EMC8基因的检测试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用及预后评估试剂盒

emc8基因的检测试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用及预后评估试剂盒
技术领域
1.本发明涉及emc8基因的检测试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用及预后评估试剂盒，属于生物医学技术领域。


背景技术：

2.胃癌具有高发病率和高死亡率的特点，是世界上主要的癌症之一，也是重要的全球医疗保健问题，对全人类的健康造成了重要影响。有资料显示，超过70％的胃癌发生在发展中国家，胃癌发病例数绝对值最大的国家是中国。中国的胃癌发病例数和死亡例数分别占全球胃癌发病和死亡的42.6％和45.0％，疾病负担严重是癌症防治的难点和重点。胃癌患者具有发病率高、转移率高、死亡率高，早诊率低、根治性切除率低、5年生存率低的特点。另一方面，有研究显示，淋巴结转移是胃癌患者预后的危险因素之一，淋巴结转移阳性相对于淋巴结转移阴性，患者往往预后不佳。影像学检查是判断淋巴结转移的主要方法之一，但是一些患者术前ct检查并没有显示出明显肿大的淋巴结，然而患者的术后病理却证实为淋巴结阳性。采用新的技术手段，帮助明确患者否确实存在淋巴结转移，对于指导手术及围手术期化疗，和改善患者预后都有帮助，并对提高患者生存质量具有重要意义。目前在胃癌领域，仍然十分缺乏有效的检测胃癌的试剂盒，以及预后评估的肿瘤标记物，因此迫切的需要这方面的标志物，为胃癌的预后评估提供客观依据。
3.聚合酶链反应(polymerase chain reaction，pcr)是一种体外特异性扩增目的dna片段的技术，其基本原理是利用碱基互补配对原则。实时荧光定量pcr是以cdna作为模板，在dna polymerase(聚合酶)作用下，参照目的片段的特异性引物序列，特异性合成上、下游引物之间的目的片段。检测结合在dna双链中的荧光信号，根据ct值等可以对目的mrna进行定量检测。因此设计出能够识别目的片段的特异性引物序列，是保证目的mrna定量准确的重要保证和重要环节。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了emc8基因的检测试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用及预后评估试剂盒。
5.本发明的技术方案如下：
6.emc8基因的检测试剂在制备胃癌预后评估试剂盒中的应用。
7.根据本发明优选的，所述emc8基因的ncbi gene数据库gene id为10328。
8.根据本发明优选的，所述胃癌预后评估试剂盒为荧光定量pcr检测试剂盒。
9.根据本发明优选的，所述胃癌预后评估试剂盒用于检测细胞、组织、血浆或血清中的emc8基因。
10.一种胃癌预后评估试剂盒，包括emc8基因的荧光定量pcr反应试剂。
11.根据本发明优选的，所述emc8基因的荧光定量pcr反应试剂包括emc8基因的上游
引物和下游引物；所述上游引物和下游引物的序列如下：
12.emc8_f：5
’‑
cccatgctggaggtggctct-3’，
13.emc8_r：5
’‑
ggactggcatcctttactcg-3’。
14.根据本发明优选的，所述胃癌诊断试剂盒还包括内参体系。
15.进一步优选的，所述内参体系为内参基因β-actin(beta-actin)的荧光定量pcr的检测体系，包括β-actin基因的上游引物和下游引物；所述上游引物和下游引物的序列如下：
16.β-actin_f：5
’‑
gaagagctacgagctgcctga-3’，
17.β-actin_r：5
’‑
cagacagcactgtgttggcg-3’。
18.根据本发明优选的，所述试剂盒中还包括用于荧光定量pcr的酶液和缓冲液体系，为现有的市购产品。
19.上述胃癌预后评估试剂盒在预警老年胃癌患者的淋巴结转移中的应用。
20.上述胃癌预后评估试剂盒在胃癌预后评估中的应用。
21.有益效果：
22.1、本发明首次揭示了emc8基因与胃癌淋巴结转移相关，在胃癌淋巴结转移患者中emc8基因的表达水平显著升高且具有统计学意义。基于此，本发明将emc8基因的检测试剂应用于制备胃癌淋巴结转移评估试剂盒，制备得到的试剂盒具有方便、快捷等特点，可用于胃癌的淋巴结转移预警领域，为胃癌患者的治疗提供指导。
23.2、本发明中所述emc8基因作为评估胃癌患者预后的标志物，对于胃癌预后评估具有重要参考价值。根据emc8基因设计的试剂盒可用于评估胃癌患者预后情况，辅助胃癌患者治疗，有着较高的临床使用价值及推广价值。
附图说明
24.图1是实施例1中秩和检验分析结果图。
25.图2是在geo数据库(gene expression omnibus，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载数据集gse14208，在km plotter(www.kmplot.com)数据库中下载胃癌患者预后信息以及emc8表达数据，分析emc8基因表达水平对胃癌患者预后的影响，应用log-rank检验emc8基因高表达与低表达胃癌患者之间预后差异是否具有统计学意义的示意图；
26.图中：a为总生存率分析一，b为复发生存期分析，c为总生存率分析二，d为首次进展期分析。
具体实施方式
27.下面结合实验例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验步骤，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
28.实施例1、emc8基因在老年(大于65岁)胃癌有、无淋巴结转移患者中的表达水平差异
29.1、检测90个样本，分别来自45例胃癌患者，其中每例患者均取癌组织和癌旁组织样本，共90个样本(45对癌组织和癌旁组织)的cdna。该90个样本的cdna购买于上海芯超生
物科技有限公司，型号为胃癌mecdna-hstma030cs01和mecdna-hstma060cs01。其中，患者年纪大于65岁共19例。这19例老年患者中，14例患者有淋巴结转移，5例患者无淋巴结转移。
30.2、荧光定量pcr：
31.根据ncbi gene数据库gene id为10328所示的emc8基因设计引物，具体如下：
32.emc8_f：5
’‑
cccatgctggaggtggctct-3’，
33.emc8_r：5
’‑
ggactggcatcctttactcg-3’。
34.以β-actin(beta-actin)基因作为内参基因进行qpcr，所述β-actin基因的ncbi gene数据库gene id为60；
35.内参基因β-actin的引物序列如下：
36.β-actin_f：5
’‑
gaagagctacgagctgcctga-3’，
37.β-actin_r：5
’‑
cagacagcactgtgttggcg-3’。
38.实时荧光定量pcr体系：总反应体系为10μl；2
×
sybr green pcr master mix 5μl，qn rox reference dye 0.05μl，上游引物稀释液0.7μl(终浓度0.7μm)，下游引物稀释液0.7μl(终浓度0.7μm)，rnase-free water加cdna溶解液3.55μl。反应试剂2
×
sybr green pcr master mix，qn rox reference dye购买自quantinova
tm
green pcr kit。
39.反应条件(最大/快速模式)：pcr初始活化步骤，95℃，2分钟；两步循环，变性95℃，5秒；退火/延伸步骤，60℃，10秒，共40循环。仪器为赛默飞quantstuidio 3。
40.通过以上荧光定量pcr，获得19对来自老年胃癌患者的癌组织和癌旁组织样本中emc8基因的表达水平数据。
41.3、统计学分析：
42.以2-δδct
法数据进行数据标准化及分析，对每例胃癌患者(分别有一个癌组织样本和一个癌旁组织样本)，分别进行2-δδct
法进行计算，以计算出目的基因在每例胃癌患者的表达情况。
43.δct＝目的基因ct值-内参基因ct值，δδct＝癌样本δct值-癌旁样本δct值，2-δδct反映每例胃癌患者的癌组织样本目的基因的相对表达水平。对实验检测的原始数据进行质控，其中取ct平均值的基本方法为，目的基因ct值取重复样本复孔平均值；内参基因ct值取重复样本复孔平均值。对数据进行质控后，按照以下方法进行分析。
44.两样本的秩和检验，h0：为两个总体分布相同，h1：为两个总体分布不相同，α＝0.1500(单侧)，此次检测分析，样本均来自大于65岁胃癌患者，例数为n＝19例。
45.统计结果如图1所示，t＝35.0000，p＝0.0906，u＝-1.3887，p＝0.0825。经秩和检验，按α水准拒绝h0，故可认为两组的总体分布不同。无淋巴结转移的老年胃癌患者的emc8的mrna相对表达水平平均为0.7839，有淋巴结转移的老年胃癌患者的emc8的mrna相对表达水平平均为1.2341。即无淋巴结转移的老年胃癌患者的emc8的mrna相对表达水平明显低于有淋巴结转移的老年胃癌患者的emc8的mrna相对表达水平。
46.以上分析通过简明统计14.0(concise statistics,cs14.0)计算。以上统计结果说明无淋巴结转移的老年胃癌患者的emc8的mrna相对表达水平明显低于有淋巴结转移的老年胃癌患者的emc8的mrna相对表达水平，具有明显差异和统计学意义，可以根据emc8基因的表达水平预警胃癌患者的淋巴结转移，因此可基于emc8基因制作用于预警胃癌患者的淋巴结转移的试剂盒。
47.实施例2、胃癌emc8基因高表达患者和emc8基因低表达患者其预后水平的差异。
48.在geo数据库(gene expression omnibus，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载数据集gse14208，在km plotter(www.kmplot.com)数据库中下载胃癌患者预后信息以及emc8表达数据。使用kaplan-meier和log-rank检验，分析评估总生存期，进展/复发后生存期和首次进展期。以中位数为界将基因表达水平分为低表达组和高表达组，使用graphpad prism或r软件绘制曲线图，结果图2所示。p《0.05被认为具有统计学意义。
49.由图2a可知，胃癌患者中高emc8表达(高emc8组，n＝62；低emc8组，n＝61)与低的总生存率显著相关(χ2＝5.967；p《0.05，log-rank检验，原始数据来自于gse14208)。由图2b可知，胃癌患者中高emc8表达(高emc8组，n＝62；低emc8组，n＝61)与复发生存期显著相关(χ2＝12.25；p《0.001，log-rank检验，原始数据来自于gse14208)。由图2c可知，胃癌患者中高emc8表达(高emc8组，n＝170；低emc8组，n＝173)与低的总生存率显著相关(χ2＝4.201；p《0.05，log-rank检验，原始数据来自于km plotter)，在更大的样本分析显示了同样的结果。由图2d可知，胃癌患者中高emc8表达(高emc8组，n＝117；低emc8组，n＝118)与首次进展期显著相关(χ2＝8.186；p《0.01，log-rank检验，原始数据来自于km plotter)。这些结果表明，emc8的高表达是胃癌患者预后不良的一个指标，与低emc8表达的胃癌患者相比，高emc8表达的胃癌患者的总生存率显著降低。
50.上述实施例仅为本发明优选的具体实施方案，并不用来限制本发明，凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。