞系或哺乳动物(例如，人源化小鼠或兔子)中来合成。或者，可 以通过聚合酶链式反应(pcr)或其他本领域已知的方法在体外合成 蛋白质形式的合成功能性分子(sambrook,j.,fritsch,e.f.和maniatis, t.,molecular cloning:a laboratory manual.cold spring harborlaboratory press,ny,vol.1,2,3(1989)，按引用并入本文中)。
[0222]
可以对功能性分子进行修饰，以提高体内的蛋白质稳定性。或者， 将功能性分子工程化为更高或更低免疫原性的。例如，在各种功能性 分子的结构是已知的情况下，可以在一个或多个氨基酸残基(例如， 糖基化位点)处修饰序列，以产生免疫原性变体。
[0223]
在一个实施方式中，所述功能性分子是重组的。或者，所述功能 性分子是哺乳动物对应物的人源化衍生物。功能性分子从其衍生的示 例性哺乳动物物种包括，但不限于，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、雪貂、 猫、狗、猴或灵长类。在优选实施方式中，所述功能性分子是上述功 能性分子的人或人源化形式。
[0224]
上述功能性分子的每一种，例如，t细胞刺激分子、t细胞共刺 激分子和t细胞稳态剂，可以彼此独立地吸附或整合至msr基底层 或slb基底层中。因此，在一个实施方式中，提供了一种apc-ms， 其中将t细胞刺激分子吸附或整合至msr基底层中。优选，提供了 一种apc-ms，其中将所述t细胞刺激分子吸附或整合至slb层中。 在另一个实施方式中，提供了一种apc-ms，其中将所述t细胞刺激 分子吸附或整合至msr基底层以及slb层中。在另一个实施方式中， 提供了一种apc-ms，其中将t细胞共刺激分子吸附或整合至msr 基底层中。优选，提供了一种apc-ms，其中将t细胞共刺激分子吸 附或整合至slb层中。再在另一个实施方式中，提供了一种apc-ms， 其中将t细胞共刺激分子吸附或整合至msr基底层以及slb层中。 在另一个实施方式中，提供了一种apc-ms，其中将t细胞稳态剂吸 附或整合至msr基底层中。在另一个实施方式中，提供了一种 apc-ms，其中将t细胞稳态剂吸附或整合至slb层中。再在另一个 实施方式中，提供了一种apc-ms，其中将t细胞稳态剂吸附或整合 至msr基底层以及slb层中。
[0225]
通常，所述功能性分子和msr基底层和/或slb层可以通过使用 反应基团连接在一起，所述反应基团通常通过连接过程转化成新的官 能团或非反应性物质。反应性官能团可以位于上述任一种组分中。在 实施本发明中有用的反应基团和反应类别通常是生物缀合物化学领 域中公知的那些。目前有利的可用于以与反应性螯合物一起利用的反 应类别是在相对温和的条件下进行的那些。这些包括，但不限于亲核 置换(例如，胺和醇与酰基卤化物、活性酯的反应)、亲电子置换(例 如，烯胺反应)以及碳-碳和碳-杂原子多键加成(例如，michael反应、 diels-alder加成)。这些和其他有用的反应在例如march，advancedorganic chemistry，第3版，john wiley&sons，new york，1985； hermanson,bioconjugate techniques，academic press，san diego， 1996；和feeney等，modification of proteins；vol.198，americanchemical society，washington,d.c.，1982中有讨论。
[0226]
有用的反应性侧基官能团包括，例如：
[0227]
(a)羧基及其各种衍生物，包括，但不限于，n-羟基琥珀酰亚 胺酯、n-羟基苯并三
唑酯、酸性卤化物(例如，i、br、cl)、酰基 咪唑、硫酯、p-硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳香族酯；
[0228]
(b)羟基基团，其可以转化成例如酯、醚、醛等。
[0229]
(c)卤代烷基基团，其中卤化物可以之后被亲核基团替代，所 述亲核基团如，例如，胺、羧酸酯阳离子、硫醇阴离子、负碳离子或 醇盐离子，由此产生在卤素原子的官能团处新基团的共价连接；
[0230]
(d)亲双烯体基团，其能够参与diels-alder反应，如，例如， 马来酰亚胺基团；
[0231]
(e)醛或酮基团，使得随后通过羰基衍生物(例如，亚胺、腙、 半卡巴腙(semicarbazones)或肟)的形成或通过如grignard加成或 烷基锂加成这样的机制的衍生化是可能的；
[0232]
(f)磺酰卤基团，用于随后与胺的反应，例如，形成磺胺；
[0233]
(g)硫醇基团，其可以例如转化成二硫化物，或与酰基卤反应；
[0234]
(h)胺或巯基基团，其可以例如酰基化、烷基化或氧化；
[0235]
(i)烯烃，其可以经历例如环加成、酰基化、michael加成等；
[0236]
(j)环氧化物，其可以与例如胺或羟基化合物反应；和
[0237]
(k)亚磷酰胺和其他在核酸合成中有用的标准官能团。
[0238]
可以选择反应性官能团，使得它们不参与或干扰组装反应性螯合 物所需的反应。或者，可以将反应性官能团保护起来，以通过保护基 团的存在防止其参与反应。本领域技术人员了解怎样保护特定的官能 团使得其不干扰选定反应条件集。参见，例如，greene等，protectivegroups in organic synthesis，john wiley&sons，new york，1991。
[0239]
在一个实施方式中，将所述功能性分子通过亲和性配对或化学偶 联加载/吸附至msr基底层或slb或msr层和slb两者上。
[0240]
如本文中使用的术语“亲和性对”包括抗原-抗体、受体-激素、受 体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、核酸(rna或dna) 杂交序列、fc受体或小鼠igg-蛋白a、抗生物素蛋白-生物素、抗生 物素蛋白链菌素-生物素、生物素/生物素结合剂、ni2 或cu2 /histag (6
×
组氨酸)和病毒-受体相互作用。考虑将各种其他特异性结合对 用于实施本发明的方法中。
[0241]
如本文中使用的，“生物素结合剂”包括抗生物素蛋白、抗生物 素蛋白链菌素和其他抗生物素蛋白类似物，如抗生物素蛋白链菌素或 抗生物素蛋白缀合物、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素的高度纯 化和分级分离的物质，以及非或部分氨基酸变体、具有氨基酸或化学 置换的重组或化学合成的抗生物素蛋白类似物(其仍然适应生物素结 合)。优选，每个生物素结合剂分子结合至少两个生物素部分，并且 更优选结合至少四个生物素部分。如本文中使用的，“生物素”包括 除了生物胞素以外的生物素和其他生物素类似物，如生物素酰胺己酸 酯n-羟基琥珀酰亚胺酯、生物素4-酰胺苯甲酸、生物素酰胺己酰肼 以及其他生物素衍生物和缀合物。其他衍生物包括生物素-葡聚糖、 生物素-二硫化物-n-羟基琥珀酰亚胺酯、生物素-6酰胺喹啉、生物素 肼、d-生物素-n羟基琥珀酰亚胺酯、生物素马来酰亚胺、d-生物素p
‑ꢀ
硝基苯基酯、生物素化核苷酸和生物素化氨基酸，如nε-生物素基-1
‑ꢀ
赖氨酸。
[0242]
可以通过亲和性配对官能化的配体包括，但不限于，从天然或合 成来源制备或分
离的受体、单克隆或多克隆抗体、病毒、化疗剂、受 体激动剂和拮抗剂、抗体片段、凝集素、白蛋白、肽、蛋白质、激素、 氨基糖、脂质、脂肪酸、核酸和细胞。简而言之，可以利用针对待通 过本发明的实施检测的任何分子表位或受体的任何位点特异性配体。 优选，所述配体是膜锚定的蛋白质。配体还可以是膜锚定的蛋白质的 衍生物，如可溶性胞外结构域。配体可以是涉及受体-受体细胞相互 作用的受体，如结合mhc受体的tcr。
[0243]
可以通过本领域已知的任何方法来表达和纯化本发明的配体。在 某些实施方式中，可以通过基于杆状病毒的昆虫表达系统或哺乳动物 表达系统来表达所述蛋白质。可以将十五个残基的avitag
tm
肽添加 至所有分子的c-末端。avitag
tm
(avidity，co)中的赖氨酸残基 可以特意地通过bira酶(avidity，co)生物素化。蛋白质还可以设 计成分泌至细胞培养物的上清液中。
[0244]
如上文所述，所述功能性分子可以是任何蛋白质或肽。优选，所 述蛋白质涉及配体-受体相互作用。例如，t细胞激活的重要事件是t 细胞和apc之间的膜-膜接触的结果，其中在两个相对的膜之间发生 了各种配体-受体相互作用，包括，mhc-肽和tcr、lfa-1和icam-1、 cd2和cd48，以及b7或ctla-4和cd28。理解这些相互作用的化 合价需求将促进治疗剂的设计，所述治疗剂增强或抑制对某些抗原的 免疫应答。本发明还可以用作工具来研究通过激动剂或拮抗剂抗原诱 导的t细胞胞内信号传导途径中的微妙差异。所述支架提供了一种明 确的生理环境来测试所述微妙的差异，而无需使用常常使生化分析复 杂化的天然抗原呈递细胞。
[0245]
尽管在整个说明书和实施例中举例说明了抗生物素蛋白链菌素
‑ꢀ
生物素相互作用，但上文中描述的特定结合对成员可以替代本发明方 法中的抗生物素蛋白链菌素和生物素来使用。此外，可以使用超过一 组的特定结合对，特别是当超过一种配体连接到膜表面时。在这一点 上，传统的pep-mhc-抗生物素蛋白链菌素四聚体技术也可以用于筛 选具有特定pep-mhc特异性的t细胞。然而，具有相同特异性的t 细胞可以通过相同抗原刺激而激活或不激活。为了研究免疫应答(例 如，对疫苗接种[病毒或癌症疫苗]的应答、免疫耐受性、自身免疫)， 重要的是基于其对抗原的反应性来区分t细胞。将通过显微镜观察的 钙通量用作t细胞激活的指示，本发明还提供了一种筛选分析用于定 量对特定抗原反应性的原代t细胞。或者，可以将生物素化的 pep-mhc和共刺激分子偶联至抗生物素蛋白链菌素覆盖的芯片上，并 且将所述芯片与本发明的支架配对。
[0246]
在另一个实施方式中，将所述功能性分子与msr基底层和/或 slb层化学偶联。在某些实施方式中，所述化学偶联包括，点击化学 试剂，例如，叠氮化物-炔化学(aac)反应、二苯并-环新炔连接(dcl) 或四嗪-烯烃连接(tal)。例如，在aac的情况中，msr或slb 含有多种单点击化学官能性，并且常常含有两种、三种或更多种这样 的官能性。优选的是每个分子一种或两种这样的官能性。在一个实施 方式中，可点击试剂，如3-叠氮丙胺或10-十一炔酸可以通过点击反 应分别酰胺-键合至肽或蛋白质的羧基或氨基末端，所述点击反应使 用相应的炔烃或叠氮化合物和合适的催化剂来形成1,2,3-三唑环连接 基团。参见，例如，美国公开no.2007/0060658。为了进一步扩展生 物正交无铜点击试剂的库，可以将用于叠氮化物-偶合反应的含有氮 杂-二苯并环辛炔(adibo)的化合物用于蛋白质功能性分子(例如， 抗体)、白细胞介素和细胞因子的位点特异性共价锚定。将相同的无 金属点击反应用于表面的未功能化区域的peg化。这样的处理允许 非特异性结合的显著降低或完全消除。
无铜点击固定方法可以用于制 备各种类型的阵列，以及微珠和纳米颗粒的衍生化。参见，例如，美 国专利no.8,912,322。在一些实施方式中，使用选自叠氮化物、二苯 并环辛炔(dbco)、反式环辛烯、四嗪和降冰片烯及其变体的点击 试剂将所述功能性分子与msr基底层和/或slb层偶联。在一些实施 方式中，所述功能性分子包括叠氮化物，并且所述msr-slb的脂质 双层的脂质包括dbco。
[0247]
术语“点击化学”是指斯凯里普研究所(the scripps researchinstitute)的k.barry sharpless of介绍的化学理念，描述了为了通过 将包括反应性基团的小的单元连接在一起而快速和可靠地产生共价 键而定制的化学作用。点击化学不是指特定的反应，而是指包括模拟 自然界中发现的反应的反应的概念。在一些实施方式中，点击化学反 应是模块化的、范围广泛、给予高化学产量、产生无害的副产物，是 立体特异性的，呈现出》84kj/mol的大的热力学驱动力以利于具有单 一反应产物的反应，和/或可以在生理条件下进行。明显的放热反应使 得反应物是“弹簧加载的(spring loaded)”。在一些实施方式中，点 击化学反应呈现出高原子经济性，可以在简单的反应条件下进行，使 用容易得到的起始材料和试剂，使用无毒溶剂或使用良性或容易去除 的溶剂(优选水)，和/或提供通过非色谱方法(结晶或蒸馏)的简单 产物分离。
[0248]
如本文中使用的，术语“点击化学手柄(handle)”，是指可以 参与点击化学反应的反应物，或反应性基团。例如，应变炔烃(strainedalkyne)，例如，环辛炔，是点击化学手柄，因为其可以参与应变促进 的环加成。通常，点击化学反应需要至少两个包括可以反应的点击化 学手柄的分子。这样的彼此反应性的点击化学手柄对有时候在本文中 称为伴侣点击化学手柄。例如，叠氮化物是环辛炔或任何其他炔烃的 伴侣点击化学手柄。本文中描述了根据本发明的一些方面适用的示例 性点击化学手柄，例如，us 2014/0249296。其他合适的点击化学手 柄是本领域技术人员已知的。
[0249]
在一个实施方式中，本发明提供了包括多种t细胞激活分子和t 细胞共刺激分子，任选地以及与t细胞稳态剂(其通过金属螯合脂质 端基吸附至支架上)的apc-ms。参见，maloney等，chem biol., 3(3):185-92，1996。已经报道了使用螯合的金属离子的几种方法，其 允许组氨酸标记的蛋白质固定于几种类型的界面上，如脂质界面和具 有金属螯合脂质的脂质单层，具有用金属螯合链烷醇形成的自组装单 层的金表面和具有金属螯合硅烷的氧化物表面。例如，peterson等(us 5,674,677)描述了通过将有机螯合剂与蛋白质(例如，酶)偶联来连 接两个氨基酸序列并且将螯合剂加载金属离子的方法。随后将这种复 合物与含有组氨酸标签的任何蛋白质混合以将复合物与组氨酸标记 的蛋白质偶联。还参见us6,087,452，将其全部按引用并入本文中。
[0250]
本发明的功能性分子优选是蛋白质。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽
”ꢀ
可互换使用，并且是指通过肽(酰胺)键连接在一起的氨基酸残基的 聚合物。所述术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、肽或多肽。 通常，蛋白质、肽或多肽是至少三个氨基酸长。蛋白质、肽或多肽可 以是指单个蛋白质或蛋白质的集合。蛋白质、肽或多肽中的一个或多 个氨基酸可以例如通过添加化学实体来修饰，所述化学实体如碳水化 合物基团、羟基基团、磷酸酯基团、法尼基基团、异法尼基基团、接 头，用于缀合、功能化或其他修饰等。蛋白质、肽或多肽也可以是单 个分子或可以是多分子复合物。蛋白质、肽或多肽可以仅是天然产生 的蛋白质或肽的片段。蛋白质、肽或多肽可以是天然产生的、重组的 或合成的，或其任意组合。
[0251]
术语“缀合的”或“缀合”是指两个分子(例如，两个蛋白质)彼此 以通过直接或间接共价或非共价相互作用连接的方式的结合。在通过 点击化学缀合的情况中，所述缀合是通过点击化学手柄的反应形成的 共价键。在某些实施方式中，所述结合是共价的，并且将实体称为彼 此是“缀合的”。在一些实施方式中，通过在蛋白质翻译后蛋白质，并 且在一些实施方式中，在蛋白质分离后与其他分子之间形成共价键， 蛋白质翻译后与另一分子，例如，第二蛋白质缀合。在一些实施方式 中，通过在蛋白质上安置点击化学手柄以及在第二分子上安置可以与 第一点击化学手柄反应的第二点击化学手柄，并进行其中点击化学手 柄反应并在蛋白质和第二分子之间形成共价键的点击化学反应，由此 产生嵌合蛋白质，来实现蛋白质和第二分子(例如，第二蛋白质)的 翻译后缀合。在一些实施方式中，两个蛋白质在其各自的c-末端缀合， 产生c-c缀合的嵌合蛋白。在一些实施方式中，两个蛋白质在其各自 的n-末端缀合，产生n-n缀合的嵌合蛋白。
[0252]
在某些实施方式中，多种可检测标记可以用于分析和/或研究缀合 过程。如本文中使用的，“可检测标记”是指具有至少一种掺入所述 部分中的元素、同位素或官能团的部分，其使得能够检测标记与其连 接的分子，例如，蛋白质或多肽，或其他实体。标记可以直接连接(例 如，通过键)或可以通过栓系(如，例如，任选取代的烷撑；任选取 代的烯撑；任选取代的炔撑；任选取代的杂烷撑；任选取代的杂烯撑； 任选取代的杂炔撑；任选取代的芳撑；任选取代的杂芳撑；或任选取 代的酰撑，或其任意组合，其可以构成栓系)连接。将认识到所述标 记可以在任何位置连接或结合至分子中，例如，蛋白质、多肽或其他 实体。
[0253]
通常，标记可以落入以下五类中的任何一类(或多类)：a)含 有同位素部分的标记，其可以是放射性或重同位素，包括，但不限于， 2
h、3h、
13
c、
14
c、
15
n、
18
f、
31
p、
32
p、
35
s、
67
ga、
99
mtc(tc-99m)、 111
in、
125
i、
131
i、
153
gd、
169
yb和
186
re；b)含有免疫部分的标记，其 可以是抗体或抗原，其可以结合酶(例如，如辣根过氧化物酶)；c) 作为有色的、发光、磷光或荧光部分的标记(例如，如，荧光标记异 硫氰酸荧光素(fitc)或羧基荧光素)；d)具有一个或多个光亲和 性部分的标记；和e)作为一个或多个已知结合伴体的配体的标记(例 如，生物素-抗生物素蛋白链菌素、fk506-fkbp)。在某些实施方式 中，标记包括放射性同位素，优选发射可检测颗粒的同位素。在某些 实施方式中，标记包括荧光部分。在某些实施方式中，标记是荧光标 记异硫氰酸荧光素(fitc)。在某些实施方式中，标记包括具有一个 或多个已知结合伴体的配体部分。在某些实施方式中，标记包括生物 素。在一些实施方式中，标记是荧光多肽(例如，gfp或其衍生物， 如增强的gfp(egfp)或荧光素酶(例如，萤火虫、renilla或gaussia 荧光素酶)。将认识到，在某些实施方式中，标记可以与合适的底物 (例如，荧光素)反应以产生可检测的信号。荧光蛋白的非限制性实 例包括gfp及其衍生物，包括发射不同颜色的光的发色团的蛋白质， 如红色、黄色和青色荧光蛋白等。示例性荧光蛋白包括，例如，sirius、 azurite、ebfp2、tagbfp、mturquoise、ecfp、cerulean、tagcfp、mtfp1、mukg1、mag1、acgfp1、taggfp2、egfp、mwasabi、 emgfp、tagypf、eyfp、topaz、syfp2、venus、citrine、mko、 mko2、morange、morange2、tagrfp、tagrfp-t、mstrawberry、 mruby、mcherry、mraspberry、mkate2、mplum、mneptune、t-sapphire、 mametrine、mkeima。对于gfp和许多其他荧光或发光蛋白的讨论， 参见，例如，chalfie,m.和kain,s r(编辑)green fluorescent protein: properties,applications,and protocols(methods of biochemical analysis, v.47).wiley-interscience,hoboken,n.j.,2006,和/或
chudakov等， physiol rev.90(3):1103-63,2010。在一些实施方式中，标记包括暗淬 灭剂，例如，吸收来自荧光团的激发能并将能量作为热耗散的物质。
[0254]
在另一个实施方式中，可以使用本领域已知的、共价或非共价加 载技术将功能性分子加载至介孔二氧化硅和/或脂质双层上。在一个实 施方式中，非共价地加载所述功能性分子。例如，lei等(美国公开 no.2011-0256184)描述了介孔硅酸盐，其提供天然或功能化结构内 通过非共价键合的抗体(如igg)的增强的自发加载。因此，可以用 这样的硅酸盐来配制本发明的支架。
[0255]
在另一个实施方式中，可以功能性分子化学偶联至msr上。在 这样的实施方式中，可以通过利用一种或多种以下的分子和其中所含 的反应基团来进行偶联：半胱氨酸(硫醇基)、丝氨酸或苏氨酸(羟 基)、赖氨酸(氨基)、天冬氨酸或谷氨酸(羧基)。或者，功能性 分子可以通过利用多聚组氨酸-标签(his-标签)、含有多聚组氨酸标 签的肽或含有多聚组氨酸-标签的抗体与msr缀合。在本文中，多聚 组氨酸-标签由至少四个、五个、六个或七个组氨酸(his)残基组成。
[0256]
在一个实施方式中，使用锚，将功能性分子连接孔隙壁。然而， 锚不是必需组分。在某些实施方式中，介孔二氧化硅的每个孔隙容纳 至少一个功能性分子。因此，孔隙必须具有适于固定生物物质的大小。 孔径取决于待固定的功能性分子的大小。发功能性分子固定于孔隙中 时，功能性分子可以通过静电键合吸附于孔隙的内表面上。功能性分 子还可以通过非共价键合(如van der waals力、氢键键合或离子键合) 保持在孔隙中。
[0257]
在其中msr包括锚定部分的上述实施方式中，锚可以具有减少 功能性分子的大的结构变化的作用，以将其稳定地保持。优选，锚由 与介孔材料基本上相同的组分组成。锚可以包括一个或多个官能团以 允许结合所需的功能性分子：羟基、酰胺基、氨基、吡啶基、脲基、 氨基甲酸酯基、羧基、酚基、偶氮基、羟基、马来酰亚胺基、硅烷衍 生物或氨基烷烯基。
[0258]
本发明的实施方式进一步涉及本发明的msr-slb支架，包括， 含有这样的支架的支架，所述支架包括吸附于脂质基质中的多种上述 功能性分子。
[0259]
在一个实施方式中，将所述功能性分子通过物理插入吸附于支撑 脂质双层中。用于将蛋白质插入两性分子的双层中的技术是本领域已 知的。在一个实施方式中，双层的环境中的蛋白质，例如，在疏水性 介质和/或亲水主体和/或水合支撑物中，可以自发地插入双层中。或 者，可以通过施加电压和/或将加载蛋白质的囊泡与双层融合，驱使蛋 白质进入双层中。囊泡可以包含在亲水主体中或引入亲水主体中。在 一种情况中，可以通过使用pct公开no.wo2009/024775中公开的 探针方法将蛋白质引入膜中。插入的蛋白质可以是已知的膜相关蛋 白，例如，上述t细胞激活分子和/或t细胞共刺激分子中的一种或 多种。
[0260]
在另一个实施方式中，功能性分子可以是用于t细胞扩增中的抗 原。这样在t细胞扩增中有用的抗原的代表性实例包括，全长cd19 或其片段或其变体。cd19是嵌合抗原受体(car)t细胞的扩增中 使用的原型抗原。参见，turtle等，blood,126:184,2015；turtle等， j clin invest.,126,2123-38,2016。在另一个实施方式中，抗原是全长 cd22或其片段或其变体，其在car t细胞的扩增中也是有用的。参 见，haso等，blood,121(7):1165
–
1174,2013；qin等，blood,122:1431, 2013。
[0261]
在可替换的实施方式中，功能性分子可以是膜相关蛋白，其直接 或间接锚定于双层。其他功能性分子，例如，选择性或非选择性膜转 运蛋白、离子通道、孔形成蛋白或膜驻
留受体等，也可以通过这种方 法插入slb中。
[0262]
在另一个实施方式中，功能性分子可以与膜相关蛋白缀合，所述 膜相关蛋白可以结合和/或插入slb中，例如，短杆菌肽；α-螺旋束， 例如，噬菌调理素或k 通道；和β-桶状结构，例如，α-溶血素、杀 白细胞素或大肠杆菌孔蛋白(e.coli porin)；或其组合。
[0263]
在某些实施方式中，可以通过如离子或非离子表面活性剂这样的 化合物来稳定制造的slb(含有一种或多种功能性分子)。合适的表 面活性剂包括，但不限于，以下实例：合成的磷脂、其氢化衍生物及 其混合物、鞘脂和糖鞘脂、饱和或不饱和脂肪酸、脂肪醇、聚氧乙烯
ꢀ‑
聚氧丙烯共聚物、乙氧基化脂肪酸及其酯或醚、二肉豆蔻酰磷脂酰 胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油或上述两种或多种的组合。根据本发明 优选的表面活性剂是二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油。
[0264]
制造的slb任选可以通过至少一种共表面活性剂来稳定，所述 共表面活性剂选自丁醇、丁酸、己酸、胆酸钠、牛黄胆酸钠和甘氨胆 酸钠，更特别是胆酸钠，或由其组成。
[0265]
制造的slb还可以包括其他赋形剂，如具有生物粘附性或吸附 增强特性的聚合物并且选自包含丙烯酸类聚合物( polycarbophil、)、中链脂肪酸和聚乙二醇或由其组成的 驵。优选的赋形剂是上述丙烯酸类聚合物。
[0266]
可以用用于检测膜相关蛋白的试剂来修饰slb。优选，膜相关蛋 白质是离子通道蛋白和/或孔形成蛋白。优选，膜相关蛋白扩散至双层 中和/或结合双层，引起双层性质的可检测变化。所改变的性质可以是 物理、光学、电学或生物化学的。
[0267]
在一些实施方式中，msr-slb支架和/或抗原呈递细胞模拟支架 包括小分子药物。在一些实施方式中，msr-slb支架和/或抗原呈递 细胞模拟支架包括沙利度胺类似物。在一些实施方式中，msr-slb 支架和/或抗原呈递细胞模拟支架包括ido/mek抑制剂。在一些实施 方式中，msr-slb支架和/或抗原呈递细胞模拟支架包括具有免疫调 节作用的小分子药物。具有免疫调节作用的小分子是本领域已知的 (参见，例如，murphy等，hum.vaccin.immunother.11(10):2463-8 (2015)，将其完整内容特意按引用并入本文中)。
[0268]
在某些实施方式中，含有功能性分子的msr-slb支架可以用于 检测能够与双层中的两性分子和/或双层中的功能性分子相互作用的 细胞。所述相互作用性质上可以是特异性的或非特异性的。或者，所 述细胞可以与功能性分子或与脂质双层相互作用以引起物理、光学、 电学或生物化学变化。这样的相互作用可以以许多不同的方式来检 测，包括，但不限于，通过视觉变化、通过slb中的荧光标记的脂 质或蛋白质的激活，或slb的电容变化。
[0269]
生物可降解支架
[0270]
本发明的实施方式进一步涉及生物可降解支架。在一个实施方式 中，当暴露于生物环境时，所述支架结构可以基本上降解。在一个实 施方式中，所述生物环境是组织培养条件，例如，已经任选适用于培 养淋巴细胞(如t细胞)的组织培养基。在另一个实施方式中，所述 生物环境是生物流体，例如，血液、淋巴、csf、腹水等。在再另一 个实施方式中，所述生物环境是在植入部位(例如，血管、淋巴系统、 脂肪组织等)的组织环境。
[0271]
在某些实施方式中，生物可降解支架在体内接触生物环境1天、 2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12 天、13天、14天、15天、20天、30天、45天、60天、90天或更长 时间后，基本上降解。在某些实施方式中，生物可降解支架在体内接 触生物环境短于1周后，基本上降解。在某些实施方式中，生物可降 解支架在体外接触生物环境过1天、2天、
3天、4天、5天、6天、7 天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、 30天、45天、60天、90天或更长时间后，基本上降解。在某些实施 方式中，生物可降解支架在体外接触生物环境短于1周后，基本上降 解。基本上降解表示支架组合物接触生物环境时，至少30％，至少 50％，至少60％，至少70％，至少90％，至少95％或更多支架组合物 降解。
[0272]
在某些实施方式中，可以有利地使用生物可降解支架。例如，通 过制造支架组合物使得其在孵育期间(例如，允许t细胞扩增时)基 本上降解，可能可以利用扩增的t细胞而无需将其接受另外的纯化和 /或配制步骤。避免下游纯化和/或配制步骤将确保t细胞健康并具有 用于所需应用的所需功能性。
[0273]
因此，在某些实施方式中，可以通过改变介孔二氧化棒的性质， 如大小、几何形状、多孔性，来有利地定制支架组合物的降解动力学。 或者，可以通过改变培养条件(例如，通过调节培养基的ph)，来 改变支架组合物的降解动力学。
[0274]
根据上述目的，本发明的实施方式涉及包括多种功能性分子的 msr-slb支架，其任选是生物可降解的。在一个实施方式中，本发 明的支架可以包封在其他生物可降解支架中。在制备这样的复合生物 可降解支架组合物中有用的试剂和技术是本领域已知的。参见，liao 等，j.biomed.mater.res.b.appl.biomater.,102(2):293-302，2014。 在一个实施方式中，支架由生理上相容的和任选生物可降解的聚合物 制成。可用于支架中的聚合物的实例是本领域已知的。参见，例如， 美国公开no.2011/0020216，将其完整内容按引用并入本文中。这样 的聚合物的代表性实例包括，但不限于，聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、 聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚酐、聚原酸酯、聚醚酯、聚己酸内酯、聚 酰胺酯、聚碳酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚氨酯、聚丙烯酸酯，及其混 合物或共聚物。生物可降解支架可以包括生物可降解材料，例如，胶 原蛋白、海藻酸盐、多糖、聚乙二醇(peg)、聚(乙交酯)(pga)、 聚(l-丙交酯)(pla)或聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)或丝。用于 制造支架组合物的方法是本领域已知的。参见，例如，martinsen等 (biotech.&bioeng.，33(1989)79-89)、(matthew等(biomaterials， 16(1995)265-274),atala等(j urology，152(1994)641-643)和smidsrod(tibtech 8(1990)71-78)，将其中的公开内容按引用并 入本文中。
[0275]
示例性支架利用相对低分子量的乙交酯或海藻酸盐，优选溶解后 在人的肾清除阈值处的大小，例如，将海藻酸盐或多糖减小至1000 至80,000道尔顿的分子量。优选，分子量为1000至60,000道尔顿， 特别优选1000至50,000道尔顿。使用高古洛糖醛酸(guluronate)含 量的海藻酸盐材料也是有用的，因为古洛糖醛酸单体(与甘露糖醛酸 单元相反)提供用于通过二价阳离子的离子交联使聚合物胶凝的位 点。例如，美国专利no.6,642,363，将其按引用并入本文中，公开了 用于制备和使用含有多糖(如海藻酸盐)的聚合物的方法。
[0276]
本发明的支架可以是多孔的，使得支架可以维持抗原递呈，并且 吸引和操纵免疫细胞。在一个实施方式中，支架含有多孔基质，其中 孔隙具有10nm至500μm的直径，特别是100nm至100μm。在这些 实施方式中，本发明利用包括介孔支架的支架。制备具有所需孔径和 孔排列的聚合物基质的方法在本领域中有描述，例如，美国公开no. 2011/0020216和美国专利no.6,511,650，将其按引用并入本文中。
[0277]
介孔二氧化硅棒可以修饰成多功能递送平台，用于递送药物如化 疗剂和dna/sirna、抗体和蛋白质生物制剂、细胞等(lee等，adv. funct.mater.,215-222,2009；liong
多600％，多800％，多1000％，或更多数量的靶t细胞。在某些实 施方式中，孵育时间段为1-30天，优选4-15天，特别是7-12天。在 其他实施方式中，选择性渗透涉及与全血中存在的其他血液细胞(例 如，b细胞、树突细胞、巨噬细胞、红血球或血小板)相比t细胞的 保留和/或扩增。
[0281]
在其他实施方式中，本发明的支架允许特定的t细胞亚群的选择 性渗透，所述t细胞亚群例如自然杀伤(nk)细胞、cd3 t细胞、 cd4 t细胞、cd8 t细胞或调节t细胞(treg)。在本文中，在 4-14天孵育后，与全血中存在的相比，支架含有至少多10％，多20％， 多30％，多40％，多50％，多60％，多70％，多80％，多90％，多 100％，多150％，多200％，多300％，多400％，多500％，多600％， 多800％，多1000％，或更多数量的靶t细胞。人全血中各种类型的 淋巴细胞的百分比和范围如下：nk细胞7％(范围：2-13％)；辅助 t细胞46％(范围：28-59％)；细胞毒性t细胞19％(范围13-32％)； γδt细胞5％(范围：2％-8％)；b细胞23％(范围:18-47％)(berrington 等，clin exp immunol 140(2):289-292，2005)。
[0282]
其他试剂
[0283]
本发明的支架包括一种或多种试剂，其可以是天然产生的、合成 产生的或重组化合物，例如，肽、多肽、蛋白质、核酸、小分子、半 抗原、碳水化合物或其他试剂，包括其片段或其组合。在一个实施方 式中，所述试剂是抗原。在一个实施方式中，所述抗原是肽或蛋白质 或其免疫活性片段。在一个实施方式中，本文中所述的抗原是纯化的。 纯化的化合物含有至少60％重量(干重)的目标化合物。特别地，抗 原是至少75％纯，优选至少90％纯，和更优选至少99％纯。通过任何 合适的标准方法，例如，通过柱色谱、凝胶电泳或hplc分析，来测 量纯度。所述抗原可以是自身抗原或非自身抗原。
[0284]
非自身抗原的代表性实例包括，例如，源自病原体的抗原，所述 病原体选自病毒、细菌、原生动物、寄生物和真菌。所述抗原可以任 选加载于mhc分子上，例如，hla-a、hla-b、hla-c、dp、dq 和dr，其随后结合至支架中。
[0285]
或者，支架含有多种自身抗原，其任选与疾病或障碍关联或相关。 优选，自身抗原特别地与人疾病或障碍相关。在一个实施方式中，自 身抗原与选自以下的自身免疫障碍相关：类风湿性关节炎、狼疮、乳 糜泻、炎性肠病或节段性回肠炎、综合征风湿性多肌痛、多 发性硬化、强制性脊柱炎、1型糖尿病、斑秃、脉管炎、颞动脉炎等。 与1型糖尿病、多发性硬化、节段性回肠炎和类风湿性关节炎等相关 的特定类型的抗原，包括其片段，在文献中已经鉴定。例如，类风湿 性关节炎相关的抗原是47kda蛋白(ra-a47)。参见hattori等，j boneminer metab.,18(6):328-34(2000)。在节段性回肠炎中，抗原可以 是细菌鞭毛蛋白。参见，lodes等，j clin invest.113(9):1296-306 (2004)。同样，主要的髓鞘蛋白，如髓鞘碱性蛋白(mbp)和蛋白 脂蛋白(plp)，很可能在多发性硬化(ms)的病程中是重要的。参 见，derosbo等，j clin invest.92(6):2602-260(1993)。在1型糖尿 病的情况中，可能涉及多种自身抗原，如，前胰岛素原(ppi)、胰 岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶(igrp)、谷氨酸脱羧酶(gad65)、胰 岛瘤抗原-2(ia-2)、嗜铬粒蛋白a和热休克蛋白60。参见，roep 等，cold spring harb perspect med.2(4)，2012(pmid:22474615)。
[0286]
在另一个实施方式中，自身抗原与癌症相关。癌抗原的代表性类 型包括，例如，mage-1、mage-2、mage-3、cea、酪氨酸酶、 midkin、bage、casp-8、β-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、 ca-125、cdk-1、cdk4、eso-1、gp75、gp100、mart-1、muc-1、 mum-1、p53、pap、
psa、psma、ras、trp-1、her-2、trp-1、trp-2、 il13α、il13α2、aim-2、aim-3、ny-eso-1、c9orf112、sart1、 sart2、sart3、brap、rtn4、glea2、tnks2、kiaa0376、ing4、 hsph1、c13orf24、rbpsuh、c6orf153、nktr、nsep1、u2af1l、 cynl2、tpr、sox2、golga、bmi1、cox-2、egfrviii、ezh2、 licam、livin、livinβ、mrp-3、巢蛋白、olig2、art1、art4、 b-细胞周期蛋白、gli1、cav-1、组织蛋白酶b、cd74、e-钙粘着蛋 白、epha2/eck、fra-1/fosl1、gage-1、神经节苷脂/gd2、gnt-v、 β1,6-n、ki67、ku70/80、prox1、psca、sox10、sox11、生存素、 upar、wt-1、二肽酰基肽酶iv(dppiv)、腺苷脱氨酶-结合蛋白 (ad abp)、亲环蛋白b、结直肠相关抗原(crc)-c017-1a/ga733、 t-细胞受体/cd3-ζ链、肿瘤抗原的gage家族、rage、lage-i、 nag、gnt-v、rcasl、α-甲胎蛋白、pl20ctn、pmel117、prame、 脑糖原磷酸化酶、ssx-i、ssx-2(hom-mel-40)、ssx-i、ssx-4、 ssx-5、scp-i、ct-7、cdc27、腺瘤性结肠息肉病蛋白(apc)、胞 衬蛋白、pla、连接蛋白37、ig-独特型、pl5、gm2、gd2神经节苷 脂、肿瘤抗原的smad家族、lmp-1、ebv-编码的核抗原(ebna)-i、 ul16-结合蛋白样转录产物1(mult1)、rae-1蛋白、h60、mica、 micb和c-erbb-2，或其免疫原性肽，及其组合。
[0287]
在另一个实施方式中，抗原是修饰的t细胞(例如，以上所述的 car t细胞)的靶标。在这样的实施方式中，抗原是cd19或其片段 或其变体。在另一个实施方式中，抗原是cd22或其片段或其变体。
[0288]
可以使用任何已知方法，包括共价和非共价相互作用，将上述抗 原与支架组合物结合。在以上涉及制造本发明的具有功能性分子的 msr-slb的章节中已经列出了这些方法中的一些。非共价相互作用 的实例包括，例如，静电相互作用、van der waals’相互作用、π-效应、 疏水性相互作用、物理插入等。例如，可以使用常规方法，通过物理 插入将全长跨膜蛋白抗原结合至脂质双层中。参见，cymer等，journalof molecular biology,427.5:999-1022,2015和美国专利no. 7,569,850，其通过引用并入本文。
[0289]
抗原还可以通过共价相互作用连接或栓系于支架组合物。用于将 抗原连接于支架/表面的方法是本领域已知的，例如，表面吸附、物理 固定，例如，使用相变来捕获支架材料中的物质。或者，通过烷化或 酰化剂的共价偶联可以用于提供抗原在支架上以限定的构象的稳定、 长期的呈现。用于将肽/蛋白质共价与聚合物偶联的示例性试剂和方法 是本领域已知的。参见，例如，美国专利no.6,001,395，将其按引用 并入本文中。在其他实施方式中，将抗原包封在支架中。用于将抗原 包封至合适的支架(例如，plga微球)中的方法是本领域已知的。 参见，例如，美国专利no.6,913,767和国际公开no.wo 1995/011010， 将每篇的公开内容按引用并入本文中。
[0290]
可以将抗原配制成通过直接结合或间接结合与免疫细胞相互作 用。直接结合的类型包括，例如，抗原与同源受体(例如，t细胞受 体)的啮合或偶联。间接结合可以通过一种或多种次级试剂或细胞类 型的中介进行。例如，抗原可以首先结合b细胞或抗原呈递细胞 (apc)，在靶细胞群体(例如，t细胞)与其结合的细胞表面主要 组织相容性复合物(mhc)上获得加工(例如，降解)和呈递。或者， 抗原可以募集分泌各种细胞因子、生长因子、趋化因子等的其他中间 细胞，其转而吸引靶免疫细胞群体。不管机理如何，所述组分协同作 用来操纵或修饰免疫细胞。
[0291]
抗原可以源自细胞裂解物、分级的细胞裂解物、新鲜收集的细胞、 生物流体(包括血液、血清、腹水)、组织提取物等。在一个实施方 式中，抗原源自所需免疫细胞(例如，t细
胞)与其结合的靶细胞的 裂解物。在这些实施方式中，在加载支架前，首先分级分离细胞裂解 物中的抗原。裂解物可以源自所需的靶组织，例如，获自原代组织的 自身免疫疾病特异性细胞。或者，裂解物可以源自癌细胞，例如，从 活检组织学获得的肿瘤样品或组织培养物或肿瘤细胞获得的个体细 胞。
[0292]
本发明的支架还可以含有一种或多种募集剂。所述募集剂可以是 选自t细胞募集剂、b细胞募集剂、树突细胞募集剂和巨噬细胞募集 剂的试剂。
[0293]
在一个实施方式中，所述支架含有t细胞募集剂。t细胞募集剂 的非限制性实例包括，例如，粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子 (gm-csf)、趋化因子(c-c基序)配体21(ccl-21)、趋化因子 (c-c基序)配体19(ccl-19)或fms样酪氨酸激酶3(flt-3)配 体、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、ifnγ、c-x-x基序趋化因子配 体(cxcl)(选自cxcl12和cxcr4)，或其片段，其变体，或其 组合。其他类型的t细胞募集剂包括，用于募集1型t辅助(th1) 子集的ccr5和cxcr3受体的配体。ccr5配体、ccl5和巨噬细胞 炎性蛋白(mip-1α)是已知的。或者，ccr3、ccr4、ccr8和cxcr4 的配体可以用于th2子集的特异性募集。还可以使用配体的组合。
[0294]
上述t细胞募集剂的各种同源物，包括其功能性片段，或其变体， 是本领域已知的。同源物的代表性实例包括来自苍蝇、小鼠、大鼠、 猪、牛、猴、人等的相关蛋白。同源物优选包括上述募集剂的人或小 鼠同源物。
[0295]
本发明的支架适用于优先募集单一类型或单一亚型的细胞，例 如，优先募集t细胞并且特别是treg细胞或nk细胞的子集。优先 募集特征在于与装置(或缺乏募集剂的对照支架)中其他类型的免疫 细胞相比，装置中的一种或多种特定类型的免疫细胞(例如，t细胞、 b细胞、dc/巨噬细胞)增加至少10％，至少20％，至少30％，至少 50％，至少75％，至少100％，至少2倍，至少5倍，至少8倍，至 少10倍或更高的累积。在适用于募集免疫细胞组合(例如，t细胞 和dc/巨噬细胞的组合)的支架中，优先募集特征在于募集的细胞的 总百分比与装置中(或对照支架中)的其他类型的免疫细胞相比高至 少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少75％，至少100％， 至少2倍(即，200％)，至少5倍，至少8倍，至少10倍或更高。 特别地，优先募集特征在于与其它免疫细胞相比，目标细胞数量1-10 倍的增加。
[0296]
在一个实施方式中，本发明涉及进一步包括募集剂(其是 gm-csf、其激动剂、其模拟物、其片段、其变体或其组合)的msr-slb 支架。优选，募集剂是gm-csf，与其ccl-21、ccl-19、flt-3或 gcsf中的至少一种结合。这样的募集剂的代表性实例包括例如人 gm-csf(ncbi登录号#np_000749.2)和小鼠gm-csf(ncbi登录 号#np_034099.2)。在另一个实施方式中，本发明涉及含有gm-csf 片段的msr-slb支架，例如，含有hgm-csf序列的氨基酸18-144 的多肽。在再另一个实施方式中，本发明涉及含有gm-csf变体的支 架，所述变体包括例如var_013089和var_001975，其序列已经登 记在uniprot中(登录no.p04141)。在另一个实施方式中，本发 明涉及含有gm-csf模拟物的msr-slb支架，所述模拟物包括例如 结合gm-csf受体的抗体，例如，monfardini等，curr pharm des., 8(24):2185-99，2002中所述的那些。
[0297]
本发明的实施方式进一步提供用于操纵免疫细胞的支架，其包括 多种其他试剂。在这样的实施方式中，所述其他试剂可以包括生长因 子、细胞因子、趋化因子、白细胞介素、粘附信号传导分子、整联蛋 白信号传导分子或其片段或其组合。
[0298]
生长因子/细胞因子的代表性实例包括，但不限于，肾上腺髓质素 (am)、促血管生
成素(ang)、自分泌运动因子、骨形态形成蛋 白(bmp)、脑源神经营养因子(bdnf)、表皮生长因子(egf)、 促红细胞生成素(epo)、成纤维细胞生长因子(fgf)、胎牛生长 激素(fbs)、胶质细胞系衍生的神经营养因子(gdnf)、粒细胞 集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、 生长分化因子9(gdf9)、肝细胞生长因子(hgf)、肝细胞瘤衍生 的生长因子(hdgf)、胰岛素样生长因子(igf)、角化细胞生长 因子(kgf)、移动刺激因子(msf)、肌抑制素(gdf-8)、神经 生长因子(ngf)、神经营养因子、血小板源生长因子(pdgf)、 促血小板生成素(tpo)、t细胞生长因子(tcgf)、转化生长因子 (tgf-α或tgf-β)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、血管内皮生长因 子(vegf)、wnt、胎盘生长因子(pgf)，或其功能性片段，或其 组合。
[0299]
白细胞介素的代表性类型包括，但不限于，il-1(激活t细胞、 b细胞、nk细胞和巨噬细胞)、il-2(激活b细胞和nk细胞)、 il-3(刺激非淋巴样细胞)、il-4(用于激活的b细胞、静止t细胞 和肥大细胞的生长因子)、il-5(用于激活的b细胞的分化)、il-6 (用于浆细胞和t细胞的生长因子)、il-7(用于前b细胞/前t细 胞和nk细胞的生长因子)、il-10(激活巨噬细胞、b细胞、肥大细 胞、th1/th2细胞)、il-12(激活t细胞和nk细胞)、il-17(激 活th细胞)。也可以使用白细胞介素的功能性片段，其特征在于调 节靶细胞活性的能力。
[0300]
任选，所述支架可以含有粘附分子，其也可以作为信号传导剂。 粘附信号传导分子的代表性实例包括，但不限于，纤连蛋白、层粘连 蛋白、胶原蛋白、血小板反应蛋白1、玻连蛋白、弹性蛋白、肌腱蛋 白、聚集蛋白聚糖、聚集蛋白、骨唾液蛋白、软骨基质蛋白、血纤维 蛋白原、血纤维蛋白、纤蛋白、粘蛋白、巢蛋白、骨桥蛋白、血纤维 蛋白溶酶原、限制素(restritin)、丝甘蛋白、sparc/骨连接素、versican、 von willebrand因子、多糖硫酸肝素、接合素、胶原蛋白、rgd (arg-gly-asp)和yigsr(tyr-ile-gly-ser-arg)肽和环状肽、糖胺 聚糖(gag)、透明质酸(ha)、6-硫酸软骨素、整联蛋白配体、 选择蛋白、钙粘蛋白和免疫球蛋白超家族的成员。其他实例包括神经 细胞粘附分子(ncam)、细胞间粘附分子(icam)、血管细胞粘 附分子(vcam-1)、血小板-内皮细胞粘附分子(pecam-1)、l1 和chl1。也可以使用粘附分子的功能性片段，其特征在于调节靶细 胞与本发明的支架结合的能力。特别地，粘附分子包括含有氨基酸序 列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)的肽或环状肽，其称为细胞粘附 配体并且在各种天然胞外基质分子中发现。在另一个实施方式中，粘 附肽是胶原蛋白模拟物。代表性实例包括，具有结构 ggygggpc(gpp)5gfoger(gpp)5gpc的肽，其中o是羟基脯氨酸。 这样的肽可以总称为gfoger肽。gfoger肽之前已经显示出对于 t细胞粘附是特别良好的。参见，stephan等，nature biotechnology 33， 2015。
[0301]
具有这样的修饰的聚合物基质给本发明的支架提供了细胞粘附 特性，并且维持哺乳动物细胞系统的长期存活，以及支持细胞生长和 分化。粘附分子可以与聚合物基质偶联，使用本领域普通技术人员通 常已知的和实施例中描述的合成方法来完成。参见，例如，hirano等， advanced materials,17-25,2004；hermanson等，bioconjugatetechniques,p.152-185,1996；massia和hubbell,j.cell biol. 114:1089-1100，1991；mooney等，j.cell phys.151:497-505，1992； 和hansen等，mol.biol.cell 5:967-975，1994，将其中的公开内容按 引用并入。
[0302]
根据靶细胞类型，可以优选使用靶细胞特异性的粘附信号传导分 子。因此，在一个实施方式中，所述支架含有在t细胞的结合/隔离 (sequestration)中有用的粘附受体。
在这些实施方式中，所述支架 可以含有t细胞特异性粘附分子，例如，选自ii类mhc(对于cd4 细胞)、i类mhc(对于cd8 细胞)、lfa-3(cd2配体)、icam1 (对于lfa-1的配体)或其变体，其片段或其组合的受体。
[0303]
根据需求，所述支架可以特意配制成含有募集剂和粘附分子的子 集，使得操纵特定子集的免疫细胞，例如，特定的t细胞亚群。在这 些实施方式中，可以使用特异性地结合靶细胞中表达的细胞表面标志 物的试剂来配制/制造所述支架。例如，在t细胞的情况中，所述支 架可以适用于辅助t细胞(th细胞；其差异表达cd4 )、细胞毒性t细胞(tc细胞；其差异表达cd8 )、记忆t细胞(tm细胞；其差 异表达cd45ro)、抑制t细胞(ts，其细胞)、调节t细胞(treg； 进一步表征为foxp3 treg细胞和foxp3-treg)、自然杀伤t细胞 (nk细胞；差异表达cd1d )、粘膜相关不变体(invariant)(mait； 差异表达mr1)、gamma delta t细胞(γδt细胞；包括含有一条γ 链和一条δ链的tcr)的优先募集。这类结合细胞表面标志物的试剂 可以包括，例如，半抗原、肽、配体、抗体等。可以任选原位(in situ) 或非原位(ex situ)使用用于富集具有一种或多种细胞亚型的分离物 的其他常规技术
[0304]
所述支架还可以适用于募集疾病特异性的免疫细胞。例如，可以 募集对于特定类型的自身免疫疾病特异性的多种t细胞。因此，在一 个实施方式中，在自身免疫疾病的诊断中有用的支架可以配制成含有 对于障碍中涉及的免疫细胞特异性的募集剂。这样的募集剂可以例如 是对于调节t细胞(treg)、抑制t细胞(ts)或其组合特异性的。 在相关实施方式中，在癌症诊断中有用的支架可以配制成含有用于优 先募集癌症特异性t细胞类型(例如，细胞毒性t细胞(tc)、自然 杀伤细胞(nk)或其组合)的募集剂。
[0305]
在某些实施方式中，所述支架用于淘选疾病特异性细胞。这可以 包括例如直接促进疾病进展的细胞。在许多自身免疫疾病的情况中， 所述疾病可以通过特定细胞群的靶向杀灭来介导和促进，例如，t1d 中的胰腺的β细胞和多发性硬化中的神经元细胞。在其他自身免疫疾 病中，所述疾病可以通过特定表位的靶向攻击来促成，如，例如，在 类风湿性关节炎情况中的类风湿因子(rf)和瓜氨酸肽，以及在节段 性回肠炎的情况中，肠道菌群中存在的抗原。细胞的靶向破坏通常涉 及特定类型或子集的免疫细胞。因此，基于细胞靶标的性质和特性， 可以使用本发明的支架优先操纵对其特异性的免疫细胞。
[0306]
在上述实施方式中，给支架提供了疾病特异性免疫细胞(例如， t细胞)结合的抗原。这些自身免疫细胞可以被操纵和任选重新编程 至非自身免疫表型。将t细胞重新编程至多能性的方法是本领域已知 的。参见，nishimura等，stem cell 12,114-126(2013)；themeli 等，nature biotechnology 31，928-933(2013)。在某些情况中，特 别是在癌症特异性t细胞的情况中，可以将重新编程的细胞更新以靶 向癌症。或者，在对于自身免疫疾病特异性的t细胞的情况中，可以 将细胞消除。
[0307]
在某些实施方式中，将本发明的支架制成已经工程化来维持抗原 呈递的多孔结构。用于制造多孔支架的方法在本领域中已经有描述。 参见，例如，美国公开no.2011/0020216、2013/0202707、2011/0020216 和美国专利no.8,067,237，将其中的公开内容按引用并入本文中。
[0308]
本发明的实施方式进一步提供了含有对于各种离体和体内应用 具有所需稳定性的msr-slb支架的支架。例如，所述支架在组织培 养应用、细胞生长实验中或作为待施用于组织(收集的或工程化的) 以及受试者的移植材料是稳定的。在一个实施方式中，本发明涉
及介 孔二氧化硅微棒-脂质双层(msr-slb)支架，其保持连续的流体架 构至少0.5天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9 天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18 天、19天、20天、21天、25天、30天、35天、40天、45天、50 天或更长时间。可以使用常规技术，例如，以下实施例中说明的显微 可视化技术，来监测支架的稳定性和/或流体架构。
[0309]
ii.制备本发明支架的方法
[0310]
本发明的实施方式进一步涉及用于制备本发明的抗原呈递细胞 模拟支架(apc-ms)的方法。所述方法包括提供包括高表面积介孔 二氧化硅微棒(msr)的基底层；任选将t细胞稳态剂加载于msr 上；将连续的流体支撑的脂质双层(slb)成层于包括msr的基底 层上，由此产生msr-slb支架；如果没有进行步骤(b)，将t细 胞稳态剂加载于msr-slb支架上；任选用阻断剂阻断msr-slb支 架中的一个或多个非特异性整合位点；以及将t细胞激活分子和t细 胞共刺激分子加载于msr-slb支架上，由此制得apc-ms。在这些 实施方式中，所述方法可以包括进一步将至少一种其他试剂加载于支 架中，所述其他试剂是生长因子、细胞因子、白细胞介素、粘附信号 传导分子、整联蛋白信号传导分子，或其片段，或其组合。之前已经 在设备制造部分中描述了用于加载其他成分的方法。图24中提供了 用于制备本发明支架的代表性方法。
[0311]
在一个实施方式中，将含有1:1的t细胞激活分子和t细胞共刺 激分子(例如，抗cd3抗体和抗cd28抗体)混合物的功能性分子混 合物与msr-slb支架混合，使得功能性分子:msr-slb支架的重量 比为约1:2至约1:20，优选约1:4至约1:15，特别是约1:5至约1:10。 可以调节t细胞激活分子和t细胞共刺激分子的重量比，例如，约 5:1至约1:5，同时保持功能性分子和msr-slb支架之间相同的干重 比。
[0312]
此外，本发明的实施方式进一步涉及通过组装多个支架产生具有 允许t细胞(更特别地，不同的辅助t细胞或细胞毒性t细胞的亚 群)渗透的充足多孔性的堆叠来制备apc-ms的方法。
[0313]
iii.使用本发明支架的方法
[0314]
本发明的支架可以用于各种应用，包括，但不限于，靶效应细胞 (例如，t细胞)的操纵、特定效应细胞群(例如，cd8 t细胞的 亚群)的分离、疾病的诊断和治疗以及用于疾病的诊断和治疗的组合 物和试剂盒的生产。
[0315]
用于操纵靶细胞的方法
[0316]
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于操纵靶效应细胞或其 亚群(例如，辅助t细胞或细胞毒性t细胞)的方法。在这点上，术 语“操纵”包括，例如，靶效应细胞的激活、分裂、分化、生长、扩增、 重编程、无能、休眠、衰老、凋亡或死亡。
[0317]
在一个实施方式中，通过提供本发明的支架使得靶效应细胞接触 支架，从而在原位操纵(例如，激活)靶效应细胞，例如，t细胞。 为了促进接触，可以将支架植入受试者体内的合适部位处，例如，皮 下或静脉内植入。在其他实施方式中，通过用本发明的支架培养含有 靶效应细胞的样品非原位地操纵靶细胞。
[0318]
可以操纵多种靶效应细胞，包括，使用来自受试者的新鲜样品、 原代培养细胞、永生化细胞、细胞系、杂交瘤。操纵的细胞可以用于 各种免疫治疗应用以及用于研究中。
[0319]
靶效应细胞的操纵部位可以是在原位或非原位。因此，在一个实 施方式中，在原位(例如，在支架内)操纵细胞。在这点上，不需要 将细胞从支架物理地取出以操纵。在另一
个实施方式中，非原位地操 纵细胞(例如，通过首先从支架取出细胞并操纵取出的细胞)。在将 支架植入受试者中时，可以在植入部位或附近操纵细胞。在其他实施 方式中，首先可以将植入的支架从植入部位取出，并且按照之前所述 的在原位或非原位操纵效应细胞。
[0320]
在某些实施方式中，操纵效应细胞中使用的支架可以具有抗原呈 递细胞(apc)和/或源自这些apc的各种抗原。可以在支架结构中 提供或外部提供(例如，在培养基中)这些次级试剂(例如，apc或 源自apc的抗原)。在某些实施方式中，所述支架可以具有吸引和/ 或募集apc的各种抗原。之前的部分中已经提供了这样的吸引和/或 募集分子的代表性实例。
[0321]
在某些实施方式中，含抗原支架可以用于在体内操纵靶效应细 胞。对于这样的应用，所述支架可以植入血管内部、淋巴组织内、肿 瘤部位、疾病部位(例如，受类风湿性关节炎影响的组织周围的区域) 或皮下植入，使得靶效应细胞接触支架。或者，支架可以以最小侵入 性方式注射，例如，通过针、导管等。可以允许植入的支架在植入部 位保留约0.5天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3 周、4周、1个月、2个月、3个月、6个月、7个月、8个月、9个月、 1年、2年或更长时间。定期地，可以将支架外植，以研究、分子乃 至进一步操纵效应细胞。
[0322]
在相关实施方式中，本发明涉及在原位操纵抗原特异性效应细 胞。在这点上，本发明的支架可以含有目标抗原，使用用于吸附功能 性分子的相同策略将所述目标抗原吸附至支架上。或者，本发明的支 架可以用含有培养基中的抗原特异性效应t细胞及展示目标抗原的 apc的样品孵育。随后允许靶效应细胞接触支架并且支架中所含的功 能性分子一起作用来促进效应细胞的操纵。单纯作为代表性实施方 式，如实施例部分中所述的，用本发明的支架孵育含有t细胞的样品， 其激活、共同刺激和稳态地维持靶效应细胞。可以用支架孵育样品约 1天至30天，约1至15天或约4至13天，例如，约7-8天，导致效 应细胞群体的选择性操纵。可以通过基于某些基因产物(例如，识别 目标抗原或抗原呈递细胞的t细胞受体(tcr))的表达选择细胞来 另外操纵抗原特异性效应细胞。
[0323]
本文中所述的实施方式进一步涉及用于非原位操纵抗原特异性 效应细胞的方法，其中所述支架具有表达目标抗原的apc或抗原自 身。所述操纵步骤可以非原位或原位进行。
[0324]
在另一个实施方式中，可以相对于其他效应细胞选择性地操纵对 抗原或apc特异性的效应靶细胞(例如，相对于cd4 t细胞偏向于 cd8 t细胞)。例如，可以用本发明的支架孵育含有cd8 t细胞 (连同cd4 t细胞一起)的样品，本发明的支架机械或化学制造以 允许cd8 t细胞渗入和/或隔离。可以使用本领域已知技术，使渗入 和/或隔离的cd8 t细胞进一步扩增、激活、增殖或生长。之前已经 描述了代表性方法。
[0325]
在另一个实施方式中，抗原或apc特异性的效应靶细胞可能是 不合需要的(例如，调节/抑制t细胞)，并且在接触本发明的支架 后它们被诱导经历凋亡、无能或死亡。例如，可以用本发明的支架孵 育含有调节t细胞(连同其他t细胞一起)的样品，所述支架机械或 化学制造以允许调节/抑制t细胞渗入和/或隔离。可以使用本领域已 知技术消除渗入和/或隔离的t细胞。
[0326]
在这点上，可以用本领域已知的技术来进一步测定本发明支架中 已经渗入和/或隔离的细胞的性质。因此，在一个实施方式中，用于鉴 定或选择激活t细胞的基因产物可以
是细胞表面标志物或细胞因子， 或其组合。用于鉴定激活的t细胞的细胞表面标志物包括，但不限于， cd69、cd4、cd8、cd25、hla-dr、cd28和cd134。cd69是在 b和t淋巴细胞、nk细胞和粒细胞上发现的早期激活标志物。cd25 是il-2受体并且是激活的t细胞和b细胞的标志物。cd4是tcr共 受体并且是胸腺淋巴细胞、th1-和th2-型t细胞、单核细胞和巨噬 细胞的标志物。cd8也是tcr共受体并且是细胞毒性t细胞的标志 物。cd134只在激活的cd4 t细胞中表达。
[0327]
用于选择激活的t细胞的细胞表面标志物包括，但不限于，cd36、 cd40和cd44。cd28作为与t细胞受体途径无关的刺激性t细胞激 活途径，并且在cd4 和cd8 细胞上表达。cd36是膜糖蛋白并且是 用于血小板、单核细胞和内皮细胞的标志物。cd40是b细胞、巨噬 细胞和树突细胞的标志物。cd44是巨噬细胞和其他吞噬细胞的标志 物。可以通过使用辅助t细胞或细胞毒性t细胞(例如，cd4 vs.cd8) 的细胞表面基因产物的表达的阳性选择、阴性选择或其组合来分离t 细胞子集。用于鉴定本发明的激活的t细胞的细胞因子包括，但不限 于由th1型t细胞(细胞介导的应答)和th2型t细胞(抗体应答) 产生的细胞因子。用于鉴定激活的th1型t细胞的细胞因子包括， 但不限于，il-2、γ干扰素(γifn)和组织坏死因子α(tnfα)。用 于鉴定激活的th2型t细胞的细胞因子包括，但不限于，il-4、il-5、 il-10和il-13。也可以通过辅助t细胞或细胞毒性t细胞的细胞因子 产物(例如，γifn vs.il4)的表达的阳性选择、阴性选择或其组合来 分离t细胞的子集。
[0328]
可以通过鉴定表达cd69、cd4、cd25、il-2、ifnγ、tnfα，或 其组合的细胞来分离对于目标抗原特异性的激活的th1型t细胞。 还可以通过鉴定与ifnγ或tnfα一起表达cd69和cd4的细胞来分 离对目标抗原特异性的激活的th1型t细胞。可以通过鉴定表达 cd69、cd4、il-4、il-5、il-10、il-13或其组合的细胞来分离对目 标抗原特异性的激活的th2型t细胞。可以通过鉴定表达cd69、cd4、cd25、il-2、ifnγ、tnfα或其组合的细胞和表达cd69、cd4、 il-4、il-5、il-10、il-13或其组合的细胞来分离对目标抗原特异性 的激活的th1型t细胞和th2型t细胞的组合。
[0329]
可以通过本领域技术人员已知的利用抗体的免疫选择技术来鉴 定用于本发明的激活的t细胞的阳性或阴性选择的基因产物，所述技 术包括但不限于荧光激活细胞分选(facs)、磁性细胞分选、淘选 和色谱。可以在一个或多个步骤中进行激活的t细胞上的两种或更多 种标志物的鉴定。使用facs在一个步骤中进行两种或更多种标志物 的免疫选择时，用不同的荧光团标记两种或更多种不同的抗体。或者， 如上所述，可以使用微珠来分选细胞。
[0330]
对于细胞表面表达的基因产物，抗体可以直接结合基因产物并且 可以用于细胞选择。对于以低浓度表达的细胞表面基因产物，可以将 磁荧光(magnetofluorescent)脂质体用于细胞选择。在低表达水平下， 常规荧光标记的抗体可能不够灵敏来检测细胞表面表达的基因产物 的存在。可以将含有荧光团的脂质体与具有目标特异性的抗体缀合， 由此允许检测细胞表面标志物。
[0331]
对于细胞内基因产物，如细胞因子，抗体可以在渗透细胞后使用。 或者，为了避免细胞被渗透杀灭，如果细胞内基因产物最终从细胞分 泌出来，可以在其通过细胞膜分泌时使用细胞表面上的“捕获”抗体 进行检测。捕获抗体可以是对两种不同的抗原特异性的双重抗体：(i) 分泌的目标基因产物和(ii)细胞表面蛋白。通常，细胞表面蛋白可 以是t细胞
(特别地，或淋巴细胞)上存在的任何表面标志物(例如， cd45)。捕获抗体可以首先结合细胞表面蛋白并且随后结合目标细 胞内基因产物(在其通过膜分泌时)，由此将基因产物保留在细胞表 面上。随后可以将对捕获的基因产物特异性的标记的抗体用于结合捕 获的基因产物，这允许选择激活的t细胞。还发现某些形式的细胞因 子在细胞表面上以低浓度表达。例如，γifn以低浓度在细胞表面上呈 现，具有与胞内γifn表达相似的动力学(assenmacher等，eur j. immunol,1996,26:263-267)。对于细胞表面上表达的细胞因子的形式， 常规荧光标记的抗体或含有荧光团的脂质体可以用于检测目标细胞 因子。本领域普通技术人员将认识到用于检测和选择对激活的t细胞 特异性的胞外和胞内基因产物的其他技术。
[0332]
通过本发明的方法分离的t细胞可以从全血富集至少40-90％。t 细胞还可以从全血富集至少95％。t细胞还可以从全血富集至少98％。 t细胞还可以从全血富集至少99.5％。相似的方法可以用于b细胞的 原位或非原位操纵中。在某些实施方式中，按照本文中所述的，将冷 冻保存的细胞解冻并洗涤，并在激活前使其在室温下静置一小时。
[0333]
根据应用，可以调节支架与细胞样品的干重比。例如，支架:细胞 干重比范围可以从1:500至500:1，并且其中的任何整数值可以用于 操纵效应细胞。如本领域普通技术人员可以容易地获知的，支架与细 胞的比例可能取决于相对于靶细胞的支架大小。
[0334]
t细胞群体的扩增
[0335]
在相关实施方式中，本发明进一步涉及用于从免疫细胞群体扩增 t细胞的方法，例如，扩增含有b细胞、树突细胞、巨噬细胞、浆细 胞等的样品中所含的t细胞。在另一个实施方式中，本发明还涉及用 于扩增特定的t细胞群体的方法，例如，扩增来自含有辅助t细胞、 自然杀伤t细胞、调节/抑制t细胞等的样品的细胞毒性t细胞。特 定的t细胞亚群可以随后用于各种免疫治疗应用中。不希望受到任何 特定理论的束缚，据认为本发明的apc-ms对于t细胞的扩增特别 有效，因为介孔二氧化硅棒的相对大尺寸和高纵横比允许与每个棒相 互作用的t细胞形成大的簇，这通过允许t细胞/t细胞相互作用和/ 或旁分泌信号传导而促进了t细胞的有效扩增。
[0336]
在一个实施方式中，通过提供本发明的支架，使得靶效应细胞接 触支架，在原位扩增(例如，生长或分化)靶效应细胞，例如，t细 胞。为了促进接触，可以将支架植入受试者体内的合适部位，例如， 皮下或静脉内植入。在其他实施方式中，可以通过用本发明的支架培 养含有靶效应细胞的样品，非原位地扩增靶细胞。在一个实施方式中， 可以通过首先从样品分离t细胞并随后通过接触本发明的支架来刺 激t细胞使得效应t细胞被激活、共刺激和稳态地维持，从而进行非 原位的t细胞扩增。
[0337]
在本发明的一个实施方式中，t细胞是获自受试者的原代t细胞。 术语“受试者”意欲包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如， 哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因 物种。t细胞可以获得多种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴 结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、脾组织和肿瘤。 在本发明的某些实施方式中，可以使用本领域中可利用的任何数量的 原代t细胞和/或t细胞系。
[0338]
对全血计数的研究揭示了全血中的t细胞数量非常低。例如，根 据stem cell technologies，vancouver，bc，canada(document #23629，version 2.1.0)公开的产品目录，全血中的白细胞群体为 约0.1-0.2％(由于红细胞的优势)，其中t细胞构成全部白细胞
群体 的约7-24％。在t细胞中，cd4 t细胞构成全部白细胞群体的约 4-20％(转换成低于全血中全部细胞群体的0.04％)和cd8 t细胞构 成全部白细胞群体的约2-11％(转换成低于全血中全部细胞群的 0.022％)。因此，在本发明的某些实施方式中，本发明的方法可以结 合其他本领域已知的用于靶细胞富集的技术。可以在将样品接触本发 明的支架前进行富集步骤。在另一个实施方式中，可以在样品接触本 发明的支架后进行富集步骤。
[0339]
在一个实施方式中，可以使用ficoll分离富集效应细胞群体。 在一个实施方式中，通过单采术(apheresis)或白细胞去除法 (leukapheresis)获得来自个体循环血液的细胞。单采术产物通常含 有淋巴细胞(包括t细胞)、单核细胞、粒细胞、b细胞、其他有核 白细胞、红细胞和血小板。可以将通过单采术收集的细胞洗涤以除去 血浆部分并且将细胞置于合适的缓冲液或介质中用于随后的处理步 骤。随后用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞。或者，洗涤液缺乏钙 并且可以缺乏镁或可以缺乏许多二价阳离子(如果不是全部的话)。 还可以根据制造商的说明，使用半自动化的“流通”离心。洗涤后，可 以将细胞重悬浮于各种生物相容性缓冲液中，如，例如，无ca、无 mg-pbs。或者，可以除去单采法样品的不合需要的组分并且将细胞 直接悬浮于培养基中。
[0340]
在另一个实施方式中，可以通过裂解红细胞并且耗尽单核细胞， 例如，通过percoll
tm
梯度离心，来富集外周血或全血t细胞。可 以通过阳性或阴性选择技术来进一步分离特定的t细胞亚群，如 cd28 、cd4 、cd8 、cd45ra 和cd45ro t细胞。
[0341]
根据本发明，可以任选使用各种分选技术。例如，可以使用针对 细胞独特的表面标志物的抗体的组合来进一步分选扩增的或操纵的t 细胞群体。优选的方法是通过使用针对选定的细胞上存在的细胞表面 标志物的单克隆抗体的混合物的磁免疫粘附或流式细胞术的细胞分 选和/或选择。例如，为了通过阴性选择富集cd4 细胞，单克隆抗体 混合物通常包括cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的 抗体。在某些实施方式中，可能希望富集或阴性选择调节t细胞，其 通常表达cd4 、cd25 、cd62lhi、gitr 和foxp3 。
[0342]
对于所需细胞群体的分离，细胞的浓度和支架表面可以改变。在 某些实施方式中，可能希望显著降低其中将支架和细胞混合在一起的 体积(即，提高细胞的浓度)以确保细胞和支架的最大接触。例如， 在一个实施方式中，使用20亿细胞/ml的浓度。在一个实施方式中， 使用10亿细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，使用高于100百 万细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、 40、45或50百万细胞/ml的细胞浓度。在再另一个实施方式中，使 用75、80、85、90、95或100百万细胞/ml的细胞浓度。在进一步的 实施方式中，可以使用125或150百万细胞/ml的浓度。使用高浓度 可以导致提高的细胞产量、细胞激活和细胞扩增。此外，使用高细胞 浓度允许更有效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞，如cd28阴性 t细胞，或从其中存在许多肿瘤细胞的样品捕获(即，白血病血液、 肿瘤组织等)。这样的细胞群体可以具有治疗价值并且是希望获得的。 例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱cd28表达 的cd8 t细胞。
[0343]
在相关实施方式中，可能希望使用较低浓度的细胞。这可以通过 降低支架:细胞比率来实现，使得支架和细胞之间的相互作用最小化。 这种方法选择表达高的待结合支架的所需抗原量的细胞。例如，cd4 t细胞表达较高水平的cd28并且在稀浓度下比cd8 t细胞更有效 地捕获。在一个实施方式中，使用的细胞浓度为5
×
106/ml。在其他实 施方式中，使用的浓度为约1
×
105/ml至1
×
109/ml，以及其中的任何整 数值，例如，1
×
105/ml至1
×
108/ml，1
×
106/ml至1
×
107/ml，1
×
107/ml 至1
×
109/ml。
[0344]
在一个实施方式中，本发明可以包括本领域已知的用于样品制备 的程序。例如，可以在洗涤步骤后将t细胞冷冻并在使用前解冻。冷 冻和随后的解冻通过除去细胞群体中的粒细胞和一定程度的单核细 胞提供了更均一的产品。除去血浆和血小板的洗涤步骤后，可以将细 胞悬浮于冷冻液中。尽管许多冷冻液和参数是本领域已知的并且在这 点上将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％dmso和8％人血清 白蛋白的pbs，或其他合适的含有例如hespan和plasmalyte a 的细胞冷冻介质，随后以1℃/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃，并且 储存在液氮存储罐的蒸汽相中。可以使用其他受控冷冻方法，以及在
ꢀ‑
20℃或液氮中立即冷冻的未受控冷冻。
[0345]
在本发明的情况中还考虑了在可能需要本文中所述的扩增细胞 时的前一段时间，从受试者收集血样或白细胞去除法产物。因此，可 以在需要的任何时间点收集待扩增的细胞源，并且将所需的细胞，如 t细胞，分离并冷冻用于之后针对各种将得益于t细胞治疗的疾病或 病症的t细胞治疗中，如本文中所述的那些。在一个实施方式中，血 样或白细胞去除法取自整体健康的受试者。在某些实施方式中，血样 或白细胞去除法取自处于产生疾病的风险中但尚未发展成疾病的整 体健康的受试者，并且将目标细胞分离并冷冻用于之后的用途。在某 些实施方式中，可以将t细胞扩增、冷冻并在之后的时间使用。在某 些实施方式中，就在如本文中所述的特定疾病诊断后不久但在任何治 疗之前，从患者收集样品。在进一步的实施方式中，在各种相关治疗 方法前，从受试者的血样或白细胞去除法分离细胞，所述治疗包括但 不限于使用药剂的治疗，如抗病毒剂、化疗、放疗、免疫抑制剂如环 磷酰胺、硫唑嘌呤、氨甲喋呤、霉酚酸酯和fk506、抗体，或其他免 疫消融剂，如campath、抗cd3抗体、fr901228和辐射。这些药 物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和fk506)或抑制对生 长因子诱导的信号传导重要的p70s6激酶(雷帕霉素)(liu等，cell 66:807-815，1991；henderson等，immun.73:316-321，1991；bierer 等，curr.opin.immun.5:763-773，1993；isoniemi(上文))。在进 一步的实施方式中，针对患者分离细胞，并冷冻用于之后结合(例如， 在其之前、同时或之后)骨髓移植、使用化疗剂(如氟达拉滨)的t 细胞消融治疗、外部束放疗(xrt)、环磷酰胺或抗体(如okt3或 campath)使用。在另一个实施方式中，之前分离细胞并可以冷冻 用于之后b细胞消融治疗(如与cd20反应的药剂，例如，rituxan) 后的治疗。
[0346]
在本发明的再一个实施方式中，治疗后直接从患者获得t细胞。 在这点上，已经观察到在某些癌症治疗后，特别是使用破坏免疫系统 的药物的治疗，就在治疗后不久在患者正常从治疗恢复时的时间段期 间，获得的t细胞质量对于其离体扩增的能力可能是最佳的或提高 的。同样，使用本文中所述的方法离体操纵后，这些细胞对于增强的 移植和体内扩增是处于优选的状态。因此，在本发明的情况内考虑了 在这个恢复期期间收集血液细胞，包括t细胞、树突细胞或造血谱系 的其他细胞。此外，在某些实施方式中，动员(例如，使用gm-csf 的动员)和调理方案可以用于在受试者中形成其中有利于特定细胞类 型的再分群、再循环、再生和/或扩增的条件，尤其是在治疗后的限定 时间窗口期间。说明性的细胞类型包括t细胞、b细胞、树突细胞和 免疫系统的其他细胞。
[0347]
根据本发明可以使用含有任何比率的t细胞激活分子:t细胞共 刺激分子的支架。在一个实施方式中，其中t细胞激活分子和t细胞 共刺激分子都是抗体，可以使用1:1比率
的每种抗体。在一个实施方 式中，结合支架的cd3:cd28抗体的比率范围为100:1至1:100以及 其中的所有整数值。在本发明的一个方面中，结合支架的抗cd28抗 体比抗cd3抗体多，即，cd3:cd28的比率低于一。在本发明的某些 实施方式中，结合支架的抗cd28抗体与抗cd3抗体的比率高于2:1。 在一个特别的实施方式中，可以使用1:100cd3:cd28比率的结合支 架的抗体。在另一个实施方式中，可以使用1:75cd3:cd28比率的结 合支架的抗体。在再一个实施方式中，使用1:50cd3:cd28比率的结 合支架的抗体。在另一个实施方式中，使用1:30cd3:cd28比率的结 合支架的抗体。在一个优选实施方式中，使用1:10cd3:cd28比率的 结合支架的抗体。在另一个实施方式中，使用1:3cd3:cd28比率的 结合支架的抗体。在再另一个实施方式中，使用3:1cd3:cd28比率 的结合支架的抗体。
[0348]
本发明的一个方面源于令人惊讶的发现：其中与含有基底层(其 含有高表面积介孔二氧化硅微棒(msr))和连续的流体支撑的脂质 双层(slb)但不含t细胞激活分子和t细胞共刺激分子的对照支架 相比，接触所述支架约1周后，所述方法给予t细胞群体扩增的提高。 在一个实施方式中，根据本发明的方法，与含有基底层(其含有高表 面积介孔二氧化硅微棒(msr))和连续的流体支撑的脂质双层(slb) 但不含t细胞激活分子和t细胞共刺激分子的对照支架相比，接触所 述支架约1周后，观察到t细胞群体的扩增提高约10倍至1000倍， 优选约50倍至500倍，或更高。
[0349]
本发明的另一个方面源于令人惊讶的发现：其中与含有t细胞激 活分子和t细胞共刺激分子的超顺磁性球形聚合物颗粒 (dynabead)相比，接触所述支架约1周后，所述方法给予t细 胞群体扩增的提高。在一个实施方式中，根据本发明的方法，与含有 t细胞激活分子和t细胞共刺激分子的超顺磁性球形聚合物颗粒 (dynabead)相比，接触所述支架约1周后，观察到t细胞群的 扩增提高约2倍至100倍，优选约5倍至20倍，或更高。
[0350]
本发明的再一个方面源于令人惊讶的发现：根据上述方法操纵t 细胞提高了t细胞的代谢活性。特别地，与含有基底层(其含有高表 面积介孔二氧化硅微棒(msr))和连续的流体支撑的脂质双层(slb) 但不含t细胞激活分子和t细胞共刺激分子的对照支架相比，接触所 述支架约1周后，观察到提高的t细胞的代谢活性。在一个实施方式 中，根据本发明的方法，与含有基底层(其含有高表面积介孔二氧化 硅微棒(msr))和连续的流体支撑的脂质双层(slb)但不含t细 胞激活分子和t细胞共刺激分子的对照支架相比，接触所述支架约1 周后，观察到t细胞群的代谢活性提高约2倍至100倍，优选约5倍 至20倍，或更大。
[0351]
本发明的另一个方面源于令人惊讶的发现：与含有t细胞激活分 子和t细胞共刺激分子的超顺磁性球形聚合物颗粒(dynabead) 相比，接触所述支架约1周后，所述方法给予更好的t细胞群体的代 谢活性。在一个实施方式中，根据本发明的方法，与含有t细胞激活 分子和t细胞共刺激分子的超顺磁性球形聚合物颗粒(dynabead) 相比，接触所述支架约1周后，观察到t细胞群的扩增提高约1倍(例 如，提高100％)至20倍，优选2倍至10倍，或更多的提高。
[0352]
另外，根据本发明的方法，发现接触所述支架后，扩增的t细胞 保持代谢活性至少约7天。通过常规技术，例如，分析细胞因子产生 的水平或监测细胞倍增，来测量t细胞代谢活性。此外，根据本发明 的方法，扩增的t细胞比对照支架形成更大且更稳定的聚集物(例如， 持续更长时间)。例如，在一个实验中，接触所述支架后，扩增的t 细胞形成稳定的聚集物至少约7天，而用只含有msr基底层和slb 层的对照支架孵育的样品中的聚集物明显不
同。
[0353]
本发明的更多实施方式涉及用于获得cd8 细胞的多克隆群体的 方法，包括将本发明的支架接触受试者的生物样品，由此激活、共刺 激、稳态地维持和任选扩增样品内存在的t细胞群体；将样品中的t 细胞接触用于检测cd8 细胞的试剂；以及从样品分离出检测到的cd8 t细胞亚群。
[0354]
在相关实施方式中，本发明涉及用于获得cd4 细胞的多克隆群 体的方法，包括将本发明的支架接触受试者的生物样品，由此激活、 共刺激、稳态地维持和任选扩增样品内存在的t细胞群体；将样品中 的t细胞接触用于检测cd4 细胞的试剂；以及从样品分离出检测到 的cd4 t细胞亚群。
[0355]
在相关实施方式中，本发明涉及用于获得cd4 /foxp3 或 cd4 /foxp3-细胞的多克隆群体的方法。所述方法包括将本发明的支 架接触受试者的生物样品，由此激活、共刺激、稳态地维持和任选扩 增样品内存在的t细胞群；将样品中的t细胞接触用于检测cd4 细 胞的试剂；进一步将t细胞接触用于检测foxp3 细胞的试剂；以及 从样品分离出检测的cd4 /foxp3 或cd4 /foxp3-t细胞亚群。在 这些实施方式中，用于cd4 和/或foxp3 t细胞的检测和/或分离的 试剂优选是特异性地结合cd4 和foxp3标志物的抗体或其抗原结 合片段。在这点上，在foxp3被识别为调节t细胞(其调低免疫应 答)的发育和功能中的调节途径的主要调节子的范围中，可能期望分 离foxp3 细胞用于某些应用，以及foxp3-细胞用于其他应用。例 如，在癌症治疗应用中，可能期望消除或降低t细胞药物组合物中的 调节t细胞活性。因此，所述方法可以适用于筛选foxp3-细胞。或 者，在自身免疫疾病治疗的情况中，可能期望提高t细胞药物组合物 中的调节t细胞活性(因为减弱的调节t细胞活性可能造成身体的自 身免疫状况)。因此，在这样的情况中，可以改变配制方法以阳性选 择并包括foxp3 细胞。
[0356]
在再另一个实施方式中，本发明涉及用于获得效应记忆和/或效应 t细胞的多克隆群体的方法。所述方法包括将本发明的支架接触受试 者的生物样品，由此激活、共刺激、稳态地维持和任选扩增样品内存 在的t细胞群体；将样品中的t细胞接触用于检测cd44 细胞的试 剂；进一步将t细胞接触用于检测cd62l的试剂；以及从样品分离 检测的cd4 //cd62l 或cd4 /cd62l-t细胞亚群。在这些实施方式 中，所述效应记忆和/或效应t细胞优选是cd4 //cd62l-。
[0357]
在再另一个实施方式中，本发明涉及用于获得激活的cd8 t细 胞的多克隆群体的方法。所述方法包括将本发明的支架接触受试者的 生物样品，由此激活、共刺激、稳态地维持和任选扩增样品内存在的 t细胞群体；将样品中的t细胞接触用于检测cd8 细胞的试剂；进 一步将t细胞接触用于检测cd69 的试剂；以及从样品中分离出检测 到的cd8 //cd69 或cd8 //cd69-t细胞亚群。在这些实施方式中， 所述激活的t细胞优选是cd8 /cd69 。
[0358]
在再另一个实施方式中，本发明涉及用于获得细胞毒素分泌t细 胞的多克隆群体的方法。所述方法包括将本发明的支架接触受试者的 生物样品，由此激活、共刺激、稳态地维持和任选扩增样品内存在的 t细胞群体；将样品中的t细胞接触用于检测cd8 细胞的试剂；进 一步将t细胞接触用于检测颗粒酶b的试剂；以及从样品中分离出检 测到的cd8 //颗粒酶b 或cd8 //颗粒酶b-t细胞亚群。在这些实 施方式中，所述细胞毒素分泌t细胞优选
是cd8 /颗粒酶b 。
[0359]
在再另一个实施方式中，本发明涉及用于获得激活细胞因子分泌 t细胞的多克隆群体的方法。所述方法包括将本发明的支架接触受试 者的生物样品，由此激活、共刺激、稳态地维持和任选扩增样品内存 在的t细胞群；将样品中的t细胞接触用于检测ifnγ 细胞的试剂； 以及从样品中分离出检测到的ifnγ t细胞亚群。在这些实施方式中， 所述t细胞优选是ifnγ分泌细胞。
[0360]
在再另一个实施方式中，本发明涉及用于获得记忆t细胞的多克 隆群体的方法。所述方法包括将本发明的支架接触受试者的生物样 品，由此激活、共刺激、稳态地维持和任选扩增样品内存在的t细胞 群体；将样品中的t细胞接触用于检测cd62l ccr7 t细胞的试剂； 以及从样品分离出检测到的cd62l ccr7 t细胞亚群。在这些实施 方式中，所述t细胞优选是cd62l ccr7 cd4 中心记忆t细胞。 参见，okada等，int immunol.,20(9):1189-99，2008。在另一个实施 方式，本发明涉及用于获得记忆t细胞的多克隆群体的方法，包括将 本发明的支架接触受试者的生物样品，由此激活、共刺激、稳态地维 持和任选扩增样品内存在的t细胞群体；将样品中的t细胞接触用于 检测cd62l ccr7 t细胞的试剂；以及从样品中分离出检测到的 cd62l-ccr7-t细胞亚群。在这些实施方式中，所述cd62l-ccr7-t 细胞是效应记忆t细胞。参见，sallusto等，nature 401:708-712，1999。
[0361]
在再另一个实施方式中，本发明涉及用于从样品检测和/或除去耗 尽的t细胞多克隆群体的方法。所述方法包括将本发明的支架接触受 试者的生物样品，由此激活、共刺激、稳态地维持和任选扩增样品中 存在的t细胞群体；将样品中的t细胞接触用于检测cd8 t细胞的 试剂；进一步将t细胞接触用于检测pd-1 t细胞的试剂；以及从样 品中分离出检测到的cd8 /pd-1 t细胞亚群。可以任选从样品中消 除cd8 /pd-1 t细胞，其表示是耗尽的细胞。
[0362]
在另一个用于从样品检测和/或除去t细胞的实施方式中，本发 明提供了一种方法，包括将本发明的支架接触受试者的生物样品，由 此激活、共刺激、稳态地维持和任选扩增样品内存在的t细胞群体； 将样品中的t细胞接触用于检测t细胞上的共抑制受体的试剂；以及 从样品分离出表达共抑制受体的t细胞亚群。所述共抑制受体的表达 通常表示耗尽的细胞，其可以任选从样品中消除。在这些实施方式中， 所述共抑制受体是选自ctla-4、tim3、lag3、2b4、btla、cd160 和klrg1的受体。参见，legat等，front immunol.，2013dec 19； 4:455。
[0363]
在上述实施方式中，用于检测和/或分离细胞的试剂优选是抗体或 其抗原结合片段，例如，特异性地结合上述标志物的抗体，例如，cd8、 cd4、foxp3、cd62l、pd-1、颗粒酶b等。优选使用facs分析进 行这些细胞标志物的检测。
[0364]
本发明进一步涉及使用一种或多种上述方法分离多克隆t细胞 群体并且进一步检测细胞因子的产生，所述细胞因子选自干扰素γ (ifnγ)、组织坏死因子α(tnfα)、il-2、il-1、il-4、il-5、il-10 和il-13，或其组合。所述细胞因子可以允许验证分离方法。例如， 其中操纵的t细胞是t辅助1(th1)细胞，所述方法可以包括检测 选自il-2、干扰素γ(ifnγ)和组织坏死因子α(tnfα)，或其组合 的细胞因子的产生。同样，其中操纵的t细胞是t辅助2(th2)细 胞，并且所述方法包括检测选自il-4、il-5、il-10和il-13，或其组 合的细胞因子的产生。此外，其中操纵的t细胞是细胞毒性t(tc) 细胞，所述方法可以进一步包括检
测选自干扰素γ(ifnγ)和淋巴毒 素α(ltα/tnfβ)或其组合的细胞因子的产生，任选与选自颗粒酶或 穿孔素或其组合的分泌细胞毒素的检测一起。
[0365]
使用某些方法，在约12至约14天的时间段后，通过将t细胞与 刺激物分离，可以有利地在初始激活和刺激后维持t细胞群体的长期 刺激。例如，通过检查t细胞的大小或测量t细胞的体积，如使用 coulter counter，周期性地(例如，每天)监测t细胞增殖速率。在 这点上，静止t细胞具有约6.8微米的平均直径，并且在初始激活和 刺激时，在刺激配体的存在下，t细胞平均直径将在第4天增加至超 过12微米，并且在约第6天开始降低。当平均t细胞直径降至大约 8微米时，可以将t细胞再激活和再刺激，以诱导更多的t细胞增殖。 或者，可以通过分析细胞表面分子的存在来监测t细胞增殖速率和用 于t细胞再刺激的时间，所述细胞表面分子如选自cd69、cd4、cd8、 cd25、cd62l、foxp3、hla-dr、cd28和cd134，或其组合的细 胞表面标志物。另外，可以通过分析非t细胞表面分子的存在来完成 所述方法，所述非t细胞表面分子如cd36、cd40和cd44，或其组 合。在某些情况中，所述方法可以通过分析在激活的t细胞上诱导的 非t细胞表面分子的存在来补充，所述非t细胞表面分子如cd154、 cd54、cd25、cd137、cd134。
[0366]
疾病的诊断和治疗
[0367]
本文中所述的实施方式进一步涉及用于治疗受试者的疾病或障 碍的方法。在一个实施方式中，所述疾病是癌症。在另一个实施方式 中，所述疾病是自身免疫疾病。在第三实施方式中，所述疾病是由病 原体引起的疾病。
[0368]
在这些实施方式中，可以通过将包括t细胞群体的受试者样品接 触本发明的抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)，由此激活、共刺激 和稳态地维持t细胞群；任选扩增t细胞群；以及将激活的、共刺激 的、维持的和任选扩增的t细胞施用于受试者，由此治疗受试者的疾 病而治疗患有疾病的受试者。在一个实施方式中，将t细胞群体接触 支架一段时间，例如，0.5天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、 7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、 17天、18天、19天、20天、21天、25天、30天、35天、38天、45 天、50天、60天，或更长时间，并且使用一种或多种上述技术操纵 其中所含的细胞。操纵的实例包括例如激活、分裂、分化、生长、扩 增、再编程、无能、静止、衰老、凋亡或死亡等。不需要从待操纵的 支架物理地取出细胞。因此，在一个实施方式中，将支架在原位接触 受试者的样品(例如，通过将支架植入受试者中)。在其他实施方式 中，非原位地操纵细胞(例如，孵育支架和受试者抽取的血样)。
[0369]
在本发明的治疗实施方式中，施用于哺乳动物的t细胞为约4至 约35天大，由此促进了哺乳动物中疾病的消退。在一些实施方式中， 施用的t细胞小于约14天大，例如，约7至约21天大。本发明的方 法提供了多个优势。例如，据信约4至约14天大的t细胞与约60天 大或更大的t细胞相比，提供了提高的体内增殖、存活和活性。产生 用于过继性细胞治疗(act)的t细胞需要的时间段可以从平均的约 44天缩短至约4至约15天的范围(或短于约35天，例如，约7至约 15天)。因此，更多的患者可以在疾病负荷进展成其中施用act不 再安全或可能的阶段前进行治疗。此外，因为本发明方法的优选实施 方式不需要在施用前体外测试特定的抗原反应性，因此本发明的方法 减少了与患者治疗相关的时间、费用和劳动。另外，本发明的方法可 以有利地施用从大量培养物汇合的t细胞，替代源自微量培养物的那 些。据信更简单且更快速的产生临床上有效的t细胞的方法的研发有 助于更广泛地使用过
继性细胞治疗。本发明的方法还有利地利用通过 体外测试特定抗原反应性而错误地预测在体内非反应性的t细胞培 养物。因为从单个肿瘤样本产生的t细胞培养物具有多样的特定反应 性，缺乏体外抗原反应性测试有利地避免了必需选择仅少数的t细胞 来扩增，并且因此提供了更多样化的待施用于患者的肿瘤反应性库。 约4至约30天大的t细胞还含有更高的细胞多样性和比t细胞更高 的活性/健康细胞频率。此外，本发明方法的一个或多个方面(例如， 但不限于，培养和/或扩增)可以是自动化的。
[0370]
所述方法的一个实施方式包括培养自体t细胞。从患者获得肿瘤 样品，并且获得单细胞悬浮液。单细胞悬浮液可以以任何合适的方式 获得，例如，通过机械(使用例如gentlemacs
tm
dissociator, miltenyi biotec,auburn,calif.分解肿瘤)或通过酶(例如，胶原蛋白 酶或dnase)。在支架或本发明的支架中培养肿瘤酶消化物的单细胞 悬浮液。将细胞培养直至汇合(例如，约2
×
106淋巴细胞)，例如， 约2至约21天，优选约4至约14天。例如，细胞可以培养5天、5.5 天或5.8天、6.0天、6.5天、7.0天至21天、21.5天或21.8天，优选 10天、10.5天或10.8天至14天、14.5天或14.8天。
[0371]
所述方法的一个实施方式包括扩增培养的t细胞。将培养的t细 胞汇合并快速扩增。快速扩增提供了在约7至约14天的时间段中， 优选约14天，抗原特异性t细胞的数量提高至少约10倍(例如，10、 20、40、50、60、70、80、90或100倍或更高)。更优选，快速扩增 提供了在约7至约14天的时间段中，优选约14天，提高至少约200 倍(例如，200、300、400、500、600、700、800、900倍或更高)。 最优选，快速扩增提供了在约10至约14天的时间段中，优选约14 天，提高至少约400倍或更高。任选，细胞可以在支架中经历最初的 扩增，那时将其接受快速扩增。在这两步扩增方案下，可以实现在约 7至14天的时间段中提高约1000倍。
[0372]
可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种来完成扩增。例 如，在饲养淋巴细胞和白细胞介素-2(il-2)或白细胞介素-15(il-15) 的存在下，优选il-2，可以使用非特异性t细胞受体刺激快速扩增t 细胞。非特异性t细胞受体刺激可以包括约30ng/ml的okt3，小鼠 单克隆抗cd3抗体(可获自raritan,n.j.)。或者， 可以通过在t细胞生长因子的存在下，如300iu/ml il-2或il15，优 选il-2，在体外使用一种或多种癌症抗原(包括其抗原部分，如表位， 或细胞)刺激外周血单核细胞来快速扩增t细胞，所述抗原任选可以 从载体表达，如人白细胞抗原a2(hla-a2)结合肽，例如，0.3μmmart-1:26-35(27l)或gp100:209-217(210m)。体外诱导的t细 胞通过用脉冲至hla-a2表达抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺 激来快速扩增。或者，例如，可以用照射过的自体同源淋巴细胞或用 照射过的hla-a2 同种异体淋巴细胞和il-2再刺激t细胞。
[0373]
所述方法的一个实施方式包括将扩增的t细胞施用于受试者，其 中施用于哺乳动物的t细胞为约4至约35天大。例如，施用的细胞 可以为6、7或8至14、15或16天大。在一些实施方式中，施用于 哺乳动物的t细胞为约4至约29或约7至约15天大，或约10天大。 在这点上，根据本发明的实施方式，施用于哺乳动物的t细胞是“年 轻的”t细胞，即，最少培养的t细胞。
[0374]
根据本发明的实施方式，施用于哺乳动物的年轻的t细胞培养物 有利地具有与体内持久性、增殖和抗肿瘤活性相关的特征。例如，年 轻的t细胞培养物比约44天大的t细胞具有更高的cd27和/或cd28 表达。不受特定理论的束缚，认为cd27和cd28与t细胞的增殖、 体内持久性和较少的分化状态相关(认为提高的t细胞分化负面地影 响t细胞在体内发挥
作用的能力)。认为表达较高水平的cd27的t 细胞比低cd27细胞具有更好的抗肿瘤活性。此外，年轻的t细胞培 养物比约44天大的t细胞具有更高的cd4 细胞频率。
[0375]
此外，年轻的t细胞培养物具有比约44天大的t细胞长的平均 端粒长度。不束缚于特定理论，认为培养物中的t细胞每周失去0.8kb 的估算端粒长度，并且年轻的t细胞培养物端粒比约44天大的t细 胞长约1.4kb。不束缚于特定理论，认为较长的端粒长度与患者中积 极的客观临床反应和细胞在体内的持久性相关。
[0376]
可以通过本领域已知的任何合适的途径来施用t细胞。优选，作 为动脉内或静脉内输注来施用t细胞，所述输注优选持续约30至约 60分钟。施用途径的其它实例包括皮下、腹膜内、鞘内和淋巴内。
[0377]
另外，本发明的实施方式提供了施用包括扩增细胞的治疗组合物 的各种方式。在一个实施方式中，首先纯化扩增的细胞并随后施用于 受试者。或者，可以在施用于受试者之前，将扩增的细胞与本发明的 支架混合。在这种替换方法下，支架(apc-ms)可以持续在体内刺 激细胞并且还用于在体内环境中选择性地操纵靶全血细胞。
[0378]
本发明的治疗方法可以涉及在施用步骤前再刺激t细胞群体。可 以使用本领域已知的技术来进行再刺激步骤。在一个实施方式中，通 过用支架组合物再孵育细胞来进行再刺激步骤。在另一个实施方式 中，通过添加佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-醋酸酯(pma，10ng/ml， sigma-aldrich，inc.)、离子霉素(0.5μg/ml，sigma-aldrich，inc.) 和布雷非德菌素a(ebiosciences，inc.)进行再刺激。在再另一个实 施方式中，通过在支架中或外部地在培养物中包括抗原(例如，病原 体抗原或癌症抗原)来进行再刺激步骤。
[0379]
在一个实施方式中，通过操纵获自受试者的血液样品、骨髓样品、 淋巴样品或脾脏样品的t细胞进行治疗方法。
[0380]
因此，本发明的实施方式提供了用于治疗受试者癌症的方法。所 述方法包括将包括t细胞群体的受试者样品接触本发明的抗原呈递 细胞模拟支架(apc-ms)，由此激活、共刺激和稳态地维持t细胞 群体；任选扩增t细胞群体；以及将激活的、共刺激的、维持的和任 选扩增的t细胞施用于受试者，由此治疗受试者的癌症。在某些实施 方式中，所述支架具有癌症抗原。在一个实施方式中，所述癌症抗原 在mhc分子或其片段中呈递，例如，用于通过t细胞识别。在某些 情况中，可以提供完整细胞产品。
[0381]
癌症抗原的代表性实例包括，但不限于，mage-1、mage-2、 mage-3、cea、酪氨酸酶、midkin、bage、casp-8、β-连环蛋白、 β-连环蛋白、γ-连环蛋白、ca-125、cdk-1、cdk4、eso-1、gp75、gp100、mart-1、muc-1、mum-1、p53、pap、psa、psma、ras、 trp-1、her-2、trp-1、trp-2、il13α、il13α2、aim-2、aim-3、 ny-eso-1、c9orf 112、sart1、sart2、sart3、brap、rtn4、 glea2、tnks2、kiaa0376、ing4、hsph1、c13orf24、rbpsuh、 c6orf153、nktr、nsep1、u2af1l、cynl2、tpr、sox2、golga、 bmi1、cox-2、egfrviii、ezh2、licam、livin、livinβ、mrp-3、 巢蛋白、olig2、art1、art4、b-细胞周期蛋白、gli1、cav-1、组 织蛋白酶b、cd74、e-钙粘着蛋白、epha2/eck、fra-1/fosl1、gage-1、 神经节苷脂/gd2、gnt-v、β1,6-n、ki67、ku70/80、prox1、psca、 sox10、sox11、生存素、upar、wt-1、二肽酰基肽酶iv(dppiv)、 腺苷脱氨酶结合蛋白(ad abp)、亲环蛋白b、结直肠相关抗原 (crc)-c017-1a/ga733、t-细胞受体/cd3-ζ链、肿瘤抗原的gage 家族、rage、lage-i、nag、gnt-v、rcasl、α-甲胎蛋白、pl20ctn、 pmel117、prame、脑糖原磷酸化酶、ssx-i、ssx-2(hom-mel-40)、 ssx-i、ssx-4、ssx-5、scp-i、ct-7、
cdc27、腺瘤性结肠息肉蛋白 (apc)、fodrin、pla、连接蛋白37、ig-独特型、pl5、gm2、gd2 神经节苷脂、肿瘤抗原的smad家族、lmp-1、ebv-编码的核抗原 (ebna)-i、ul16-结合蛋白样转录产物1(mult1)、rae-1蛋白、h60、 mica、micb和c-erbb-2，或其免疫原性肽，及其组合。
[0382]
在另一个实施方式中，所述癌症抗原是在患者中鉴定的新抗原。 新抗原决定簇是新抗原上的表位，新抗原是之前尚未被免疫系统识别 的新形成的抗原。新抗原常常与肿瘤抗原相关并且在致癌细胞中被发 现。在蛋白质经历生物化学途径内的更多修饰，如糖基化、磷酸化或 蛋白水解，导致新表位的产生时，可以形成新抗原并且相关地形成新 抗原决定簇。可以通过单独的特异性抗体来识别这些表位。参见， schumacher等，science 348(6230):69-74，2015。在一个实施方式中， 可以以患者特异性方式来检测新抗原。用于检测来自患者样品(例如， 血液样品)的新抗原的方法描述于us 9,1115,402中，将其按引用并 入本文中。在一个实施方式中，新抗原是源自sf3b1、myd88、tp53、atm、abl、a fbxw7、a ddx3x、mapk1、gnb1、cdk4、mum1、 ctnnb1、cdc27、trappc1、tpi、ascc3、hhat、fn1、os-9、 ptprk、cdkn2a、hla-a11、gas7、gapdh、sirt2、gpnmb、 snrp116、rbaf600、snrpd1、prdx5、clpp、ppp1r3b、ef2、 actn4、me1、nf-yc、hla-a2、hsp70-2、kiaa1440、casp8或 其组合的肽。参见，lu等，seminars in immunology，28(1)，22-27， 2016。
[0383]
在实施以上列出的癌症治疗实施方式中，可以有利地提供已经用 细胞毒性t细胞特异性的激活分子和细胞毒性t细胞特异性的共刺激 分子，任选与一种或多种给予细胞毒性t细胞的激活、分裂、分化、 生长、扩增或再编程的其他试剂一起制造的支架。以上已经提供了这 样的分子和试剂的代表性实例。
[0384]
在某些实施方式中，隔离和/或分离的细胞通常可以进行遗传修 饰。在一个实施方式中，将效应细胞遗传修饰以表达cd19特异性的 嵌合抗原受体(car)(cd19 car-t细胞)。这种特定类型的t 细胞在患有复发性和难治性b细胞急性淋巴母细胞性白血病 (b-all)的成年和儿科患者的小的i期临床试验中产生了高比例的 完全缓解(cr)。参见，turtle等(j clin invest.，126，2123-38，2016) 和其中引用的参考文献。在非霍奇金淋巴瘤(nhl)和慢性淋巴细胞 性白血病(cll)的cd19 car-t细胞治疗的临床试验中也看到了有 利的结果。这些研究表明接受者中转移的car-t细胞的强烈增殖与 临床反应有关，并且功能性car t细胞延长的体内持久性可以防止 疾病复发。因此，在一个实施方式中，本发明涉及用于进一步配制用 于癌症治疗的t细胞组合物的方法，包括进一步遗传修饰获自支架的 t细胞。遗传修饰可以非原位或原位介导。任何技术可以用于遗传修 饰t细胞，包括，但不限于，使用病毒载体、质粒、转座子/转座酶 系统、shrna、sirna、反义rna等。在一些实施方式中，使用基 因编辑系统(例如，crispr/cas9系统)，对t细胞进行遗传修饰。 在一些实施方式中，使用病毒递送系统，对分离的t细胞进行遗传修 饰。在一些实施方式中，使用慢病毒系统对分离的t细胞进行遗传修 饰。在一些实施方式中，使用逆转录病毒系统对分离的t细胞进行遗 传修饰。在一些实施方式中，使用腺病毒系统对分离的t细胞进行遗 传修饰。在一些实施方式中，将分离的t细胞接触促进与病毒递送系 统的相互作用或病毒隔离的试剂(例如，促进受体介导的与病毒递送 系统的相互作用的试剂或促进与病毒递送系统的静电相互作用的试 剂)。
[0385]
在一些实施方式中，使用病毒递送系统在原位对分离的t细胞进 行遗传修饰。在其中在原位对分离的t细胞进行遗传修饰的实施方式 中，支架可以包括促进病毒隔离的试
剂。促进病毒隔离的试剂可以通 过吸附或通过连接脂质端基存在于msr-slb脂质双层的表面上。在 一些实施方式中，促进病毒隔离的试剂是纤连蛋白肽，如在一些实施方式中，促进病毒隔离的试剂是两性肽， 如在一些实施方式中，支架可以进一步包括t细胞激 活分子、t细胞共刺激分子和/或t细胞稳态剂。不希望受到任何特定 理论的束缚，认为t细胞接触包括与t细胞激活分子、t细胞共刺激 分子和/或t细胞稳态剂结合的促进隔离的试剂的支架时，支架可以 促进t细胞的激活和扩增，这可以导致细胞成簇并允许病毒递送系统 密切接近t细胞，由此促进更有效的细胞转导。可以选择支架上存在 的t细胞激活分子、t细胞共刺激分子和/或t细胞稳态剂，以导致 所需的t细胞表型，其可以增强所得到的t细胞的疗效(参见，例如， sommermeyer等，leukemia 30(2):492-500(2016))。
[0386]
在一些实施方式中，对分离的t细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗 原受体(car)。在一个实施方式中，cd4 和cd8 t细胞以慢病毒 转导来表达cd19 car和截短的人表皮生长因子受体(egfrt)，其 使得能够使用抗egfr单克隆抗体西妥昔单抗通过流式细胞术鉴定转 导的细胞。转导的egfrt cd4 和cd8 t细胞在培养过程中通过用 照射过的cd19 淋巴母细胞系(lcl)的单次刺激富集。释放用于输 注(其给予了良好的治疗结果)时，产品中的cd3 cd4 和cd3 cd8 子集内的egfrt car-t细胞的中值频率分别为约80％(范围 50.0％-95.9％)和约85％(范围13.0-95.6％)。参见，turtle等(j clininvest.，126，2123-38，2016)。可以通过用本发明的支架孵育t细 胞产品来进一步扩增遗传修饰的t细胞。在一个实施方式中，含有 car t细胞特异性抗原(例如，cd19、cd22或其片段，或其变体) 的支架可以用于选择性地扩增所需的car t细胞。
[0387]
在某些实施方式中，支架配备有在实施癌症治疗方法中有用的产 品。代表性的实例包括，例如，b细胞的杂交瘤、稳定的t细胞谱系、 源自b细胞或其杂交瘤的抗体、结合癌症抗原的受体(结合呈递抗原 的mhc分子的受体)，包括其片段、编码受体或其抗原结合结构域 的核酸、编码抗体的核酸，包括完整细胞。
[0388]
本发明的实施方式提供了用于治疗受试者的免疫缺陷障碍的方 法，包括将受试者的包括t细胞群体的样品接触本发明的抗原呈递细 胞模拟支架(apc-ms)，由此激活、共刺激和稳态地维持t细胞群； 任选扩增t细胞群体；以及将激活、共刺激、维持和任选扩增的t细 胞施用于受试者，由此治疗受试者的免疫缺陷障碍。
[0389]
在一个实施方式中，提供了一种用于治疗选自原发性免疫缺陷障 碍和获得性免疫缺陷障碍的免疫缺陷障碍的方法，包括将受试者的包 括t细胞群体的样品接触本发明的apc-ms，由此激活、共刺激和稳 态地维持t细胞群体；任选扩增t细胞群体；以及将激活、共刺激、 维持和任选扩增的t细胞施用于受试者，由此治疗受试者的免疫缺陷 障碍。在一个实施方式中，免疫缺陷障碍可以是获得性免疫缺陷障碍， 例如，获得性免疫缺陷综合征(aids)，或遗传性障碍，例如，digeorge 综合征(dgs)、染色体断裂综合征(cbs)、共济失调毛细血管扩 张(at)和wiskott-aldrich综合征(was)，或其组合。
[0390]
在实施免疫缺陷障碍的治疗中，如以上列出的，可以有利地提供 已经用辅助t细胞特异性的激活分子和辅助t细胞特异性的共刺激分 子，任选与一种或多种赋予辅助t细胞的激活、分裂、分化、生长、 扩增或再编程的其他试剂一起制造的支架。以上已经提供了
这样的分 子和试剂的代表性实例。
[0391]
本发明的实施方式提供了用于治疗受试者的病原体性疾病的方 法，包括将受试者的包括t细胞群体的样品接触本发明的抗原呈递细 胞模拟支架(apc-ms)，由此激活、共刺激和稳态地维持t细胞群 体；任选扩增t细胞群体；以及将激活、共刺激、维持和任选扩增的 t细胞施用于受试者，由此治疗受试者的病原体性疾病。在一些情况 中，可以预防性地施用源自操纵步骤的免疫细胞或组合物，例如，在 受试者的疾病症状发作前。根据上述实施方式可以治疗的病原体性疾 病包括细菌性疾病、病毒性疾病、真菌性疾病，或其组合。
[0392]
本发明的实施方式提供了用于治疗受试者的自身免疫疾病的方 法。所述方法包括将受试者的包括t细胞群体的样品接触本发明的抗 原呈递细胞模拟支架(apc-ms)，由此激活、共刺激和稳态地维持 t细胞群体；任选扩增t细胞群体；以及将激活、共刺激、维持和任 选扩增的t细胞施用于受试者，由此治疗受试者的自身免疫疾病。
[0393]
在治疗自身免疫疾病的情况中，可以优选不施用活性免疫细胞 (因为这些是自身反应性的)，而是施用休眠、衰老或灭活的免疫细 胞。优选，免疫细胞是t细胞。或者，可以施用免疫细胞的调节子， 例如，调节t细胞或抑制t细胞。所述支架/设备可以制造用于ts/treg 细胞亚群的操纵，随后将其施用于受试者。
[0394]
因此，在一些实施方式中，本发明提供了治疗自身免疫疾病的方 法，通过将本发明的支架施用于需要的受试者，其中支架中的多种抗 原是自身免疫疾病特异性的，收集支架/设备中的多种调节或抑制t 细胞，其中多种调节或抑制t细胞是自身免疫疾病特异性的，并且将 多种调节t细胞或抑制t细胞或从其衍生的产品施用于受试者，由此 治疗自身免疫疾病。
[0395]
在实施自身免疫疾病的治疗中有用的细胞产品包括，例如，结合 自身反应性细胞的抗体和受体、位于抑制或调节t细胞中的调节蛋 白，包括编码这些分子的核酸序列。
[0396]
在上述治疗实施方式中，可以以包括约5
×
102细胞/ml至约1
×
109细胞/ml的总细胞浓度来配制细胞。优选的t细胞剂量范围为约2
×
106细胞至约9
×
107细胞。
[0397]
本发明的实施方式进一步涉及通过施用一种或多种上述组合物 的疾病治疗。所述组合物可以是药物组合物，其通过实现其计划的目 的的任何方式来施用。例如，施用可以通过非肠道、皮下、静脉内、 动脉内、皮内、肌内、腹膜内、经皮、经粘膜、颅内、鞘内或心室内 途径。替换地，或同时地，施用可以通过口服途径。可以通过弹丸注 射或通过随着时间的逐渐输注来施用药物组合物。
[0398]
施用的剂量可以取决于接受者的年龄、性别、健康和重量，同时 进行的治疗的种类(如果有的话)，治疗频率以及所需效果的形式。 用于施用药物组合物的剂量范围可以足够大以产生所需的效果，由此 例如耗尽自身反应性t细胞和/或自身免疫疾病得到明显预防、抑制 或治疗。剂量不能太大以致引起不良副作用，如不合需要的交叉反应、 广义免疫抑制、过敏反应等。
[0399]
本文中所述的实施方式进一步涉及用于检测或诊断受试者的疾 病或障碍的方法。使用上述方法可以检测或诊断任何疾病或障碍。特 别优选，所述疾病是选自类风湿性关节炎、狼疮、乳糜泻、炎性肠病 或节段性回肠炎、干燥综合征风湿性多肌痛、多发性硬化、强制性脊 柱炎、1型糖尿病、斑秃、脉管炎、颞动脉炎等的自身免疫疾病。在 其他实施方式中，所述疾病是选自头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺 癌、肾癌、食道癌、骨癌、睾丸癌、宫颈
癌、胃肠道癌、成胶质细胞 瘤、白血病、淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肺部的肿瘤前病变、结肠癌、 黑素瘤和膀胱癌的癌症。根据上述实施方式可以诊断的病原性疾病包 括细菌性疾病、病毒性疾病、真菌性疾病，或其组合。
[0400]
在这些实施方式中，可以通过首先将含有目标免疫细胞的受试者 样品接触本发明的支架来诊断患有疾病的受试者，其中支架中的抗原 是所述疾病特异性的。在一个实施方式中，样品含有t细胞，并且将 支架/设备接触样品一段时间，例如，0.5天、1天、2天、3天、4天、 5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、25天、30天、35 天、40天、45天、50天、60天，或更长时间，并且使用一种或多种 上述技术来分析支架中的细胞。例如，在诊断自身免疫疾病的情况中， 分析的细胞可以包括激活的t细胞。在癌症诊断的情况中，分析的细 胞可以包括肿瘤抗原特异性t细胞。在病原性疾病的情况中，分析的 细胞可以包括特异性地消除病原体的t细胞(例如，在胞内病原体的 情况中，分析th1细胞，以及在胞外病原体的情况中，分析th2细胞)。
[0401]
受试者是动物，优选哺乳动物或鸟类。特别优选，受试者选自人、 狗、猫、猪、母牛、水牛和马。最优选，受试者是人。任何免疫细胞 可以用于疾病或障碍的诊断中。优选，使用淋巴细胞(例如，t细胞) 进行诊断。
[0402]
可以使用任何常规方法来进行分析步骤。因此，在一个实施方式 中，分析步骤可以涉及测定自身免疫疾病特异性的免疫细胞的数量。 任何常规技术可以用于测定免疫细胞的抗原结合特异性，例如，将细 胞样品加载至抗原覆盖的表面上，洗掉非特异性结合的细胞，并且使 用检测剂(例如，结合位于抗原特异性细胞上的细胞表面表位的抗体) 定量抗原特异性细胞的数量(以通过释放结合的细胞的游离形式，或 以结合形式)。在另一个实施方式中，分析步骤可以涉及测定抗原特 异性免疫细胞的物理或生物学特征。物理特征的实例包括，例如，大 小、形状、反射率、形态学、密度。生物学特征的实例包括，例如， 特定细胞表面标志物的表达、细胞因子的分泌、对特定抗原或试剂的 反应性、基因表达的模式。
[0403]
分析步骤可以与相关步骤结合，其中，分析步骤的结果可以与目 标参数相关联。参数的代表性类型包括，疾病存在(或不存在)、疾 病的类型(例如，侵袭性vs.非侵袭性自身免疫障碍；可用药vs.不可 用药的疾病，例如，抗生素易感的vs.抗生素抗性的细菌感染、免疫 治疗抗性vs.免疫治疗敏感性癌症)、疾病的阶段、疾病(随着时间) 的进展/消退等。在一个实施方式中，所述参数涉及疾病的存在或不存 在(其可以以二元术语来表述)。在另一个实施方式中，所述参数涉 及疾病的分级(其可以以名义上的等级来表示，例如，i-iv级，iv 级为最高)。在再另一个实施方式中，参数涉及疾病发病率的几率或 可能性，例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、2 倍、3倍、5倍、10倍、20倍或更高。
[0404]
在上述诊断方法中，可以将所述参数与基线值比较。基线值可以 是预定的值，例如，在健康受试者群体中。例如，在目标抗原是类风 湿性关节炎(ra)抗原的情况中，健康受试者中的ra特异性抗体(或 t细胞)的基线水平可以用于相关步骤中。或者，可以使用合适的对 照通过实验鉴定基线值。本领域技术人员可以使用常规技术在不同受 试者组之间进行校正和/或得出推论。
[0405]
因此，本发明的实施方式涉及检测或诊断受试者的自身免疫疾 病、癌症或病原性疾病，其是通过将受试者的样品接触本发明的含有 自身免疫疾病、癌症疾病或病原性疾病特异性的抗原的支架，并分析 其中所含的免疫细胞。接触步骤可以在体内(例如，通过将支
架植入 受试者中)或离体(例如，通过用支架培养从受试者抽取的血样)进 行。在某些实施方式中，可以通过首先使用常规技术从支架取出免疫 细胞来进行分析步骤，即，通过非原位分析。例如，可以使用温和的 去污剂和酶从支架取出细胞。或者，可以在没有从支架取出细胞的情 况下进行检测/分析步骤，即，通过原位分析。
[0406]
相关实施方式涉及监测受试者的疾病进展的方法。所述方法包括 将受试者的样品接触本发明的含有疾病特异性的抗原的支架，并且分 析其中所含的免疫细胞。设备中所含的免疫细胞的数量/类型可以给予 有价值的关于疾病进展的线索。或者，在受试者已经经历了治疗干预 的情况中，类似的方法可以用于监测疾病治疗和/或疾病控制。
[0407]
上述方法可以用于监测自身免疫障碍、癌症、病原性疾病等的进 展/治疗。优选，诊断方法中使用的免疫细胞是t细胞。
[0408]
在自身免疫障碍的情况中，可以通过分析自身反应性t细胞的数 量和/或类型来监测疾病进展。根据分析结果，可以设计干预和/治疗 方法来最小化症状的严重性。在其他情况中，可以采取预防方法，包 括给受试者提供关于膳食、营养和/或其他生活方式改变的推荐。
[0409]
本文中所述的实施方式进一步涉及用于设计和生产用于治疗疾 病的新组合物的方法。所述方法包括将本发明的含有疾病特异性抗原 的支架施用于受试者，其随后操纵疾病特异性的免疫细胞，任选分离、 富集和扩增设备中操纵的免疫细胞，并随后将免疫细胞返回受试者。 或者，可以将源自这样的免疫细胞的产品施用于受试者。源自免疫细 胞的产品的实例包括核酸(包括含有这样的核酸的载体和细胞)、肽、 蛋白质、抗体、细胞因子等。
[0410]
优选，所述疾病是自身免疫疾病。在一个实施方式中，可以将通 过上述方法分离的(和任选如本文中所述的在培养物中扩增的)自身 反应性t细胞原位或非原位灭活。将t细胞灭活的方法是本领域已知 的。实例包括，但不限于，化学灭活或照射。可以使用本领域技术人 员已知的各种技术，包括，但不限于，冷冻保存，在灭活之前或之后 保存自身反应性t细胞。如以下所述的，所述组合物可以用作疫苗来 耗尽自身免疫患者中的自身反应性t细胞。
[0411]
本文中所述的实施方式进一步涉及通过上述方法产生的组合物 和疫苗。所述组合物可以是药物组合物，其可以使用本领域公知的方 法来生产。可以通过技术人员，使用公认的诊断和治疗原则，来生产 用作疾病或障碍治疗中的临床前和临床治疗剂的药物组合物。
[0412]
在一个实施方式中，所述疫苗可以包括自身反应性t细胞，其包 括同源(“单克隆”)或异源(“多克隆”)模式的vβ-dβ-jβ基因 用法。临床研究表明接受自体同源的单克隆t细胞疫苗接种的自身免 疫患者可以显示出对抗自身反应性t细胞的免疫性的逐渐下降。在一 些情况中，重新出现的自身反应性t细胞可能源自不同的克隆群，表 明t细胞可以经历潜在地与正在进行的疾病过程相关的克隆移位或 表位扩散。克隆移位或表位扩散在自身反应性t细胞介导的自身免疫 疾病中可能是个问题。能够耗尽多个自身反应性t细胞群的包含多克 隆自身反应性t细胞的疫苗可以避免与克隆移位或表位扩散相关的 问题。本发明的含有所需t细胞的组合物/疫苗可以配有药物学上可 接受的载体。还可以提供t细胞的冻干制备物。
[0413]
iv.试剂盒/设备
[0414]
在某些实施方式中，本发明提供了在一个或单独的区室中包括本 发明支架的试剂盒。所述试剂盒可以进一步包括其他成分。所述试剂 盒可以任选包括用于配制支架用于诊断或治疗应用的说明书。所述试 剂盒还可以包括在各种障碍和/或疾病的治疗或诊断中单独或一起使 用试剂盒组分的说明书。
[0415]
在相关实施方式中，本发明提供了包括本发明的支架连同用于选 择、培养、扩增、维持和/或移植目标操纵细胞的试剂的试剂盒。用于 t细胞、b细胞和抗原呈递细胞的细胞选择试剂盒、培养试剂盒、扩 增试剂盒、移植试剂盒的代表性实例是本领域已知的。
[0416]
通过以下实施例来进一步说明本发明，所述实施例不应当解释为 限制性的。整个申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请 的完整内容，以及附图，按引用并入本文中。
[0417]
实施例
[0418]
实施例1：支架的构建和组装结构的显微分析
[0419]
使用以下所述的方法组装抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)。 简而言之，首先提供含有高表面积介孔二氧化硅微棒(msr)的基底 层，在其上任选加载各种t细胞稳态剂，例如，白细胞介素，如il2， 和/或细胞因子，如tgf-β。在某些实施方式中，可以优选将稳态剂加 载至msr层上。随后，将连续的流体支撑的脂质双层(slb)成层 于基底层上，由此产生msr-slb支架。如果没有将稳态剂直接加载 于msr层上，则它们可以在slb有效负载已经应用于msr层顶部 后加载。随后，可以施用阻断剂，如bsa，以阻断msr-slb支架中 的非特异性整合位点，此后，将一种或多种t细胞激活分子和t细胞 共刺激分子加载于msr-slb支架上。用相差显微技术观察与介孔二 氧化硅微棒(msr)结合的脂质的结构，其中将安装在显微镜上的数 码相机用于获得图1中所示的结构图像。上图显示了1:20的脂质:msr 比率下脂质(绿色)和介孔二氧化硅微棒(灰色)的合并图(比例尺 ＝200μm)。中图显示了1:4的脂质:msr比率下脂质(绿色)和介孔 二氧化硅微棒(灰色)的合并图(比例尺＝200μm)。下图显示了在 较高放大倍数下与msr结合的脂质的合并相差显微镜图像(比例尺 ＝20μm)。
[0420]
发现抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)的特征取决于脂质的类 型和脂质的含量。图2a提供了可以用于获得所需的支架架构和/或性 质的脂质列表，例如，二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)；棕榈酰-油酰 基磷脂酰胆碱(popc)；或二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)。此外， 发现了在msr-slb组合物上成层的脂质的停留时间取决于脂质的类 型和/或含量(参见图2b)。接着，使用荧光分析研究了本发明的支 架中的脂质双层的组织化。图2c显示了含有dopc、popc或dspc 的各种msr-slb组合物在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中在两周(14天) 的时间中的相对荧光变化。图2d显示了含有dopc、popc或dspc 的各种msr-slb组合物在完全roswell park memorial institute培养 基(crpmi)中在37℃下两周(14天)的时间中的相对荧光变化。
[0421]
另外，通过将支架在pbs中悬浮3天、7天和14天，研究了各 种msr-slb组合物在各个不同时间点的稳定性。随后用相差荧光显 微镜检查来分析支架架构和/或结构。结果显示于图3中。上图显示了 msr-slb组合物中的dopc的稳定性；中图显示了msr-slb组合 物中的popc的稳定性；和下图显示了msr-slb组合物中的dspc 的稳定性。
[0422]
随后，采用相差显微镜检查，随着时间研究了msr-slb流体结 构的组装和特征。结果显示于图4a-4e中。图4a显示了在漂白脂质 组合物之前(“前”)、漂白脂质组合物时(t＝
0)和漂白脂质组合物后 5分钟(t＝5min)，在高放大倍数(比例尺＝2μm)下获取的与介孔 二氧化硅微棒(msr)结合的脂质的相差共焦荧光显微镜图像。图 4b显示了光漂白后随着时间的荧光恢复的变化(frap)。源描绘于 区域(2)中，沉降(sink)描绘于区域(3)中，并且标准化点表示为 区域(1)。在漂白后的早期时间点处最佳地看到了差异分布，并且 在约2min(120s)时获得了平衡。右图显示了平滑拟合曲线，其描 绘了随着时间的frap的平均变化，如从标准化图像得到的。图4c 和图4d显示了脂质组合物在漂白前(前)、漂白时(t＝0)和漂白后 3分钟后(t＝3min)，msr-slb流体结构的两组高分辨率图像。
[0423]
此外，使用分光光度分析研究了含有各种脂质部分的msr-slb 组合物的结构和功能性质。结果显示于图5a和5b中。图5a显示了 含有popc的脂质双层的msr-slb的示意图，所述脂质双层含有磷 酸乙醇胺生物素(生物素pe)，其与抗生物素蛋白链菌素分子(例 如，抗生物素蛋白链菌素二聚体)缀合，其转而与生物素化的抗体(例 如，生物素化的抗cd3抗体或生物素化的抗cd28抗体或另一种特异 性或非特异性抗体)缀合。图5b显示了mps(二氧化硅)、popc (脂质)、mps-popc复合物、生物素化的mps-popc复合物(在 抗生物素蛋白链菌素存在或不存在下)以及在藻红蛋白生物素(生物 素pe)和/或抗生物素蛋白链菌素的存在或不存在下与生物素化的抗 体一起的mps-popc复合物的分光光度分析。在含有通过抗生物素 蛋白链菌素接头与生物素化的抗体缀合的磷酸乙醇胺生物素(生物素 pe)的msr-slb组合物中观察到了吸光度的显著提高(暗条；**表 示统计学显著性)。在所有组分存在下，观察到了b3z杂交瘤细胞(其 响应激活而产生β-半乳糖苷酶)的活性提高，表明apc-ms主要采用 (a)中所绘的结构。
[0424]
实施例2：apc-ms的功能性性质的分析
[0425]
稳态因子(如il-2)的释放
[0426]
使用实施例1中所述的方法制造含有介孔二氧化硅棒(msr)和 支撑的脂质双层(slb)的apc-ms，其进一步含有il-2。使用染色 技术和/或结合测定分析了il-2从这些msr-slb的释放。结果呈现 于图6a和6b中。如图6a的电子显微照片中所示的，msr的高表 面积孔可用于il2或其他可溶性有效负载的潜在吸附(比例尺＝100 nm)。显示了在15天时间段中的累积il-12释放的图(图6b)说明 本发明的apc-ms能够在两周研究时间的整个过程中以受控和持续 的方式释放稳态剂，如il-2。
[0427]
与t细胞的结合
[0428]
用含有功能性t细胞的培养基孵育包含msr-slb支架 (apc-ms)的抗原呈递细胞模拟支架，并且用相差显微镜检查分析 t细胞进入支架中的渗透。结果呈现于图7a和7b中。图7a显示了 用活细胞染料和核染料染色的完整细胞。图像描绘了已经渗入堆叠的 高纵横比的脂质覆盖的msr-slb支架的颗粒间空间中的活t细胞。 图5b显示了已经用单种染料染色的细胞。
[0429]
实施例3：抗体加载
[0430]
随后将含有msr-slb的apc-ms加载各种刺激分子、共刺激分 子和/或t细胞稳态剂，并且用荧光显微镜检查分析所得到的结构。 分析了四种不同类型的msr-slb支架
‑‑
(1)裸msr-slb支架(对 照)；(2)含有缀合的抗体的msr-slb；(3)含有il-2的msr-slb； 和(4)含有缀合的抗体和il-2的msr-slb。显微照片显示于图8 中(低分辨率图像在左侧和高分辨率图像在右侧)。上图(灰色调图 像)含有上述每种msr-slb支架的相差显微图像。下图合并了
ms 或dynabeads孵育时foxp3 小鼠脾脏t细胞子集的多克隆扩增。 在第三实验中，用本发明的支架(apc-ms)或dynabeads孵育 时cd62l 小鼠脾脏t细胞的子集的多克隆扩增。在第四实验中，用 apc-ms或dynabeads孵育时cd8 /cd69 小鼠脾脏t细胞的子 集的多克隆扩增。在第五实验中，用apc-ms或dynabeads孵育 时cd8 /颗粒酶b 小鼠脾脏t细胞的子集的多克隆扩增。在上述每 个实验中，在7天后，将第一t细胞亚群接受il-2处理，同时将第 二t细胞亚群再刺激，并且将细胞悬浮液再培养6天。另外，确保实 验中使用的apc-ms和dynabeads含有相同的刺激和共刺激分子 组(repertoire)。
[0438]
第一实验的结果呈现于图13a和13b中。结果显示与使用 dynabeads的孵育相比，使用本发明的支架(apc-ms)的孵育在 14天孵育阶段结束时获得了更高的多克隆cd8 小鼠脾脏t细胞的扩 增。此外，尽管il-2处理抑制了使用dynabeads刺激的细胞的扩 增(约降低20％)，但在使用apc-ms孵育的细胞中没有观察到这种 作用。
[0439]
在第二实验中，使用矩形门控来计数各个部分中的foxp3 细胞 的数量和/或比例。结果呈现于图14中。
[0440]
在第三实验中，其结果显示于图15中，发现了本发明的apc-ms 组合物以与使用dynabeads获得的那些相似和相当的方式给予 cd62l 小鼠脾脏t细胞子集的多克隆扩增。结果在用apc-ms或 dynabeads(7天孵育后使用再刺激或il-2处理)孵育后的各个不 同时间点(t＝0天、5天、7天、11天和13天)以t细胞群体的流式 细胞术(facs)散点图的形式描绘。cd62l 细胞出现在散点图的右 手(上和下)象限。结果证明了本发明的apc-ms组合物在选择性地 扩增靶t细胞亚群上同等有效，其随后可以使用已知的细胞学技术进 行操纵或配制。
[0441]
在第四实验中，其结果显示于图16中，发现了本发明的apc-ms 组合物以使用dynabeads获得的那些相似和相当的方式给予 cd8 /cd69 小鼠脾脏t细胞子集的多克隆扩增。在用apc-ms或 dynabeads(7天孵育后使用再刺激或il-2处理)孵育后的各个不 同时间点(t＝0天、5天、7天、11天和13天)以t细胞群的流式细 胞术(facs)散点图的形式描绘了其结果。cd8 /cd69 细胞出现在 散点图的右上象限。结果证明了与使用dynabeads的孵育相比， 使用apc-ms的孵育在14天孵育阶段结束时获得了更高的多克隆 cd8 /cd69 t细胞的扩增(用apc-ms孵育的样品中约90％ cd8 /cd69 t细胞vs.用dynabeads孵育的样品中约50％ cd8 /cd69 t细胞的相对比例)。
[0442]
在第五实验中，其结果显示于图17中，发现了本发明的apc-ms 组合物以使用dynabeads获得的那些相似和相当的方式给予 cd8 /颗粒酶b 小鼠脾脏t细胞子集的多克隆扩增。在用apc-ms 或dynabeads(7天孵育后使用再刺激或il-2处理)孵育后的各 个不同时间点(t＝0天、5天、7天、11天和13天)以t细胞群的流 式细胞术(facs)散点图的形式描绘了其结果。cd8 /颗粒酶b 细 胞出现在散点图的右上象限。结果证明了与使用dynabeads的孵 育相比，使用apc-ms的孵育在14天孵育阶段结束时获得了更高的 多克隆cd8 /颗粒酶b t细胞的扩增(用apc-ms孵育的样品中约 95％cd8 /颗粒酶 t细胞vs.用dynabeads孵育的样品中约80％ cd8 /颗粒酶b t细胞的相对比例)。
[0443]
实施例6：支架刺激和扩增细胞因子分泌细胞的用途
[0444]
用apc-ms或dynabeads孵育小鼠脾脏t细胞各个不同的持 续时间(t＝0天、5天、7天、11天和13天)。孵育7天后，分别用 apc-ms或dynabeads再刺激t细胞的第一亚群，并且用
il-2处 理第二亚群。使用用于测量生物样品中的ifnγ浓度的标准分析，例 如，elisa分析，测量了细胞因子(ifnγ)分泌。呈现于图18中的 结果证明了与使用dynabeads的孵育相比，使用apc-ms的孵育 在孵育5天后获得了更高的多克隆cd8小鼠脾脏t细胞的扩增。这 个效果在整个13天的实验阶段中持续。用支架孵育脾脏t细胞提高 了ifnγ分泌。此外，发现了再刺激在增强用dynabeads孵育的细 胞亚群的ifnγ分泌中特别有效。
[0445]
实施例7：支架除去无能的、休眠的或消耗的t细胞的用途
[0446]
基于其与b7和cd28家族的同源性发现了几种新的共刺激分子。 程序化死亡蛋白1(pd1；uniprot登录号no.q15116)在激活的t 细胞上表达并且具有两个b7样配体，pd-l1和pd-l2(freeman等， j.exp.med.192:1027-1034(2000)；latchman等，nat.immunol. 2:261-268(2001)；dong等，nat.med.5:1365-1369(1999)；tseng 等，j.exp.med.193:839-846(2001))。据认为pd-1是无能的标志 物(chikuma等，j immunol.,182(11):6682-9，2009)。因此，使用流 式细胞术研究了本发明的支架对诱导t细胞无能的作用。用本发明的 支架(apc-ms)或dynabeads孵育小鼠脾脏t细胞各种不同的 持续时间(t＝0天、5天、7天、11天和13天)。孵育7天后，将t 细胞的第一亚群再刺激，并用il-2处理第二亚群。使用facs散点图 分析每个t细胞亚群的细胞表面标志物的表达，其中x轴上的值描 绘了cd8 染色的强度，而y轴上的值描绘了pd-1 染色的强度。呈 现于图19中的结果显示了随着时间提高的小鼠脾脏t细胞的pd-1 表达(即，提高的无能)。在两个亚群中都实现了t细胞耗尽。结果 表明整个培养阶段中的大部分细胞是pd-1阴性的(下象限)，尽管 一些细胞确实上调了pd-1的表达。apc-ms的再刺激倾向于提高 pd-1表达。注意：在所有设定中提供了il-2暴露。
[0447]
实施例8：支架提高t细胞扩增和提高细胞活性的用途
[0448]
使用细胞计数术分析了本发明的apc-ms组合物在提高t细胞 扩增和/或代谢活性中的作用。用对照支架或实验支架孵育人外周血t 细胞，并且使用标准分析在各个不同时间点(t＝0天、5天、7天、11 天和13天)测量了t细胞的数量和/或代谢活性，例如，使用台盼蓝 排除/血球计的活细胞人工细胞计数，使用alamar蓝分析分析代谢活 性。结果呈现于图20a和20b。在t细胞扩增研究的情况中，对照支 架包括假组合物(标记：“模拟”；用黑线描绘)和含有可溶性的游 离形式的刺激物抗cd3、抗cd28、il-2的组合物(“游离”；用红 线描绘)，而实验支架包括(1)dynabeads(蓝线)和(2)本发 明的脂质双层(slb)(绿线)。结果显示于图20a中。可以看到在 13天实验阶段结束时，与使用dynabeads的孵育相比，使用slb 的孵育导致了t细胞几乎高两倍的扩增。更令人惊讶地，甚至“游离
”ꢀ
支架对t细胞引发了与dynabeads作用相当的刺激性作用。
[0449]
本发明的支架对原代t细胞的代谢活性的作用的结果呈现于图 20b中。用对照支架或实验支架孵育脾脏t细胞，并且使用alamar 蓝染色测量了各个不同时间点(t＝0天、5天、7天、11天和13天) 的t细胞代谢活性。对照支架包括假组合物(“模拟”；“m”)和 无slb的组合物(“无”，“f”)，而实验支架包括(1)dynabeads (“d”)和(2)脂质双层(slb)(“s”)。可以看到在14天实 验结果结束时，使用“模拟”支架孵育的细胞全部死亡，而使用实验 支架(slb或dynabeads)孵育的细胞经历了随着时间的持续生 长和扩增。更重要地，与dynabeads给予的作用相比，本发明的 slb支架在14天实验阶段结束时促进了更好的t细胞生长和代谢活 性。
[0450]
实施例9：支架促进人t细胞扩增的用途
[0451]
用对照支架(“模拟”)或含有所列的抗cd3抗体-莫罗单抗 (okt3)、识别cd3抗原内的cd3的17-19kdε-链的抗体/t细胞受 体(tcr)复合物(hit3a)和识别cd3e内的tcr复合物的20kda 亚基的单克隆抗体(ucht1)的实验支架孵育获自受试者1(图21a) 和受试者2(图21b)的人血样。研究了三个不同的剂量-5μg(上载 玻片)、1μg(针对受试者2的下载玻片)和0.5μg(针对受试者1的 下载玻片)。在每种情况中，用抗cd28抗体提供了共刺激，其中将 抗cd3抗体:抗cd28抗体的比率维持在1:1。在各个不同时间点(t＝0 天、7天、11天和13天)测量了t细胞的倍数扩增。呈现于图21a 和21b的结果显示了在较高抗体剂量下(5μg)，所有三种抗cd3抗 体能够刺激人t细胞的扩增。在所有情况中，t细胞群体的扩增开始 是缓慢的直至第7天，此后，其按指数增加。在最高剂量下，在实验 阶段结束时(第13天)，获得了t细胞数量600-800倍增加。使用 中等剂量(1μg)，只有okt3和hit3a(但ucht1没有)能够刺激 t细胞扩增，其中，在实验阶段结束时(第13天)获得了t细胞数 量300-400倍提高。在最低剂量下(0.5μg)，只有okt3(但ucht1 和/或hit3a没有)能够刺激t细胞扩增，其中，在实验阶段结束时 (第13天)获得了t细胞数量600-700倍增加。结果表明了抗cd3 抗体克隆以及抗体剂量两者对表达速率的作用。
[0452]
接着，通过流式细胞术分析了用对照支架(“模拟”)或含有所 列的抗cd3抗体-okt3、hit3a和ucht1的实验支架孵育时人t细 胞的多克隆扩增。结果呈现于图22中，其中下图显示出用含有每种 抗cd3抗体作为刺激分子和抗cd28抗体作为t细胞共刺激分子的 apc-ms孵育后各个不同时间点(t＝8天、11天和14天)的t细胞 群体的流式细胞(facs)散点图。散点图的x轴上的值描绘了cd8 染色的强度，而y轴上的值描绘了cd4 染色的强度。散点图概括于 上图的线图中，其显示了用含有上述抗cd3抗体-okt3(圆形)、 hit3a(方块)和ucht1(三角)的apc-ms孵育后，cd4 vs.cd8 t细胞亚群百分比的变化。研究了两个不同的抗体剂量-5μg的第一剂 量(1
×
稀释)和0.5μg的第个剂量(1:10
×
稀释)。结果表明在低抗体 剂量下(1:10
×
稀释；0.5μg)，所有三种抗cd3抗体能够使用低抗体 浓度vs.高抗体浓度富集cd8 特异性t细胞。在实验阶段结束时(第 14天)，获得了cd8 特异性t细胞数量3-4倍增加。例如，在实验 开始时，cd8 t细胞的相对频率为20％，其在第14天提高至约 60％-80％。此外，发现了在促进cd8 t细胞的扩增中，抗cd3抗体 uhct1和okt1同等有效并且优于抗cd3抗体hit3a。在高(5μg) 抗体剂量下，整体t细胞群中的cd8 :cd4 的比率在第14天未改变 (或甚至减弱)。结果表明了抗cd3抗体克隆以及抗体的剂量两者 对cd8 特异性t细胞扩增的作用。
[0453]
实施例10：支架促进特定的人t细胞亚群扩增的用途
[0454]
用含有1
×
剂量(5μg)的所列抗cd3抗体-莫罗单抗(okt3)、 hit3a和ucht1的实验支架孵育人血样。在每种情况中，提供了使 用抗cd28抗体的共刺激。在14天后测量了t细胞的倍数扩增。在 上图中显示了总的活细胞中的cd62l和ccr7的表达，而下图中显 示了这些标志物在门控的cd8 细胞中的表达。呈现于图23中的结果 表明了所有三种抗cd3抗体能够刺激不同的人t细胞亚群的扩增。 令人惊讶地，用本发明的不同抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)扩 增的大部分细胞保留了cd62l ccr7 ，即使在孵育14天后。结果 表明离体扩增后扩增的t细胞保留体内功能性。因此，可以使用抗原 呈递细胞模拟支架选择性地扩增和维持不同的cd62l ccr7 t细胞 (例如，记忆细胞)的亚群。
[0455]
另外，与含有ucht1和/或hit3a的支架相比，含有okt3的 apc-ms支架在扩增和/或
保持cd62l ccr7 t细胞中特别有效。
[0456]
实施例11：使用抗原呈递细胞模拟支架(apc-ms)的t细胞 离体扩增
[0457]
t细胞的过继性细胞转移(act)是具有前景的针对癌症和传染 病的治疗。然而，目前用于离体t细胞扩增的方法(act中的关键 步骤)常常产生次佳的扩增速率和有限的细胞功能性。在此，我们研 发了介孔二氧化硅微棒支撑的脂质双层，其提供了用于流体脂质双层 上t细胞受体刺激和局部预定密度的共刺激的信号，并且促进了可溶 性白细胞介素-2的受控释放，与通过抗原呈递细胞(apc)自然地呈 递这些信号的情况相似。在细胞培养物中，材料形成了apc-模拟支 架(apc-ms)，其促进了渗入的小鼠和人t细胞的激活。两周后， apc-ms比商业扩增珠促进了高两倍至十倍的多克隆t细胞扩增，以 及罕见的功能性细胞毒性t细胞亚群的强烈抗原特异性扩增。这个研 究证明了快速扩增用于act的功能性t细胞的新平台。
[0458]
使用t细胞的过继性细胞转移(act)是具有前景的用于各种恶 性疾病和传染病治疗的方法(参见，例如，rosenberg,s.a.&restifo, n.p.science 348,62-68(20115)；june,c.h.等，science translationalmedicine 7(280):280ps7(2015)；和fesnak,a.d.等，nature reviewscancer 16,566-581(2016))。然而，功能性t细胞的快速离体扩增 (用于act的t细胞产生中的关键步骤)仍然是主要的挑战。t细 胞激活需要三个信号：(1)t细胞受体(tcr)刺激，(2)共刺激 和(3)促存活细胞因子(huppa,j.b.&davis,m.m.nature reviewsimmunology 3,973-983(2003))。在体内，这些信号通过抗原呈递 细胞(apc)来提供，其以特定的时空模式将这些信号呈递给t细胞(huppa和davis(2003)；lee,k.-h.等，science 302，1218-1222(2003)； alarc
ó
n,b.等，immunology 133，420-425(2011)；和minguet,s. 等，immunity 26，43-54(2007))。使用各种方法来离体扩增用于 act的t细胞，并且合成的人工apc(aapc)特别方便(rosenberg 和restifo(2015)；hasan,a.等，advancements in genetic engineering 2015(2015)；hollyman,d.等，journal of immunotherapy(hagerstown, md.:1997)32,169(2009)；maus,m.v.等，nature biotechnology 20, 143-148(2002)；zappasodi,r.等，haematologica 93,1523-1534(2008)； perica,k.等，acs nano 9,6861-6871(2015)；mandal,s.等，acschemical biology 10,485-492(2014)；steenblock,e.r.&fahmy,t.m. molecular therapy 16,765-772(2008)；fadel,t.r.等，naturenanotechnology 9,639-647(2014)；sunshine,j.c.等，biomaterials 35, 269-277(2014)；fadel,t.r.等，nano letters 8,2070-2076(2008)； meyer,r.a.等，small 11,1519-1525(2015)；和steenblock,e.r.等， journal of biological chemistry 286,34883-34892(2011))。目前， 用针对cd3(acd3；tcr刺激物)和cd28(acd28；共刺激信号) 的激活抗体功能化的商业微珠(dynabeads)是唯一fda批准的 用于扩增t细胞的合成系统(hollyman等(2009))。这些珠在外 源性白细胞介素-2(il-2)补充下促进多克隆t细胞激活。尽管这些 培养物为t细胞提供三个关键信号，但其中这些信号被呈递的情况不 是通过apc天然呈递的情况典型的。这种情境不一致性可能导致次 佳的t细胞扩增速率和具有有限的或失调的功能的t细胞产品 (zappasodi等(2008)；fadel等(2014)；li,y.&kurlander,r.j. journal of translational medicine 8,1(2010)；和jjin,c.等，moleculartherapy-methods&clinical development 1(2014))。此外，这些珠 不适于大的信号集的呈递，这可能对于高度功能性的治疗性t细胞的 产生是重要的(hasan等(2015)；和
hendriks,j.等，nature immunology 1,433-440(2000))。
[0459]
研发了由高纵横比介孔二氧化硅微棒(msr)上形成的支撑脂质 双层(slb)组成的复合材料(kim,j.等，nature biotechnology 33， 64-72(2015)；和li,w.a.等，biomaterials 83，249-256(2016))。 slb能够在流体脂质双层上以预定的密度呈递t细胞激活信号的组 合，同时msr促进了可溶性信号持续旁分泌释放至附近的t细胞。 因此，复合msr-slb能够在类似天然apc的环境中将表面和可溶性 信号呈递给t细胞。在细胞培养物中，高纵横比微棒沉降并堆叠，形 成3d支架结构。将从用t细胞激活信号功能化的msr-slb形成的 支架称为apc-模拟支架(apc-ms)。两周后，apc-ms促进了原代 小鼠和人t细胞比商业dynabeads高两倍至十倍的多克隆扩增。 apc-ms还促进了功能性小鼠和人细胞毒性t细胞的强烈抗原特异性 扩增。特别地，呈递eb病毒(ebv)相关抗原的apc-ms针对人t 细胞的罕见亚群以抗原特异性方式扩增和富集。总之，apc-ms代表 了灵活且可调的能够以特定的时空模式快速扩增用于act的高功能 性t细胞的平台(huppa和davis(2003)；lee等(2003)；alarc
ó
n 等(2011)；和minguet等(2007))。
[0460]
apc-ms的组装和表征
[0461]
使用针对多克隆和抗原特异性扩增的独特信号(图25b)，针对 t细胞激活制备了apc-ms(图25a)。按照之前实施所述的(kim 等(2015)和li等(2016))合成了具有88μm长，4.5μm直径(纵 横比～20)的平均尺寸和10.9nm孔隙的高纵横比msr(参见图26a)， 并吸附了il-2。
[0462]
制备含有预定量的生物素化脂质的脂质体(140nm)，并涂覆于 负载1l-2的msr上，形成msr-slb(参见图26b)。接着，将用 于tcr激活和共刺激的生物素化信号通过抗生物素蛋白链菌素中间 体连接到msr-slb表面。在细胞培养物中，通过棒的沉降和随机堆 叠自发形成3d支架，形成apc-ms。t细胞渗透支架的空间。总之， 支架在脂质双层的表面上呈递用于tcr激活和共刺激的信号，并随 着时间以旁分泌方式释放可溶性il-2以渗透t细胞，与通过天然apc 将这些信号递呈给t细胞的情况相似(参见huppa和davis(2003))。
[0463]
将msr用磷脂1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)涂 覆，其通常用作用于哺乳动物细胞膜的模型(jerabek，h.r.等，journalof the american chemical society 132，7990-7(2010)；和torres等， lab on a chip 13，90-99(2013))。在低脂质:msr比率下，观察到 脂质介导的msr的聚集(图27a)，而在高脂质:msr比率下，脂质 涂覆的msr以充分分散的单颗粒状态维持(图27b)。在这种较高 脂质:msr比率下，最初34.1
±
0.9％的输入popc与msr结合，并且 随着popc涂覆的msr降解(图28b)，细胞培养条件中的popc 涂层随着时间缓慢流失(图28a)。还用1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸 胆碱(dopc)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)成功地 涂覆了msr。与msr结合的脂质量与脂质的饱和成逆相关，很可能 是由于更多高度饱和的脂质更紧密的填充在脂质双层中。在各种脂质 涂层的稳定性中没有观察到显著差异。为了评价msr脂质涂层是否 是连续的流体slb结构，使用荧光团标记的脂质进行了光漂白后荧 光恢复(frap)的研究。观察到脂质涂覆的msr的光漂白区域的荧 光恢复和整个漂白的棒的荧光的一致性标准化，证明了msr脂质涂 层是连续的流体slb(图39a和39b)。
[0464]
还分析了可溶性信号的加载和释放，以及表面信号的加载。msr 具有非常高的可用于分子有效负载表面吸附的表面积(kim等 (2015))，并且用2μg il-2(0.04mg/ml il-2)
加载500μg msr时， msr保留了50
±
1％的输入il-2。加载的il-2随后在9天中以受控方 式释放。趋势可以使用单相指数函数(r2＝0.98)良好估算，表明il-2 的释放遵循一级动力学(图28e)。
[0465]
还分析了表面信号的连接随着掺入脂质制剂中的生物素化脂质 物质的量而改变。在相应msr-slb制剂上以30％摩尔量的生物素化 脂质基团来添加抗生物素蛋白链菌素，并且作为表面信号代理来添加 生物素化igg。在饱和下，可以加载至各种msr-slb制剂上的生物 素化igg的最大量相差～10倍(图28f)。这种差异与各种msr-slb 制剂中生物素化脂质量的相对差异相一致，表明了可以通过限定涂层 脂质制剂中的粘附性脂质的量来精确地控制表面结合的igg的密度。 在所有随后的实验中，按照所述的，msr-slb用表面信号饱和，并 且通过制剂中的生物素化脂质的mol％来描述相对表面信号密度。
[0466]
为了证实支架表面上激活信号的呈递促进了t细胞相互作用，用 不含表面t细胞信号的msr-slb或完整的apc-ms培养原代t细胞。 然而t细胞大部分无视了不含表面t细胞信号的msr-slb，但它们 与apc-ms强烈地相互作用，将支架结构重组以形成大范围、高密度 的细胞材料簇(图28g和图29)。
[0467]
原代小鼠和人t细胞的多克隆扩增
[0468]
用dynabeads或用apc-ms培养原代小鼠t细胞。使用 apc-ms的培养导致了大的细胞材料簇的形成，并且apc-ms培养物 中的这些簇的大小和频率高于dynabead培养物中(图30a)。使用 apc-ms的培养比使用dynabeads的培养促进了高超过两倍的扩 增(图30b)。有趣地，尽管dynabeads在培养期间促进了适度 的t细胞群体的cd8偏倚的偏斜，但apc-ms促进了高于95％的总 t细胞是cd8 (图30c和图31)。使用apc-ms扩增的效应cd8 t细胞比使用dynabeads扩增的cd8 t细胞在培养期间更快速地 上调细胞毒性介质颗粒酶b并且扩增至更高的程度(图32a)。在 dynabead和apc-ms扩增的t细胞产物中，没有观察到cd4 foxp3 细胞的扩增(图32b)。重要地，尽管观察到了快速扩增速率，但大 部分apc-ms扩增的t细胞对耗尽标志物pd-1保持阴性(图32c)。
[0469]
还评价了apc-ms制剂的原代人t细胞的多克隆扩增。使用 apc-ms培养原代人t细胞还导致大的细胞材料簇的形成，apc-ms 培养物中的这些簇的大小和频率比dynabead培养物中的更高。观察 到了这些簇的稳定性和持久性取决于表面信号密度和最初的材料输 入(图30d)。全部测试的apc-ms制剂培养14天导致扩增比 dynabeads高两倍至十倍(图30e)。有趣地，通过较高表面信号 密度或较高初始材料质量，含有较高量的t细胞刺激的apc-ms制 剂在14天培养后促进了极端cd4偏倚的偏移。相反，含有较低整体 含量的t细胞刺激物的apc-ms制剂相对于其他apc-ms制剂(f4) 促进了更平衡的cd4 和cd8 扩增，与dynabeads相当(图30f)。 在测试的apc-ms制剂中，制剂中的t细胞刺激总量和培养阶段结 束时共表达耗尽标志物pd-1和lag-3的细胞频率之间观察到了正相 关。引入注目地，尽管在两周培养阶段中接近高十倍的扩增，但使用 低t细胞刺激物apc-ms制剂(f4)观察到了低频率的pd-1和lag-3 共表达细胞(《5％)，与dynabeads相似。然而，在第7天，在 dynabeads条件中观察到了高频率的共表达pd-1和lag-3的细 胞(图30g)。在dynabead和apc-ms扩增的t细胞产物之间的共 表达淋巴归巢分子ccr7和cd62l的细胞的频率中没有观察到显著 差异(图33)，这表明了更天然的t细胞表型并且已经显示出对于 体内转移后的功能是重要的(gattinoni,l.等，the journal of clinicalinvestigation 115，1616-1626(2005))。
合起来，这些数据表明apc-ms 能够比dynabeads更快速地多克隆地扩增小鼠和人t细胞。
[0470]
原代小鼠t细胞的抗原特异性扩增
[0471]
为了确定apc-ms是否可适用于抗原特异性扩增，使用从ot-i 小鼠分离的原代小鼠cd8 t细胞，其在h-2k(b)i类mhc的情况中 表达对来自鸡卵白蛋白的siinfekl(seq id no:4)肽特异性的 tcr。用呈递加载无关肽的mhc(pmhc)的apc-ms制剂培养这 些细胞时，观察到了最小的细胞材料相互作用。然而，用呈递 siinfekl(seq id no:4)的apc-ms制剂培养细胞时，观察到了 导致大范围的细胞材料簇形成的强烈相互作用(图34a)。呈递 siinfekl(seq id no:4)的apc-ms制剂促进了ot-i cd8 t细 胞的强烈扩增，即使使用低如0.01mol％的脂质上递呈的表面信号(图 34b)。应答来自b16-f10黑素瘤细胞的siinfekl(seq id no:4) 呈递，扩增的t细胞分泌ifnγ(图34e)，上调了ifnγ和tnfα的 共表达(图34c)并在体外杀灭了靶细胞(图34d)。
[0472]
原代人t细胞的抗原特异性扩增
[0473]
为了确定apc-ms是否可以用于罕见的人t细胞亚群的抗原特 异性富集和扩增，这对于来自肿瘤或血液的罕见癌症特异性t细胞的 选择性扩增是有用的(cohen,c.j.等，the journal of clinicalinvestigation 125,3981-3991(2015)；和streinen,e.等，science 352, 1337-1341(2016))。在i类mhc的hla-a2同种异型的情况中， apc-ms制剂呈递来自不同ebv相关蛋白的两种肽(缩写为clg或 glc)中的一种。从具有之前的ebv暴露的hla-a2匹配的供体的 人血样分离cd8 t细胞，并用单独的可溶性il-2(30u/ml)(模拟) 处理，或用呈递clg或glc肽的apc-ms培养。观察到了两个t 细胞子集强烈的抗原特异性富集和扩增，同时注意到总t细胞的最小 增加(图35a)。用递呈clg的apc-ms培养时，clg-特异性cd8 t细胞的频率从第0天的全部cd8 t细胞的0.04％提高至第14天的 cd8 t细胞的3.3
±
0.9％(图36a和36b)，对应于细胞数量的170
±
70 倍扩增(图36c)。相似地，用递呈glc的apc-ms培养时，glc
‑ꢀ
特异性cd8 t细胞的频率从第0天的全部cd8 t细胞的0.66％提 高至第14天的48
±
9％(图36d和36e)，对应于细胞数量300
±
100 倍扩增(图36f)。通过评价ifnγ分泌(图35b)、ifnγ和tnfα 共表达(图35c，以及图36g、36h和36i)，以及加载肽的靶细胞 的体外杀灭(图36j)，在用t2刺激剂细胞的共培养实验中分析了 各种t细胞产物的功能性。用呈递clg或glc的apc-ms扩增的 cd8 t细胞群体强烈地应答呈递其同源抗原的刺激细胞。值得注意 的是，用t2细胞共培养后，通过四聚体染色检测的clg-和glc-特 异性细胞的频率与共表达ifnγ和tnfα的细胞的频率相似，表明大 部分扩增的t细胞是功能性的。
[0474]
为了确定是否可以从异源细胞群(pbmc)直接扩增抗原特异性 t细胞，避免对t细胞分离的需求，进行了以下实验。用呈递glc 的apc-ms制剂培养来自之前ebv暴露的bla-a2匹配的供体的 pbmc样品。显著地，glc特异性t细胞的频率从第0天的总cd8 t细胞的0.66％提高至第7天的15
±
1％；在模拟处理的样品中发现了 最小改变(图36k)。这对应于glc特异性t细胞的60
±
9倍的扩增 (图36l)。通过与未脉冲的或用clg或glc肽脉冲的t2细胞共 培养来评价扩增的t细胞的功能性。共表达tnfα和ifnγ的细胞的 频率(图36m)以及1fn1分泌(图36n)的定量证明了使用呈递 glc的apc-ms从pbmc扩增的cd8 t细胞群只强烈应答呈递其 同源抗原的t2细胞。合起来，这些数据证明了apc-ms以抗原特异 性方式强烈扩增小鼠和人t细胞的能力。
[0475]
为了确定使用apc-ms相对于dynabeads观察到的提高是否 不仅仅是归因于呈递
的抗cd3抗体和抗cd28抗体量的差异，将 dynabeadas中的抗cd3和抗cd28抗体的量标准化以对应于 apc-ms中的这些抗体的浓度。如图40b、40c和40d中所示，匹配 apc-ms和dynabeads中存在的抗cd3和抗cd28量，apc-ms 促进了更快速的原代小鼠t细胞的扩增(图40b)，同时维持相当的 耗尽标志物pd-1和lag-3的共表达水平(图40c)。此外，通过调 整apc-ms制剂，可以调整cd4:cd8比率(图40d)。
[0476]
观察到在大约一周的过程中，il-2以持续方式从apc-ms释放。 为了评价il-2剂量以及从apc-ms持续释放的作用，用呈递相同量 的抗cd3和抗cd28抗体的dynabeads或apc-ms培养原代小鼠 t细胞7天。对于apc-ms条件，将il-2加载于apc-ms上并允许 随着时间释放(m-d)，或在第0天将相同剂量的il-2作为可溶性大 丸剂加入培养基中(m-d/bil-2)。对于dynabead条件，在培养 基中补充了制造商推荐剂量的il-2并且在每次培养基更换时重新补 充(d-b)，或在d0以加载至apc-ms中的相同剂量作为可溶性大 丸剂加入培养基中(d-b/bil-2)。如图41a中所示的，将il-2加载 至apc-ms中并允许随着时间释放时，apc-ms促进了比将相同剂量 的il-2作为可溶性弹丸加入培养基中时更高的原代小鼠t细胞扩增， 证明了在这种情况中呈递il-2的益处。在呈递的抗cd3、抗cd28 和il-2的含量匹配时(m-d/bil-2vs d-b/eil-2)，apc-ms促进了 比dynabeads更高的原代小鼠t细胞的扩增，证明了在apc-ms 的情况中呈递这些信号的益处。如图41b中所示的，在呈递的抗cd3、 抗cd28和il-2的量匹配时，使用apc-ms扩增的t细胞显示出比 使用dynabeas扩增更低的耗尽标志物pd-1和lag-3的共表达 (m-d/bil-2vs d-b/bil-2)。
[0477]
以上的实验证明了apc-ms是可以在流体脂质双层表面上局部 呈递tcr刺激物和共刺激信号并且促进可溶性细胞因子持续的旁分 泌递送至附近t细胞的多功能性材料。呈递acd3或pmhc、acd28 和il-2的三元制剂促进了原代小鼠和人t细胞的快速多克隆和抗原 特异性扩增，包括显著快于商业dynabeads的多克隆扩增。重要 地，尽管在这个实施例中使用apc-ms观察到了提高的扩增速率，扩 增的t细胞保留了功能性表型，证明了扩增速率根本上不是与功能逆 相关。t细胞大部分无视了apc-ms，除非它们配制以呈递相关tcr 信号，这允许即使是复杂细胞混合物如pbmc中的罕见t细胞亚群 的特异性扩增。
[0478]
这些研究的结果支持以与天然呈递这些信号相当的方式将表面 和可溶性信号呈递给t细胞的重要性。之前关于合成aapc的工作已 经证明了以旁分泌方式将细胞因子(如，il-2)递送给t细胞可以加 强细胞因子的作用(steenblock和fahmy(2008)；和fadel等(2014))。 当前系统主要聚焦于通过刺激的静态高密度呈递以促进tcr成簇而 增强t细胞激活(zappasodi等人(2008)；fadel等人(2014)；和fadel 等人(2008))。然而，tcr的成簇只是涉及许多细胞表面分子随着时间 的重组织化的动态过程中的一个步骤，其不仅用于增强t细胞激活， 而且限制tcr信号传导的持续时间，以防止t细胞过度刺激(huppa 和davis(2003)；lee等(2003)；alarc
ó
n等(2011))。当跨过 流体脂质双层呈递t细胞信号时，模拟这些信号怎样天然地在apc 质膜的表面上遇到，观察到相对较低的表面信号密度以促进更快速的 扩增速率并产生具有更高功能性和较低耗尽表型的t细胞。
[0479]
使用非常高纵横比的颗粒来形成apc-ms，这与大部分之前描述 的合成aapc材料(steenblock和fahmy(2008)；fadel等(2014)； sunshine等(2014)；fadel等(2008)；meyer等(2015)和steenblock (2011))形成对比。这些颗粒自发沉降并堆叠以形成高表面积3d 结构，其渗透重塑的t细胞形成密集的细胞材料簇，形成其中t细 胞接近该材料的微环境。
这很可能允许更有效的il-2的旁分泌递送， 和提高的t细胞-t细胞旁分泌信号传导(long,m.&adler,a.j.thejournal of immunology 177,4257-4261(2006))。相对于dynabead 培养物，棒的相对大的尺寸和高纵横比很可能有助于apc-ms中观察 到的较大簇的形成，因为与较小的球形dynabeads相比，更多的 t细胞与每个棒相互作用。这些簇在apc-ms培养物中的持久性取决 于培养物中的表面信号密度和材料量，这很可能造成各种apc-ms条 件中观察到的不同表型。
[0480]
在多克隆小鼠t细胞扩增研究中，apc-ms促进了t细胞群体极 端的cd8偏倚的偏斜。这与之前的观察相一致：il-2的旁分泌递送 增强了小鼠cd8 t细胞的增殖，但促进了小鼠cd4 t细胞中激活 诱导的细胞死亡(steenblock等(2011))。然而，在多克隆人t细 胞扩增研究中，偏斜取决于apc-ms呈递的t细胞刺激物的总量， 使用含有较高t细胞刺激物量的条件促进极端cd4偏倚的偏移。这 种差异可以表明小鼠和人t细胞怎样应答这些信号中的根本差异。更 好地理解这种行为能够使材料制剂将混合的t细胞群体偏向特定的 cd4:cd8比率，这是最近已经表明对于过继性转移的t细胞的功能 重要的性质(turtle,c.j.等，the journal of clinical investigation 126 (2016))。
[0481]
离体快速产生治疗相关数量的功能性t细胞的需求是个性化t细 胞治疗中的重要挑战，并且这个研究的结果表明apc-ms提供了满足 这个需求的显著进展(turtle,c.j.&riddell,s.r.cancer journal (sudbury,mass.)16,374(2010)；和eggermont,l.j.等，trends inbiotechnology 32，456-465(2014))。观察到使用三元apc-ms制 剂的单次刺激促进了明显比商业dynabeads更快的t细胞扩增， 并且证明了可以操纵材料的参数来提高细胞产物的表型，而没有损害 快速扩增速率。因为apc-ms是模块化平台技术，所述系统的组成部 分可以改变或变化以改变其中信号被呈递的空间和时间环境。例如， 改变msr性质可以允许调节支架微环境或降解动力学。改变脂质制 剂可以使得能够调节slb稳定性、流动性或表面信号分区，或信号 通过不同化学作用的连接(torres等(2013)；puu,g.&gustafson,i. biochimica et biophysica acta(bba)-biomembranes 1327,149-161 (1997)；anderson,n.a.等journal of the american chemical society 129,2094-2100(2007)；collins,m.d.&keller,s.l.proceedings of thenational academy of sciences 105,124-128(2008)；reich,c.等， biophysical journal 95,657-668(2008)；longo,g.s.et al.biophysicaljournal 96,3977-3986(2009)；kwong,b.等，biomaterials 32, 5134-5147(2011)；koo,h.等，angewandte chemie international edition 51,11836-11840(2012)；和desai,r.m.等，biomaterials 50,30-37 (2015))。本文中所述的apc-ms还可以改变以呈递较大的表面和 可溶性信号集，这可以使得能够产生进一步优化的t细胞用于acts (hasan等(2015)；和hendriks等(2000))。
[0482]
方法
[0483]
细胞和试剂
[0484]
b16-f10小鼠黑素瘤细胞系获自atcc，并且证实了对于支原体 是阴性的。将b16-f10细胞在补充了10％热灭活的胎牛血清(fbs) (hi-fbs)和1％青霉素-链霉素的dulbecco’s改良的eagle’s培养基 (dmem)中培养。将b3z鼠t细胞杂交瘤细胞在补充了10％ hi-fbs、2mm l-谷氨酰胺、1mm丙酮酸钠、50μmβ-巯基乙醇和 1％青霉素-链霉素的rpmi 1640中培养。将t2(174
×
cem.t2)人淋 巴母细胞在补充了10％hi-fbs、2mm l-谷氨酰胺、
ms培养过夜，在4％多聚甲醛中固定， 并且随后在2000rpm下离心5分钟。将固定的样品通过水中0、30、 50、75、90、100％乙醇梯度按序转移。将样品浸没在六甲基二硅氮 烷(electron microscopy sciences)中并且在台式干燥器中保持过夜。 使用碳胶带将干燥的盖玻片安装在sem杆上，溅涂5nm铂-钯，并 且使用carl zeiss supra 55vp场发射扫描电子显微镜上的二次电子检 测来成像。
[0498]
体外t细胞扩增研究
[0499]
使用原代cd3 t细胞进行了多克隆小鼠和人t细胞扩增实验。 使用从ot-i小鼠分离的cd8 t细胞进行了抗原特异性小鼠t细胞 扩增实验。使用从去识别的供体血样分离的cd8 t细胞或pbmc进 行了抗原特异性人t细胞扩增实验。将分离的原代小鼠或人t细胞或 人pbmc与激活刺激物混合，并培养长达两周。在所有实验中，使用 了非组织培养物处理的培养容器。对于人抗原特异性t细胞扩增研 究，在建立培养物之前，通过facs分析供体样品的hla-a2 mew i 表达，并且通过血清的抗ebv vca elisa(1bl international)分析 之前的ebv暴露。仅将hla-a2 经历ebv的样品用于扩增研究。
[0500]
将人抗原特异性t细胞扩增实验中的模拟处理的样品在补充了 30u/ml重组il-2的培养基中培养。将所有其他t细胞扩增实验中的 模拟处理的样品在未补充的培养基中培养。对于商业dynabead条件， 根据试剂盒中包括的制造商优化的实验方案来使用dynabeads。 简而言之，在补充了30u/ml重组il-2的培养基中，以珠与细胞1:1 的比例使用预洗涤的dynabeads，以1
×
106t细胞/ml的密度接种 t细胞。对于dynabead培养物，将1
×
105细胞接种于起始培养物中。 每三天将细胞计数并且加入新鲜的补充il-2的培养基以使细胞悬浮 液达到0.5-1
×
106细胞/ml的密度。通常，在整个培养期间，将细胞维 持在低于2.5
×
106细胞/ml的密度。
[0501]
对于小鼠多克隆研究，以1:1摩尔比，在0.2-1mol％脂质上制备 了呈递表面信号(αcd3 αcd28)的apc-ms，并以333μg/ml加入 起始培养物中。对于人多克隆研究，以1:1摩尔比在0.1mol％或1 mol％脂质上制备了呈递表面信号(αcd3 αcd28)的apc-ms，并 以33μg/ml或333μg/ml加入起始培养物中。对于小鼠抗原特异性研 究，以1:1摩尔比在0.01mol％或0.1mol％脂质上制备了呈递表面信 号(svydffvwl(seq id no:3)/h-2k(b)或siinfekl(seq id no: 4)/h-2k(b) αcd28)的apc-ms，并以33μg/ml或333μg/ml加入 起始培养物中。对于人抗原特异性研究，以1:1摩尔比在1mol％脂质 上制备了呈递表面信号(clgglltmv(seq id no:1)/hla-a2或glctlvaml(seq id no:2)/hla-a2 αcd28)的apc-ms，并 以333μg/ml加入起始培养物中。以333μg/ml添加的在1mol％脂质 上呈递信号的apc-ms对应于起始培养物中～55nm tcr刺激物和 αcd28。对于apc ms条件，在没有补充il-2的培养基中将5
×
104细 胞/ml的t细胞接种特定含量的材料。在所有apc-ms条件中，将 2.5
×
104细胞接种于起始培养物中。在整个培养期间添加培养基以将 细胞维持在低于2.5
×
106细胞/ml的密度。在第7天开始，大部分材料 加载的il-2已经释放时，添加补充了30u/ml重组il-2的新鲜培养 基。在特定的时间点，使用台盼蓝排除使用血球计手动计数活细胞， 以避免作为材料污染结果的自动化计数系统可能的假象。计数后，使 用流式细胞术评价细胞表型。基于荧光减一(fmo)对照，对每个时 间点和样品集独立地设定门控。
[0502]
体外t细胞功能研究
[0503]
对于其中通过胞内细胞因子染色评价ifnγ和tnfα的t细胞表 达的共培养实验，
首先对刺激细胞(小鼠，b16-f10；人，t2)不脉 冲或用1μg/ml肽(小鼠，siinfekl(seq id no:4)；人， clgglltmv(seq id no:1)或glctlvaml(seq id no:2)) 在37℃下脉冲30分钟。随后，在添加布雷菲德菌素a(bd biosciences) 来抑制细胞因子分泌前，用2
×
104刺激细胞培养1
×
105扩增的细胞一 小时，并且随后再培养四小时。随后将细胞染色，并使用facs进行 分析。
[0504]
首先在20μg/ml钙黄绿素am(biotium)中在37℃下孵育靶细 胞(小鼠，b16-f10；人，t2)30分钟来进行体外杀灭分析。随后对 靶细胞不脉冲或用1μg/ml肽(小鼠，siinfekl(seq id no:4)； 人，clgglltmv(seq id no:1)或glctlvaml(seq id no:2)) 在37℃下脉冲30分钟。随后以0、1、10、25或50的效应细胞:靶细 胞(e:t)比例用扩增的效应细胞培养5
×
103靶细胞四小时。随后将细 胞沉淀，并且使用平板阅读器定量上清液样品的荧光强度。还通过elisa(biolegend)定量上清液样品中的ifnγ浓度。
[0505]
统计学分析
[0506]
作为平均
±
s.d.表示所有值，除非另外指出。使用graphpad prism 进行了统计学分析，并且统计方法在文字中有记载。在所有情况中， 认为p《0.05是显著性的。
[0507]
实施例12：体外apc-ms降解的分析
[0508]
为了研究示例性apc-ms的体外降解，进行了以下的实验。用原 代小鼠t细胞(25e
4 t细胞/167μg msr)培养包括αcd3/αcd28抗 体(1％生物素化脂质)并释放il-2的apc-ms(167μg)。在各个不 同的时间点，将培养物以700rcf离心5min，并且通过电感耦合等离 子体光发射光谱法(icp-oes；galbraith laboratories)定量沉淀物中 的二氧化硅(si)含量。如图37中所示，在约1周后，培养沉淀物 中的二氧化硅是不可检测的。
[0509]
实施例13：多样的可溶性免疫指导有效负载从apc-ms的受控 释放
[0510]
为了研究细胞因子有效负载从示例性apc-ms的释放，进行了以 下实验。在脂质涂覆前，将各自包括il-2、il-21、tgfβ或il-15sa 的四个apc-ms加载至500μg介孔二氧化硅微棒(msr)中。将样 品彻底洗涤以除去任何未加载的蛋白质，并随后在37℃下维持长达 28天。使用elisa评价了随着时间的有效负载释放。如图38中所示， 在实验过程中观察到细胞因子从apc-ms的受控释放。释放动力学很 可能取决于特定细胞因子的物理化学性质。
[0511]
实施例14：抗体通过点击化学反应与msr-slb缀合
[0512]
为了确定功能性分子是否可以与msr-slb脂质双层缀合，进行 了以下实验。使用thermo siteclick抗体标记系统，用叠氮化物基团 位点特异性地标记igg。还制备了含有不同量(mol％)的dbco修 饰的脂质(avanti polar lipids)的msr-slb。如图42a和42b中所 示，叠氮化物修饰的igg以浓度依赖性方式成功地缀合至msr-slb 的脂质双层上。
[0513]
等同
[0514]
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规的实验确定本文中 所述的特定实施方式和方法的许多等同方式。打算通过以下权利要求 的范围来包括这样的等同方式。