一种诱导豆瓣菜芽脱分化高效再生的方法

1.本发明涉及一种植物组织培养方法，特别涉及一种诱导豆瓣菜芽脱分化高效再生的方法。


背景技术：

2.诱导组织脱分化为愈伤，诱导愈伤形成植株属于细胞工程的基本技术之一。该项技术在蔬菜各项研究中属于奠基技术的存在，虽然技术较为成熟，但是并非所有蔬菜都能用于再生，这一点是由蔬菜的基因型效应所决定的。能诱导再生的蔬菜，其诱导脱分化的组织主要是茎段、叶片、根，如番茄叶片和豆瓣菜茎段再生成植株，需至少三个月时间；胡萝卜肉质根再生成植株，需至少四个月时间；存在周期长、效率低、投入高的问题。
3.豆瓣菜又名西洋菜，十字花科豆瓣菜属，存在无性繁殖与有性繁殖两种生殖方式，自然界中存在二倍体、三倍体及四倍体，属于即可水生也可陆生植物，在亚非欧均有野生资源分布。其口感、营养极佳，硫苷代谢物、多酚类物质的含量颇高，属高保健价值蔬菜。张楠等人以野生豆瓣菜的嫩茎为外植体，其再生苗形成至少需要三个月时间才能形成，具有周期长、后期投入大、效率低的缺点；shinjiro ogita等人以豆瓣菜的节间为材料，诱导节间生根生芽，但是存在不形成愈伤由茎段直接产生芽，难以高效再生。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明旨在提供一种缩短诱导脱分化周期的诱导豆瓣菜芽脱分化高效再生的方法。
5.技术方案：本发明所述的诱导豆瓣菜芽脱分化高效再生的方法，包括以下步骤：
6.(1)选取带有叶柄基部的茎段；
7.(2)将茎段接种到含细胞分裂素和植物生长素的培养基上，暗培养至产生畸形膨大芽；
8.(3)将畸形膨大芽绿色组织切除形成创伤，接种到含细胞分裂素和植物生长素的培养基上，暗光培养至畸形膨大芽伤口形成愈伤团；
9.(4)将整体接种到培养基上培养至形成丛芽；
10.(5)将整体接种到培养基上培养至形成不定根，成为完整植株。
11.所述步骤(1)中选取带有叶柄基部的茎段，这是因为茎的叶柄基部含有在萌发过程更容易诱导脱分化的芽原基。
12.所述步骤(2)中暗光培养，因为诱导植物脱分化的难易往往与植物基因表达程度相关，表达程度越低，越易诱导脱分化，暗光培养能够避免茎段和畸形膨大芽中与光合作用相关的基因表达，从而降低基因表达程度，使得在暗培养环境下诱导的畸形膨大芽能够更好更快的脱分化形成愈伤。
13.所述步骤(3)中，畸形膨大芽绿色组织是畸形的叶片，畸形叶片内光合作用相关基因已经表达，这部分组织脱分化形成愈伤的程度相对于畸形膨大芽的其他部位而言，难度
较大，而且其代谢产物往往会影响愈伤的形成。因此切除畸形膨大芽绿色组织，作用有两点，一是能够避免绿色组织对后期愈伤形成产生负面影响，二是切除绿色组织形成的伤口能直接与培养基接触，使得培养基中的激素能够更有效的诱导伤口细胞脱分化形成愈伤，缩短愈伤形成的时间。
14.所述步骤(2)和(3)中，培养基含细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)6～10mg/l和噻苯隆(tdz)1～2mg/l，植物生长素2,4-二氯苄氧乙酸(2,4-d)1～2mg/l。常见的用于组织再生细胞分裂素有玉米素(zt)、激动素(kt)、6-ba、tdz等，但是前两者不耐高温，需待培养基冷却后加入，过多的操作往往会提高污染概率，增加工作量。而6-ba和tdz相对两者而言，不仅耐高温，而且6-ba的稳定性高，能够持续发挥作用，tdz在组织培养过程中，能够促进芽的形成，有利于诱导茎段产生畸形膨大芽。常见植物生长素有吲哚乙酸(iaa)、吲哚丁酸(iba)、萘乙酸(naa)、二氯苯氧乙酸(2,4-d)，前两者不耐高温，2,4-d和naa耐高温，naa主要在促进生根方面效果较好，2,4-d活性强，更容易诱导植物组织产生愈伤组织，因此步骤(2)或(3)细胞植物生长素选择2,4-d。
15.所述步骤(2)～(4)中，培养基的ph值为6.2～6.6。采用氢氧化钠和盐酸调节培养基的ph，调节ph作用有两点，一是可以使得6-ba、2,4-d、tdz、naa在培养基中的存在形式，更易被植物组织吸收运输，更快捷的发挥作用，二是能够使得愈伤生活环境更加接近豆瓣菜最适生长环境ph，能够避免在愈伤诱导或生长过程中因为ph不合适导致愈伤形成缓慢或愈伤死亡。
16.优选的，所述步骤(2)中，畸形膨大芽为0.5～1cm，该长度的畸形膨大芽细胞增生较多，而且便于操作。
17.优选的，所述步骤(4)中，所述培养基含有细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)3～5mg/l和萘乙酸(naa)1～2mg/l，naa能有效促进根的生成。
18.优选的，所述步骤(4)和(5)中，培养条件为暗培养和光培养交替培养。暗培养和光培养交替培养模拟豆瓣菜正常生长环境。光刺激能够更好的诱导光合相关基因的表达，更利于愈伤向芽进行分化，形成再生芽。光强度为10000～20000lux，不仅有利于愈伤向芽进行分化，形成再生芽，而且能使得再生芽健壮。
19.步骤(1)～(5)的培养温度为20～27℃。
20.步骤(5)中，所述的培养基为ms培养基。
21.发明机理：诱导植物形成愈伤是形成再生植株的最重要步骤，而决定形成愈伤难易的有两个主要因素，一个是所选材料的基因型效应，另一个是材料器官的年龄。选择的豆瓣菜是广西大叶豆瓣菜，已有人用于诱导愈伤，虽整个周期极长，但说明该品种的豆瓣菜的基因型效应是不会阻碍愈伤形成的，这一点是所有能诱导产生愈伤的植物所必须的。选择材料器官是一般是茎段、叶片、根，这类材料是最常见的诱导部位，但由于高度分化，同时所选取的材料器官年龄不佳，导致诱导愈伤的形成需要投入大量前期工作，才能保证愈伤的正常形成。选用豆瓣菜畸形膨大芽而不是豆瓣菜茎段作为诱导愈伤产生对象的一个重要原因就是畸形膨大芽处于幼嫩时期，年龄极佳，而且细胞分裂旺盛，非常符合诱导愈伤形成的前期条件，减少了大量的前期投入；另一个原因在于，在生长素和细胞分裂素配比作用下，能使得豆瓣菜茎节这一老器官能在短时间内产生大量的畸形膨大芽，完全解决了材料不足的问题。与采用根、茎或叶这类老器官直接作为诱导愈伤形成对象而言，畸形膨大芽作为诱
导的对象，是突破了传统思维，通过相应的方法，解决了老器官所带来的局限。基于材料器官的选择、合理的激素配比以及畸形膨大芽自身所有的特点，极大程度的缩短了再生的时间。
22.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)该方法选择带叶柄基部的茎段产生畸形膨大芽，利用畸形膨大芽诱导形成愈伤，培养形成完整植株，整个周期只要37～43天；(2)选择诱导愈伤部位为畸形膨大芽，该植物器官相对于传统的根茎叶而言更加幼嫩，细胞分裂更加旺盛，形成愈伤时间短。
附图说明
23.图1为实施例1带叶柄基部的茎段图；
24.图2为实施例1诱导形成的畸形膨大芽图；
25.图3为实施例1诱导畸形膨大芽形成的愈伤细胞团图；
26.图4为实施例1诱导愈伤形成芽图；
27.图5为实施例1诱导芽节间形成不定根图；
28.图6为实施例1形成完整植株图。
具体实施方式
29.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
30.实施例1
31.本发明所述的一种诱导豆瓣菜芽脱分化高效再生的方法包括以下步骤：
32.(1)茎段选取：在超净工作台上，将豆瓣菜茎段进行切割，切割后茎段带有叶柄基部，长度1cm。
33.(2)诱导畸形膨大芽：将茎段用无菌镊子接种到含6-ba 6mg/l，2,4-d 1mg/l，tdz1mg/l，ph 6.2的培养基上，石蜡封口膜密封，在光培箱中25℃避光暗培养7天左右，出现淡黄色偏透明的畸形膨大芽，长度约1cm时取出。
34.(3)去除绿色组织，诱导愈伤形成：将畸形膨大畸形芽取出，置于无菌滤纸盘上，用灭菌的微创手术刀直接对滤纸上畸形膨大芽的绿色部分进行切割形成创伤，将剔除干净的畸形膨大芽继续接种到含6-ba 6mg/l，2,4-d 1mg/l，tdz 1mg/l，ph值6.2的培养基上，继续在光培箱中25℃暗培养7天左右，直到畸形膨大芽伤口形成可以看见的小颗粒愈伤团。
35.(4)诱导愈伤团形成从芽：在超净工作台上用灭菌镊子将整体转移至含6-ba3mg/l，naa 1mg/l，ph值6.2的培养基上，石蜡封口膜密封，在25℃条件下暗培养8小时，然后25℃下光强10000lux条件下培养16h，暗培养和光培养交替培养9天，在愈伤团上能明显看到绿色芽点形成，绿色芽点形成丛芽。
36.(5)诱导生根形成完整再生植株：在超净工作台上，用灭菌镊子将整体接种到含ms培养基的培养皿上，用石蜡封口膜密封，在25℃条件下暗培养8小时，然后25℃下光强10000lux条件下培养16h，暗培养和光培养交替培养7天芽节间处形成不定根。用无菌弯头手术刀剪掉苗子，用镊子将苗接种于含固体ms培养基的组培瓶中，暗培养和光培养条件不变，交替培养7天成为完整植株。
37.整个周期大致在37天左右完成。
38.实施例2
39.本发明所述的一种诱导豆瓣菜芽脱分化高效再生的方法包括以下步骤：
40.(1)茎段选取：在超净工作台上，将豆瓣菜茎段进行切割，切割后茎段带有叶柄基部，长度0.5cm.
41.(2)诱导畸形膨大芽：将茎段用无菌镊子接种到含6-ba 6mg/l，2,4-d 1.5mg/l，tdz 1.5mg/l，ph值6.6的培养基上，石蜡封口膜密封，在光培箱中27℃避光暗培养7天左右，出现淡黄色偏透明的畸形膨大芽，长度约0.5cm时取出。
42.(3)去除绿色组织，诱导愈伤形成：将畸形膨大畸形芽取出，置于无菌滤纸盘上，用灭菌的微创手术刀直接对滤纸上畸形膨大芽的绿色部分进行切割形成创伤，将剔除干净的畸形膨大芽继续接种到含6-ba 6mg/l，2,4-d 1.5mg/l，tdz 1.5mg/l，ph值6.6的培养基上，继续在光培箱中27℃暗培养7天左右，直到畸形膨大芽伤口形成可以看见的小颗粒愈伤团。
43.(4)诱导愈伤团形成从芽：在超净工作台上用灭菌镊子将整体转移至含6-ba4mg/l，naa 1.5mg/l，ph值6.6的培养基上，石蜡封口膜密封，在27℃条件下暗培养8小时，然后27℃下光强15000lux条件下培养16h，暗培养和光培养交替培养12天，在愈伤团上能明显看到绿色芽点形成，绿色芽点形成丛芽。
44.(5)诱导生根形成完整再生植株：在超净工作台上，用灭菌镊子将整体接种到含ms培养基的培养皿上，用石蜡封口膜密封，在27℃条件下暗培养8小时，然后27℃下光强15000lux条件下培养16h，暗培养和光培养交替培养7天芽节间处形成不定根。用无菌弯头手术刀剪掉苗子，用镊子将苗接种于含固体ms培养基的组培瓶中，暗培养和光培养条件不变，交替培养7天成为完整植株。
45.整个周期大致在40天左右完成。
46.实施例3
47.本发明所述的一种诱导豆瓣菜芽脱分化高效再生的方法包括以下步骤：
48.(1)茎段选取：在超净工作台上，将豆瓣菜茎段进行切割，切割后茎段带有叶柄基部，长度1cm.
49.(2)诱导畸形膨大芽：将茎段用无菌镊子接种到含6-ba 10mg/l，2,4-d 2mg/l，tdz 2mg/l，ph值6.4的培养基上，石蜡封口膜密封，在光培箱中20℃避光暗培养7天左右，出现淡黄色偏透明的畸形膨大芽，长度为0.5cm左右时取出。
50.(3)去除绿色组织，诱导愈伤形成：将畸形膨大畸形芽取出，置于无菌滤纸盘上，用灭菌的微创手术刀直接对滤纸上畸形膨大芽的绿色部分进行切割形成创伤，将剔除干净的畸形膨大芽继续接种到含6-ba 10mg/l，2,4-d 2mg/l，tdz 2mg/l，ph值6.4的培养基上，继续在光培箱中20℃暗培养7天左右，直到畸形膨大芽伤口形成可以看见的小颗粒愈伤团。
51.(4)诱导愈伤团形成从芽：在超净工作台上用灭菌镊子将整体转移至含6-ba5mg/l，naa 2mg/l，ph值6.4的培养基上，石蜡封口膜密封，在20℃条件下暗培养8小时，然后20℃下光强20000lux条件下培养16h，暗培养和光培养交替培养15天，在愈伤团上能明显看到绿色芽点形成，绿色芽点形成丛芽。
52.(5)诱导生根形成完整再生植株：在超净工作台上，用灭菌镊子将整体接种到含ms培养基的培养皿上，用石蜡封口膜密封，在20℃条件下暗培养8小时，然后20℃下光强20000lux条件下培养16h，暗培养和光培养交替培养7天芽节间处形成不定根。用无菌弯头
手术刀剪掉苗子，用镊子将苗接种于含固体ms培养基的组培瓶中，暗培养和光培养条件不变，交替培养7天成为完整植株。
53.整个周期大致在43天左右完成。