一种具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂及其制备方法和应用

1.本发明属于生物化学材料技术领域，具体涉及一种具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.癌症已经成为严重威胁人类健康的疾病之一。光动力疗法(pdt)利用特定波长光激活光敏剂产生活性氧物种(ros)，从而杀伤癌细胞。这种方法具有无创性、低耐药性、局部治疗等优势，因此在抗癌方面得到了广泛的关注。
3.但是，传统的pdt光敏剂，如卟啉及其衍生物通常在进行癌细胞杀伤时，由于聚集状态下的π-π堆积引起荧光猝灭和ros生成能力的降低，影响pdt的推广和应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂及其制备方法和应用，本发明提供的光敏剂具有聚集诱导发光(aie)性质，强的ros产生能力，可对癌细胞进行高效的光动力杀伤，具有显著抗癌活性。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了一种具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂，具有式i所示结构：
[0007][0008]
所述式i中的a为
[0009]
所述式i中的r1为h、烷基或烷氧基；
[0010]
所述式i中的r2为h、烷基或烷氧基。
[0011]
优选的，所述式i中的r1为所述式i中的r2为h或甲氧基。
[0012]
优选的，具有式i-1、式i-2、式i-3或式i-4所示结构：
[0013][0014]
本发明提供了上述技术方案所述的具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
[0015]
将第一反应原料、第二反应原料和有机溶剂混合进行knoevenagel反应，得到式i所示结构的具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂；
[0016]
所述第一反应原料的结构式如式ii或式iv所示；
[0017]
所述第二反应原料的结构式如式iii所示；
[0018]
所述第一反应原料的结构式如式iv所示时，所述knoevenagel反应的原料还包括乙酸铵，所述knoevenagel反应在保护气体气氛中进行；
[0019][0020]
优选的，所述第一反应原料的结构式如式ii所示，所述第一反应原料和第二反应原料的摩尔比为1.2:1。
[0021]
优选的，所述knoevenagel反应的温度为常温。
[0022]
优选的，所述第一反应原料的结构式如式iv所示，所述第一反应原料、第二反应原料和乙酸铵的摩尔比为1.2:1:1.5。
[0023]
优选的，所述knoevenagel反应的温度为78℃。
[0024]
本发明提供了一种光动力诊疗试剂，包括上述技术方案所述的具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的具有活性氧产
生能力的聚集诱导发光特性光敏剂。
[0025]
本发明提供了技术方案所述的具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂在制备抗癌药物中的应用。
[0026]
本发明提供了一种具有活性氧产生能力的聚集诱导发光(aie)特性光敏剂，具有式i所示结构。本发明提供的光敏剂的分子结构具有给受体相互作用，可以促使光敏剂的吸收和发射波长发生红移，增加生物组织穿透深度，降低对生物组织的光损伤；而且，本发明提供的光敏剂具有aie性质，在聚集状态下式i所示结构的光敏剂分子内运动受到限制，非辐射减弱，辐射增强，使其具有荧光增强的特性，同时本发明提供的具有式i所示结构的光敏剂具有较强的ros产生能力。由实施例的结果表明，将本发明式i-4所示结构的光敏剂用于光动力抗癌，对hela细胞具有良好的光动力杀伤效果，同时，本发明提供的光敏剂还能够对细胞内脂滴进行定位，因此本发明提供的光敏剂有望用作荧光介导的pdt诊疗的试剂。
[0027]
本发明提供了上述技术方案所述的具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂的制备方法，包括以下步骤：将第一反应原料、第二反应原料和有机溶剂混合进行knoevenagel反应，得到式i所示结构的具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂。本发明通过knoevenagel反应，制备得到式i所示结构的具有ros产生能力的aie特性光敏剂，制备方法步骤简单，容易操作，适宜工业生产。
附图说明
[0028]
图1为实施例1制备的tcf-depom在不同甲苯体积分数(f
t
)的dmso/甲苯混合溶液中实时荧光强度与初始荧光强度的比值随甲苯体积分数的变化曲线；
[0029]
图2为实施例1制备的tcf-depom与ros捕获剂dcfh-da混合溶液在530nm处的实时荧光强度与初始荧光强度比随光照时间的变化曲线；
[0030]
图3为实施例1制备的tcf-depom和商业脂滴染料bodipy493/503对hela细胞的实时荧光成像图；
[0031]
图4为实施例1制备的tcf-depom不同浓度条件下对hela细胞的光动力光热杀伤情况；
[0032]
图5为实施例1制备tcf-depom的合成路线图；
[0033]
图6为实施例4制备的式i-1所示结构的化合物在不同甲苯体积分数(f
t
)的dmso/甲苯混合溶液中实时荧光强度与初始荧光强度的比值随甲苯体积分数的变化曲线；
[0034]
图7为实施例4制备的式i-1所示结构的化合物与ros捕获剂dcfh-da混合溶液在530nm处的实时荧光强度与初始荧光强度比随光照时间的变化曲线；
[0035]
图8为实施例3制备的式i-2所示结构的化合物在不同甲苯体积分数(f
t
)的dmso/甲苯混合溶液中实时荧光强度与初始荧光强度的比值随甲苯体积分数的变化曲线；
[0036]
图9为实施例3制备的式i-2所示结构的化合物与ros捕获剂dcfh-da混合溶液在530nm处的实时荧光强度与初始荧光强度比随光照时间的变化曲线；
[0037]
图10为实施例2制备的式i-3所示结构的化合物在不同甲苯体积分数(f
t
)的dmso/甲苯混合溶液中实时荧光强度与初始荧光强度的比值随甲苯体积分数的变化曲线；
[0038]
图11为实施例2制备的式i-3所示结构的化合物与ros捕获剂dcfh-da混合溶液在
530nm处的实时荧光强度与初始荧光强度比随光照时间的变化曲线。
具体实施方式
[0039]
本发明提供了一种具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂，具有式i所示结构：
[0040][0041]
所述式i中的a为
[0042]
所述式i中的r1为h、烷基或烷氧基；
[0043]
所述式i中的r2为h、烷基或烷氧基。
[0044]
在本发明中，所述式i中的r1具体优选为
[0045]
在本发明中，所述式i中的r2优选为h或甲氧基。
[0046]
在本发明中，所述具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂优选具有式i-1、式i-2、式i-3或式i-4所示结构：
[0047][0048]
本发明提供了上述技术方案所述的具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
[0049]
将第一反应原料、第二反应原料和有机溶剂混合进行knoevenagel反应，得到式i所示结构的具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂；
[0050]
所述第一反应原料的结构式如式ii或式iv所示；
[0051]
所述第二反应原料的结构式如式iii所示；
[0052]
所述第一反应原料的结构式如式iv所示时，所述knoevenagel反应在保护气体气氛中进行；
[0053][0054]
在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。
[0055]
在本发明中，所述第一反应原料的结构式如式ii所示，所述第一反应原料和第二反应原料的摩尔比优选为1.2:1。
[0056]
在本发明中，所述第一反应原料的结构式如式ii所示，所述knoevenagel反应的温度为常温。
[0057]
在本发明中，所述第一反应原料的结构式如式iv所示，所述第一反应原料、第二反应原料和乙酸铵的摩尔比优选为1.2:1:1.5。
[0058]
在本发明中，所述第一反应原料的结构式如式iv所示，所述knoevenagel反应的温度为78℃。
[0059]
本发明对所述有机溶剂的种类没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的适用于进行knoevenagel反应的有机溶剂即可，具体如无水乙醇。本发明对所述有机溶剂的用量
没有特殊要求，能够使所述knoevenagel反应顺利进行即可。
[0060]
在本发明中，所述第一反应原料的结构式如式iv所示，所述knoevenagel反应在保护气体气氛中进行。本发明对所述保护气体气氛没有特殊限定，在常规的保护气体气氛中进行即可，如氮气氛围或惰性气体氛围。
[0061]
在本发明中，所述knoevenagel反应优选在搅拌条件下进行，本发明对于所述搅拌的速率没有特殊的限定，能够搅拌均匀即可。
[0062]
本发明对于所述knoevenagel反应的保温时间没有特殊的限定，优选通过本领域公知的薄层色谱点板(tlc板)对所述knoevenagel反应进行监控，反应至所述第二反应原料完全消失即可。
[0063]
在本发明中，所述knoevenagel反应后，本发明优选还包括对knoevenagel产物体系进行后处理，得到所述具有ros生成能力的aie特性光敏剂。
[0064]
在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：
[0065]
将所述knoevenagel反应得到反应液浓缩，得到浓缩物；
[0066]
将所述浓缩物进行柱层析，得到反应纯化液；
[0067]
将所述反应纯化液和氯甲烷与正己烷的混合溶剂混合进行重结晶，固液分离后，得到具有式i所示结构的具有ros生成能力的aie特性光敏剂。
[0068]
本发明对所述浓缩的具体实施过程没有特殊要求，采用常规的浓缩的方式即可，如旋蒸。
[0069]
在本发明中，所述柱层析用洗脱剂优选为石油醚和乙酸乙酯的混合液，其中石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为1:1。
[0070]
柱层析完成后，本发明优选将柱层析得到的反应纯化液进行重结晶，所述重结晶使用的的混合溶剂中，氯甲烷与正己烷的体积比优选为1:6。
[0071]
在本发明中，所述固液分离优选为过滤。
[0072]
本发明提供了一种光动力诊疗试剂，包括上述技术方案所述的具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂。
[0073]
本发明提供了技术方案所述的具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂或上述技术方案所述的制备方法制备得到的具有活性氧产生能力的聚集诱导发光特性光敏剂在制备抗癌药物中的应用。
[0074]
在本发明中，所述光动力诊疗试剂优选为人宫颈癌(hela)细胞的光动力诊疗试剂。
[0075]
在本发明中，所述抗癌药物优选为抗人宫颈癌(hela)药物。
[0076]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的体术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0077]
实施例1
[0078]
按照图5所述的合成路线，制备具有i-4所示结构的光敏剂(记为tcf-depom)：
[0079]
将第一反应原料(图5中化合物1，96mg，0.48mmol)，第二反应原料(图5中的化合物2，100mg，0.48mmol)和乙酸铵(55mg，0.72mmol)溶于无水乙醇(6ml)中得到混合液；将混合液在78℃、n2保护条件下反应过夜，用薄层色谱板(tlc)监测反应进程，待化合物1消失后反
应完全，将反应后得到的反应混合物浓缩，以石油醚:乙酸乙酯＝1:1(体积比)作为洗脱液进行柱层析纯化，得到纯化反应液。然后用二氯甲烷:正己烷＝1:6(体积比)的混合溶剂与纯化反应液混合在室温条件下进行重结晶，过滤后得到紫黑色固体产物，产率83％；
[0080]
对所得固体产物进行表征，具体核磁数据如下：
[0081]1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.97(d,j＝15.9hz,1h),7.55(d,j＝9.1hz,1h),6.84(d,j＝15.9hz,1h),6.39(dd,j＝9.1,2.1hz,1h),6.08(d,j＝2.1hz,1h),3.94(s,3h),3.52(m,4h),1.76(s,6h),1.29(m,6h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ176.62,174.99,162.47,153.91,143.38,113.25,112.43,112.13,111.83,108.03,106.27,96.42,92.95,92.34,55.58,53.08,45.21,27.11,12.72.
[0082]
根据上述核磁表征数据可知得到的本实施例制备的具有ros产生能力的aie特性光敏剂的结构式如式i-4所示，记为tcf-depom。
[0083][0084]
性能测试：
[0085]
(1)tcf-depom的aie性质测试：在不同甲苯体积分数(f
t
)的dmso/甲苯混合溶液中加入tcf-depom的dmso溶液(1mm)，得到浓度为10μm的tcf-depom溶液，以580nm作为激发波长测定在不同甲苯体积分数的混合溶液中在632nm处的实时荧光强度与初始荧光强度的比值变化情况，测试结果如图1所示。
[0086]
图1为tcf-depom在不同甲苯体积分数的dmso/甲苯混合溶液中632nm处的荧光强度比随甲苯体积分数的变化情况，从低到高对应的正己烷的体积分数依次为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和99％，激发光波长为580nm。从图1中可以看出，随着甲苯体积分数的增加，tcf-depom荧光发射强度比逐渐增加，直至90％之后出现一定程度的下降，这说明tcf-depom具有aie性质，甲苯(不良溶剂)体积分数90％后的荧光下降可能是由于其聚集状态的改变导致的。
[0087]
(2)tcf-depom的ros产生能力测试：利用2
′
,7
′‑
二氯荧光黄双乙酸盐(dcfh-da)为ros捕获剂，检测本实施例制备的光敏剂产生ros的效率。首先需要用无水乙醇配置浓度为1mm的dcfh-da母液，吸取500μl的dcfh-da的无水乙醇母液于naoh溶液中(2ml、10mm)，混合均匀，避光条件下保存30min以活化dcfh-da得到二氯荧光素(dcfh)溶液。最后将dcfh溶液加入到10mlpbs缓冲溶液(ph＝7.4、25mm)中，混合均匀后得到终浓度为40μm的dcfh溶液。在含有一定浓度光敏剂的2ml比色皿中加入50μl的dcfh溶液，用cel-pe300l-3a太阳能模拟器光照，此为实验组。利用荧光光谱仪收集光照时间从0s开始，一定时间间隔的荧光光谱(激发波长为489nm，发射波长范围：500～600nm)，将只加dcfh组做为空白对照组，测试结果如图2所示。
[0088]
图2为tcf-depom与ros捕获剂dcfh混合溶液在530nm处的不荧光强度与初始荧光强度比随光照时间的变化情况。从图2可以看出，随着光照时间的延长，空白dcfh组荧光强度比无明显变化，但有本实施例制备的的光敏剂存在时，dcfh的荧光强度比上升明显，说明tcf-depom具有强的ros产生能力。
[0089]
(3)tcf-depom对hela细胞的靶向荧光成像能力测试，具体步骤如下：
[0090]
将hela细胞铺在共聚焦皿中放置在二氧化碳培养箱(37℃，5％co2)中培养过夜。在hela细胞中加入商业染料bodipy 493/503(3μm)，孵化30min，pbs冲洗三次后加入tcf-depom溶液(20μm，dmso溶液)孵化30min，使用蔡司lsm 880激光扫描显微镜对细胞进行成像。tcf-depom的激发波长为543nm，发射接收波长》570nm；bodipy 493/503的激发波长为488nm，发射接收波长为495～620nm，测试结果如图3。
[0091]
图3为tcf-depom和商业脂滴染料bodipy 493/503对hela细胞的实时荧光成像图，从图3中可以看出，tcf-depom可在细胞内呈现明亮的红色荧光，商业脂滴染料bodipy 493/503在细胞中呈现绿色荧光，两者的叠加图可以看出，红色荧光和绿色英光可以很好的重叠，说明tcf-depom具有脂滴靶向荧光成像能力。
[0092]
(4)tcf-depom对hela细胞光动力杀伤能力测试，具体步骤如下：
[0093]
hela细胞在含10％(体积百分含量)热灭活胎牛血清、100mg
·
ml-1
青霉素和100mg
·
ml-1
链霉素的dmem(含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)中，37℃条件下，在含有5％co2(体积百分含量)的湿化培养箱中培养。采用mtt法测定细胞活力，mtt法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。dmso能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。
[0094]
将100μl细胞悬液(5000个细胞/孔)置于96孔板中。37℃条件下，在含有5％co2的加湿培养箱中预孵育24h。孔中加入不同浓度的tcf-depom溶液，终浓度分别为0、5、10、20、30、40、50μm。细胞在培养箱中孵育16h后，用0.5w/cm2，660nm激光对hela细胞光照5min，继续在37℃条件下孵育4h后，用含20μg/ml mtt的新鲜培养基(100μl)交换细胞培养液。孵育4h后移去培养基，加入100μl的dmso溶解甲臜晶体。用酶标仪测定490nm处吸光度，作为光毒性组。未处理细胞作为对照组。按照上述方法，区别仅在于不进行光照处理，细胞在培养箱中孵育20h后，用含20μg/ml mtt的新鲜培养基(100μl)交换细胞培养液。孵育4h后移去培养基，加入100μl的dmso溶解甲臜晶体。用酶标仪测定490nm处吸光度，作为暗毒性组。测试结果如图4所示。
[0095]
图4为不同浓度的tcf-depom对hela细胞的光动力光热杀伤情况。从图4可以看出，随着tcf-depom浓度的增大，光毒性组hela细胞的存活率明显下降，暗毒性组hela细胞的存活率均保持在90％左右，说明黑暗条件下，tcf-depom对hela细胞具有较高的安全性，光照条件下，对hela细胞的光动力光热杀伤作用明显。
[0096]
实施例2
[0097]
与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：将化合物2替换为
[0098]
将所得产物进行核磁表征，核磁数据为：1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ7.91(d,j＝15.7hz,1h),7.75(d,j＝8.6hz,2h),6.90
–
6.79(m,3h),3.51(m,4h),1.75(s,6h),1.16(m,6h).
13
c nmr(126mhz,dmso-d6)δ177.80,175.81,152.31,149.84,133.82,122.01,114.04,113.20,112.57,112.49,108.31,98.51,91.86,51.03,44.78,26.14,12.97.
[0099]
可知本实施例制备得到的具有ros产生能力的aie特性光敏剂的结构式如式i-3所示。
[0100][0101]
按照实施例1的方法对实施例2所得式i-3的光敏剂的ros产生能力进行测试，所得结果如图10和图11所示，与实施例1制备的产品测试结果相似。
[0102]
实施例3
[0103]
与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：将化合物1替换为
[0104]
将所得产物进行核磁表征，核磁数据为：1h nmr(500mhz,cdcl3)δ9.11(s,1h),8.89(d,j＝9.2hz,1h),8.62(d,j＝7.3hz,1h),7.82(d,j＝6.8hz,1h),7.66(m,6.8hz,2h),6.44(dd,j＝9.4,2.2hz,1h),6.03(s,1h),3.96(s,3h),3.54(m,4h),1.31(m,6h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ187.26,164.68,164.25,155.76,141.71,139.57,138.49,137.33,133.91,133.35,124.39,123.05,120.36,116.15,115.70,112.98,105.58,92.07,55.83,45.36,12.82.
[0105]
可知本实施例制备得得到的具有ros产生能力的aie特性的光敏剂的结构式如式i-2所示。
[0106][0107]
按照实施例1的方法对实施例3所得式i-2的光敏剂的ros产生能力进行测试，所得结果如图8和图9所示，与实施例1制备的产品测试结果相似。
[0108]
实施例4
[0109]
与实施例3的制备方法基本相同，不同之处在于：将化合物2替换为
[0110]
将所得产物进行核磁表征，核磁数据为：1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.43(d,j＝7.8hz,1h),8.27(s,3h),7.90
–
7.75(m,3h),6.91(d,j＝9.1hz,2h),3.58(d,j＝7.0hz,4h),1.20(m,6h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ187.39,163.53,152.99,147.88,139.59,137.29,134.27,133.76,124.66,123.31,121.91,121.65,115.61,115.43,111.38,66.66,45.18,12.71.
[0111]
可知本实施例制备得到的具有ros产生能力的aie特性光敏剂的结构式如式i-1所示。
[0112][0113]
按照实施例1的方法对实施例4所得式i-4的光敏剂的ros产生能力进行测试，所得结果如图6和图7所示，与实施例1制备的产品测试结果相似。
[0114]
由以上实施例可知，本发明提供的具有ros产生能力的aie光敏剂合成步骤简单，分离纯化操作简单；具有aie性质，对hela细胞的脂滴具有靶向荧光成像能力，并有良好的光动力杀伤效果，有望用作荧光介导的光动力抗癌。
[0115]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。