改进的T细胞制备方法与流程

改进的t细胞制备方法
技术领域
1.本发明涉及用于制备t细胞的改进方法和由此产生的改进的t细胞组合物。本发明还涉及用于制备t细胞的方法，该方法提供改进的t细胞扩增，并且导致t细胞群体具有改善的持久性、记忆功能和抗原刺激的存活。本发明还涉及改进的t细胞群体在过继性(adoptive)t细胞免疫疗法中的用途，包括用于治疗肿瘤和癌症的过继性疗法。


背景技术：

2.过继性细胞疗法(adoptive cell therapy，act)可以包括将肿瘤驻留的外周血修饰的免疫细胞静脉转移至癌症患者中，以介导抗肿瘤功能，从而为治疗包括癌症、传染病、自身免疫病、炎症性疾病和免疫缺陷的疾病提供机会。act还可以包括转移肿瘤浸润性淋巴细胞(tumour-infiltrating lymphocyte，til)或自然杀伤细胞(natural killer cell，nk细胞)作为癌症的细胞疗法的基础。此外，使用表达新型t细胞受体(t cell receptor，tcr)或嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)的基因修饰的t细胞的act提供了给予可以产生的大量的肿瘤特异性t细胞的机会，该肿瘤特异性t细胞具有特异性和强效的抗肿瘤活性，用于识别特异性肿瘤表达的抗原的改善的和靶向的临床反应。
3.act过程通常涉及供体受试者白细胞去除术(leukapheresis)的步骤，其中，供体的血液通过从血液样本中分离出白细胞的装置。然后，对分离的t细胞群体进行包括活化和扩增步骤的过程，以及任选的基因修饰以引入特定的car或tcr分子，以产生所需的活性t细胞数量，从而使治疗剂量是临床有效的。
4.当前的t细胞制备过程通常需要多轮活化和扩增以取得足够大的t细胞群体用于治疗剂量。群体的扩增为限制性步骤，并且t细胞活化和扩增方法经常导致高的细胞群体在分化程度更高的细胞亚群(subset)中；这些细胞就其性质而言，其存活时间较短，因此提供了短暂且较低效力的抗肿瘤活性和记忆功能。此类t细胞群体倾向于耗尽并丧失效应子免疫细胞功能，并且不利于转移的t细胞的体内扩增，且在输注至患者后缺乏持久性。
5.本发明解决了当前的t细胞制备过程和治疗性t细胞的上述限制，并且提供了改善的扩增、持久性和存活的治疗性t细胞组合物的方法。


技术实现要素：

6.本发明总体上提供了产生t细胞和/或t细胞的群体的改进方法，从而提供了通过所述方法制备的改进的t细胞的群体和/或t细胞的组合物，本发明还提供了改进的t细胞的群体和/或t细胞的组合物在用于治疗疾病的过继性疗法中的用途，所述疾病包括癌症、传染病、自身免疫病、炎症性疾病和免疫缺陷。根据本发明的方法提供了在体外(in-vitro)和/或体内(in-vivo)改进的t细胞扩增、存活持续性、效应子和记忆功能。
7.根据本发明，提供了一种制备修饰的t细胞和/或修饰的t细胞的群体的方法，包括以下步骤：
8.(a)活化分离的t细胞的群体，
9.(b)培养t细胞，
10.(c)修饰t细胞以表达异源性t细胞受体(heterologous t cell receptor，tcr)或嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)，
11.(d)将akt的抑制剂(akt抑制剂)添加至所述修饰的t细胞中，
12.(e)培养所述修饰的t细胞或t细胞群体以扩增和/或增殖所述细胞，
13.(f)任选地，收获和/或低温保存所述修饰的t细胞或t细胞群体；任选地其中，异源性tcr或car结合或特异性结合至癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原；任选地其中，修饰t细胞以表达异源性t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)，例如通过用包含编码一种或多种异源性t细胞受体(tcr)和/或一种或多种嵌合抗原受体(car)的核酸的核酸或载体转导t细胞。
14.t细胞过继性疗法
15.分离的t细胞或t细胞的群体可以是t细胞、肿瘤浸润性细胞毒性t淋巴细胞(til)或自然杀伤细胞(nk细胞)。t细胞可以是自然杀伤t(nkt)细胞或其前体，包括胚胎干细胞和多能干细胞(例如，可以从它们中分化出淋巴细胞的那些)。t细胞可以是在胸腺中成熟的淋巴细胞，并且该淋巴细胞主要负责细胞介导的免疫，也参与适应性免疫系统(adaptive immune system)。根据本发明，t细胞可以包括但不限于辅助性t细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞(包括中央记忆型t细胞、干细胞样记忆t细胞(stem-cell-like memory t cell或stem-like memory t cell)或记忆t细胞：例如tem细胞和temra细胞)、调节性t细胞(也称为抑制性t细胞)、自然杀伤t细胞、黏膜相关恒定t细胞或γ-δt细胞。细胞毒性t细胞(ctl或杀伤t细胞)是t淋巴细胞的亚群，其能够诱导感染的体细胞或肿瘤细胞的死亡。本文中根据本发明提供的t细胞可以是cd8

t细胞或cd4

t细胞；或cd4

t细胞和cd8

t细胞。例如，t细胞可以是cd4

t细胞和cd8

t细胞的混合群体。cd4

t细胞被称为t辅助性细胞(th细胞)，其表达cd4表面糖蛋白，并且在适应性免疫系统中发挥重要作用，通过释放t细胞细胞因子有助于其它免疫细胞的活性，并且有助于抑制或调节免疫应答。它们对于细胞毒性t细胞的活化和生长是必需的。cd8

t细胞被称为细胞毒性t细胞(tc细胞、ctl、杀伤t细胞)并表达cd8表面糖蛋白。cd8

t细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞。大部分cd8

t细胞表达可以识别由i类mhc分子在感染的或损坏的细胞的表面显示的特异性抗原的tcr。tcr和任选的cd8糖蛋白与抗原和mhc分子的特异性结合导致感染的或损坏的细胞的t细胞介导的破坏。
16.可以从供体受试者中分离出t细胞的分离的群体。根据本发明，通过本发明的方法产生的t细胞可以用于过继性细胞疗法或过继性免疫疗法。供体受试者和接受者个体(接受过继性细胞疗法或过继性免疫疗法)可以相同(即自体治疗；从随后用修饰的t细胞治疗的个体获得t细胞)，或者供体个体和接受者个体可以不同(即异体(allogeneic)治疗；t细胞从一个个体获得并且随后用于治疗不同的个体)。自体的是指来源于受试者的然后将其重新引入相同受试者的任何材料。
17.因此，本发明的上下文中的过继性细胞疗法或过继性免疫疗法是指过继性转移分离的t细胞或t细胞的群体，其通过基因转移而工程化以表达基因修饰的tcr或car和/或共受体(co-receptor)(例如cd8)，其特异性针对靶细胞上表达的表面抗原、多种抗原肽或一种抗原肽，任选地在其上作为mhc复合物表达。这可以用于治疗取决于选择的靶点的一系列疾病，例如，肿瘤或癌症特异性抗原或抗原肽，从而治疗癌症或肿瘤。简而言之，过继性细胞
疗法涉及使用称为白细胞去除术的过程去除一部分供体的或患者的白细胞。然后，可以扩增t细胞、til或nk细胞并将其与包含tcr/car多核苷酸和/或共受体(例如cd8)的表达载体混合，从而将tcr/car和/或共受体(例如cd8)转移至t细胞、til或nk细胞。将t细胞、til或nk细胞再次扩增，在扩增结束时，工程化的t细胞或nk细胞可以被洗涤、浓缩，然后冷冻，以留出时间进行测试、运输和储存，直到患者准备好接受工程细胞的输注。
18.细胞培养
19.可以使用任何方便的工具、技术、器皿、容器或系统培养修饰的t细胞以产生扩增的群体。合适的培养系统包括搅拌釜式发酵罐、气升式发酵罐、滚瓶、培养袋或培养皿，以及其它生物反应器，特别是中空纤维生物反应器。优选地，此类系统的使用在本领域中是众所周知的。优选地，培养工具为透气的快速扩增培养，例如g-rex
tm
，一种用于扩增或静态扩增细胞(如非贴壁细胞(non-adherent cell))的装置。和或根据本发明的方法的细胞。
20.细胞修饰
21.根据本发明，t细胞被修饰以表达一种或多种异源性t细胞受体(tcr)和/或一种或多种嵌合抗原受体(car)，修饰可以通过用包含编码一种或多种异源性t细胞受体(tcr)和/或一种或多种嵌合抗原受体(car)的核酸的核酸或载体转导t细胞来实施。t细胞也可以通过将编码一种或多种异源性t细胞受体(tcr)和/或一种或多种嵌合抗原受体(car)的核酸掺入至t细胞的基因组中来修饰，例如，掺入至t细胞的先祖的基因组中，例如，诱导的多能干细胞或来源于其的淋巴系细胞，例如来源于其的成熟t细胞。
22.根据本发明，修饰的t细胞可以被修饰以包含编码异源性t细胞受体(tcr)或异源性嵌合抗原受体(car)的异源性核酸或核酸构建体或包含该核酸或构建体的载体。任选地，tcr可以是亲和力增强的tcr，例如特异性肽增强的亲和力受体(specific peptide enhanced affinity receptor，spear)tcr。
23.根据本发明，所述方法可以包括在该过程的任何阶段或步骤中包括泊洛沙姆(poloxamer)，优选在t细胞或t细胞群体的修饰或转导中，优选地以有助于修饰和/或转导，任选地在相对于细胞浓度高达或约为病毒感染复数(multiplicity of infection，moi)的一半的水平(即每个细胞0.5个病毒)，任选地，介于0.1-0.2、0.3-0.4、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-1.0、1.0-1.1、1.1-1.2、1.2-1.3、1.3-1.4、1.4-1.5、1.5-1.6、1.6-1.7、1.7-1.8、1.8-1.9、1.9-2.0.moi之间的任何一个moi。
24.异源性tcr/car
25.根据本发明，修饰的t细胞可以表达至少一种异源性t细胞受体(tcr)和/或异源性嵌合抗原受体(car)，其结合或特异性结合至癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原，优选地其中，肽抗原与癌性病症、癌症和/或肿瘤相关和/或由癌细胞或组织的肿瘤呈递，任选地由hla/mhc呈递。在结合至抗原后，修饰的t细胞或t细胞的群体可以对携带抗原的细胞表现出t细胞效应子功能和/或细胞溶解作用和/或经受增殖和/或细胞分裂。在某些实施方案中，与包含靶向相同癌症和/或肿瘤抗原和/或肽(抗原肽)的嵌合抗原受体(car)的细胞相比，包含tcr的修饰的t细胞或t细胞的群体表现出类似的或更好的治疗效力。包含异源性tcr或car的活化的修饰的t细胞或t细胞的群体可以分泌抗肿瘤细胞因子，其可以包括但不限于tnfα、ifnγ和il2。
26.术语“异源性(heterologous)”或“外源性(exogenous)”是指，对于特定的生物系
统(如细胞或宿主细胞)是外来的且并非天然存在于该系统中的并且可以通过人工或重组方式引入该系统的多肽或核酸。因此，异源性tcr或car的表达可以由此改变t细胞的免疫原性特异性(immunogenic specificity)，使得它们识别或显示对存在于患有癌症的个体的癌细胞表面上的一种或多种癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原的改善识别。可以在体外和/或离体实施t细胞的修饰及其随后的扩增。
27.根据本发明，癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原可以是癌症-睾丸抗原、ny-eso-1、mart-1(由t细胞识别的黑色素瘤抗原)、wt1(wilms肿瘤1)、gp100(糖蛋白100)、酪氨酸酶、prame(黑色素瘤中优先表达的抗原)、p53、hpv-e6/hpv-e7(人乳头瘤病毒)、hbv、trail、dr4、甲状腺球蛋白、tgfbii移码抗原、lage-1a、kras、cmv(巨细胞病毒)、cea(癌胚抗原)、afp(甲胎蛋白)、mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a6、mage-a8和mage-a9、mage-a10或mage-a12，或其肽抗原。优选地，肿瘤抗原为mage-a4或afp或其肽抗原。优选地，癌症和/或肿瘤抗原肽为mage-a4的肽抗原和/或包含氨基酸序列gvydgrehtv(seq id no:1)(mage-a4)或者为甲胎蛋白(afp)的肽抗原和/或包含序列fmnkfiyei(seq id no:2)或来源于甲胎蛋白(afp)的残基158-166(seq id no:3)。
28.根据本发明，异源性tcr或car结合或特异性结合至与肿瘤或癌性病症相关的和/或由肿瘤或癌细胞或组织呈递的癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原，和/或结合或特异性结合至患有疾病病症或癌性病症的受试者、患者或癌症患者的肿瘤细胞和/或组织和/或癌细胞和/或组织。随后，可以用根据本发明的修饰的t细胞或其群体来治疗受试者、患者或癌症患者。根据本发明用修饰的t细胞治疗的合适的癌症患者可以通过一种方法来鉴定，所述方法包括：从患有肿瘤和/或癌症的个体或受试者获得肿瘤和/或癌细胞的样本；并且将癌细胞鉴定为结合至表达的异源性tcr或car。
29.特异性描述了异源性tcr或car与特定靶癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原之间的结合强度，并且特异性可以由解离常数(dissociation constant)kd来描述，kd为受体-配体系统的结合状态与未结合状态之间的比率。此外，异源性tcr或car能够结合的不同的癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原越少，其结合特异性就越大。根据本发明，异源性tcr或car可以结合少于10、9、8、7、6、5、4、3、2种不同的癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原。根据本发明，异源性tcr或car可以以0.01μm至100μm、0.01μm至50μm、0.01μm至20μm、0.05μm至20μm，或0.01μμ、0.02μμ、0.03μμ、0.04μμ、0.05μμ、0.06μμ、0.07μμ、0.08μμ、0.09μμ、0.1μμ、0.15μμ、0.2μμ、0.25μμ、0.3μμ、0.35μμ、0.4μμ、0.45μμ、0.5μμ、0.55μμ、0.6μμ、0.65μμ、0.7μμ、0.75μμ、0.8μμ、0.85μμ、0.9μμ、0.95μμ、1.0μμ、1.5μμ、2.0μμ、2.5μμ、3.0μμ、3.5μμ、4.0μμ、4.5μμ、5.0μμ、5.5μμ、6.0μμ、6.5μμ、7.0μμ、7.5μμ、8.0μμ、8.5μμ、9.0μμ、9.5μμ、10.0μμ的解离常数结合；或者以10μm至1000μm、10μm至500μm、50μm至500μm，或10μμ、20μμ、30μμ、40μμ、50μμ、60μμ、70μμ、80μμ、90μμ、100μμ、150μμ、200μμ、250μμ、300μμ、350μμ、400μμ、450μμ、500μμ的解离常数结合；任选地，任选地在25℃，任选地于6.5至6.9或7.0至7.5的ph，用表面等离子共振(surface plasmon resonance)测量。可以通过实验测量解离速率常数k
off
和结合速率常数k
on
来确定解离常数kd或k
off
/k
on
。可以使用tcr的可溶形式来测量tcr解离常数，其中，tcr包含tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域。
30.因此，根据本发明使用的异源性tcr或car能够有效和/或以高亲和力结合至癌症
和/或肿瘤抗原或mage-a4或afp的肽抗原，优选为包含gvydgrehtv(seq id no:1)(mage-a4肽)或fmnkfiyei(seq id no:2)(afp肽)的肽，任选地与肽呈递分子(例如hla)复合，例如与hla-a*02复合，hla-a*02任选地选自hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:04、hla-a*02:05、hla-a*02:06、hla-a*02:642或hla-a*02:07，优选hla-a*02:01或hla-a*02:642，可替代地，不与肽呈递分子(例如hla)复合呈递，例如，具有0.01μm至100μm的解离常数，如50μμ、100μμ、200μμ、500μμ，优选0.05μm至20.0μm。例如，异源性tcr或car可以具有结合至内源地表达的肿瘤细胞表面的癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原的性质，任选地其中，该结合不依赖于细胞表面抗原作为具有肽呈递或抗原呈递分子的复合物的呈递，例如，主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，mhc)或人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，hla)或主要组织相容性复合物类相关蛋白(mr)1。
31.根据本发明，任选地与密切相关的癌症和/或肿瘤抗原或肽抗原序列相比，tcr或car结合可以特异性针对一种癌症和/或肿瘤抗原，例如mage蛋白(如mage-a4或afp)，或其肽抗原。密切相关的癌症和/或肿瘤抗原或肽抗原序列可以具有相似或相同的长度和/或可以具有相似数量或相同数量的氨基酸残基。密切相关的肽抗原序列可以共有50％或60％或70％或80％至90％的同一性，优选80％至90％的同一性，和/或可以相差1、2、3或4个氨基酸残基。密切相关的肽序列可以来源于包含序列gvydgrehtv(seq id no：1)或fmnkfiyei(seq id no：2)的多肽序列的序列。可以通过平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)或放射免疫测定法(radioimmunoassay，ria))或动力学(例如，biacore
tm
分析)来确定结合亲和力。亲合力是两个分子在多个位点彼此结合的强度的总和，例如考虑到相互作用的化合价。根据本发明，与缺乏异源性tcr或car或具有可替代的异源性tcr或car的t细胞相比，免疫应答细胞可以表现出，对癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原，或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的并被异源性tcr或car识别的癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原的改善的亲和力(affinity)和/或亲合力(avidity)。
32.根据本发明，如上文所述，异源性tcr或car可以选择性地结合至癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原，其任选地与癌性病症相关和/或由癌细胞或组织的肿瘤呈递；任选地其中，癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原被异源性tcr或car识别，任选地与肽呈递分子(例如hla)复合，可替代地，不与肽呈递分子或hla复合呈递，优选由肿瘤细胞或癌细胞或组织表达。选择性结合表示异源性tcr或car以比另一种癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原更高的亲和力结合至一种癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原。选择性结合由用于具有异源性tcr或car的复合物中一种配体抗原置换另一种配体抗原的平衡常数表示。
33.根据本发明，异源性tcr或car结合对于本文所描述的癌症和/或肿瘤抗原或肽抗原是选择性和/或特异性的。根据本发明，异源性tcr或car可以结合和/或特异性结合和/或选择性结合至肽呈递分子，例如呈递或显示癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原的hla，即癌症和/或肿瘤抗原的肽片段(phla)。其中，hla对应于mhc i类(a、b和c)，它们都是hla 1类或其特定的等位基因，或者hla对应于mhc ii类(dp、dm、do、dq和dr)或其特定的等位基因，优选地，hla为1类，优选地，等位基因为hla-a2或hla-a*02或hla-a2 或hla-a*02阳性hla，任选地选自hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:04、hla-a*02:05、hla-a*02:06、hla-a*02:642或hla-a*02:07，优选hla-a*02:01或hla-a*02:642。可替代地，异源性tcr或car可以结合和/或特异性结合和/或选择性结合癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原，其不由
肽呈递分子(例如hla)呈递或显示。
34.异源性tcr
35.优选地，异源性tcr或car不是由免疫应答细胞天然表达的(即tcr或car为外源性的或异源性的)。异源性tcr可以包括αβtcr异质二聚体(heterodimer)。异源性tcr或car可以是重组的或合成的或人工的tcr或car，即自然界中不存在的tcr。例如，异源性tcr可以被工程化以增加其对特定癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原的亲和力或亲合力(即亲和力增强的tcr或特异性肽增强的亲和力受体(spear)tcr)。亲和力增强的tcr或(spear)tcr可以包含相对于天然存在的tcr的一个或多个突变，例如，tcr的α和β链可变区的高变互补决定区(cdr)中的一个或多个突变。这些突变可以增加tcr对mhc的亲和力，该mhc任选地在由肿瘤和/或癌细胞表达时显示肿瘤抗原的肽片段。产生亲和力增强或成熟的tcr的合适方法包括使用噬菌体或酵母显示来筛选tcr突变体的库，并且这是本领域众所周知的(例如参见robbins et al j immunol(2008)180(9):6116；san miguel et al(2015)cancer cell 28(3)281-283；schmitt et al(2013)blood 122 348-256；jiang et al(2015)cancer discovery 5 901)。优选的亲和力增强的tcr可以结合至表达mage家族的肿瘤抗原的肿瘤或癌细胞，例如mage-a4或其肽抗原，例如，序列gvydgrehtv(seq id no:1)或甲胎蛋白(afp)的肽抗原，和/或包含序列fmnkfiyei(seq id no:2)或来源于甲胎蛋白(afp)的残基158-166(seq id no:3)。
36.根据本发明，异源性tcr可以是mage-a4 tcr，其可以包含seq id no：4的α链参考氨基酸序列或其变体以及seq id no：6的β链参考氨基酸序列或其变体。
37.根据可替代的实施方案，异源性tcr可以是afp tcr，其可以包含seq id no：16的α链参考氨基酸序列或其变体以及seq id no：18的β链参考氨基酸序列或其变体。
38.变体可以具有与参考氨基酸序列具有至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
39.tcr可以由seq id no：5的α链参考核苷酸序列或其变体以及seq id no：7的β链参考核苷酸序列或其变体编码。
40.根据可替代的实施方案，tcr可以由seq id no：17的α链参考核苷酸序列或其变体以及seq id no：19的β链参考核苷酸序列或其变体编码。
41.变体可以具有与参考核苷酸序列具有至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的核苷酸序列。
42.根据本发明，tcr(mage-a4 tcr)可以包含tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域，其中：
43.(i)该α链可变结构域包含具有序列vspfsn(αcdr1)、seq id no:10或seq id no:4的第48-53位氨基酸；ltfsen(αcdr2)、seq id no:11或seq id no:4的第71-76位氨基酸以及cvvsggtdswgklqf(αcdr3)、seq id no:12或seq id no:4的第111-125位氨基酸的cdr，以及
44.(ii)该β链可变结构域包含具有序列kghdr(βcdr1)、seq id no:13或seq id no:6的第46-50位氨基酸；sfdvkd(βcdr2)、seq id no:14或seq id no:6的第68-73位氨基酸以
及catsgqgayeeqff(βcdr3)、seq id no:15或seq id no:6的第110-123位氨基酸的cdr；或与其具有至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列，任选地，与其具有100％的序列同一性的序列。
45.根据可替代的实施方案，tcr(afp tcr)可以包含tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域，其中：
46.(i)该α链可变结构域包含具有序列drgsqs(αcdr1)、seq id no:22或seq id no:16的第27-32位氨基酸；iysngd(αcdr2)、seq id no:23或seq id no:16的第50-55位氨基酸以及avnsdsgyalnf(αcdr3)、seq id no:24或seq id no:16的第90-101位氨基酸的cdr，以及
47.(ii)该β链可变结构域包含具有序列sgdls(βcdr1)、seq id no:25或seq id no:18的第27-31位氨基酸、yyngee(βcdr2)、seq id no:26或seq id no:18的第49-54位氨基酸以及asslggeseqy(βcdr3)、seq id no:27或seq id no:18的第92-102位氨基酸的cdr；或与其具有至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列，任选地，与其具有100％的序列同一性的序列。
48.根据可替代的实施方案，tcr可以具有被取代的：
49.a.具有序列drgsqa的αcdr1、seq id no：28，
50.b.具有序列avnsdssyalnf的αcdr2、seq id no：29，
51.c.具有序列avnsdsgvalnf的αcdr2、seq id no：30，
52.d.具有序列drgsqa的αcdr1、seq id no：28和具有序列avnsdsgvalnf的αcdr2、seq id no：30，
53.e.具有序列avnsqsgyalnf的αcdr2、seq id no：31，
54.f.具有序列avnsqsgyslnf的αcdr2、seq id no：32，
55.g.具有序列avnsqssyalnf的αcdr2、seq id no：36
56.h.具有序列drgsqa的αcdr1、seq id no：28和具有序列avnsqsgyalnf的αcdr2、seq id no：31，
57.i.具有序列avnsqsgvalnf的αcdr2、seq id no：32，
58.j.具有序列avnsqngyalnf的αcdr2、seq id no：33，
59.k.具有序列drgsfs的αcdr1、seq id no：34，
60.l.具有序列drgsys的αcdr1、seq id no：35，
61.m.具有序列drgsys的αcdr1、seq id no：35和具有序列avnsdssyalnf的αcdr2、seq id no：29，
62.n.具有序列drgsys的αcdr1、seq id no：35和具有序列avnsdssyalnf的αcdr2、seq id no：29，
63.o.具有序列drgsys的αcdr1、seq id no：35和具有序列avnsqsgyalnf的αcdr2、seq id no：31。
64.因此，tcr(mage-a4 tcr)可以包含一种tcr，其中，α链可变结构域包含与seq id no：8或seq id no：4的氨基酸残基1-136的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列，和/或β链可变结构域包含与seq id no：9或seq id no：6的氨基酸残基1-133的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。可替代地，tcr(afp tcr)可以包含一种tcr，其中，α链可变结构域包含与seq id no：20或seq id no：16的氨基酸残基1-112的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列，和/或β链可变结构域包含与seq id no：21或seq id no：18的氨基酸残基1-112的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
65.术语“先祖tcr”或“亲本tcr”在本文中用于指分别包含seq id no：4和seq id no：6的mage-a4 tcrα链和mage-a4 tcrβ链的tcr，或可替代地，分别包含seq id no：16和seq id no：18的afp tcrα链和afp tcrβ链的tcr。期望提供相对于先祖tcr突变的或修饰的tcr，其与先祖tcr相比对于肽-hla复合物具有相等、等价或更高的亲和力和/或相等、等价或更慢的解离速率(off-rate)。根据本发明，相对于先祖tcr，异源性tcr在α链可变结构域和/或β链可变结构域中可以存在有多于一个突变，并且可以表示为“工程化的tcr”或“突变tcr”。这些突变可以改善对于mage-a4或其肽抗原的结合亲和力和/或特异性和/或选择性和/或亲合力。在某些实施方案中，α链可变结构域中存在1、2、3、4、5、6、7或8个突变，例如4或8个突变，和/或β链可变结构域中存在1、2、3、4或5个突变，例如5个突变。在一些实施方案中，本发明的tcr的α链可变结构域可以包含与mage-a4tcr的seq id no：8或afp tcr的seq id no：20的氨基酸残基的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的tcr的β链可变结构域可以包含与mage-a4 tcr的seq id no：9或afp tcr的seq id no：21的氨基酸残基的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列。
66.根据本发明，tcr可以包含一种tcr(mage-a4 tcr)，其中，α链可变结构域包含：seq id no：8或seq id no：4的氨基酸残基1-136的氨基酸序列，或者一种氨基酸序列，其中，其氨基酸残基1-47、54-70、77-110以及126-136分别与seq id no：8的氨基酸残基1-47、54-70、77-110和126-136的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，和/或其中，氨基酸残基48-53、71-76和111-125，cdr1、cdr2、cdr3分别与seq id no：8的氨基酸残基48-53、71-76和111-125，cdr1、cdr2、cdr3的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
67.根据本发明，tcr(mage-a4)可以包含一种tcr，其中，在α链可变结构域中：
68.(i)其氨基酸残基1-47的序列(a)可以与seq id no：8的氨基酸残基1-47的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或(b)相对于seq id no：8的残基1-47可以具有1个、2个或3个氨基酸残基插入或缺失，
69.(ii)氨基酸残基48-53的序列为vspfsn(cdr1)、seq id no：10或seq id no：8的氨基酸48-53，
70.(iii)其氨基酸残基54-70的序列(a)可以与seq id no：25的氨基酸残基54-70的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或(b)相对于seq id no：8的氨基酸残基54-70的序列可以具有1个、2个或3个氨基酸残基插入或缺失，
71.(iv)氨基酸残基71-76的序列可以是ltfsen(cdr2)、seq id no：11或seq id no：8的氨基酸71-76，
72.(v)其氨基酸残基77-110的序列可以与seq id no：8的氨基酸残基77-110的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或相对于seq id no：8的氨基酸残基77-110的序列可以具有1个、2个或3个插入、缺失或替换，
73.(vi)氨基酸残基111-125的序列可以是cvvsggtdswgklqf(cdr3)、seq id no：12或seq id no：8的氨基酸111-125，
74.(vii)其氨基酸残基126-136的序列可以与seq id no：8的氨基酸残基126-136的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或相对于seq id no：8的氨基酸残基126-136的序列可以具有1个、2个或3个插入、缺失或替换。
75.根据本发明，tcr可以包括tcr或mage-a4 tcr，其中，β链可变结构域中包含：seq id no：9的氨基酸序列，或者一种氨基酸序列，其中，其氨基酸残基1-45、51-67、74-109、124-133分别与seq id no：9的氨基酸残基1-45、51-67、74-109、124-133的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，并且其中，氨基酸残基46-50、68-73和110-123分别与seq id no：9的氨基酸残基46-50、68-73和110-123，cdr1、cdr2、cdr3的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性。
76.根据本发明，tcr可以包含一种tcr，其中，在β链可变结构域中：
77.(i)其氨基酸残基1-45的序列(a)可以与seq id no：9的氨基酸残基1-45的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或(b)相对于seq id no：9的残基1-45可以具有1个、2个或3个氨基酸残基插入或缺失，
78.(ii)氨基酸残基46-50的序列为kghdr(cdr1)、seq id no：13或seq id no：9的氨基酸46-50，
79.(iii)其氨基酸残基51-67的序列(a)可以与seq id no：9的氨基酸残基51-67的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或(b)相对于seq id no：9的氨基酸残基51-67的序列可以具有1个、2个或3个氨基酸残基插入或缺失，
80.(iv)氨基酸残基68-73的序列可以是sfdvkd(cdr2)、seq id no：14或seq id no：9的氨基酸68-73，
81.(v)其氨基酸残基74-109的序列可以与seq id no：9的氨基酸残基74-109的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或相对于seq id no：9的氨基酸残基74-109的序列可以具有1个、2个或3个插入、缺失或替换，
82.(vi)氨基酸110-123的序列可以是catsgqgayeeqff(cdr3)、seq id no：15或seq id no：9的氨基酸110-123，
83.(vii)其氨基酸残基124-133的序列可以与seq id no：9的氨基酸残基124-133的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或相对于seq id no：9的氨基酸残基124-133的序列可以具有1个、2个或3个插入、缺失或替换。
84.在可替代的方案中，tcr可以包括tcr或afp tcr，其中，α链可变结构域包含：seq id no：16的氨基酸残基1-112的氨基酸序列，或者一种氨基酸序列，其中，其氨基酸残基1-26、33-49、56-89和102-112分别与seq id no：16的氨基酸残基1-26、33-49、56-89和102-112的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，
和/或其中，氨基酸残基27-32、50-55、90-101，cdr1、cdr2、cdr3分别与seq id no：16的氨基酸残基27-32、50-55、90-101，cdr1、cdr2、cdr3的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
85.根据本发明，tcr可以包含一种tcr，其中，在α链可变结构域中：
86.(i)其氨基酸残基1-26的序列(a)可以与seq id no：16的氨基酸残基1-26的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或(b)相对于seq id no：16的残基1-26可以具有1个、2个或3个氨基酸残基插入或缺失，
87.(ii)其氨基酸残基27-32的序列为drgsqs(αcdr1)、seq id no：22或seq id no：16的氨基酸27-32，
88.(iii)其氨基酸残基33-49的序列(a)可以与seq id no：16的氨基酸残基33-49的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或(b)相对于seq id no：16的氨基酸残基33-49的序列可以具有1个、2个或3个氨基酸残基插入或缺失，
89.(iv)其氨基酸残基50-55的序列可以是iysngd(αcdr2)、seq id no：23或seq id no：16的氨基酸50-55，
90.(v)其氨基酸残基56-89的序列可以与seq id no：16的氨基酸残基56-89的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或相对于seq id no：16的氨基酸残基56-89的序列可以具有1个、2个或3个插入、缺失或替换，
91.(vi)其氨基酸90-101的序列可以是avnsdsgyalnf(αcdr 3)、seq id no：24或seq id no：16的氨基酸90-101，
92.(vii)其氨基酸残基102-112的序列可以与seq id no：16的氨基酸残基102-112的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或相对于seq id no：16的氨基酸残基102-112的序列可以具有1个、2个或3个插入、缺失或替换。
93.根据本发明，tcr或afp tcr可以包括一种tcr，其中，β链可变结构域中包含：seq id no：18的氨基酸残基1-112的氨基酸序列，或者一种氨基酸序列，其中，其氨基酸残基1-26、32-48、55-91、103-112分别与seq id no：18的氨基酸残基1-26、32-48、55-91、103-112的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，并且其中，氨基酸残基27-31、49-54和92-102分别与seq id no：18的氨基酸残基27-31、49-54和92-102，βcdr1、βcdr2、βcdr3的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性。
94.根据本发明，tcr可以包含一种tcr，其中，在β链可变结构域中：
95.(i)其氨基酸残基1-26的序列(a)可以与seq id no：18的氨基酸残基1-26的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或(b)相对于seq id no：18的残基1-26可以具有1个、2个或3个氨基酸残基插入或缺失，
96.(ii)氨基酸残基27-31的序列为sgdls(βcdr1)、seq id no：25或seq id no：18的氨基酸27-31，
97.(iii)其氨基酸残基32-48的序列(a)可以与seq id no：18的氨基酸残基32-48的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或(b)相对于seq id no：18的氨基酸残基32-48的序列可以具有1个、2个或3个氨基酸残基插入或缺失，
98.(iv)氨基酸残基49-54的序列可以是yyngee(βcdr2)、seq id no：26或seq id no：18的氨基酸49-54，
99.(v)其氨基酸残基55-91的序列可以与seq id no：18的氨基酸残基55-91的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或相对于seq id no：18的氨基酸残基55-91的序列可以具有1个、2个或3个插入、缺失或替换，
100.(vi)氨基酸92-102的序列可以是asslggeseqy(βcdr3)、seq id no：27或seq id no：18的氨基酸92-102，
101.(vii)其氨基酸残基103-112的序列可以与seq id no：18的氨基酸残基103-112的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或相对于seq id no：18的氨基酸残基103-112的序列可以具有1个、2个或3个插入、缺失或替换。
102.因此，异源性tcr可以包括一种tcr，其中，α链包含seq id no：20的氨基酸残基，而β链可变结构域包含seq id no：21或seq id no：42的氨基酸残基。
103.共受体修饰的t细胞
104.根据本发明，表达或呈递异源性tcr或car的修饰的t细胞的群体还可以表达或呈递异源性共受体。异源性共受体可以是cd8共受体。该cd8共受体可以包含cd8链的二聚体或对，其包含cd8-α和cd8-β链或cd8-α和cd8-α链。优选地，cd8共受体为包含cd8-α和cd8-α链的cd8αα共受体。cd8α共受体可以包含与seq id no：37具有至少80％的同一性、seq id no：37或其变体的氨基酸序列。cd8α共受体可以是同型二聚体(homodimer)。
105.cd8共受体结合至1类mhc并增强tcr信号传导。根据本发明，cd8共受体可以包含seq id no：37的参考氨基酸序列或可以是其变体。变体可以具有与参考氨基酸序列seq id no：37具有至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。cd8共受体可以由seq id no：38的参考核苷酸序列编码或可以是其变体。变体可以具有与参考核苷酸序列seq id no：38具有至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的核苷酸序列。
106.根据本发明，异源性cd8共受体可以包含一种cd8共受体，其中，ig样v型结构域中包含具有以下序列的cdr：
107.(i)vllsnptsg(cdr1)、seq id no：39，或seq id no：37的氨基酸45-53，
108.(ii)ylsqnkpk(cdr2)、seq id no：40，或seq id no：37的氨基酸72-79，
109.(iii)lsnsim(cdr3)、seq id no：41，或seq id no：37的氨基酸80-117，
110.或者与其具有至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列的cdr。
111.根据本发明，异源性cd8共受体可以包含cd8共受体，其包含或其中，ig样v型结构域中包含：seq id no：37的氨基酸序列的残基22-135，或者一种氨基酸序列，其中，其氨基酸残基22-44、54-71、80-117、124-135分别与seq id no：37的氨基酸残基22-44、54-71、80-117、124-135、cdr1、cdr2、cdr3的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，并且其中，氨基酸残基45-53、72-79和118-123分别与seq id no：37的氨基酸残基45-53、72-79和118-123的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性。
112.根据本发明，cd8共受体可以包含一种cd8共受体，其中或其中在ig样v型结构域中：
113.(i)其氨基酸残基22-44的序列(a)可以与seq id no：37的氨基酸残基22-44的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或(b)相对于seq id no：37的残基22-44可以具有1个、2个或3个氨基酸残基插入或缺失，
114.(ii)氨基酸残基45-53的序列为vllsnptsg、seq id no：39(cdr1)，或seq id no：37的氨基酸45-53，
115.(iii)其氨基酸残基54-71的序列(a)可以与seq id no：37的氨基酸残基54-71的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或(b)相对于seq id no：37的氨基酸残基54-71的序列可以具有1个、2个或3个氨基酸残基插入或缺失，
116.(iv)氨基酸残基72-79的序列可以是ylsqnkpk(cdr2)、seq id no：40或seq id no：37的氨基酸72-79，
117.(v)其氨基酸残基80-117的序列可以与seq id no：37的氨基酸残基80-117的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或相对于seq id no：37的氨基酸残基80-117的序列可以具有1个、2个或3个插入、缺失或替换；
118.(vi)氨基酸118-123的序列可以是lsnsim(cdr3)、seq id no：41或seq id no：37的氨基酸80-117，
119.(vii)其氨基酸残基124-135的序列可以与seq id no：37的氨基酸残基124-135的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，或相对于seq id no：37的氨基酸残基124-135的序列可以具有1个、2个或3个插入、缺失或替换。
120.表达异源性cd8共受体的修饰的t细胞可以表现出，如可通过本文公开的测定法确定的，对抗原肽、肿瘤或癌抗原的刺激改善的亲和力和/或亲合力和/或改善的t细胞的活化，任选地当相对于不表达异源性cd8共受体的修饰的t细胞呈递在hla上时。修饰的t细胞的异源性cd8可以与mhc相互作用或特异性结合，该mhc可以是i类或ii类，优选i类主要组织相容性复合物(mhc)、hla-i分子或与mhc i类hla-a/b2m二聚体，优选cd8-α与i类mhc的α3部分(在残基223与229之间)相互作用，优选通过cd8的igv样结构域。因此，与缺乏异源性cd8的t细胞相比，异源性cd8改进了t细胞与hla和/或由hla pmhci或phla结合或呈递的抗原肽的tcr结合，任选地在抗原呈递细胞、树突细胞和/或肿瘤或癌细胞、肿瘤或癌组织的表面上。
121.因此，与缺乏异源性cd8的细胞相比，异源性cd8可以改善或增加免疫应答细胞的细胞(tcr)/肽-主要组织相容性复合物i类(pmhci)的相互作用的解离速率(k
off
)，因此其半衰期，任选地在抗原呈递细胞、树突细胞和/或肿瘤或癌细胞、或肿瘤或癌组织的表面上，且从而也可以提供改进的连接亲和力和/或亲合力。异源性cd8可以改进tcr在免疫应答细胞表面上的组织，以实现phla结合的协同性，并且可以提供改进的治疗性亲合力。因此，异源性cd8共受体修饰的t细胞可以以导致转录因子(如nfat、nf-κb和ap-1)的活化的锌依赖性方式与lck(淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶)结合或相互作用。与缺乏异源性cd8共受体的t细胞相比，异源性cd8修饰的t细胞可以具有改善的或增加的cd40l的表达、细胞因子产生、细胞毒活性、树突细胞成熟的诱导或树突细胞细胞因子产生的诱导，任选地应答于癌症和/或肿瘤抗原或其肽抗原，任选地由癌细胞或组织的肿瘤呈递。
122.共刺激配体修饰的t细胞
123.根据本发明，修饰的t细胞或修饰的t细胞的群体还可以包含和/或表达至少一种外源性和/或重组的共刺激配体，任选为一种、两种、三种或四种。tcr与至少一种外源性共刺激配体之间的相互作用可以提供非抗原特异性信号和细胞的活化。共刺激配体包括但不限于肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，tnf)超家族的成员和免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)超家族配体。tnf是参与全身性炎症(systemic inflammation)的细胞因子，并且刺激急性期反应。它的主要作用是调节免疫细胞。tnf超家族的成员共有许多共同特征。大部分tnf超家族成员被合成为ii型跨膜蛋白(细胞外c端)，其含有短的细胞质片段和相对长的细胞外区域。tnf超家族成员包括但不限于神经生长因子(nerve growth factor，ngf)、cd40l(cd40l)/cdl54、cd137l/4-1bbl、tnf-α、cd134l/ox40l/cd252、cd27l/cd70、fas配体(fasl)、cd30l/cd153、肿瘤坏死因子β(tnfp)/淋巴毒素-α(lta)、淋巴毒素-β(ttb)、cd257/b细胞活化因子(baff)/blys/thank/tall-l、糖皮质激素诱导的tnf受体配体(gitrl)、以及tnf相关的细胞凋亡诱导配体(trail)、light(tnfsf14)。免疫球蛋白(ig)超家族是一大类细胞表面和可溶性蛋白质，其参与细胞的识别、结合或粘附过程。这些蛋白质与免疫球蛋白共有结构特征——它们具有免疫球蛋白结构域(折叠)。免疫球蛋白超家族配体包括但不限于cd80和cd86，两者都是cd28的配体。在某些实施方案中，该至少一种共刺激配体选自由以下组成的组：4-1bbl、cd275、cd80、cd86、cd70、ox40l、cd48、tnfrsf14及其组合。根据本发明，修饰的t细胞或修饰的t细胞的群体还可以包含至少一种外源性和/或重组的共刺激配体，该共刺激配体可以是4-1bbl或cd80，优选4-1bbl，可替代地为4-1bbl和cd80。
124.cd3 富集
125.根据本发明，所述方法还可以包括以下步骤：其中，t细胞富集用于cd3 部分，用于t细胞表达cd3、抗原、分化蛋白簇以及成熟t淋巴细胞上的t细胞受体(tcr)复合物的一部分。可以在修饰t细胞之前实施富集。可以在活化t细胞之前实施富集。可替代地并且优选地，在t细胞的活化期间或之后实施富集，优选在t细胞的活化期间或之后以及修饰之前实施富集。任选地，在包含抗cd3抗体或其抗原结合片段和/或抗cd28抗体或其抗原结合片段(任选地例如在活化期间任选地在修饰之前连接至可去除的珠子)的t细胞上实施富集。
126.t细胞活化
127.根据本发明的方法，活化或活化t细胞或t细胞的群体刺激t细胞以增殖和/或扩增。
128.活化分离的t细胞的群体可以通过多种方法实现，例如，通过使t细胞与抗cd3抗体或其cd3结合片段接触，或通过使t细胞与抗cd28抗体或其cd28结合片段接触，或通过使t细胞与b7蛋白质(b7为在活化的抗原呈递细胞上发现的一种外周膜蛋白，当与t细胞上的cd28或cd152(ctla-4)表面蛋白配对时，其可以产生共刺激信号)或其cd28结合片段接触，例如b7-1或b7-2或其cd28结合片段。活化装置可以附着至固体和可选地可去除的表面或基底，如珠子或磁珠，例如涂覆有抗cd3和/或抗cd28的磁珠。优选地，活化是通过添加抗cd3抗体或其抗原结合片段和/或抗cd28抗体或其抗原结合片段，任选地附着至珠子，任选为可去除的珠子，例如，它可以是磁珠并因此能够从细胞培养基中分离出来。t细胞活化可以在t细胞修饰的同时或之后实施，在akti添加的同时或之后实施，在t细胞修饰与akti添加的同时或
之后实施。优选地，t细胞活化是在t细胞修饰之前，优选在akti添加之前，优选在t细胞修饰与akti添加之前。
129.akt抑制剂步骤
130.根据本发明的方法，可以在活化之前或与活化同时实施t细胞修饰或转导，例如，在活化之前约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20小时中的任一个或比约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20小时更长的时间。
131.根据本发明的方法，可以在活化之后实施t细胞修饰或转导，优选在活化之后18-26小时，优选在活化之后12-40、13-38、14-36、15-34、16-32、17-30、18-28、18-26或18-24小时中的任一个，或在活化之后约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42小时中的任一个。
132.根据本发明的方法，可以在t细胞修饰或转导之后添加akt抑制剂，优选地，可以在修饰或转导之后8-42、9-41、10-40、11-39、12-38、13-37、14-36、15-35、16-34、17-33、18-32、19-31、20-30、21-29、22-28、23-27、24-26或24-25小时中的任一个添加akt抑制剂，优选在t细胞修饰或转导之后15-26、16-25、17-24、18-23、19-22或20-21小时中的任一个，优选在t细胞修饰或转导之后17-24小时。
133.根据本发明的方法，可以在t细胞活化之后添加akt抑制剂，优选地，可以在t细胞活化之后35-50、36-49、37-48、38-47、39-46、40-45、41-44、42-43小时中的任一个添加akt抑制剂，优选在t细胞修饰或转导之后35-50小时。
134.akt抑制剂
135.根据本发明的方法，akt抑制剂可以选自由以下组成的组：变构抑制剂或变构akt抑制剂、竞争性atp抑制剂、akt与磷脂之间相互作用的抑制剂、akt的下游分子的磷酸化的抑制剂，优选pras40、核糖体s6或tsc2的磷酸化的抑制剂。akt抑制剂还可以选自由以下组成的组：akt的dna-pk活化的抑制剂、akt的pdk-1活化的抑制剂、akt的mtorc2活化的抑制剂、akt的hsp活化的抑制剂。
136.因此，该变构抑制剂或变构akt抑制剂可以选自以下任一种：
137.(a)arq092，miransertib，cas号：1313881-70-7，化学式：c27h24n6，或者具有以下结构的化合物：
[0138][0139]
(b)arq751，或具有以下结构的化合物：
[0140][0141]
(c)bay1125976，(cas号1402608-02-9)，化学式：c23h21n5o，或具有以下结构的化合物：
[0142][0143]
或
[0144]
(d)mk-2206，(cas号1032350-13-2)，化学式：c
25h21
n5o，或具有以下结构的化合物：
[0145][0146]
因此，竞争性atp抑制剂可以选自以下任一种：
[0147]
(a)福瑞塞替(afuresertib，gsk2110183)，(cas号：1047645-82-8)，化学式：c
18h17
cl2fn4os
·
hcl，或具有以下结构的化合物：
[0148][0149]
(b)优普色替(uprosertib，gsk2141795)，(cas号：1047634-65-0)，化学式：c
18h16
cl2f2n4o2，或具有以下结构的化合物：
[0150][0151]
(c)gsk690693，(cas号：937174-76-0)，化学式：c
21h27
n7o3，或具有以下结构的化合
物：
[0152][0153]
(d)帕他色替(ipatasertib，gdc-0068)，(cas号：1001264-89-6)，化学式：c
24h32
cln5o2，或具有以下结构的化合物：
[0154][0155]
(e)ly2780301，或具有以下结构的化合物：
[0156][0157]
(f)曲西立滨(triciribine，tcn-pm；vd-0002)，(cas号：35943-35-2)，化学式：c
13h16
n6o4，或具有以下结构的化合物：
[0158][0159]
(g)azd5363，(cas号：1143532-39-1)，化学式：c
21h25
cln6o2，或具有以下结构的化合物：
[0160]
或
[0161]
(g)cct128930，(cas号：885499-61-6)，化学式：c18h20cln5，或具有以下结构的化合物：
[0162][0163]
因此，akt与磷脂之间相互作用的抑制剂可以是哌立福新(perifosine，d-21266，krx0401)，(cas号：157716-52-4)，化学式：c25h52no4p，或具有以下结构的化合物：
[0164][0165]
优选地，akt抑制剂为mk-2206或gsk690693。
[0166]
根据本发明，可以以大于或等于akt抑制剂对akt的抑制的ic50(任选akt1、akt2或akt3的抑制的ic50)的10至1000倍的浓度添加akt抑制剂，优选地以大于或等于ic50的10、25、20、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000倍中的任一个的浓度。优选地，可以以0.01μm至10μm或20μm至100μm的浓度添加akt抑制剂，优选地以等于或大于0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100μm的浓度，优选0.5μm。
[0167]
过程中的t细胞
[0168]
根据本发明，与以下相比：
[0169]
(i)在不存在akt抑制剂的情况下产生的t细胞的群体或活化的和修饰的或转导的t细胞的群体(例如，参考t细胞或t细胞的群体)，或
[0170]
(ii)在存在akt抑制剂的情况下产生的t细胞的群体或活化的和修饰的或转导的t细胞的群体，其中，在修饰或转导之前添加和/或在活化或刺激之后小于或等于24小时添加akt抑制剂，例如，在活化或刺激之后小于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时中的任一个(例如，参考t细胞或t细胞的群体)；
[0171]
在存在akt抑制剂的情况下产生的活化的和修饰的和/或转导的t细胞或t细胞的
群体可以具有增加的或更高的相对比例的以下任一种或多种：
[0172]
(a)表达cd45ra 和ccr7 的t细胞，
[0173]
(b)是cd45ro-、ccr7 、cd45ra 、cd62l (l-选择素)、cd27 、cd28 和il-7rα 的t细胞，
[0174]
(c)是t
scm
细胞(干细胞记忆性t细胞)的t细胞，
[0175]
(d)具有记忆表型的t细胞，优选cd8记忆表型。
[0176]
根据本发明，优选地，与以下相比：
[0177]
(i)在不存在akt抑制剂的情况下产生的t细胞的群体或活化的和修饰的或转导的t细胞的群体(例如，参考t细胞或t细胞的群体)，或
[0178]
(ii)在存在akt抑制剂的情况下产生的t细胞的群体或活化的和修饰的或转导的t细胞的群体，其中，在转导之前添加和/或在活化或刺激之后小于或等于24小时添加akt抑制剂，例如，在活化或刺激之后小于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时中的任一个(例如，参考t细胞或t细胞的群体)；
[0179]
在存在akt抑制剂的情况下产生的活化的和修饰的和/或转导的t细胞或t细胞的群体具有改善的水平的以下任一种或多种：
[0180]
(a)体外和/或体内持久性(persistence)，
[0181]
(b)从接种至收获的扩增，
[0182]
(c)缓解的持续时间(durability)，
[0183]
(d)抗原诱导的细胞因子的产生，任选地，干扰素γ的产生
[0184]
(e)t细胞存活或寿命或活力百分比，
[0185]
(f)t细胞效应子功能，优选细胞毒性。
[0186]
t细胞持久性
[0187]
优选地，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出改善的持久性，并且具有增加的比例的较少末端分化的t细胞，优选在功能性cd8 群体内，优选增加的比例的双阳性scm细胞，优选表达cd45ra 和ccr7 。优选地，t细胞在体内和/或体外测试时具有改善的持久性和记忆形成、存活和/或抗原刺激的存活。
[0188]
优选地，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体在一段时间内表现出在体内和/或体外证明的改善的持久性，其任选地相对于参考t细胞或t细胞的群体改善。
[0189]
优选地，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出通过测量增加的体内扩增的水平和/或增加的量化的双阳性scm细胞的比例来确定的改善的持久性，任选地相对于参考t细胞或t细胞的群体，例如通过流式细胞术以鉴定t细胞或表达异源性tcr或car和/或表达cd45ra 和ccr7和/或通过qpcr确定的t细胞的比例，以鉴定基因修饰的t细胞。
[0190]
优选地，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出由改善的峰值扩增确定的改善的持久性，例如，通过异源性tcr或car的qpcr测量拷贝/μg或其中位数，或通过测量对异源性tc或car阳性的cd3

细胞的峰值百分比(例如，在体内外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)的样本中)或其中位数。优选地，相对于参考t细胞或t细胞的群体，这些值提高至少10％，可替代地提高20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％或更多。扩增的程度和持久性的持续时间与致瘤反应(tumorigenic response)相关。
[0191]
优选地，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出由细胞因子产生的提高的水平确定的改善的持久性，例如，体内和/或体外干扰素γ产生的提高的水平，如通过细胞因子测定(例如elisa)来量化或如本文所描述，任选地相对于参考t细胞或t细胞的群体。
[0192]
优选地，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出通过在体外和/或体内较少受到和/或证明功能衰竭的减少确定的改善的持久性，从而更能够在体外和/或体内持续更长的存活时间，并提供持续时间更长且更持久的免疫应答，任选地相对于参考t细胞或t细胞的群体改善，例如通过本文展示的测定法确定。优选地，与参考t细胞或t细胞的群体相比，t细胞功能增强至少10％，可替代地增强20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％或更多，例如，如通过以下来判断的：来自cd8 t细胞的γ-干扰素的增加的分泌，例如根据细胞计数的t细胞增殖的增加，例如根据细胞信号传导测定的内部信号传导的增加，增加的抗原应答性，细胞因子和/或干扰素的增加的分泌，增加的靶细胞杀伤，增加的t细胞活化，增加的cd28信号传导，增强的t细胞浸润肿瘤的能力，增强的识别与结合至树突细胞呈递的抗原的能力。
[0193]
优选地，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出由具有改善的抗肿瘤活性的效力确定的改善的持久性，从而表现出改善的肿瘤免疫的降低或免疫识别的逃避，例如，通过体外和/或体内的肿瘤浸润、肿瘤结合、肿瘤缩小和/或肿瘤清除的程度的测定或确定来测量的，任选地与参考t细胞或t细胞的群体相比来确定。优选地，相对于参考t细胞或t细胞的群体，抗肿瘤活性的效力增强或提高至少10％，可替代地增强或提高20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％或更多，例如，如通过肿瘤结合测定、肿瘤缩小和/或肿瘤清除所测量的。
[0194]
优选地，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出由改善的或增强的肿瘤免疫原性确定的改善的持久性，例如，如通过在体外和/或体内引起应答于肿瘤或肿瘤抗原的免疫应答的能力来测量的，例如，相对于参考t细胞或t细胞的群体，增强至少5％或10％，可替代地增强20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％或更多，例如，如通过以下来判断的：细胞因子和/或干扰素的增加的分泌，增加的t细胞增殖，例如通过体外测定的抗原应答性的增加，增加的靶细胞杀伤，增加的t细胞活化，增加的cd28信号传导，增强的t细胞浸润肿瘤的能力，增强的识别与结合至树突细胞呈递的抗原的能力。
[0195]
优选地，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出在体内输注之后或体外培养开始之后5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36天，和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49个月的任何一个或多个的时间段(period of time)内、时期(time peroid)或时间过程中改善的持久性，优选地相对于参考t细胞或t细胞的群体。优选地，在比较的时间过程中，细胞表现出改善的功能活性水平，而不会耗尽。优选地，在体内输注之后8至14天内确定改善的持久性。
[0196]
t细胞扩增
[0197]
优选地，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出在接种与收获的时
间点之间的过程或培养中测量的改善的和/或提高的t细胞扩增水平。优选地，与参考t细胞或t细胞的群体相比，t细胞扩增、分裂或增殖水平增加，例如，与在不存在akt抑制剂的情况下产生的t细胞的群体或活化的和修饰的或转导的t细胞的群体(例如，参考t细胞或t细胞的群体)相比，在t细胞活化之后。例如，在本发明的过程或培养过程或过程中，或从其样本中测量，可以使用自动细胞计数器(automated cell counter)以提供细胞活力和浓度以及增殖和扩增的速率的测量来进行扩增、分裂或增殖的测定或确定。优选地，与参考t细胞或t细胞的群体相比，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出改善的扩增、分裂或增殖的能力，如从在本发明的过程或培养过程或过程中采集的等效样本或样本的时间点测量的，或从其中的样本中测量的，可以在涉及t细胞活化的测定中确定改善。可以在如前所描述的细胞因子、白细胞介素、抗体、肽或抗原肽的存在下开始活化，例如，活化可以通过使用癌症或肿瘤抗原或其肽、由异源性tcr或细胞或组织识别的癌症或肿瘤抗原的肽片段，例如，呈递肽或抗原肽或肽片段的肿瘤或癌细胞或组织。优选地，相对于参考的改进或相对改进在如上所描述的时间段或时间过程中被证实。
[0198]
t细胞持续时间
[0199]
因此，与参考t细胞或t细胞的群体相比，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出改善的体内持续缓解(durable response)和/或持续缓解率(durable response rate)。优选地，t细胞或t细胞的群体在治疗停止之后/体内输注之后提供了降低肿瘤生长或肿瘤生长速率或维持肿瘤尺寸的改善的持续缓解，例如，通过测量肿瘤尺寸或肿瘤数量确定的，优选地，相对于输注或治疗或干预之前的此类水平，或相对于用参考t细胞或t细胞的群体的输注或治疗，增强至少10％，可替代地增强20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％或更多。优选地，相对于参考的改善或相对改善在如上所描述的时间段或时间过程中被证实。
[0200]
t细胞细胞因子的产生
[0201]
优选地，例如，与参考t细胞或t细胞的群体相比，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出改善的和/或增加的细胞因子产生的水平，应答于癌症或肿瘤抗原或其肽，或癌症细胞或组织的肿瘤呈递的或癌症或肿瘤抗原的肽、抗原肽、肽片段；以及与参考t细胞或t细胞的群体相比，由异源性tcr或car识别的。细胞因子可以是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，gm-csf)、ifn-γ、il-2、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，tnf)-α、mip-1β(ccl4)、il-17、il-10、il-4、il-5、il-13、il-2受体、il-12或mig(cxcl9)；优选为ifnγ、il-2、tnfα、gm-csf或mip1β；优选为ifnγ、il-2、tnfα、gm-csf和mip1β。另外地或可替代地，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体可以表现出诱导树突细胞中细胞因子产生的水平增加，其应答于癌症或肿瘤抗原或其肽，或癌症细胞或组织的肿瘤呈递的或癌症或肿瘤抗原的肽、抗原肽、肽片段；以及与参考t细胞或t细胞的群体相比，由异源性tcr或car识别的。细胞因子可以是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、ifn-γ、il-2、肿瘤坏死因子(tnf)-α、mip-1β(ccl4)、il-17、il-10、il-4、il-5、il-13、il-2受体、il-12或mig(cxcl9)；优选为ifn-γ、il-12或mig；可替代地为ifn-γ、il-12和mig。用于确定细胞因子产生的合适测定是本领域已知的。优选地，相对于参考的改善或相对改善在如上所描述的时间段或时间过程中被证实。
[0202]
t细胞存活、寿命、活力
[0203]
优选地，例如，与参考t细胞或t细胞的群体相比，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出体外和/或体内改善的和/或增加的存活或寿命或活力百分比。优选地，相对于参考的改善或相对改善在如上所描述的时间段或时间过程中被证实。优选地，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出通过在体外或体内样本中测量应答于抗原刺激的t细胞增殖的水平确定的改善的t细胞活力，例如，异源性tcr或car特异性抗原，例如使用基于染料的增殖测定或3h-胸苷掺入增殖测定。另外地或可替代地，可以通过测量t细胞的抗原特异性应答水平来确定t细胞活力，例如使用酶联免疫吸附测定法(elisa)或酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospots，elispots)在抗原应答t细胞的细胞因子产生的方面。这可以与用于物理细胞生长的比色测定和与有活力的t细胞数量相关的标志物活性的测量相结合。优选地，活化的和修饰的或转导的t细胞或t细胞的群体表现出通过测量增加的存活或寿命来确定的改善的持久性，例如通过流式细胞术量化的，以鉴定t细胞或表达异源性tcr或car和/或表达cd45ra 和ccr7和/或通过qpcr确定的t细胞的比例，以鉴定基因修饰的t细胞。
[0204]
t细胞效应子功能
[0205]
例如，与参考t细胞或t细胞的群体相比，根据本发明的t细胞或t细胞的群体可以表现出改善的抗原应答或i类抗原应答。优选地，相对于参考的改善或相对改善在如上所描述的时间段或时间过程中被证实。根据本发明的t细胞或t细胞的群体可以表现出改善的或增加的cd40l的表达、对抗原呈递细胞的亲和力和/或细胞因子的产生、细胞毒活性，例如，如通过表达t细胞识别的抗原、肿瘤或癌症抗原的细胞的细胞杀伤测定、树突细胞成熟的诱导或树突细胞细胞因子产生的诱导所确定的，任选地，应答于癌症或肿瘤抗原或肽或癌症肽、抗原肽、癌症或肿瘤抗原的肽片段或由癌细胞或组织的肿瘤呈递并被t细胞或异源性tcr或car识别或结合的肽片段。
[0206]
组合物和疗法
[0207]
本发明提供了根据本发明的方法产生的t细胞或t细胞的群体。
[0208]
本发明还提供了一种组合物，其包含根据本发明的方法产生的t细胞或t细胞的群体和生理学上可接受的赋形剂。
[0209]
根据本发明的t细胞或修饰的t细胞的群体，可以与其它试剂混合，如缓冲剂、载体、稀释剂、防腐剂和/或药学上可接受的赋形剂。适合施用(例如，通过输注)的药物组合物包括水性和非水性等渗溶液、无热原溶液、无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂以及使制剂与预期的接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。用于此类制剂的合适的等渗载体的例子包括氯化钠注射液、林格氏溶液(ringer’s solution)或乳酸钠林格注射液(lactated ringer’s injection)。合适的载体可以在标准药学文本中找到，例如，remington’s pharmaceutical sciences，第18版，mack publishing company，easton，pa.，1990。在一些优选实施方案中，可以将根据本发明的修饰的t细胞或t细胞的群体配制成适合于静脉内输注至个体的药物组合物。
[0210]
如本文所使用的术语“药学上可接受的”涉及在合理的医学判断的范围内适合用于与受试者(例如，人类)的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应，或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。每种载体、赋形剂等
在与制剂的其它成分相容的意义上也必须是“可接受的”。
[0211]
本发明提供了根据本发明的方法产生的t细胞或t细胞的群体，或其用于过继性疗法的组合物。因此，修饰的t细胞或t细胞的群体可以通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射、外敷、口服、经皮施用、腹膜内施用、眼眶内施用、植入、吸入、鞘内施用、心室内施用、鼻内施用或静脉输注等施用。优选地，可以静脉注射或通过静脉输注施用修饰的免疫应答性细胞。因此，修饰的t细胞或t细胞的群体可以作为单剂量或多于一种剂量(多剂量)施用，并且可以以约5亿至约10亿个细胞、约20亿个细胞、约30亿个细胞、约40亿个细胞、约50亿个细胞、约60亿个细胞、约70亿个细胞、约80亿个细胞、约90亿个细胞、约100亿个细胞、约110亿个细胞、约120亿个细胞、约130亿个细胞、约140亿个细胞、约150亿个细胞、约160亿个细胞、约170亿个细胞、约180亿个细胞、约190亿个细胞、约200亿个细胞、或约210亿个细胞中的任一种的剂量施用。
[0212]
本发明提供了根据本发明的方法产生的t细胞或t细胞的群体，或其用于治疗肿瘤和/或癌症的组合物。肿瘤和/或癌症可以选自：肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、转移性或晚期nsclc、鳞状nsclc、腺状nsclc、腺鳞状nsclc、大细胞nsclc、卵巢癌、胃癌、尿道癌、食管癌、食管胃交界癌(egj)、黑色素瘤、膀胱癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌(hnscc)、口腔癌、口咽癌、下咽癌、咽喉癌(cancer of the throat)、喉头癌(cancer of the larynx)、扁桃腺癌、舌癌、软腭癌、咽癌(cancer of the pharynx)、滑膜肉瘤、黏液样圆细胞脂肪肉瘤(mrcls)。根据本发明，癌症可选自以下任一种：乳腺癌、转移性乳腺癌、肝癌、肾细胞癌、滑膜肉瘤、尿路上皮癌或肿瘤、胰腺癌、结肠直肠癌、转移性胃部癌(metastatic stomach cancer)、转移性胃癌(metastatic gastric cancer)、转移性肝癌、转移性卵巢癌、转移性胰腺癌、转移性结直肠癌、转移性肺癌、结直肠癌或腺癌、肺癌或腺癌、胰腺癌或腺癌、黏液性腺瘤、胰腺的导管癌、恶性血液病。任选地，癌症和/或肿瘤可以表达mage-a4或afp或mage-a4的抗原肽或肽抗原，和/或包含氨基酸序列gvydgrehtv、seq id no：1(mage-a4)或甲胎蛋白(afp)的抗原肽或肽抗原，和/或包含序列fmnkfiyei(seq id no：2)或来源于甲胎蛋白(afp)的残基158-166(seq id no：3)。
[0213]
治疗
[0214]
优选地，与本文如上所描述的包含参考t细胞或t细胞的群体的治疗相比，该治疗延长或改善或有效延长或有效改善：
[0215]
(a)无进展生存期，
[0216]
(b)进展时间(time to progression)，
[0217]
(c)缓解持续时间，
[0218]
(d)总生存期，
[0219]
(e)客观缓解或客观缓解率，
[0220]
(f)总缓解或总缓解率，
[0221]
(g)部分缓解或部分缓解率，
[0222]
(h)完全缓解或完全缓解率，
[0223]
(i)稳定疾病率或中位稳定疾病，
[0224]
(j)中位无进展生存期，
[0225]
(k)中位进展时间，
[0226]
(l)中位缓解持续时间，或
[0227]
(m)中位总生存期，
[0228]
(n)中位客观缓解或中位客观缓解率，
[0229]
(o)中位总缓解或中位总缓解率，
[0230]
(p)中位部分缓解或中位部分缓解率，
[0231]
(q)中位完全缓解或中位完全缓解，
[0232]
(r)中位稳定疾病率或中位稳定疾病。
[0233]“总生存期”是指受试者保持存活持续定义的时间段。“客观缓解率(obrr)”为具有预定量的肿瘤尺寸减小的受试者的比例，任选地由靶病灶或肿瘤的最长直径(sld)的总和以及持续最短时间段确定。“总缓解率(orr)”被定义为对疗法有部分或完全缓解的受试者的比例；它不包括稳定疾病。orr通常被定义为在指定时间段内完全缓解(cr)与部分缓解(pr)的总和。“无进展生存期(pfs)”是指从治疗(或随机化)到首次疾病进展或死亡的时间。“进展时间(ttp)”不计算死于接受治疗的癌症或肿瘤以外的其它原因的患者，但在其它方面相当于pfs。“缓解持续时间(dor)”为癌症、肿瘤或病灶在不生长或扩散的情况下继续对治疗产生反应的时间的长度。根据本发明，dor、ttp和pfs可以通过实体肿瘤反应评估标准(response evaluation criteria in solid tumors，recist)进行评估，也可以通过ca-125水平作为进展的决定性因素进行评估。
[0234]
根据本发明，在所有靶病灶或肿瘤已经被评估或测量为已消失的情况下确定“完全缓解(cr)”。例如参考对照或治疗前比较器，在测量到靶病灶或肿瘤的最长直径(sld)的总和减少至少30％的情况下确定“部分缓解(pr)”。例如参考对照或治疗前比较器，从治疗开始或存在一个或多个新病灶以来，在测量到靶病灶或肿瘤的最长直径(sld)的总和增加至少20％的情况下确定“疾病进展(pd)”。以治疗开始以来最小的sld作为参考，在确定靶病灶或肿瘤的最长直径(sld)的总和既没有充分减少或降低而有资格获得pr，也没有足够增加而有资格获得pd的情况下确定“稳定疾病(sd)”。
[0235]
根据本发明，提供了：
[0236]
(a)一种试剂盒，其包含有效量的根据本发明的方法产生的t细胞或t细胞的群体以及药品说明书(package insert)，该药品说明书包含使用t细胞治疗或延缓受试者的癌症和/或肿瘤的进展的说明。
[0237]
本发明将通过参考以下附图和实施例进一步描述。
附图说明
[0238]
图1.添加akti的时间点。示意图示出了将mk-2206添加到t细胞扩增培养物中的时间点，比较了添加第0天 第2天与仅第2天的培养物。第0天添加发生在添加珠子、t细胞活化之后，但发生在转导/扩增之前。第2天添加发生在转导之后但在扩增之前。添加到g-rex补充(top up)使用的培养基中，不中断过程。
[0239]
图2.响应于mk-2206用于健康供体材料(healthy donor material，hdm)的t细胞总有核细胞(t cell total nucleated cell，tnc)计数。hdm在10m的g-rex中扩增了10天。用在3个不同时间点添加的不同浓度的mk-2206处理培养物；第0天( d2)，第2天。在收获后第10天，在自动细胞计数器vicell上获取总有核细胞(tnc)计数。
[0240]
图3.添加mk-2206化合物后第10天收获的多个健康供体扩增。按照所描述的过程，将6种健康供体材料在10m的g-rex中扩增10天。用10μm浓度的mk-2206处理培养物，滴定降低至0.05μm。图a详细说明了第0天添加的化合物( 第2天培养基添加)，图b详细说明了仅在第2天添加的化合物。使用vicell计数收获的细胞。结果显示为相对于未处理对照的扩增倍数变化。其中，扩增了复制培养物，数据点 /-sem显示2个重复的平均值。
[0241]
图4.转导的cd8 区室中的健康供体记忆表型分布。按照所描述的过程，将健康供体材料在10m的g-rex中扩增10天。将培养物用在x轴上以μm显示的多种浓度的akti mk-2206处理。在第0天 第2天或仅在第2天添加化合物。通过流式细胞术门控的cd3 /dextramer /cd8 区室分析收获的细胞的记忆表型标志物(ccr7 /-、cd45ra /-)。
[0242]
图5.在mk-2206存在下扩增的t细胞的抗原刺激的ifnγ分泌。将扩增的t细胞从冷冻中解冻，静置2小时，然后与抗原阳性细胞系(a375，前一天接种的)共培养48小时。使用ifny elisa分析来自刺激的t细胞培养物的上清液的细胞因子释放。每个数据点显示3个重复的平均值 /-sem。在第0天 第2天、第2天添加mk-2206。
实施例
[0243]
实施例1
[0244]
1.1目的
[0245]
以下研究的目的是研究在培养物中产生t细胞的新方法，该方法可以导致改善的t细胞功能而不损害t细胞扩增，使得产生的t细胞的群体将在过继性治疗和癌症的治疗中具有改善的功能有效性。特别希望该过程提高分化程度较低的t细胞的群体在功能性cd8 区室中的比例，特别是对t细胞扩增、t细胞活力、转导、最终群体中的cd8频率具有最小或无负面影响，并且在对抗原特异性活化的应答中具有改善的细胞因子分泌。预计此类细胞群体会具有改善的抗肿瘤活性，如通过应答于抗原(细胞毒性细胞杀伤活性和细胞因子的产生)的效应子功能所测量的，并且表现出通过应答于抗原刺激的存活延长的存活所测量的改善的持久性；此外，t细胞会具有改善的持久性和记忆形成、存活和抗原刺激的存活。该过程包括使用akt抑制剂，本文举例说明的mk-2206为蛋白激酶b(akt)的小分子抑制剂，它作用于糖酵解途径的上游。在第0天活化t细胞并在第1天转导之后，在第2天添加mk-2206时，实现了改善的t细胞扩增；分析显示产生的t细胞群体的功能性得到了改善，如下所述。
[0246]
1.2 t细胞分离扩增和培养
[0247]
使用静态扩增系统(可扩展的g-)扩增并转导所有的细胞。将来自健康供体或癌症患者的冷冻保存的白细胞去除术起始材料解冻、清洗，用cd3/cd28磁性dynabead活化，并对cd3 阳性部分进行磁分离。所有健康供体的白细胞去除术起始材料都相似。cd3 细胞的范围为44-64％，使用抗cd3/cd28 dynabead进行阳性分离之后，纯度都提高至79-87％。cd3 表型分析(phenotyping)鉴定了一系列干细胞记忆(scm)标志物(ccr7 /cd45ra )，在个体之间的cd8 区室中，范围为11.6-57％。基于总有核细胞(tnc)计数，以最终培养体积的10％，使用补充有100iu/ml il-2的texmacs 5％人ab血清(habs)，在g-静态细胞扩增系统装置中以1.5
×
106tnc/cm2的密度接种富集的cd3 t细胞。在向细胞中添加cd3/cd28 dynabead之后18-26小时，以0.45的moi使用慢病毒(lv)载体，用表达异源性tcr(识别mage-a4)的载体实施转导。然后，在用texmacs 5％habs 500iu/ml il-2转导之后17-24小时，实
施培养基的添加以达到最终培养体积。然后在37℃，5％的co2条件下，将细胞再孵育8天。将mk-2206以规定的时间间隔添加至培养基中；在第0天的接种培养基添加中，并补充到用于第2天的培养基添加的培养基中，或只补充到用于第2天的培养基添加的培养基中。每个实验的化合物的浓度不同，如以下例子所描述的10μm、7.5μm、5μm、2.5μm、2μm、1.5μm、1μm、0.5μm、0.25μm、0.1μm、0.05μm。接种之后10天收获t细胞。去除珠子后，通过自动细胞分析(用vicell)计数t细胞。然后，将收获的细胞冷冻用于所描述的随后的表型和功能性分析。图1给出了该过程的概况。
[0248]
1.3抗原刺激与细胞因子释放分析(ifnγ)。
[0249]
基于用表达magea4的细胞系a375进行抗原刺激之后扩增的t细胞释放的细胞因子水平来评估扩增的t细胞的功能。使用自动细胞计数器计数a375 magea4阳性靶细胞，并在t细胞刺激前一天，以每孔30000个有活力的有核细胞(vnc)，每孔100μl的体积接种在96孔u型底板中，并在37℃、5％co2下孵育过夜。用作“单独的t细胞”对照的孔，只接受100μl的r10培养基(具有10％fbs和1％青霉素/链霉素的rpmi培养基)。靶细胞的孵育过夜后，将收获的和冷冻的t细胞在37℃水浴中解冻并用r10培养基洗涤。将细胞在r10培养基中以2
×
106vnc/ml的密度在37℃、5％co2下静置2小时。静置2小时之后，使用自动细胞计数器计数t细胞，结合每种条件下计算的转导的和非转导的vnc量，将所有供体的培养物归一化为35％的转导效率。在接种前一天，将归一化的t细胞以150000vnc/孔以100ul体积接种到含有a375靶细胞的板中。将板在37℃、5％co2下放回培养箱中48小时以允许t细胞刺激。刺激48小时之后，将板在400g下离心5分钟，并将上清液转移到新的96孔板中。将上清液储存于-20℃。
[0250]
通过elisa使用人ifnγ实施elisa。为板制备标准对照至最大浓度为10000pg/ml的ifnγ，并以二分之一的比例连续稀释，以生成每个测定的标准曲线。在od450处分析比色读数(bmg labtech fluostarω酶标仪)。
[0251]
实施例2
[0252]
2.1 t细胞扩增分析
[0253]
在上述过程之后处理健康供体材料(包含从供体血液样本中分离的白细胞的白细胞去除术材料)以在静态扩增(g-rex装置)中持续培养10天。在第0天 第2天或仅在第2天(培养物添加的第2天)用添加到培养物中的mk-2206(1.25μm、2.5μm、5.0μm、10μm)培养细胞。收获时，使用自动细胞计数器(vicell)进行总有核细胞(tnc)计数以提供扩增数据，并实施流式细胞术以确定表型。将收获的培养物冷冻并随后解冻用于功能评估，这是一种抗原刺激的细胞因子释放测定(如以上1.3所描述的)。
[0254]
数据(图2)显示，与未处理的对照相比时，在存在较低浓度的mk-2206的情况下增加的扩增。添加mk-2206的所有时间点均显示在10μm时的扩增减少。除10μm以外，仅第2天的添加就提高了tnc产量。第0天( 2)始终提供低产量。
[0255]
实施例3
[0256]
3.1延长滴定与扩展分析
[0257]
在从0.05μm到10μm的进一步滴定中测试mk-2206的浓度，以完全确定最佳剂量，并且评估第0( 2)天和仅第2天以确定最佳添加时间。再次评估了扩增、表型和细胞因子产生数据。在不同浓度下对另外4个供体进行了测试，以在本研究中提供完整的滴定范围，10μm
至0.05μm。在所描述的过程之后，在10m的g-rex中测试了所有供体，并在第10天收获。扩增数据考虑了添加mk-2206的时间点；第0 2天和仅第2天。
[0258]
mk-2206的添加时间点对扩增有影响。第0 2天没有显示出一致的反应。在所有测试的浓度中存在供体改变，具有增加1.5倍的扩增极限和减少0.15倍的扩增极限。峰值扩增处于最低浓度(0.05μm和0.1μm)，其中所有供体反应相似或比未处理的对照好0.5倍(图3a)。第2天添加对扩增没有负面影响。不存在供体改变；然而，所有条件都相对于对照(≥1-2倍)提供了相似或更好的反应。第2天添加为3个供体在0.5μm处提供了峰值扩增，在扩增前，开始以剂量依赖性反应(0.05-0.25μm)降低。扩增反应似乎达到》0.5μm的平台期(plateau)，有一些供体改变(图3b)。总体而言，第2天添加为第0 2天的扩增提供了显著更好的反应。
[0259]
实施例4
[0260]
3.4 t细胞表型分析
[0261]
在从所述过程收获的第10天对健康供体材料实施流式细胞术，以使用ccr7和cd45ra染色确定培养的细胞的记忆表型标志物。
[0262]
图4数据显示，当与未处理的对照相比时，在第0 2天和仅第2天添加时，用mk-2206培养的细胞在收获时显示出增加的ccr7 cd45ra 群体。添加剂的浓度对增加ccr7 cd45ra 没有显著影响。这些干细胞样标志物的增加更加反映了第0天的白细胞去除术起始材料(图4的第0天)，这可能表明添加剂通过减缓分化来维持此群体。
[0263]
mk-2206对记忆表型标志物(ccr7/cd45ra)有影响，如图所示(图4)，还观察到cd62l表达的增加，这增加了这些双阳性scm样细胞的群体，这些双阳性scm样细胞具有较少的末端分化，较少受到功能性衰竭的影响，并且更能够在体内维持更长的存活时间并提供持续更长和更持久的免疫应答。ccr7 群体的这种增加表明干细胞样和中央记忆标志物的增加，以及随之而来的ccr7-cd45ra-的减少，即，末端分化的效应子记忆(em)群体越多，该细胞亚群就可能衰竭并降低t细胞在体内的存活与增殖。在所有测试的浓度下，emra群体通常与未处理的对照保持相似。ccr7 群体的增加表明用mk-2206培养的细胞正在生成“更健康的”t细胞，这些细胞具有存活和持续存在的能力，这对t细胞群体具有功能性益处，特别是在过继性疗法和治疗癌症的背景下。
[0264]
scm t细胞是“干记忆细胞”(t
scm
细胞)ccr7 /cd45ra ，并且与初始t细胞相似，它们也表达大量的cd95、il-2rβ、cxcr3和lfa-1，并显示出记忆细胞特有的许多功能属性。scm t细胞是末端分化较少的t细胞，其具有长期应答和自我更新与存活的高能力。cm t细胞为“中央记忆型t细胞”(t
cm
细胞)，其表达ccr7 /cd45ra-，也具有中到高表达的cd44。cm t细胞是常见于淋巴结和外周循环中的记忆亚群。em t细胞是“效应子记忆t细胞”(t
em
细胞)，它们是ccr7-/cd45ra-，即缺乏ccr7和cd45ra的表达。它们也具有中到高表达的cd44。这些记忆t细胞缺乏淋巴结归巢受体(homing receptor)，因此发现于外周循环和组织中，它们是即时应答效应子细胞，由于它们的末端分化状态而导致功能衰竭。emra细胞(t
emra
)是重新表达cd45ra(ccr7-/cd45ra )的末端分化的效应子记忆细胞，cd45ra是通常在初始t细胞上发现的标志物。
[0265]
实施例5
[0266]
5.1细胞因子产生
[0267]
在magea4阳性细胞系a375存在的情况下，将来源于以上描述的t细胞培养过程的扩增的t细胞解冻并接种。对于细胞因子释放测定，将靶细胞和效应子细胞共培养48小时，然后收集上清液并通过elisa分析ifnγ水平。非转导的对照也包括在测定中作为额外的对照措施。所有样品均归一化为35％的转导率。
[0268]
研究了由抗原刺激的t细胞产生的ifnγ的水平作为t细胞群体功能性的指示。针对每个供体的未处理的对照评估mk-2206。抗原刺激之后ifnγ产生的应答在一定程度上是供体依赖性的。mk-2206浓度的增加似乎也降低了细胞的细胞因子产生(》5μm)。在添加mk-2206的第2天可以观察到最高的增加(图5)。
[0269]
序列
[0270]
gvydgrehtv，(seq id no：1)，mage-a4肽
[0271]
fmnkfiyei(seq id no：2)甲胎蛋白(afp)肽或来源于seq id no：3的残基158-166
[0272]
人类甲胎蛋白seq id no：3
[0273][0274]
seq id no：4；mage-a4 tcrα链，cdr粗体下划线
[0275][0276]
seq id no：5；mage-a4 tcrα链编码序列
[0277][0278]
seq id no：6；(mage-a4 tcrβ链)cdr粗体下划线
[0279][0280]
seq id no：7；(mage-a4 tcrβ链编码序列)
[0281][0282]
seq id no：8；(mage-a4 tcrα链可变区)136aa-cdr粗体下划线
[0283]
seq id no：9；(mage-a4 tcrβ链可变区)133aa-cdr粗体下划线
[0284][0285]
seq id no：10；cdr1 mage-a4 tcrα链
[0286]
vspfsn
[0287]
seq id no：11；cdr2 mage-a4 tcrα链
[0288]
ltfsen
[0289]
seq id no：12；cdr3 mage-a4 tcrα链
[0290]
cvvsggtdswgklqf
[0291]
seq id no：13；cdr1 mage-a4 tcrβ链
[0292]
kghdr
[0293]
seq id no：14；cdr2 mage-a4 tcrβ链
[0294]
sfdvkd
[0295]
seq id no：15；cdr3 mage-a4 tcrβ链，
[0296]
catsgqgayeeqff
[0297]
亲本afp tcr trav12-2*02/traj41*01/tracα链氨基酸胞外序列(seq id no：16)
[0298][0299]
亲本afp tcrα链dna序列(seq id no：17)
[0300][0301]
亲本afp tcr trbv9*01/trbd2/trbj2-7*01/trbc2β链氨基酸胞外序列(seq id no：18)
[0302][0303]
亲本afp tcrβ链dna序列(seq id no：19)
[0304][0305]
变体afp tcr(afp trav12-2*02/traj41*01/tracα链氨基酸胞外序列(seq id no：20)
[0306]
[0307]
变体afp tcr trbv9*01/trbd2/trbj2-7*01/trbc2β链氨基酸胞外序列(seq id no：21)
[0308][0309]
drgsqs(αcdr1)，afp tcr，seq id no：22
[0310]
iysngd(αcdr2)，afp tcr，seq id no：23
[0311]
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[0312]
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[0313]
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[0314]
asslggeseqy(βcdr3)，afp tcr，seq id no：27
[0315]
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[0316]
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[0317]
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[0318]
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[0320]
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[0321]
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[0322]
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[0323]
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[0324][0325]
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[0326][0327]
ggtagtggtgcccctgtga，seq id no：38；(cd8α)核酸序列
[0328]
vllsnptsg，cd8αcdr1，seq id no：39
[0329]
ylsqnkpk，cd8αcdr2，seq id no：40
[0330]
lsnsim，cd8αcdr3，seq id no：41