RCN3基因的检测试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用及胃癌检测试剂盒

rcn3基因的检测试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用及胃癌检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及rcn3基因的检测试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用及胃癌检测试剂盒，属于生物医学技术领域。


背景技术：

2.胃癌具有高发病率和高死亡率的特点，是世界上主要的癌症之一，也是重要的全球医疗保健问题，对全人类的健康造成了重要影响。有资料显示，超过70％的胃癌发生在发展中国家，胃癌发病例数绝对值最大的国家是中国。中国的胃癌发病例数和死亡例数分别占全球胃癌发病和死亡的42.6％和45.0％，疾病负担严重是癌症防治的难点和重点。胃癌患者具有发病率高、转移率高、死亡率高，早诊率低、根治性切除率低、5年生存率低的特点。与英国和美国相比，不仅中国的胃癌的发病率更高，并且5年总生存率还较低。目前在胃癌领域，仍然十分缺乏有效的检测胃癌的试剂盒，以及早期诊断和预后评估相关的肿瘤标记物，因此迫切的需要一种较为敏感的标志物，为胃癌的早期诊断和预后评估提供客观依据。
3.聚合酶链反应(polymerase chain reaction，pcr)是一种是一种体外特异性扩增目的dna片段的技术，其基本原理是利用碱基互补配对原则。实时荧光定量pcr是以cdna作为模板，在dna polymerase(聚合酶)作用下，参照目的片段的特异性引物序列，特异性合成上、下游引物之间的目的片段。检测结合在dna双链中的荧光信号，根据ct值等可以对目的mrna进行定量检测。因此设计出能够识别目的片段的特异性引物序列，是保证目的mrna定量准确的重要保证和重要环节。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了rcn3基因的检测试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用及胃癌检测试剂盒。
5.本发明的技术方案如下：
6.rcn3基因的检测试剂在制备胃癌检测试剂盒中的应用。
7.根据本发明优选的，所述rcn3基因的ncbi gene数据库gene id为57333。
8.根据本发明优选的，所述胃癌检测试剂盒为荧光定量pcr检测试剂盒。
9.根据本发明优选的，所述胃癌检测试剂盒用于检测细胞、组织、血浆或血清中的rcn3基因。
10.一种胃癌检测试剂盒，包括rcn3基因的荧光定量pcr反应试剂。
11.根据本发明优选的，所述rcn3基因的荧光定量pcr反应试剂包括rcn3基因的上游引物和下游引物；所述上游引物和下游引物的序列如rcn3_f1/r1或rcn3_f2/r2所示；
12.所述rcn3_f1/r1和rcn3_f2/r2的序列如下：
13.rcn3_f1：5
’‑
cctggatgggagtgaggtg-3’，
14.rcn3_r1：5
’‑
caggatttccgctttgct-3’；
15.rcn3_f2：5
’‑
tggaagccaaccacctg-3’，
16.rcn3_r2：5
’‑
cctgactgcccacaaacat-3’。
17.根据本发明优选的，所述胃癌检测试剂盒还包括内参体系。
18.进一步优选的，所述内参体系为内参基因β-actin(beta-actin)的荧光定量pcr的检测体系，包括β-actin基因的上游引物和下游引物；所述上游引物和下游引物的序列如下：
19.β-actin_f：5
’‑
gaagagctacgagctgcctga-3’，
20.β-actin_r：5
’‑
cagacagcactgtgttggcg-3’。
21.根据本发明优选的，所述试剂盒中还包括用于荧光定量pcr的酶液和缓冲液体系，为现有的市购产品。
22.上述胃癌检测试剂盒在胃癌早期诊断中的应用。
23.上述胃癌检测试剂盒在胃癌预后评估中的应用。
24.有益效果：
25.1、本发明首次揭示了rcn3基因与胃癌、胃癌预后情况相关。在胃癌患者中rcn3基因的表达水平显著升高且具有统计学意义。rcn3基因的表达水平高的胃癌患者比rcn3基因的表达水平低的胃癌患者预后差，具有统计学意义。基于此，本发明将rcn3基因的检测试剂应用于制备胃癌的检测试剂盒，制备得到的试剂盒具有方便、快捷等特点，可用于胃癌的早期诊断和评估胃癌患者预后情况等领域，为胃癌患者的治疗提供指导。
26.2、本发明中所述rcn3基因作为胃癌早期诊断及判断胃癌预后的标志物具有重要参考价值。根据rcn3基因设计的试剂盒不仅可用于胃癌的筛查，同时可用于评估胃癌患者预后情况，辅助胃癌患者治疗，有着较高的临床使用价值及推广价值。
附图说明
27.图1是实施例1中以rcn3_f1/r1为引物所得数据统计学检验分析结果图。
28.图2是实施例1中以rcn3_f2/r2为引物所得数据统计学检验分析结果图。
29.图3是应用在geo数据库(gene expression omnibus，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载数据集gse15459，使用kaplan-meier和log-rank检验分析rcn3基因表达水平对胃癌患者预后的影响，应用log-rank检验rcn3基因高表达与低表达胃癌患者之间预后差异是否具有统计学意义的示意图。
具体实施方式
30.下面结合实验例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验步骤，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
31.实施例1、rcn3基因在胃癌患者中的表达水平
32.1、检测30个样本，分别来自15例胃癌患者，其中每例患者均取癌组织和癌旁组织样本，共30个样本(15对癌组织和癌旁组织)的cdna。该30个样本的cdna购买于上海芯超生物科技有限公司，型号为胃癌cdna-hstma030cs01。
33.2、荧光定量pcr：
34.根据ncbi gene数据库gene id为57333所示的rcn3基因设计两对引物，具体如下：
35.rcn3_f1：5
’‑
cctggatgggagtgaggtg-3’，
36.rcn3_r1：5
’‑
caggatttccgctttgct-3’；
37.rcn3_f2：5
’‑
tggaagccaaccacctg-3’，
38.rcn3_r2：5
’‑
cctgactgcccacaaacat-3’。
39.以β-actin(beta-actin)基因作为内参基因进行qpcr，所述β-actin基因的ncbi gene数据库gene id为60；
40.内参基因β-actin的引物序列如下：
41.β-actin_f：5
’‑
gaagagctacgagctgcctga-3’，
42.β-actin_r：5
’‑
cagacagcactgtgttggcg-3’。
43.荧光定量pcr体系：总反应体系为10μl；2
×
sybr green pcr master mix 5μl，qn rox reference dye 0.05μl，上游引物稀释液0.7μl(终浓度0.7μm)，下游引物稀释液0.7μl(终浓度0.7μm)，rnase-free water加cdna溶解液3.55μl。反应试剂2
×
sybr green pcr master mix和qn rox reference dye购买自quantinova
tm
green pcr kit。
44.反应条件(最大/快速模式)：pcr初始活化步骤，95℃，2分钟；两步循环，变性95℃，5秒；退火/延伸步骤，60℃，10秒，共40循环。仪器为赛默飞quantstuidio 3。
45.通过以上两对引物分别进行荧光定量pcr，获得15对来自胃癌患者的癌组织和癌旁组织样本中rcn3基因的表达水平数据。
46.3、统计学分析：
47.以2-δδct
法数据进行数据标准化及分析，对每例胃癌患者(分别有一个癌组织样本和一个癌旁组织样本)，分别进行2-δδct
法进行计算，以计算出目的基因在每例胃癌患者的表达情况。
48.δct＝目的基因ct值-内参基因ct值，δδct＝癌样本δct值-癌旁样本δct值，2-δδct反映每例胃癌患者的癌组织样本目的基因的相对表达水平。对实验检测的原始数据进行质控，其中取ct平均值的基本方法为，目的基因ct值取重复样本复孔平均值；内参基因ct值取重复样本复孔平均值。
49.1)对引物rcn3_f1/r1的荧光定量pcr数据进行质控后，分别按照以下三种方法分别进行分析。
50.①
.单样本单侧t检验，h0：为胃癌患者中rcn3的相对表达水平为1，h1：为胃癌患者中rcn3的相对表达水平大于1，取α＝0.1000，以p值小于α为拒绝h0。此次检测分析，样本例数为n＝15例，单样本单侧t检验，对rcn3的mrna相对表达水平进行统计学分析，mu＝1，α＝0.1000(单侧)。
51.统计结果，t＝3.5317，p＝0.001660。经检验，按α水准拒绝h0。在15例胃癌中的rcn3的mrna的相对表达水平平均为2.4181，因此胃癌患者中rcn3高表达且具有统计学意义。
52.②
.u检验，样本均数与总体均数的比较，h0假设为μ＝1.0000，h1假设为μ》1.0000，α＝0.1000(单侧)
53.统计结果，u＝3.5317，p＝0.000207。经检验，按α水准拒绝h0。在15例胃癌中的rcn3的mrna的相对表达水平平均为2.4181，因此胃癌患者中rcn3高表达且具有统计学意
义。
54.③
.秩和检验，h0：为差值的总体中位数等于0，h1：为差值的总体中位数不等于0，α＝0.1000(单侧)。
55.统计结果，v＝109.0000，p＝0.0017。经检验，按α水准拒绝h0，接受h1，故可认为差值的总体中位数不等于0。在15例胃癌中的rcn3的mrna的相对表达水平平均为2.4181，因此胃癌患者中rcn3高表达且具有统计学意义。
56.以上分析通过简明统计14.0(concise statistics,cs14.0)计算。如图1所示，以上统计结果说明胃癌患者中rcn3基因的表达水平显著升高，具有统计学意义。
57.2)对引物rcn3_f2/r2的荧光定量pcr数据进行质控后，分别按照以下三种方法分别进行分析。
58.①
.单样本单侧t检验，h0：为胃癌患者中rcn3的相对表达水平为1，h1：为胃癌患者中rcn3的相对表达水平大于1，取α＝0.1000，以p值小于α为拒绝h0。此次检测分析，样本例数为n＝15例，单样本单侧t检验，对rcn3的mrna相对表达水平进行统计学分析，mu＝1，α＝0.1000(单侧)。
59.统计结果，t＝4.1253，p＝0.000515。经检验，按α水准拒绝h0。在15例胃癌中的rcn3的mrna的相对表达水平平均为2.3688，因此胃癌患者中rcn3高表达且具有统计学意义。
60.②
.u检验，样本均数与总体均数的比较，h0假设为μ＝1.0000，h1假设为μ》1.0000，α＝0.1000(单侧)
61.统计结果，u＝4.1253，p＝0.000019。经检验，按α水准拒绝h0。在15例胃癌中的rcn3的mrna的相对表达水平平均为2.3688，因此胃癌患者中rcn3高表达且具有统计学意义。
62.③
.秩和检验，h0：为差值的总体中位数等于0，h1：为差值的总体中位数不等于0，α＝0.1000(单侧)。
63.统计结果，v＝112.0000，p＝0.0008。经检验，按α水准拒绝h0，接受h1，故可认为差值的总体中位数不等于0。在15例胃癌中的rcn3的mrna的相对表达水平平均为2.3688，因此胃癌患者中rcn3高表达且具有统计学意义。
64.以上分析通过简明统计14.0(concise statistics,cs14.0)计算。如图2所示，以上统计结果说明胃癌患者中rcn3基因的表达水平显著升高，具有统计学意义。
65.根据统计结果可知，胃癌组织中rcn3基因的表达水平显著升高，具有统计学意义，可以根据rcn3基因的表达水平进行胃癌的早期诊断，因此可基于rcn3基因制作用于胃癌早期诊断的试剂盒。
66.实施例2、胃癌rcn3基因高表达患者和rcn3基因低表达患者其预后水平的差异。
67.在geo数据库(gene expression omnibus，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载数据集gse15459，使用kaplan-meier和log-rank检验，分析评估总体生存期。以中位数为界将基因表达水平分为低表达组和高表达组，使用graphpad prism或r软件绘制曲线图，结果图3所示。p《0.05被认为具有统计学意义。
68.由图3可知，胃癌患者中高rcn3表达(高rcn3组，n＝96；低rcn3组，n＝96)与总体低生存率显著相关(χ2＝9.97；p《0.05，log-rank检验；原始数据来自于gse15459)。rcn3高表
达预示胃癌患者预后生存差。说明rcn3的高表达是胃癌患者预后不良的一个指标，与低rcn3表达的胃癌患者相比，高rcn3表达的胃癌患者的总体生存率显著降低。
69.上述实施例仅为本发明优选的具体实施方案，并不用来限制本发明，凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。